專利名稱：與人神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的新基因及其編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種與人類神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的基因，其編碼的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用，后文稱該基因為hMATH-2。
轉(zhuǎn)錄因子是通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達和功能的一類蛋白質(zhì)分子，它可形成同源或異源多聚合物并與位于基因上游的調(diào)控區(qū)域的DNA(如啟動子或增強子等)相結(jié)合來調(diào)控基因的表達。含有Helix-loop-helix(HLH)功能域的轉(zhuǎn)錄因子家族是其中重要的一類。這類蛋白通過位于HLH功能域螺旋區(qū)的疏水性氨基酸殘基之間的相互作用形成異源和同源二聚體。大多數(shù)HLH蛋白在HLH功能域旁邊有一高度堿性的功能域(Basic Region)，在15個氨基酸中約有6個殘基高度保守，該功能域是結(jié)合DNA所必需的。具有basic功能域的HLH轉(zhuǎn)錄因子稱為bHLH轉(zhuǎn)錄因子(蛋白)。BHLH蛋白形成異源或同源二聚體后，basic功能域與靶基因的E-box保守序列(CANNTG)結(jié)合。E-box一般位于發(fā)育相關(guān)基因的啟動子或增強子內(nèi)。近年大量研究表明，bHLH蛋白對于組織特異性的發(fā)育和分化起關(guān)鍵作用(Li L等，Dev Biol 1995 172(1)280-292；Gallell J等，Bioassays 1991 13(10)493-498；Mutoh H等，P.N.A.S.USA 199794(8)3560-3564；Naya FJ等，Genes Dev 1995 9(8)1009-1019)。九十年代以來，從果蠅和哺乳動物中相繼分離和克隆到了多個與神經(jīng)生長發(fā)育和分化相關(guān)的bHLH因子(Kageyama R等，Curr Opin GenetDev 1997 7(5)659-665；Lemercier C等，Dev Biol 1997 182(1)101-113)。小鼠的MATH-2/NEX-1(Shimizu C等，Eur J Biochem 1995229(1)239-248；Batholoma A等，Mech Dev 1994 48(3)217-228；Schwab MH等，J Neurosci 1998 18(4)1408-1418)，Neuro D，Neuro D2和Neuro D3等基因與果蠅的Atonal基因在bHLH區(qū)域有較高的同源性，組成一個bHLH家族(Kawakami H等，Biochem Biophys ResCommun 1996 221(1)199-204；Kume H等，Biochem Biophys ResCommun 1996 219(2)526-530；McCormick MB等，Mol Cell Biol 199616(10)5792-5800；Lee JE等，Dev Biol 1997 182(1)101-113)。人的Neuro D1，Neuro D2，Neuro D3基因也已有報道(Yokoyama M等，Brain Res Mol Brain Res 1996 42(1)135-139；Acharya HR等，BiochemBiophys Res Commun 1997 233(2)456463)。
90年代初，人們已獲知HLH因子是果蠅神經(jīng)發(fā)育過程中必需的因子。進入90年代后期，HLH因子愈發(fā)成為發(fā)育學(xué)研究的熱點，在這一領(lǐng)域不斷有新的發(fā)現(xiàn)。1994年，Bartholoma A等人(Mech Dev48(3)217-228)研究發(fā)現(xiàn)果蠅與小鼠的外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育由于某些基因的突變而受到影響，這一現(xiàn)象表明，神經(jīng)元的分化與不同種類bHLH蛋白協(xié)調(diào)表達有關(guān)。他們還從小鼠中獲得一種被稱為NEX-1的bHLH基因，它在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達。并認(rèn)為NEX-1可能在成體的神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的作用。
1995年，Shimizu C.等人(Eur J Biochem 229(1)239-248)發(fā)現(xiàn)，哺乳動物體內(nèi)也存在與果蠅HLH同源的因子。這一發(fā)現(xiàn)為研究哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生機制提供了重要的信息。他們報道了一種小鼠HLH因子的分子特性，這種因子被命名為MATH-2。MATH-2的結(jié)構(gòu)與果蠅的Atonal結(jié)構(gòu)相似。MATH-2基因編碼337個氨基酸殘基，其蛋白產(chǎn)物含有一個與Atonal相似的bHLH功能域，而在這一區(qū)域之外，MATH-2與Atonal兩者的序列無明顯相似性。對小鼠的MATH-2基因研究發(fā)現(xiàn)，MATH-2僅在神經(jīng)系統(tǒng)中有特異性表達，并且在胚胎發(fā)育的不同時期，MATH-2在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達部位和表達量均有變化。這表明MATH-2對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起到重要的作用。
