專利名稱：：一種動物源可凝固蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動物纖維蛋白原，尤其是涉及一種動物源可凝固蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有蛋白制品的病毒滅活/去除方法有其局限性，目前常用的病毒滅活方法有巴氏滅活法、干熱法、有機溶劑/去污劑法、低pH孵放等。有研究報道靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)產(chǎn)品可能傳播丙肝病毒，輸注血漿蛋白制品可能傳播人類細小病毒B19。因此尋找一種能滅活所有病毒，且對蛋白制品活性影響較小、操作方便的方法，將有助于提高蛋白制品應(yīng)用的安全性，隨著血液制品的廣泛應(yīng)用，血液傳播疾病的預(yù)防日益受到重視。為加強現(xiàn)有制品的病毒安全性，有必要增加一些有效的病毒滅活方式。其中巴氏滅活法最早與低溫乙醇法結(jié)合用于對白蛋白的處理，并沿用至今，經(jīng)此法處理的白蛋白是公認的安全制劑。干熱法最早用于凍干的凝血因子制劑的病毒滅活，此外納米膜過濾、亞甲藍光敏法、壓力循環(huán)法、亞胺法、交聯(lián)碘淀粉法等的應(yīng)用和效果都有報道。有機溶劑/去污劑被許多廠家用于滅活脂包膜病毒，對非脂包膜病毒沒有作用。熱處理能有效滅活凍干制品中的非脂包膜病毒，且已應(yīng)用于凝血因子制劑的病毒滅活。其方式有8(TC72h、10(TC30min。本發(fā)明通過對纖維蛋白原熱處理前后制品的理化性質(zhì)進行分析，希望確定一種簡便易行的處理方法，可用于二次病毒滅活。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種在保證有效地殺滅可能污染的病原微生物的同時，維持生物材料的功能和結(jié)構(gòu)的動物源可凝固蛋白的制備方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，該方法是將至少含一種生物材料及穩(wěn)定劑的組成物質(zhì)凍干、粉碎成凍干粉、封裝，在IO(TC下進行30分鐘病毒滅活。所述的組成物質(zhì)中的生物材料為蛋白質(zhì)，包括但不限于哺乳動物的血液蛋白組分凝血因子，包括維生素K依賴性蛋白，及非維生素K依賴性蛋白；白蛋白；脂蛋白；補體蛋白；球蛋白；典型的血液蛋白組分包括因子I(纖維蛋白原)，因子II(凝血酶原)因子III(組織因子)，因子V(促凝血球蛋白原)，因子VI(促凝血球蛋白)，因子VIII(抗血友病因子B)，因子X(Stuart-Prower因子)，因子XI(血漿凝血激酶前質(zhì))，因子XII(Hageman因子)，因子XIII(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)，vonWillebrands因子，(vFW))，因子Ia，因子IIa，因子IIIa，因子Va，因子Via，因子VIIa，因子VIIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，同時還包括血紅細胞中的蛋白。所述的維生素K依賴性蛋白包括因子VII或因子IX，所述的非維生素K依賴性蛋白包括因子VIII或vonWillebrands因子，所述的脂蛋白包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，所述的球蛋白包括免疫球蛋白IgA，IgM，IgG及IgE，所述的血紅細胞中的蛋白包括血紅4蛋白和各種生長因子，及這些蛋白的衍生物。所述的組成物質(zhì)中的生物材料為蛋白質(zhì)，包括但不限于從哺乳動物血液以外組織提取物，包括糖苷酶，硫酸酯酶，尿激酶，膠原或上述混合物。所述的組成物質(zhì)中的生物材料為蛋白質(zhì)，包括但不限于細胞培養(yǎng)所獲得的蛋白質(zhì)或多肽。所述的穩(wěn)定劑為L-精氨酸鹽酸鹽，枸櫞酸三鈉和氯化鈉；所述的生物材料為從哺乳動物體內(nèi)提取的纖維蛋白原復(fù)合物，哺乳動物包括人、牛、馬、豬和羊。所述的組成物質(zhì)的制劑配比以重量克/100ml計為微米蛋白質(zhì)0.l20g%L-精氨酸鹽酸鹽0.110g%氯化鈉0.0110g%枸櫞酸鈉0.015g%。所述的組成物質(zhì)的制劑配比以重量克/100ml計為蛋白質(zhì)315g%L-精氨酸鹽酸鹽0.52g%氯化鈉0.3lg%枸櫞酸鈉l3g%。所述的組成物質(zhì)中殘留水份含量為0.515%;所述的凍干粉的直徑為5100所述的組成物質(zhì)中殘留水份含』為0.55%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用至少含一種生物材料及穩(wěn)定劑的組成物質(zhì)；該組成物質(zhì)可以制備抗輻照的動物源纖維蛋白原，本發(fā)明中生物材料及穩(wěn)定劑的組成物質(zhì)可以100°C，30分鐘病毒滅活；在保證有效地殺滅可能污染的有膜和無膜病毒的同時，維持該生物材料的功能和結(jié)構(gòu)。