專利名稱：：使用加工酶的嵌合蛋白質的切斷方法
技術領域：
：本發(fā)明是關于在生產生理活性肽或其前體時，成為底物的嵌合蛋白質及其生產方法，本發(fā)明進而是關于使該生理活性肽從該嵌合蛋白質中游離、精制的方法。正在利用嵌合蛋白質表達法嘗試許多的肽生產方法。作為目的肽的游離方法，正在使用利用化學的或酶的切斷。作為酶有特異地切斷賴氨酸殘基的C末端側的肽鍵的賴酰胺肽鏈內切酶(無色桿菌蛋白酶I)、特異地切斷谷氨酸殘基的C末端側的葡萄球菌蛋白酶V8等。作為化學方法有亞硝酸引起天冬氨酸殘基開裂、CNBr引起甲硫氨酸殘基開裂等?；瘜W方法不能避免目的肽的修飾，在切斷后的目的肽的精制中，必須從各種類似物中進行目的肽的精制。而酶切斷方法特異性高、也可在較溫和的條件下進行切斷，因此目的肽的精制是容易的，但是是否可能利用這些酶，要依賴于目的肽的氨基酸序列。因此存在不能選擇現(xiàn)有蛋白酶，而尋求通用性高的切斷酶。在生物體內生成肽激素及其前體時，用酶(加工酶)特異地切斷該肽的前體多肽。在這種酶中已經(jīng)知道前體轉變酶1/3(PC1/3)、前體轉變酶2(PC2)、フリン(furin)等，在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的α-因子(α-matingfactor)生成時發(fā)揮功能的Kex2蛋白酶也是其中一種。在從嵌合蛋白質中切出目的肽時如果直接使用這些加工酶，能不損害肽激素，而且能夠適用于各種各樣肽，正期待像這樣的生產方法。本發(fā)明人已報導過以來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的多肽作為保護肽，選擇合適的接頭肽，在大腸桿菌體內以不溶性包涵體生產與目的肽嵌合的蛋白質的方法(特開平5-328992)。該嵌合蛋白質用尿素等變性劑溶解，成為加工酶的底物。另一方面，本發(fā)明人等已報導過通過變化其基因、作為可溶性酶(分泌型Kex2衍生物)生產來自膜結合型酶的啤酒糖酵母的Kex2蛋白酶的方法(“分泌型Kex2衍生物的制造方法”為題的平成8年3月4日申請的說明書)。但是，在以該酶作為加工酶使用時，未涉及關于成為其底物的嵌合蛋白質的設計。因此，正期待開發(fā)在大量培養(yǎng)下、在大腸桿菌體內作為包涵體能效率良好地生產、在加工酶有效地作用條件下能容易溶化的嵌合蛋白質的設計、生產方法，進而期待開發(fā)利用加工酶從嵌合蛋白質中有效地切斷目的肽那樣地設計、生產切斷部位附近的氨基酸序列的方法。另外，同時也期待開發(fā)以高回收率將像上述那樣生產的生理活性肽精制至99％以上的純度的通用性的高精制方法。因此，本發(fā)明想要提供在使用如分泌型Kex2衍生物的加工酶、生產生理活性肽時成為底物的嵌合蛋白質的設計、生產方法及該肽的精制方法。本發(fā)明人等研究了解決上述課題的方法，結果初次清楚以下事實，從而完成了本發(fā)明。即1)在嵌合蛋白質中插入富有His的序列，例如含有{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)的接頭肽，與產量增加和在如分泌型Kex2衍生物的加工酶反應條件下的溶解性提高有關的事實，2)以接頭內的加工酶作用部位的氨基酸序列作為X1-X2-(Lys/Arg)-Arg，希望作為X1選擇Lys、Arg或His，作為X2選擇His或Phe，是反應性高的底物條件的事實，進而3)反應后，使反應液的pH變成弱酸性，再進行稀釋，使變性劑的濃度降低，使目的肽以外的成分的大部沉淀，通過離心分離或壓濾，在上清液中能夠回收95％以上的目的肽，然后例如單獨或者最好組合使用陽離子交換色譜法、低壓反相色譜法、反相HPLC等能夠高純度且高回收率地精制目的肽的事實。因此本發(fā)明提供以下式表示的嵌合蛋白質，A-L-B(式中，A是保護肽；B是目的肽；而L是接頭肽，在其C末端具有序列X1-X2-(Lys或Arg)-Arg(式中，X1和X2是任意的氨基酸)，而在N末端具有富有His的部分。]作為在上述N末端富有His的部分，序列[(His)4-Pro-Gly]n(式中，n是1-6)是理想的，并且X1是Arg、Lys或者His，而且X2是His或者Phe為佳。進而，在上述N末端部分的氨基酸序列和上述C末端部分的氨基酸序列之間也可以存在1-5個任意的氨基酸。本發(fā)明還提供以下述為特征的方法，即在上述的嵌合蛋白質的制造方法中，用含有編碼該嵌合蛋質的DNA的表達載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)得到的轉化體，從該培養(yǎng)物中提取上述嵌合蛋白質。本發(fā)明又提供以下述為特征的方法，即在上述目的肽(B)的制造方法中，使加工酶作用于上述的嵌合蛋白質，而切斷接頭肽(L)的C末端和目的肽(B)的N末端之間的肽鍵，得到目的肽(B)。