繼Shimizu C.在1995年于小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)MATH-2后，Kawakami H.等人(Kawakami H等1996，文獻同上)又從小鼠胎腦中克隆到另一種bHLH因子----BHF1，這種因子編碼357個氨基酸殘基，與MATH-2/NEX-1在bHLH功能域有著94.6％的同源。隨后，Kume H.等(Kume H等1996，文獻同上)又于1996年2月從小鼠胎腦中克隆到一種bHLH蛋白，這一蛋白由381個氨基酸殘基構(gòu)成，其bHLH功能與MATH-2及NeuroD基因高度同源，這種蛋白僅在神經(jīng)組織中被發(fā)現(xiàn)，進一步表明，bHLH因子在神經(jīng)活動中起很重要的作用。
已知人bHLH蛋白與人類神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。1996年，Yokoyama M.等人(文獻同上)用人的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞構(gòu)建cDNA文庫，進而進行大規(guī)模篩選，鑒定出一些有神經(jīng)元特異性的cDNA，其中一種cDNA編碼的蛋白質(zhì)與小鼠NeuroD相似，并且與之有完全一致的bHLH功能域，因此該蛋白質(zhì)對神經(jīng)組織可能也有一定的作用。但人的這一基因僅在胎兒腦中表達，在成人大腦中尚未發(fā)現(xiàn)有表達的跡象。一年以后，Acharya HR等人(文獻同上)從人體視網(wǎng)膜中克隆到一種神經(jīng)分化基因，NeuroD基因。對人體視網(wǎng)膜進行原位雜交顯示，NeuroD的轉(zhuǎn)錄活性相當(dāng)高，因此，它可能維持不同性能的光感受器的功能方面起到一定的作用。其實，在兩年以前，也就是1995年，Zhu W.等人(Brain Res Mol Brain Res 30(2)312-326；Neuman K等，F(xiàn)EBS Lett 1995 374(2)279-283)已對人bHLH基因有所研究，他們發(fā)現(xiàn)，由一種被稱為Id基因所編碼的HLH蛋白質(zhì)能使bHLH失活，其主要原因可能是由于Id基因沒有與DNA連接的功能域。Zhu M.等人還克隆到兩種與人類Id-1 mRNA相關(guān)的cDNA，其中一種，Id-1a，由958個核苷酸組成，編碼135個氨基酸殘基，這一序列與小鼠Id-1的同源性高于90％。而另一種cDNA，Id-1b，由1145個核苷酸組成，編碼149個氨基酸殘基，他們將這一序列定位于人染色體2p25。
1997年，Tamimi RM.等(Genomics 40(2)355-357)完成了對bHLH基因簇中部分基因定位工作，他們將Neuro D2基因定位于人染色體17q12和小鼠1號染色體，并將Neuro D3基因定位于人染色體5q23-q31和小鼠13號染色體上。對人的腦腫瘤細(xì)胞NeuroD基因簇的各個基因進行Northern印跡和原位雜交分析表明，這些基因在腦腫瘤中均有不同程度的表達，尤其是Neuro D3表達的腦腫瘤往往有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，并且治療效果較差(Rostomily RC等，Cancer Res 199757(16)3526-3531)。不同的腦腫瘤在演變過程中生物學(xué)特性有明顯的差別，神經(jīng)源性的bHLH蛋白的表達差異可能是造成差別的主要原因。人的MATH-2基因在腦腫瘤中可能也有異常表達，因此有必要對人的MATH-2基因進行克隆、測序及深入的研究。
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的與人類的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的多核苷酸，及其編碼的蛋白，以及抗所述蛋白的抗體。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述的多核苷酸、蛋白及抗體在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病特別是腦瘤的藥物及試劑盒中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種新的與人類的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的基因，命名為hMATH-2，以及該基因編碼的蛋白質(zhì)，即hMATH-2蛋白。hMATH-2在核酸水平上，與小鼠的MATH-2/NEX-1基因同源性為93％，屬于HLH轉(zhuǎn)錄基因家族。對人類的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育起關(guān)鍵作用，并與神經(jīng)系統(tǒng)某些惡性腫瘤的發(fā)病有關(guān)。該基因及其編碼的的蛋白質(zhì)可用以治療因該基因異?；蛟摰鞍踪|(zhì)異常而引起的疾病。其多核苷酸片段和抗hMATH-2蛋白的抗體可用于診斷或治療與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。
本發(fā)明的特征是一種分離純化的核酸(多核苷酸)，這種核酸序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的hMATH-2。具體地說，該核酸序列與SEQ ID NO1所示的序列實際上相同。本發(fā)明所說的”實際上相同”是指同源性至少90％，更好95％以上，最好在99％以上。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA，基因組DNA，或人工化學(xué)合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體?！昂啿⒌淖儺愺w”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ IDNO2的蛋白質(zhì)或肽但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