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1根據(jù)生產(chǎn)標準操作流程，采用無菌技術(shù)獲取經(jīng)過嚴格屠宰前和屠宰后檢疫的定點養(yǎng)殖場生產(chǎn)的食用豬全血；在潔凈度IOO級的生產(chǎn)場地內(nèi)進行血漿的分離，纖維蛋白原復(fù)合物粗提，純化；測定純化后纖維蛋白復(fù)合物的蛋白含量，計算蛋白重量，將穩(wěn)定劑加入，攪拌混勻。最終溶液含有蛋白質(zhì)8.6%、氯化鈉2.3%、L_精氨酸鹽酸鹽3%、枸櫞酸三鈉2.4%;凍干、封裝；微生物限量測定細菌總數(shù)小于300CFU/克。然后，100°C，30分鐘病毒滅活。實施例2采用無菌采血法經(jīng)過心臟穿剌獲取無菌豬血20L，在潔凈車間(潔凈度為10000級保護下的100級)內(nèi)，離心法4000rpm得到9L血漿，在2t:，pH值7.0條件下，加入1:9的冷酒精，4000rpm離心，收集沉淀；將沉淀等分為兩份。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>第一份加入溶解液，溶解后液體的組成成分如下蛋白質(zhì)8.6%、氯化鈉2.3%、L-精氨酸鹽酸鹽3%、枸櫞酸三鈉2.4%;第二份加入溶解液，溶解后液體的組成成分如下蛋白質(zhì)8.6X，維生素C:200mM，氯化鈉2.3%，枸櫞酸三鈉2.4%。將上述兩部分液體取樣，各自分成3等分，每等分分別加入約107qfU/ml的豬細小病毒(PPV)，分裝到西林瓶，lml/瓶，粉碎后，再次冷凍干燥，使凍干粉的水分含量《1%100°C，30分鐘病毒滅活，采用Reed-muenchTCID5。法測定輻照前后病毒滴度降低(TotalReductionFactorTRF)情況，實驗數(shù)據(jù)如下結(jié)果表明，與抗壞血酸相比較，采用L-精氨酸鹽酸、氯化鈉和檸檬酸鈉作為保護劑，在100°C，30分鐘的條件下，PPV的TRF降低了近4.5-5.0，而抗壞血酸組僅僅降低了2-3.從而說明，L-精氨酸鹽酸、氯化鈉和檸檬酸鈉較抗壞血酸組更加有效地增強了輻照的滅病毒作用。實施例3根據(jù)生產(chǎn)標準操作流程，采用無菌技術(shù)獲取經(jīng)過嚴格屠宰前和屠宰后檢疫的定點養(yǎng)殖場生產(chǎn)的食用豬全血；在潔凈度100級的生產(chǎn)場地內(nèi)進行血漿的分離，纖維蛋白原復(fù)合物粗提，純化；測定純化后纖維蛋白復(fù)合物的蛋白含量，計算蛋白重量，將穩(wěn)定劑加入，攪拌混勻。最終溶液含有蛋白質(zhì)8.6%、氯化鈉2.3%、卜精氨酸鹽酸鹽3%、枸櫞酸三鈉2.4%;凍干，封裝；微生物限量測定細菌總數(shù)小于300CFU/克。然后，100°C，30分鐘病毒滅活隨機抽取兩組批號進行穩(wěn)定性測試。測定指標見實施例1.從每一批號中分別取120套置于冷凍箱中(為期3年)、120套置于37t:及75X相對濕度的烘箱中(為期6個月)、120套置于25t:空調(diào)房中(為期6個月)作為測試樣本。在此之前，已進行過基線時間測試，且測試結(jié)果均合格.在為期3年的實時測試過程中，前半年內(nèi)每月選取10套樣品進行檢測，此后，每一年選取IO套樣品進行檢測，檢測結(jié)果記錄在表中。進行加速測試中，前半年內(nèi)每月選取10套樣品進行測試，在滿1年儲存期時再進行測試.檢測結(jié)果均符合實施例1的要求。因此，穩(wěn)定性測試結(jié)果為合格。實施例4—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從牛體內(nèi)提取的纖維蛋白原復(fù)合物加入穩(wěn)定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質(zhì)O.lg%、L-精氨酸鹽酸鹽10g^、氯化鈉10g%、枸櫞酸鈉5g%，封裝、凍干、殘留水份含量為0.5%，IO(TC，30分鐘病毒滅活。實施例5—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從羊體內(nèi)提取的纖維蛋白原復(fù)合物加入穩(wěn)定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質(zhì)20g^、L-精氨酸鹽酸鹽O.lg^、氯化鈉0.01g%、枸櫞酸鈉0.01g%，凍干、封裝、殘留水份含量為15%，100°C，30分鐘病毒滅活。實施例6—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從馬體內(nèi)提取的纖維蛋白原復(fù)合物加入穩(wěn)定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質(zhì)3g%、L_精氨酸鹽酸鹽2g%、氯化鈉lg%、枸櫞酸鈉3g^，封裝、凍干、殘留水份含量為5X，10(TC，30分鐘病毒滅活。