專利名稱：一種新的人蛋白質(zhì)及其編碼序列,及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人蛋白和核苷酸編碼序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人Rab24的cDNA序列，該蛋白是小鼠Rab24的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
在真核細(xì)胞內(nèi)，膜泡運(yùn)輸是胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾绞?。?xì)胞的內(nèi)吞作用，胞吐作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間、高爾基體各囊膜之間的物質(zhì)運(yùn)輸過程，以及高爾基體形成溶酶體的過程都是由各類運(yùn)輸小泡介導(dǎo)的。運(yùn)輸小泡以出芽的方式從供體膜上產(chǎn)生，然后通過與特定受體膜的融合，將小泡中包含的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到另一細(xì)胞器中或者實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交流。
一類低分子量的GTP/GDP結(jié)合蛋白Ypt/Rab蛋白在調(diào)節(jié)膜泡運(yùn)輸過程中起著重要的作用。Ypt/Rab蛋白和Ras蛋白同屬于GTP/GDP結(jié)合蛋白超家族。它們在蛋白結(jié)構(gòu)上存在四個(gè)與GTP/GDP結(jié)合作用相關(guān)的保守區(qū)域GXXXXGKS/T，DTAGQE，NKXD和SAK/L(Pai EF，et al.Nature 1989，341(6239)209-214)。
在釀酒酵母(S.cerevisiae)中的Ypt/Rab家族成員共有11個(gè)(Ypt1，Sec4，Ypt31，Ypt32，Ypt51，Ypt52，Ypt53，Ypt6，Ypt7，Ypt10，Ypt11)(Lazar T.et al.TrendsBiochem Sci 1997；22(12)468-472)；在哺乳動物中，已發(fā)現(xiàn)的Rab蛋白約有40個(gè)，如Rab1，Rab3，Rab8，Rab10，Rab30等。1993年，Olkkonen，V.m.等首先報(bào)導(dǎo)，采用PCR的方法從小鼠腎臟組織中分離到了一系列未知Rab基因的片段，以這些核酸片段為探針篩選MDCK II cDNA文庫得到了幾個(gè)新的Rab基因，包括Rab12、Rab22、Rab24(Olkkonen，V.M.，et al.J.Cell Sci.，1993，106，1249-1261)。其中，Rab24蛋白與先前報(bào)導(dǎo)的犬Rab5a具有48.8％的同一性，與人Rab5有48.4％同一性，與人Rab5a有48.1％的同一性。
Ypt/Rab蛋白家族成員的多樣性提示不同的蛋白可能在不同的膜泡運(yùn)輸途徑的不同步驟中發(fā)揮作用。例如，Sec4蛋白參與了高爾基體分泌小泡向質(zhì)膜的運(yùn)輸過程(Salminen A.和Novick P.J.，Cell 1987；49(4)527-538)，而Rab8被證明介導(dǎo)了極化的MDCK細(xì)胞中由TGN區(qū)向基底外側(cè)區(qū)的膜泡運(yùn)輸(Huber LA，et al.JCell Biol 1993；123(1)35-45)。Rab1與從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體順式面及隨后的從高爾基體順式面到中間高爾基體的囊泡運(yùn)輸有關(guān)(J.Cell.Biol.1991，115，31-43)Rab3A可能在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87，1988-1992)。而Rab4和Rab5則參與了核內(nèi)體的融合過程，并被認(rèn)為控制了內(nèi)吞過程的限制性步驟(Cell，1990，62，317-329；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；Cell，1992，70，729-740；Cell，1991，64，915-925；Cell，1992，70，715-728)。
Rab蛋白在介導(dǎo)膜泡運(yùn)輸過程中還涉及到其它因子如GDP解離抑制因子(GDP-dissociation inhibitor，GDI)，GTP/GDP交換因子(GTP/GDP-exchangefactor，GEF)，GTP酶活化因子(GTPase-activating protein，GAP)，GDI置換因子(GDI-displacement factor，GDF)的共同作用。
在介導(dǎo)膜泡運(yùn)輸中Rab蛋白的循環(huán)過程如下(a)在細(xì)胞質(zhì)中，GDI與Rab-GDP結(jié)合，抑制了Rab蛋白非選擇性地與膜結(jié)合。(b)Rab-GDP在牻牛兒基牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶(geranylgeranyltransferase，簡稱為“GGTase”)的作用下，使Rab蛋白C末端兩個(gè)半胱氨酸的異戊二烯化。異戊二烯化是Rab與質(zhì)膜結(jié)合所必需的。GGTase包含兩個(gè)組分組分A又稱Rab護(hù)衛(wèi)蛋白(Rab escort protein，REP)，此蛋白與未異戊二烯化的Rab蛋白結(jié)合并將其呈遞給催化組分B，催化組分B負(fù)責(zé)催化半胱氨酸的異戊二烯化。異戊二烯化的Rab蛋白在GIP作用下定位于特定的供體膜上(Andres DA，et al.Cell 1993；73(6)1091-1099)。當(dāng)Rab-GDP結(jié)合于供體膜上時(shí)，GDI在GDF作用下從Rab上解離下來。(c)在GEF催化作用下，GTP替換下了Rab上的GDP從而活化了Rab。(d)運(yùn)輸小泡以出芽方式從供體膜上產(chǎn)生。(e)在GTP-Rab的介導(dǎo)下(或者還有受體膜上的效應(yīng)分子的共同作用下)，運(yùn)輸小泡與受體膜結(jié)合，GTP在GAP催化下發(fā)生水解。(f)GDI與受體膜上的Rab結(jié)合，將Rab重新釋放到細(xì)胞質(zhì)中。(Novick，P.and Zerial M，Curr Opin Cell Biol1997，9(4)496-504)此外，Rab家族與某些疾病存在一定的相關(guān)性。例如，1993年Culine S.等報(bào)道，在Sezary綜合征病人的外周血單核細(xì)胞中Rab2表現(xiàn)為過度表達(dá)，這提示Rab2可能在腫瘤發(fā)生的免疫反應(yīng)中發(fā)生作用(Dummer R，et al.，Leuk Lymphoma1998；28(5-6)515-522)。Sezary綜合征是一類皮膚T細(xì)胞淋巴瘤疾病，癥狀表現(xiàn)為分化完全的TH記憶細(xì)胞在皮膚組織和血液、淋巴結(jié)中的積累(Culine，S.，et al.，Cancer Res 1992；52(11)3083-3088)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼Rab/Ypt家族的一個(gè)新成員，本發(fā)明的Rab/Ypt家族成員被命名為人Rab24。