上述的方法，在優(yōu)選的方式中，用能夠表達編碼嵌合蛋白質的基因的載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)得到的轉化體，再破碎該轉化體，得到包涵體的不溶性級分，用可溶化劑處理該不溶性級分，使包涵體中的嵌合蛋白質溶化，用如分泌型Kex2衍生物的加工酶切斷該溶化的嵌合蛋白質的上述接頭氨基酸殘基的C末端和上述目的肽的N末端之間的肽鍵，從而切出該目的肽，通過沉淀處理、陽離子交換色譜法、低壓反相色譜法和反相HPC精制該目的肽。對附圖的簡要說明圖1表示在合成hProPTH(1-84)基因制作中使用的合成低聚物的序列。圖2表示合成hProPTH(1-84)基因的制作方法。圖3是表示質粒pG210S(S/X)的制作方法的圖。Plac表示大腸桿菌的乳糖操縱子的啟動子，Ttrp表示大腸桿菌的TrPE的減弱終止區(qū)。圖4表示表達嵌合蛋白質βGal-139S(FM)PPH84的質粒pGP#139的制作方法。圖5表示表達嵌合蛋白質βGal-139S(FM)PPH84的質粒pGP#19PP34的制作方法。圖6是表示表達嵌合蛋白質βGal-117SPPH34和βGal-117SnHPP34的質粒pG117SPPH34和pG117SnHPPH34的制作方法的前半部分的圖(n＝1-6)。使引物S05轉變成S04制成pG97SPPH34和pG97SnHPPH34，使引物S05轉變成S06，制成pG139SPPH34和pG139SnHPPH34。圖7是表示表達嵌合蛋白質βGal-117SPPH34和βGal-117SnHPP34的質粒pG117SPPH34和pG117SnHPPH34的制作方法的后半部分的圖(n＝1-6)。使引物S05轉變成S04制成pG97SPPH34和pG97SnHPPH34，使引物S05轉變成S06，制成pG139SPPH34和pG139SnHPPH34。圖8是表示調查聚組氨酸接頭{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)對嵌合蛋白質產量影響的SDS-PAGE的結果的圖。圖中4H表示組氨酸殘基是4個即n＝1。圖9是表示聚組氨酸接頭[(His)4-Pro-Gly]n(n＝1-6)對由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影響的圖。橫軸表示以βGal-117SPPH34的Kcat值作為1時的相對值。圖10是表示Kex2蛋白酶的識別部位P3的氨基酸對由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影響的圖。P4的氨基酸固定在纈氨酸殘基上，取代P3部位的氨基酸。橫軸表示以βGal-117S4HVKPH34的Kcat值作為1時的相對值。圖11是表示Kex2蛋白酶的識別部位P4的氨基酸對由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影響的圖。P3的氨基酸固定在組氨酸殘基上，取代P4部位的氨基酸。橫軸表示以βGal-117S4HVKPH34的Kcat值作為1時的相對值。圖12是表示βGal-117KS4HRHPH34基因的表達載體pGKSPH34的結構的示意圖。βGal-117ks是βGal-117S的14位的精氨酸殘基被賴氨酸殘基取代的肽。圖13是表示質粒pG210ShCT(G)的制作方法的圖。圖14表示HGLP-1(7-37)基因(DNA(1))制作用的合成低聚核苷酸的堿基序列，及以pGKSPH34作為模板用的引物的堿基序列。圖15表示質粒pG117S4HGP的制作過程。圖16表示hGLP-1的精制的分布圖，A表示Kex2反應后的結果，B表示酸性沉淀上清液的結果，C表示陽離子交換柱后的結果，D表示低壓逆相柱后的結果。峰1表示hGLP-1(7-37)，峰2表示hGLP-1，峰3表示保護肽，峰4表示嵌合蛋白質。根據(jù)本發(fā)明的方法，用加工酶切斷由上述保護肽、接頭的生理活性肽(目的肽)組成的嵌合蛋白質，能夠制造生理活性肽。作為像這樣的肽，可舉出人副甲狀腺激素(hPTH(1-84)及其衍生物(hPTH(1-34)、hPTH(1-34)、zhPTH(1-38))、人副甲狀腺激素的其他衍生物(hPTH(1-31)Gly、hPTH(1-34)Gly、hPTH(1-37)Gly、hPTH(1-38)Gly、hPTH(3-84)、hPTH(3-34)、hPTH(3-37)、hPTH(3-38))、細胞增殖因子、降鈣素及其前體、胰高血糖素樣的蛋白質1(Glucagon-likepeptide1GLIP-1)及其衍生物(GLIP-1(1-37)GLIP-1(7-37)、GLIP-1(7-36)NH3等)，但并不限于這些。另外，作為加工酶，可以使用Kex2蛋白酶、フリン(Furin)、前體轉變酶1(PC1)或前體轉變酶2(PC2)或者它們的衍生物等，但并不限于這些。