本發(fā)明還包括了分離純化的在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO1雜交的核酸片段。在本發(fā)明中，“核酸片段”的長度至少含10個核苷酸。“雜交”是指與一段特異的核酸序列結(jié)合?！皣?yán)格條件”是指(1)低離子強度和高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。核酸片段可用于根據(jù)核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼hMATH-2的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸的編碼區(qū)序列可以是如SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列的等位基因變異體。已有的技術(shù)已經(jīng)表明，等位基因變異體是多核苷酸中一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入所形成的替換形式。這種替換形式實際上不改變所編碼的蛋白或多肽的功能。
本發(fā)明進一步提供了分離的具有如序列SEQ ID NO2的hMATH-2。
在本發(fā)明中，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存的其他物質(zhì)中分開，則為分離的。
本發(fā)明還包括能特異地與hMATH-2結(jié)合的抗體或抗體片段?？贵w片段有Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2或Fr片段?？贵w可以是單鏈的，人源化的或嵌合的抗體。
本發(fā)明還包括含有SEQ ID NO1的核酸序列或其變異體或其一部分的載體和用該載體進行遺傳工程處理的宿主細(xì)胞，以及用DNA重組技術(shù)獲得的本發(fā)明的蛋白或多肽產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了診斷與hMATH-2功能異常相關(guān)的疾病的方法，包括(但不限于)檢測組織或細(xì)胞中hMATH-2的表達或hMATH-2基因的突變。通過測定組織或細(xì)胞中hMATH-2的mRNA或蛋白的水平可以判斷hMATH-2的表達。
本發(fā)明還提供了治療與hMATH-2功能異常相關(guān)的疾病的方法，包括(但不限于)給予細(xì)胞有效劑量的復(fù)合物以激活或抑制hMATH-2產(chǎn)生或活性。復(fù)合物的種類包括化合物，與hMATH-2結(jié)合的配體、多肽或抗體，反義寡核苷酸，核酶(Ribozyme)等。具體地，本發(fā)明提供了用于診斷和治療腦瘤的試劑盒，所述的試劑盒包括本發(fā)明的多核苷酸或其連續(xù)片段，或者包括抗本發(fā)明的蛋白的抗體。
克隆本發(fā)明的hMATH-2基因的方法是本領(lǐng)域中熟練人員所常用的。一種可行的途徑是利用來源于哺乳動物組織(如胚胎腦或肝或肺等)細(xì)胞的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄方式合成cDNA，并構(gòu)建相應(yīng)的cDNA文庫，再從文庫中獲得含hMATH-2基因的克隆。
提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(J.Sambrook等，1989，分子克隆實驗手冊)。另外還可直接從商業(yè)途徑得到多種組織的cDNA文庫(Clonthech)。
從cDNA文庫中獲得hMATH-2基因包括(但不限于)以下兩種技術(shù)路線一是先篩選文庫含有hMATH-2 DNA的克隆，再對這些陽性克隆進行DNA序列分析；二是先測定文庫中所有克隆的插入DNA片段的5′和3′序列。再找出含有hMATH-2 DNA的克隆，并進行全長cDNA的序列分析。
篩選文庫的方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因的功能出現(xiàn)或喪失；(3)測定hMATH-2的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)或測定生物學(xué)活性檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與hMATH-2 DNA片段的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是20-30個核苷酸，更好是50-60個核苷酸，最好是100個核苷酸以上。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測hMATH-2基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western blots，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)法(ELISA)等。
可用常規(guī)的雙脫氧鏈終止法(Sanger等.PNAS，1977，745463-5467)測定DNA序列，測序所用的引物根據(jù)已知的cDNA序列設(shè)計。
為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復(fù)進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