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人的Rab/Ypt家族成員，該蛋白被命名為人Rab24蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的Rab24多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的Rab核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人Rab24蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼—多肽，該多肽具有SEQ ID NO.5所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人Rab24蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.5氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.5序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人Rab24蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人Rab24蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人Rab24蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人Rab24蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人Rab24蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人Rab24蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為789個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.4，其中開放讀框位于72-611位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人Rab24蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人RAB24蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4中72-611位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.4序列的編碼框72-611位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.4中72-611位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.5所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人Rab24相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.5序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人Rab24蛋白或多肽”指具有人Rab24蛋白活性的SEQID NO.5序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人高效淋巴細(xì)胞趨化因子相同功能的、SEQ ID NO.5序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人Rab24蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人Rab24 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Rab24多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人Rab24多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人Rab24多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Rab24多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人Rab24蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Rab24多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人Rab24保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
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本發(fā)明還包括人Rab24多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人Rab24的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核酸分子，該分子通常具有人Rab24多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人Rab24的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人Rab24核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人Rab24多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人Rab24 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人Rab24基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Rab24基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人Rab24蛋白的分子，也包括那些并不影響人Rab24蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人Rab24基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人Rab24基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人Rab24或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人Rab24功能的抗體以及不影響人Rab24功能的抗體，本發(fā)明的各類抗體可以利用人Rab24基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Rab24基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人Rab24核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人Rab24的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腎臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用如下所示寡核苷酸為引物——A15’-CGCTGTCTGG AGTCGTAGGT T-3′和A25’-CCGAGCGGAG ATCGGGGTTT GC-3為正向引物，寡核苷酸B5′-TGAGGACCTG GGGTAGCTCA GAC-3’為反向引物。先以A1B引物對進(jìn)行PCR，以其PCR產(chǎn)物為模版，再用A2B引物對進(jìn)行PCR。對A2B引物對的PCR產(chǎn)物測序后得到SEQ ID NO.4的全長cDNA序列。
