專利名稱：靜脈注射人免疫球蛋白的雙重病毒滅活/去除方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人血漿蛋白的制備方法，特別是采用雙重病毒滅活/去除方法制備靜脈注射人免疫球蛋白的制備方法。
背景技術：
免疫球蛋白的生產(chǎn)已經(jīng)有半個多世紀的歷史，60年代-80年代初，人們普遍認為經(jīng)低溫乙醇分離制備的免疫球蛋白不傳播病毒性疾病。80年代初期隨著靜注免疫球蛋白(IVIG)的問世，臨床上對于原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷以及一些自身免疫性疾病的治療取得了顯著效果，IVIG被公認是一種安全有效的制品。然而隨著Lane[1]在1983年對輸注IVIG后發(fā)生非甲非乙肝炎傳播的首次報道后，IVIG的病毒安全性引起了人們的關注。自Lane的報道后，涉及多個國家多個制造廠家的數(shù)批IVIG輸注后上千例的非甲非乙肝炎傳播相繼報道[2-7]。上述現(xiàn)象發(fā)生的原因尚不完全清楚，但根據(jù)多方報道經(jīng)IVIG傳播病毒性疾病可能與IVIG生產(chǎn)工藝中是否加入特定的病毒滅活/去除方法及其方法的選擇有著重要的關系，為此WHO和各國相關權威機構均要求在人免疫球蛋白的生產(chǎn)中必須加入適宜的病毒滅活/去除手段以保證該產(chǎn)品在病毒傳播方面的安全性。
血漿蛋白制品生產(chǎn)中常用的病毒滅活方法有加熱滅活(如白蛋白的巴氏消毒)和SD滅活方法，由于免疫球蛋白在生物學結構和功能上的特點，上述兩種病毒滅活方法易于導致其IgG的聚合和生物活性的損失，因此難以在免疫球蛋白規(guī)模化生產(chǎn)中采用，國外同行報道采用加入麥芽糖進行低pH孵放處理用于靜注免疫球蛋白病毒滅活取得了很好的效果[8]，低pH孵放處理對脂包膜病毒有較好的滅活作用，而對非脂包膜病毒(如甲肝病毒和人類細小病毒B19)滅活效果較差。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是采用低pH孵放滅活和納米過濾去除雙重方法來彌補單獨使用低pH孵放病毒滅活方法的不足。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是一種人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于以低溫乙醇法分離得到的組分II沉淀(FII)經(jīng)低pH孵放處理滅活病毒后，采用納米膜過濾進一步去除病毒。
所述的人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、以低溫乙醇法分離得到的組分II沉淀(FII)為原料，用重量比為2-10倍的0-5℃注射用水溶解，0.5-1.0mol/L的鹽酸調整pH至3.5-4.5；b、經(jīng)30-100KD的超濾膜濃縮、透析至殘余乙醇含量≤0.03％，調整蛋白濃度至重量百分比為4.5％-5.0％，pH至3.5-4.5，加入重量百分比為9-11％的麥芽糖作保護劑，除菌過濾后置20-25℃孵放21天；c、低pH孵放處理后的免疫球蛋白半成品先經(jīng)納米膜過濾，再經(jīng)0.2μm除菌過濾膜過濾，得免疫球蛋白成品。
所述的人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述的納米膜范圍為15-35nm。
本發(fā)明的有益效果是將低溫乙醇法分離得到的組分II沉淀(FII)經(jīng)低pH孵放處理后進行納米膜過濾，在有效去除病毒的同時不損失IgG的生物活性，使靜注免疫球蛋白在臨床的使用更加安全。
下面通過本發(fā)明的具體實施方式
對本發(fā)明進一步說明。
具體實施例方式
實施例1第一步低pH孵放處理取FII沉淀20千克，用0℃注射用水160升溶解，1mol/L鹽酸調整pH至4.0，用板框濾器過濾后，用注射用水、100kD超濾膜濃縮、透析至殘余乙醇含量≤0.03％，加入9％麥芽糖，調整蛋白濃度至5.0％，pH至4.2，0.2μm膜除菌過濾分裝至10升玻璃瓶內，放置24℃孵放21天，，得免疫球蛋白半成品。