如果未能獲得完整的5′端編碼序列(這在cDNA克隆中是經(jīng)常遇到的問題)，則需要進行RACE(cDNA末端快速擴增技術(shù))。
一旦獲得全長的cDNA序列，則可用計算機對序列進行分析，如開放閱讀框的位置，可能的信號肽，跨膜結(jié)構(gòu)及其基因或蛋白結(jié)構(gòu)的相似性比較等。
本發(fā)明的hMATH-2多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的hMATH-2蛋白或多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼hMATH-2的DNA片段(或變異體)或含有該DNA片段的重組表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
表達載體的一個重要特征是含有適當(dāng)?shù)膯幼雍头g控制元件。多種表達載體可從商業(yè)途徑得到。常用的載體包括(但不限于)質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，酵母表達載體，病毒，Ti質(zhì)粒等，但最常用的載體首選質(zhì)粒。常用的宿主細(xì)胞包括(但不限于)細(xì)菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，動物細(xì)胞或植物細(xì)胞等，但最常用的宿主細(xì)胞為細(xì)菌，尤其是大腸桿菌。另一個較常用的表達系統(tǒng)是哺乳動物細(xì)胞系，如鼠3T3細(xì)胞，Hela，COS細(xì)胞系或CHO細(xì)胞系等。
可用本領(lǐng)域中熟練人員已知的方法構(gòu)建含hMATH-2編碼序列的重組表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，DNA合成技術(shù)，體內(nèi)重組技術(shù)等(J Sambrook等1989，文獻同上)。
重組的hMATH-2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療hMATH-2功能低下或喪失所致的疾病和用于篩選促進或?qū)筯MATH-2功能的抗體，多肽或其它配體。例如，抗體可用于激活或抑制hMATH-2的功能。用表達的重組hMATH-2蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激hMATH-2功能的多肽分子。
多種方法可用于生產(chǎn)針對hMATH-2抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
抗hMATH-2的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的hMATH-2。與hMATH-2結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與hMATH-2相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷hMATH-2的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如hMATH-2高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅hMATH-2陽性的細(xì)胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用hMATH-2蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
hMATH-2單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison等，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗hMATH-2的單鏈抗體。
能與hMATH-2結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。
hMATH-2多核苷酸可用于hMATH-2相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，hMATH-2多核苷酸可用于檢測hMATH-2的表達或在疾病狀態(tài)下hMATH-2的異常表達。如hMATH-2 DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷hMATH-2的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡分析，Northern印跡分析和原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。另外用hMATH-2特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體外擴增也可檢測hMATH-2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
另外，檢測hMATH-2基因的突變也可用于診斷hMATH-2相關(guān)的疾病。hMATH-2突變的形式包括點突變，易位，缺失，重組和其它與正常野生型hMATH-2 DNA序列相比的任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡分析，DNA序列分析，PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡分析，Western印跡分析可間接判斷基因有無突變。