Rab/Ypt家族調(diào)控了真核細(xì)胞內(nèi)的膜泡運(yùn)輸。Rab/Ypt家族成員的多樣性提示不同成員在膜泡運(yùn)輸?shù)牟煌緩讲煌襟E中發(fā)揮作用。小鼠Rab24蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的交界區(qū)域以及晚期內(nèi)體的結(jié)構(gòu)內(nèi)，提示小鼠Rab24可能在由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體順式面到晚期內(nèi)體區(qū)的傳輸路徑中發(fā)揮作用。(J.Cell Sci.，1993，106，1249-1261)。另外，小鼠Rab24基因已被定位于第十三號染色體，其座位與pcd(purkinje cell degeneration)突變的座位相符合(Genomics，1995，30，439-444)。pcd是一小鼠常染色體的隱性突變，它能造成幾乎所有的小腦蒲肯野氏細(xì)胞(Purkinje cell)在小鼠出生后的三到四周死亡。比較正常細(xì)胞和pcd突變細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)pcd突變細(xì)胞顯示出核外周多核糖核蛋白體的異常積累以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常構(gòu)型(J.Comp.Neurol.，1978，177(1)，125-143)。Rab24被認(rèn)為是pcd的一個(gè)候選基因。
本發(fā)明所提供的新的Rab24同源基因，為進(jìn)一步研究Rab24在生物體內(nèi)的功能以及由該類基因引起的疾病，進(jìn)而為將來的疾病治療提供了新的前景。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人Rab24(RAB24P)與小鼠Rab24蛋白(MRAB24P)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人Rab24的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人腎臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用三種對寡核苷酸為引物——A15’-CGCTGTCTGG AGTCGTAGGT T-3(SEQ ID NO1)和A25’-CCGAGCGGAG ATCGGGGTTT GC-3’(SEQ ID NO2)為正向引物，寡核苷酸B5’TGAGGACCTG GGGTAGCTCA GAC-3’(SEQ ID NO3)為反向引物，先以A1B引物對進(jìn)行PCR，以其PCR產(chǎn)物為模板，再用A2B引物對進(jìn)行PCR。A1B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分；A2B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘電泳檢測得到約800堿基對的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑦@段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A2/B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共789bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO4，其中開放讀框位于72-611位核苷酸。
根據(jù)得到的全長基因組序列推導(dǎo)出人Rab24的氨基酸序列，共179個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO5。
實(shí)施例2同源比較將本發(fā)明的人Rab24的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Rab/Ypt家族基因及其編碼蛋白具有廣泛的同源性，用PCGENE軟件比較，發(fā)現(xiàn)它與小鼠Rab24基因在蛋白水平上的同一性高達(dá)74.3％，相似性為78.8％(圖1)，尤其是它們N端的約130個(gè)氨基酸幾乎完全一致。另外，與其它物種的Rab基因/蛋白也具有較高同源性。氨基酸保守區(qū)分析表明本發(fā)明的人Rab24在蛋白結(jié)構(gòu)上存在一個(gè)與GTP/GDP結(jié)合作用相關(guān)的保守區(qū)域GXXXXGKS(本發(fā)明中為14GKEYVGKT)。另外，本發(fā)明的蛋白序列的第45位及第102位的苯丙氨酸和色氨酸是Rab家族中高度保守、并且在其它Ras家族成員中不具備的氨基酸(Yu，H.et al. Gene，1993，132，273-278)。綜上所述，本發(fā)明的人Rab24基因是小鼠Rab24基因在人體中的同系物，被認(rèn)為構(gòu)成Rab/Ypt個(gè)家族的一個(gè)成員，所以可以從本家族成員的基因或蛋白，特別是小鼠的Rab24的來推測本發(fā)明的人類Rab24的功能，然而，本發(fā)明蛋白的C末端與其它Rab家族成員顯示了較大的差異性，這表明它還可能具有一些獨(dú)特的性質(zhì)。
Ypt/Rab蛋白家族成員的多樣性提示，不同的蛋白可能在不同的膜泡運(yùn)輸途徑的不同步驟中發(fā)揮作用。例如研究表明，Sec4蛋白參與了高爾基體分泌小泡向質(zhì)膜的運(yùn)輸過程(Salminen，A.，et al.，Cell 1987；49(4)527-538)，而Rab8被證明介導(dǎo)了極化的MDCK細(xì)胞中由TGN區(qū)向基底外側(cè)區(qū)的膜泡運(yùn)輸(Huber，L.A.，etal.J Cell Biol 1993；123(1)35-45)。Rab1與從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體順式面及隨后的從高爾基體順式面到中間高爾基體的囊泡運(yùn)輸有關(guān)(J.Cell.Biol.1991，115，31-43)Rab3A可能在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87，1988-1992)。而Rab4和Rab5則參與了核內(nèi)體的融合過程，并被認(rèn)為控制了內(nèi)吞過程的限制性步驟(Cell，1990，62，317-329；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；Cell，1992，70，729-740；Cell，1991，64，915-925；Cell，1992，70，715-728)。