實施例7—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從馬體內(nèi)提取的纖維蛋白原復(fù)合物加入穩(wěn)定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質(zhì)15g%、L-精氨酸鹽酸鹽O.5g^、氯化鈉0.3g^、枸櫞酸鈉lg^，封裝、凍干、殘留水份含量為1X，10(TC，30分鐘病毒滅活。權(quán)利要求一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，該方法是將至少含一種生物材料及穩(wěn)定劑的組成物質(zhì)凍干、粉碎成凍干粉、封裝，在100℃下進行30分鐘病毒滅活。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的組成物質(zhì)中的生物材料為蛋白質(zhì)，包括但不限于哺乳動物的血液蛋白組分凝血因子，包括維生素K依賴性蛋白，及非維生素K依賴性蛋白；白蛋白；脂蛋白；補體蛋白；球蛋白；典型的血液蛋白組分包括因子I(纖維蛋白原)，因子II(凝血酶原)因子III(組織因子)，因子V(促凝血球蛋白原)，因子VI(促凝血球蛋白)，因子VIII(抗血友病因子B)，因子X(Stuart-Prower因子)，因子XI(血槳凝血激酶前質(zhì))，因子XII(Hageman因子)，因子XIII(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)，vonWillebrands因子，(vFW))，因子Ia，因子IIa，因子IIIa，因子Va，因子Via,因子VIIa，因子VIIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，同時還包括血紅細胞中的蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的維生素K依賴性蛋白包括因子VII或因子IX，所述的非維生素K依賴性蛋白包括因子VIII或vonWillebrands因子，所述的脂蛋白包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，所述的球蛋白包括免疫球蛋白IgA，IgM，IgG及IgE，所述的血紅細胞中的蛋白包括血紅蛋白和各種生長因子，及這些蛋白的衍生物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的組成物質(zhì)中的生物材料為蛋白質(zhì)，包括但不限于從哺乳動物血液以外組織提取物，包括糖苷酶，硫酸酯酶，尿激酶，膠原或上述混合物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的組成物質(zhì)中的生物材料為蛋白質(zhì)，包括但不限于細胞培養(yǎng)所獲得的蛋白質(zhì)或多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑為L-精氨酸鹽酸鹽，枸櫞酸三鈉和氯化鈉；所述的生物材料為從哺乳動物體內(nèi)提取的纖維蛋白原復(fù)合物，哺乳動物包括人、牛、馬、豬和羊。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的組成物質(zhì)的制劑配比以重量克/100ml計為20g%10g%10g%5g%。蛋白質(zhì)L-精氨酸鹽酸鹽氯化鈉枸櫞酸鈉8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的組成物質(zhì)的制劑配比以重量克/100ml計為0.1-0.1'0.010.01蛋白質(zhì)L-精氨酸鹽酸鹽氯化鈉枸櫞酸鈉9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的-成物質(zhì)中殘留水份含量為0.510.根據(jù)權(quán)利要求5所述的-315g%0.52g%0.3lg%13g%。-種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的組15%;所述的凍干粉的直徑為5100微米-種動物源可凝固蛋白的制備方法，其特征在于，所述的組成物質(zhì)中殘留水份含量為0.55%。全文摘要本發(fā)明涉及一種動物源可凝固蛋白的制備方法，該方法是將至少含一種生物材料及穩(wěn)定劑的組成物質(zhì)凍干、粉碎成凍干粉、封裝，在100℃下進行30分鐘病毒滅活。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有在保證有效地殺滅可能污染的病原微生物的同時，維持生物材料的功能和結(jié)構(gòu)等優(yōu)點。文檔編號C07K1/00GK101759766SQ20081020298公開日2010年6月30日申請日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者何紅兵申請人:上海松力生物技術(shù)有限公司