hMATH-2多核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于hMATH-2的無表達或異常/無活性的hMATH-2的表達所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達變異的hMATH-2，用于抑制內(nèi)源性的hMATH-2活性。例如，一種變異的hMATH-2可以是縮短的、缺失了信號傳導(dǎo)功能域的hMATH-2，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療hMATH-2表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，單純皰疹病毒，細(xì)小病毒等可用于將hMATH-2基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶hMATH-2基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。另外重組hMATH-2基因可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制hMATH-2 mRNA翻譯的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何合成RNA或DNA的技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，寡核苷酸應(yīng)用磷酸硫酯鍵而非磷酸二酯鍵。
多核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
下述實施例是對本發(fā)明的進一步詳細(xì)說明，但不是以此限制本發(fā)明。具體實驗參閱分子克隆實驗指南(J Sambrook等1989)和基因工程實驗技術(shù)(彭秀玲等人，1997，基因工程實驗技術(shù)，科學(xué)技術(shù)出版社)。
實施例1 編碼人MATH-2基因的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNAIsolation Kit從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA.用UniZAPxR載體試劑盒(購自Stratagene)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5細(xì)菌形成cDNA文庫。共獲得約3000個克隆。用雙脫氧法測定陽性克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列經(jīng)處理后通過GCG軟件與Genebank等已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個克隆(A16號)的DNA序列與小鼠NEX-1基因(全長為1957bp)及小鼠MATH-2(全長為1550bp)的同源性達88％。通過進一步合成一系列引物對(A16號)克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機拼接分析表明，(A16號)克隆所含的全長1344bp的cDNA是一個新的DNA序列(如SEQ ID NO1所示)，從第157bp至1170bp有一個1013bp的ORF，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。將此蛋白質(zhì)命名為hMATH-2。
hMATH-2含有337個氨基酸，與鼠MATH-2氨基酸數(shù)相同。蛋白質(zhì)水平的同源性分析表明。人MATH-2與鼠MATH-2相同性為98％，相似性為99％。結(jié)構(gòu)分析表明，其氨基酸序列中具有典型的bHLH(Basic Helix1-Loop-Helix-2)結(jié)構(gòu)。
小鼠MATH-2/NEX-1基因經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)為一與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的HLH基因族中重要的一種，同樣hMATH-2與人的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。
實施例2 人MATH-2在真核細(xì)胞中表達把抗原標(biāo)記物Myc(Turner and Weintraub，Genes&Development，81434-1447；1994).接在人MATH-2蛋白前面在真核細(xì)胞中進行融合表達，在下述實施例4中該重組細(xì)胞則用來測定抗人MATH-2抗體的篩選。質(zhì)粒CS2+MT被用于產(chǎn)生這種Myc與人MATH-2融合蛋白。CS2+MT載體含有猴的巨細(xì)胞病毒IE 94的增強子/啟動子(SP6啟動子位于IE 94驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄物的5′端非翻譯區(qū)，可用來進行體外合成RNA)其后正確地接有編碼6份重復(fù)的Myc抗原表位DNA序列(Roth等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志115587-596，1991；)，用以插入編碼序列多聚酶切接頭，和一個SV40末端Poly A化位點。用Xho I酶作用于編碼Myc序列后的多聚酶接頭，使CS2+MT線性化。線性化的質(zhì)粒用Klenow和dNTPs補平末端。全長人MATH-2 cDNA克隆被XhoI和EcoR I消化，并用Klenow和dNTPs補平末端。分離純化1245Kb的人MATH-2 cDNA片段。人全長MATH-2基因片段和線性化的載體被連接形成質(zhì)粒CS2+MTx1-83。按文獻(Roth等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志115587-596，1991)所述方法轉(zhuǎn)入鼠3T3成纖維細(xì)胞并進行細(xì)胞培養(yǎng)。收集細(xì)胞并抽提質(zhì)粒，對其進行DNA測序，可發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒中已插入1245Kb的人MATH-2 cDNA片段。對細(xì)胞裂解上清走PAGE蛋白電泳結(jié)果有新的蛋白條帶出現(xiàn)。以上步驟均按文獻(彭秀玲，袁漢英，謝毅，王洪海編著，基因工程實驗技術(shù)，湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1997)進行。