對小鼠Rab24的表達(dá)譜分析表明，該基因表達(dá)于所有被檢測的組織(腎臟、肝臟、胰臟、腦、肺、脾、心臟等)中。進(jìn)一步用共焦免疫熒光雙標(biāo)記法(confocalimmunofluorescence double labelling experiment)和免疫熒光顯微術(shù)(immunolofluorescece microscopy)對Rab24在各種細(xì)胞(BHK、HeLa、MDCK和NMuLi)中分布情況的分析表明，該蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的交界區(qū)域以及晚期內(nèi)體的結(jié)構(gòu)內(nèi)。Rab24在細(xì)胞中的這一分布特點(diǎn)提示可能存在著一條由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體順式面到晚期內(nèi)體區(qū)的傳輸路徑。這一路徑的功能很可能與自體吞噬過程有關(guān)。在該過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)被導(dǎo)入降解途徑(Olkkonen，A.M.，J.Cell Sci.，1993，106，1249-1261)。
小鼠Rab24基因已被定位于第十三號染色體，經(jīng)比較，它的座位與pcd(purkinje cell degeneration)突變的座位相符合(Maria D.F.S.Barbosa，et al.Genomics，1995，30，439-444)。pcd是一小鼠常染色體的隱性突變，它能造成幾乎所有的小腦蒲肯野氏細(xì)胞(Purkinje cell)在小鼠出生后的三到四周死亡。比較正常細(xì)胞和pcd突變細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)pcd細(xì)胞顯示出核外周多核糖核蛋白體的異常積累以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常構(gòu)型(Landis，S.C.，et al.，J.Comp.Neurol.，1978，177(1)，125-143)。小鼠Rab24被認(rèn)為是pcd的一個(gè)候選基因。
本發(fā)明提供了一個(gè)新的Rab24的同源基因，該基因的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究Rab24在生物體內(nèi)的功能以及由該類基因引起的疾病，進(jìn)而為將來的疾病治療提供了新的前景。
本發(fā)明的人Rab24除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人Rab24還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人Rab24蛋白的C端與小鼠Rab24的C端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人Rab24的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員如小鼠Rab24蛋白)。
此外，本發(fā)明人Rab24核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人Rab24的表達(dá)水平或者抑制人Rab24的過度表達(dá)。本發(fā)明的人Rab24蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人Rab24缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人Rab24在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A2/B為模版，將編碼人Rab24的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人Rab24 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCC ATGAGCGGG CAGCGCGTGG-3′(SEQ ID NO.6)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人Rab24編碼序列的19個(gè)核苷酸；
3′端引物序列為5’-AAGGAAGCTT TCACCTGGAA GGCAGCCAC-3’(SEQ ID NO.7)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人Rab24的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人Rab24的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人Rab24。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人Rab24。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約20KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.5的序列一致。
實(shí)施例4人Rab24在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A2/B為模版，將編碼人Rab24的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人Rab24 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTT ATGAGCGGGC AGCGCGTGG-3′(SEQ ID NO.8)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人Rab24編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-AAGGGGATCC TCACCTGGAA GGCAGCCAC-3’(SEQ ID NO.9)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人Rab24的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動子、一個(gè)病毒啟動子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動子、一個(gè)SV40啟動子、一個(gè)SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI和HindIII消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用ApaI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗(yàn)證人Rab24的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為20KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.5的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人Rab24基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白特異性地發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱一種新的人蛋白質(zhì)及其編碼序列，及制法和用途(iii)序列數(shù)目9(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CGCTGTCTGG AGTCGTAGGT T 21(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.2CCGAGCGGAG ATCGGGGTTT GC22(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3TGAGGACCTG GGGTAGCTCA