第二步納米過濾經(jīng)低pH孵放處理的免疫球蛋白半成品檢定合格后在20-30℃的溫度和壓力30-100Kpa條件下用35nmBMM膜(日本旭化成)串聯(lián)0.2μm除菌過濾膜進行過濾，最后分裝至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中國生物制品規(guī)程》中靜脈注射人免疫球蛋白制造和檢定規(guī)程要求進行全面質量檢測，結果見表3。
實施例2
第一步低pH孵放處理取FII沉淀25千克，用0℃注射用水200升溶解，1mol/L鹽酸調整pH至4.0，用板框濾器過濾后，用注射用水、100kD超濾膜濃縮、透析至殘余乙醇含量≤0.03％，加入10％麥芽糖，調整蛋白濃度至5.0％，pH至4.2，0.2μm膜除菌過濾分裝至11升玻璃瓶內，放置24℃孵放21天，得免疫球蛋白半成品。
第二步納米過濾經(jīng)低pH孵放處理的免疫球蛋白半成品檢定合格后在20-30℃的溫度和壓力30-100Kpa條件下用25nmBMM膜(日本旭化成)串聯(lián)0.2μm除菌過濾膜進行過濾，最后分裝至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中國生物制品規(guī)程》中靜脈注射人免疫球蛋白制造和檢定規(guī)程要求進行全面質量檢測，結果見表3。
實施例3第一步低pH孵放處理取FII沉淀22千克，用0℃注射用水176升溶解，1mol/L鹽酸調整pH至4.0，用板框濾器過濾后，用注射用水、100kD超濾膜濃縮、透析至殘余乙醇含量≤0.03％，加入10％麥芽糖，調整蛋白濃度至4.5％，pH至4.2，0.2μ膜除菌過濾分裝至10升玻璃瓶內，放置24℃孵放21天，得免疫球蛋白半成品。
第二步納米過濾經(jīng)低pH孵放處理的免疫球蛋白半成品檢定合格后在20-30℃的溫度和壓力30-100Kpa條件下用15nmBMM膜(日本旭化成)串聯(lián)0.2μm除菌過濾膜進行過濾，最后分裝至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中國生物制品規(guī)程》中靜脈注射人免疫球蛋白制造和檢定規(guī)程要求進行全面質量檢測，結果見表3。
表1三批試制產(chǎn)品全檢結果(按照中國生物制品規(guī)程要求)檢測項目實施例1 實施例2 實施例3物理外觀合格 合格 合格熱穩(wěn)定實驗 合格 合格 合格PH 4.25 4.20 4.24IgG含量g/L 47.2047.49 48.96純度％ 99.0599.55 99.65麥芽糖含量％97.3494.30 96.42分子大小分布％ 99.1299.20 99.27白喉抗體效價8.47 8.42 8.17
IU/ml乙肝表面抗體效價139.63 161.31158.70IU/IgG.gHCV抗體 陰性 陰性 陰性HIV/1+2抗體 陰性 陰性 陰性PKA IU/ml ＜0.58 ＜0.58＜0.58ACA CH50％ 23.58 0 6.09抗A，抗B＜1∶32，＜1∶8＜1∶2，＜1∶8＜1∶4，＜1∶8免疫雙擴合格 合格 合格免疫電泳合格 合格 合格無菌實驗合格 合格 合格熱源質實驗 合格 合格 合格小鼠安全實驗合格 合格 合格豚鼠安全實驗合格 合格 合格本發(fā)明制成的免疫球蛋白成品可分裝至50ml裝量的符合《中國生物制品主要原輔材料質控標準》的玻璃瓶，每瓶1.25g或2.5g。
病毒滅活/去除效果觀察1.低pH孵放處理表2低pH孵放處理對病毒的滅活效果觀察滅活時VSV Sindbis V HIV/1間(天) (7.5-8.0logTCID50)(7.98logTCID50/ml)(5.0logTCID50/ml)對照組試驗組 對照組 試驗組對照組 試驗組0 6.13 4.006.505.00 4.3 4.31 5.88 3.006.282.14 ND ND3 4.94 ≤-0.50*6.131.96 3.8 1.85 4.32 ≤-0.50 6.121.82 ND ND7 4.33 ≤-0.50 5.951.59 2.5 ＜1*102.82 ≤-0.50 5.631.37 1.9 ＜1141.50 ≤-0.50 5.421.01 ＜1*＜121≤-0.50 ≤-0.50 5.190.00 ＜1 ＜1