實施例3 部分人MATH-2基因在真核細(xì)胞中的表達以上實施例2所述質(zhì)粒CS2+MT被Eco RI消化成線性，該酶切位點在編碼Myc的DNA序列編碼下游的多聚酶接頭內(nèi)。末端用Klenow和dNTPs的補平。然后再用Xho I消化得到一個粘性末端。含有部分人的MATH-2 cDNA質(zhì)粒pCR1(該含有人MATH-2蛋白質(zhì)前50個氨基酸的編碼DNA序列)被Xho I消化，并用Klenow和dNTPs補平，然后用Xba I消化后獲得大約150bp的人MATH-2 cDNA片段。人MATH-2的片段和線性化的載體被連接形成質(zhì)粒CS2+MTx1-83(m7a)。
該質(zhì)粒CS2+MTx1-83(m7a)按實施例2所述方法轉(zhuǎn)入鼠3T3成纖維細(xì)胞并進行表達鑒定，在以下的實驗中可以用來鑒定抗人MATH-2的抗體。
實施例4 抗人MATH-2的抗體的制備麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和人MATH-2蛋白構(gòu)成的融合蛋白用作抗原來誘發(fā)兔子產(chǎn)生抗體。這種抗血清的篩選鑒別可通過上一實施例2構(gòu)建的重組鼠3T3細(xì)胞的免疫染色實驗來實現(xiàn)。在實驗中，加入抗Myc單抗，兔抗MATH-2抗血清以及與之結(jié)合的抗兔IgG抗體，就可以觀察到重組鼠3T3細(xì)胞的雙重免疫染色結(jié)果。通過這一實驗鑒定出兔抗人MATH-2抗體，進一步實驗可確定人MATH-2蛋白中與該抗血清作用區(qū)域。具體實驗方法是構(gòu)建含人MATH-2蛋白不同部分的重組鼠3T3細(xì)胞系列來進行以上雙重免疫單色實驗，然后比較分析最終可確定出與兔抗MATH-2抗體作用的人的MATH-2蛋白中的具體氨基酸區(qū)域。
實施例5 抗hMATH-2抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE-ABI)合成hMATH-2下述特異性的多肽NH2-Leu-Thr-Leu-Pro-Phe-Asp-Glu-Ser-Val-Val-Met-Pro-COOH。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復(fù)合物(薩姆布魯克，E.F.弗里克，T.曼尼阿蒂斯著，金冬燕，梨孟楓等譯，分子克隆實驗指南?？茖W(xué)出版社，1993)。用4mg上述血藍蛋白多肽復(fù)合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復(fù)合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用牛血清白蛋白多肽復(fù)合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗菌素體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與hMATH-2結(jié)合。序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1344bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述1 GACTTTTTAG AGATCAATGA GATAGTGCAG ATATACACAG ATCTAGAGAC51 TCCAGGAGAC GATGCGACAC TCAGCCTGAA AAGATTTGGA AGACCCAAAA101 TGAAAACTGA TTATTGAATG AAATTAAAAC CTAAGGTAAT TTAAGATTAG151 AGAACCATGT TAACACTACC GTTTGATGAG TCTGTTGTAA TGCCAGAATC201 CCAGATGTGC AGAAAGTTTT CTAGAGAATG CGAGGACCAG AAGCAGATTA251 AGAAGCCAGA AAGCTTTTCC AAACAGATTG TCCTTCGAGG AAAGAGCATC301 AAAAGGGCCC CTGGAGAAGA AACCGAGAAA GAAGAAGAGG AGGAAGACAG351 GGAAGAGGAA GATGAAAATG GGTTGCCTAG AAGGAGGGGT CTTAGGAAAA401 AAAAGACAAC AAAGCTGCGA TTGGAAAGGG TCAAGTTCAG GAGACAGGAA451 GCGAACGCGC GCGAGAGGAA CAGGATGCAC GGCCTCAACG ACGCTCTGGA501 CAACTTAAGA AAAGTGGTCC CCTGTTATTC TAAAACCCAG AAACTGTCCA551 AAATAGAGAC TTTACGACTG GCCAAAAACT ACATCTGGGC ACTTTCTGAA601 ATTCTGAGAA TCGGCAAGAG ACCAGATCTG CTCACATTCG TCCAAAACTT651 ATGCAAAGGT CTTTCCCAGC CAACTACAAA CTTGGTGGCA GGCTGCTTGC701 AGCTCAACGC CAGGAGTTTC CTGATGGGTC AGGGTGGGGA GGCTGCACAC