GAC 23(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度789bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(B)位置23(D)其他信息/注意點(diǎn)＝“N＝A，T，C或G”(ix)特征(B)位置46(D)其他信息/注意點(diǎn)＝“N＝A，T，C或G”(xi)序列描述SEQ ID NO.4CCGAGCGGAG ATCGGGGTTT GCNTCCCGTC CCCGCTCAGG ACCCTNACGT GGCTGAAGCG 60GCCCCGGGAG CATGAGCGGG CAGCGCGTGG ACGTCAAGGT GGTGATGCTG GGCAAGGAGT 120ACGTGGGCAA GACTAGCCTG GTGGAGCGCT ACGTGCACGA CCGCTTTCTG GTGGGGCCTT 180ATCAGAACAC CATCGGGGCC GCCTTCGTGG CCAAGGTGAT GTCGGTCGGA GACGCACTTG 240TGACATTAGG TATTTGGGAC ACAGCAGGCT CTGAGCGCTA TGAGGCCATG AGTAGAATCT 300ACTATCGGGG TGCCAAGGCT GCCATCGTCT GCTATGACCT CACAGACAGC AGCAGCTTTG 360AGCGAGCAAA GTTCTGGGTG AAGGAACTGC GCACCTTAGA GGAGGGCTGC CAAATCTACT 420TATGTGGCAC CAAGAGTGAC CTGCTGGAAG AAGACCGGAG CGTCGACGTG TGGACTTCCA 480CGACGTCCAG GACTATGCAG ACAATATCAA AGCTCAGCTC TTTGAAACAT CCAGCAAGAC 540AGGCCAGAGT GTGGACGAGC TCTTCCAGAA AGTGGCAGAG GATTACGTCA GTGTGGCTGC 600CTTCCAGGTG ATGACAGAGG ACAAGGGCGT GGATCTGGGC CAGAAGCCAA ACCCCTACTT 660CTACAGCTGT TGTCATCACT GAGTCAGCAC TCACCTGGCC TGGGGGAATT AAAGGAATTC 720CCCGTAAGGC TGGACCCAGC TCCTTTCTGG GCTTGGGTAG TCAAATGTCT GAGCTACCCC 780AGGTCCTCA 789(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度179個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.5Met Ser Gly Gln Arg Val Asp Val Lys Val Val Met Leu Gly Lys 15Glu Tyr Val Gly Lys Thr Ser Leu Val Glu Arg Tyr Val His Asp 30Arg Phe Leu Val Gly Pro Tyr Gln Asn Thr Ile Gly Ala Ala Phe 45Val Ala Lys Val Met Ser Val Gly Asp Ala Leu Val Thr Leu Gly 60Ile Trp Asp Thr Ala Gly Ser Glu Arg Tyr Glu Ala Met Ser Arg 75Ile Tyr Tyr Arg Gly Ala Lys Ala Ala Ile Val Cys Tyr Asp Leu 90Thr Asp Ser Ser Ser Phe Glu Arg Ala Lys Phe Trp Val Lys Glu 105Leu Arg Thr Leu Glu Glu Gly Cys Gln Ile Tyr Leu Cys Gly Thr 120Lys Ser Asp Leu Leu Glu Glu Asp Arg Ser Val Asp Val Trp Thr 135Ser Thr Thr Ser Arg Thr Met Gln Thr Ile Ser Lys Leu Ser Ser 150Leu Lys His Pro Ala Arg Gln Ala Arg Val Trp Thr Ser Ser Ser 165Arg Lys Trp Gln Arg Ile Thr Ser Val Trp Leu Pro Ser Arg 179(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TCAGGGATCC ATGAGCGGG CAGCGCGTGG 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7AAGGAAGCTT TCACCTGGAA GGCAGCCAC 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TCAGAAGCTT ATGAGCGGGC AGCGCGTGG 29(2)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.9AAGGGGATCC TCACCTGGAA GGCAGCCAC 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人Rab24蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.5所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列。
4.一種分離的人Rab24蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.5氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.5序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有人Rab24蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人Rab24蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人Rab24蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人Rab24蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人Rab24蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人Rab24蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.4中從核苷酸72-611位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的人Rab24蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人蛋白基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及人Rab24的cDNA序列,該序列所編碼的蛋白是小鼠Rab24的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K14/47GK1257926SQ98126050
公開日2000年6月28日 申請日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者余龍, 趙勇, 屠強(qiáng), 張宏來, 傅強(qiáng) 申請人:復(fù)旦大學(xué)