*為檢測限量，ND未檢測采用HIV/1、SindbisV、VSV三種病毒為指示病毒，以pH7.0為試驗對照組，模擬低pH孵放處理過程，檢測殘留病毒以驗證該方法病毒滅活的效果，結果見表1(檢測結果由中國生物制品檢定所和中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院P3實驗室提供)2.納米膜過濾由日本紅十字會提供HCV陽性血漿，經(jīng)35nm BMM(日本旭化成)膜過濾，采用PCR方法檢測過濾前后血漿中殘留病毒，觀察過濾過程對病毒的去除作用。結果見表2(該實驗結果由北京生物制品研究所，日本旭化成公司和成都蓉生藥業(yè)有限責任公司共同提供)表3BMM膜對HCV陽性血漿中HCV病毒的去除能力血漿樣品 樣品稀釋 殘留病 去除原倍 10-110-210-310-410-510-610-7毒 能力原液*+ + - - 105一次過濾 + - - - 100兩次過濾 - - - ＞1005原液#+ + - - 105一次過濾 + + - - 101兩次過濾 - - - ＞1004*采用北京生物制品研究所PCR試劑盒檢測結果，#采用日本紅十字會提供的PCR試劑盒檢測結果。
綜合上述實驗結果得出結論a、低pH孵放處理能有效滅活VSV、Sindbis和HIV/1病毒。
b、納米過濾技術能有效去除HCV陽性血漿中至少4log的HCV病毒。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
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1.一種人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于以低溫乙醇法分離得到的組分II沉淀(FII)經(jīng)低pH孵放處理滅活病毒后，采用納米膜過濾進一步去除病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、以低溫乙醇法分離得到的組分II沉淀(FII)為原料，用重量比為2-10倍的0-5℃注射用水溶解，0.5-1.0mol/L的鹽酸調整pH至3.5-4.5；b、經(jīng)30-100KD的超濾膜濃縮、透析至殘余乙醇含量≤0.03％，調整蛋白濃度至重量百分比為4.5％-5.0％，pH至3.5-4.5，加入重量百分比為9-11％的麥芽糖作保護劑，除菌過濾后置20-25℃孵放21天；c、低pH孵放處理后的免疫球蛋白半成品先經(jīng)納米膜過濾，再經(jīng)0.2μm除菌過濾膜過濾，得免疫球蛋白成品。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述的納米膜范圍為15-35nm。
4.根據(jù)權利要求3所述的人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述的納米膜為35nm。
5.根據(jù)權利要求2所述的人血漿免疫球蛋白的制備方法，其特征在于步驟c中的免疫球蛋白半成品過濾所需的溫度為15-30℃，壓力為30-100Kpa。
全文摘要
本發(fā)明涉及人血漿蛋白的制備方法，特別是采用雙重病毒滅活/去除方法制備靜脈注射人免疫球蛋白的制備方法。本發(fā)明的人血漿免疫球蛋白的制備方法，以低溫乙醇法分離得到的組分II沉淀(F
文檔編號C07K1/34GK1457884SQ0313517
公開日2003年11月26日 申請日期2003年6月10日 優(yōu)先權日2003年6月10日
發(fā)明者王玉, 廖紅茹, 魯濤, 呂家成, 郭中平 申請人:成都蓉生藥業(yè)有限責任公司