751 CACACAAGGT CACCCTACTC TACCTTCTAC CCACCCTACC ACAGCCCTGA801 GCTCACCACT CCCCCAGGGC ATGGGACTCT TGATAATTCC AAGTCCATGA851 AACCCTACAA TTATTGCAGT GCGTATGAAT CCTTCTATGA AAGTACTTCC901 CCTGAGTGTG CCAGCCCTCA GTTTGAAGGT CCCTTAAGTC CTCCCCCAAT951 TAACTATAAT GGGATATTTT CCCTGAAGCA AGAAGAAACC TTGGACTATG1001 GTAAAAATTA CAATTACGGC ATGCATTACT GTGCAGTGCC ACCCAGGGGT1051 CCCCTTGGGC AGGGTGCCAT GTTCAGGTTG CCCACCGACA GCCACTTCCC1101 TTACGACTTA CATCTGCGCA GCCAATCTCT CACAATGCAA GATGAATTAA1151 ATGCAGTTTT TCATAATTAA TGAGGAAAAT GAAAATAAAC AGTGGTCATT1201 CACCTCCCCT GTCTAATTAA GACAAAGCAG ATGCTTGTGG GCTGAGTAAT1251 TGGCACAACT CTATCTAAGG TGTTTACTAG TTTCTGCAGT GTGTTTCAAC1301 TATTGTGAGA ATTTTCTATG TAATAATAAA TCTCTTTTCG TATG(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度337個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述1 MLTLPFDESV VMPESQMCRK FSRECEDQKQ IKKPESFSKQ IVLRGKSIKR51 APGEETEKEE EEEDREEEDE NGLPRRRGLR KKKTTKLRLE RVKFRRQEAN101 ARERNRMHGL NDALDNLRKV VPCYSKTOKL SKIETLRLAK NYIWALSEIL
151 RIGKRPDLLT FVQNLCKGLS QPTTNLVAGC LQLNARSFLM GQGGEAAHHT201 RSPYSTFYPP YHSPELTTPP GHGTLDNSKS MKPYNYCSAY ESFYESTSPE251 CASPQFEGPL SPPPINYNGI FSLKQEETLD YGKNYNYGMH YCAVPPRGPL301 GQGAMFRLPT DSHFPYDLHL RSQSLTMQDE LNAVFHN
權(quán)利要求
1.一種分離出的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1所示的編碼序列，或者與SEQ ID NO1中的157-1170位核苷酸序列至少有70％同源性的序列，或者在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1所示序列雜交的序列，所述的嚴(yán)格條件為(1)低離子強度和高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。
2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
3.含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸的載體。
4.用權(quán)利要求3的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其為選自鼠3T3細(xì)胞、COS-7、CHO、Hela細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞。
7.一種多肽，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
8.抗權(quán)利要求7的多肽的抗體。
9.生產(chǎn)多肽的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4-6任一項所述的宿主細(xì)胞，使之表達所述多肽。
10.權(quán)利要求7的多肽在制備治療由該多肽異常引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求1的多核苷酸在制備治療由該基因異常引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
12.一種用于診斷和治療腦瘤的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1或2的多核苷酸或其連續(xù)片段。
13.一種用于診斷和治療腦瘤的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求8的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與人類神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的基因,其編碼的蛋白質(zhì)及其在診斷和治療由該基因或蛋白異常引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病特別是腦瘤中的應(yīng)用,該基因被稱為hMATH－2。
文檔編號C07K14/48GK1256315SQ9812336
公開日2000年6月14日 申請日期1998年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月10日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海生元基因開發(fā)有限公司