在本發(fā)明中，特別是除去Kex2酶的C末端而得到的分泌型Kex2衍生物是優(yōu)先選擇的。在本發(fā)明中的保護肽，其大小是220個氨基酸以下的肽為佳。例如由從大腸桿菌β半乳糖苷酶的N末端的1位至90-210個氨基酸組成的肽為佳。更好是從大腸桿菌β半乳糖苷酶的N末端的1位至97位、117位或139位組成的肽。并且更好是這些肽的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代，最好是14位的纈氨酸殘基被賴氨酸殘基取代。另外，在保護肽中，最好含有通過加工酶識別的序列，例如Arg-Arg、Lys-Arg等，在保護肽中有該識別序列時，以其他的氨基酸取代像這樣的識別序列中的至少一個氨基酸，通過形成不被加工酶識別的序列，能夠防止利用加工酶的切斷。作為用于改善嵌合蛋白質的溶解性的接頭氨基酸，以親水性者為佳。因目的肽的種類不同，嵌合蛋白質的電荷變化，因為有造成包涵體生產率降低的情況，所以作為親水性氨基酸，希望使用在是包涵體生產場所的菌體內的生理pH(中性)附近保持緩沖能力的組氨酸殘基。進而在變性、可溶化后，以使接頭部分的二級結構加寬為目的，希望插入Pro-Gly。最好是要能適應多種的生理活性肽那樣，準備編碼(His)4-Pro-Gly的合成DNA片段，適當重復插入編碼保護肽的DNA片段，形成{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)地設計接頭。以下將該接頭的N末端部分的序列記作LN。進而，本發(fā)明人等已初次清楚，來自大量生產已成為可能的啤酒糖酶的Kex2蛋白酶衍生物(分泌型Kex2衍生物)，以嵌合蛋白質作為底物時，Kex2蛋白酶識別部位(Lys/Arg/Pro)-Arg附近的氨基酸也對其活性產生大的影響。即已清楚，以位于接頭的C末端的氨基酸序列作為X1-X2-(LyS/Arg)-Arg(式中X1、X2是任意的氨基酸)，在X1中使用Arg、Lys或His，在X2中使用His或Phe的場合，分泌型Kex2衍生物活性最大。以下將該接頭的C末端部分的序列記作LC。以嵌合蛋白質法生產而切出的目的肽，用各種方法進行精制，但在使用該嵌合蛋白質的場合，通過簡便的操作，能夠有效地除去未反應嵌合蛋白質、保護肽類、來自大腸桿菌的不純物。即，已清楚，分泌型Kex2衍生物反應后，使pH移向弱酸性側，再稀釋反應液，降低變性劑濃度，以此使來自大腸桿菌的不純物的大部分、未反應嵌合蛋白質、保護肽類進行95％以上的沉淀，在上清液中能保持95％以上的目的肽，通過離心分離或壓濾就簡便地得到含有目的肽的上清液。在將該上清液進行pH調制等后，通過直接陽離子交換色譜，吸附目的肽，利用鹽濃度的變化或pH的變化進行洗脫，再使洗脫級分通過低壓逆相色譜，吸附目的肽，利用有機溶劑的濃度變化進行洗脫且濃縮。有機溶劑濃度降低后，供給逆相HPLC，利用有機溶劑濃度的變化，進行分離分級，得到高純度的目的肽。下面，例舉目的肽是人副甲狀腺激素衍生物hPTH(1-34)說明本發(fā)明。首先，通過合成DNA低聚物的連接制作hPTH(1-84)基因，接著使制成的基因與編碼質粒pG210ShCT[G]的hCT[G]基因的領域進行取代，制成βGal-210SPPH84表達用質粒pG210ShProPTH(圖3)。制成將從hPTH(1-84)基因的編碼N末端的第35號氨基酸(Val)的密碼變成翻譯的終止密碼，將編碼βGal-210S(在從大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端1位至210位的肽中，半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的肽)的基因轉變成編碼βGal-117S(在從大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端1位至177位的肽中，半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的肽)的基因的pG117SHPPH34(圖6-7)。同樣，轉變成編碼βGal-210的基因，通過插入編碼βGal-139S的基因或編碼βGal-97S的基因，可以制成pG139SHPPH34或pG97SHPPH34。這些質粒，通過接頭肽Phe-Met-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg分別使編碼βGal-97S、βGal-117S和βGal-139S的結構基因與衍生物hPTH(1-34)的結構基因連接，編碼該嵌合蛋白質的結構基因處于lac啟動子的控制下。另外這些質粒含有四環(huán)素耐性基因標志。尿素溶液的溶解度高，βGal-97SPPH34產量少，βGal-117SPPH34和βGal-139SPPH34產量高，分泌型Kex2衍生物反應條件下的溶解性降低，為了從嵌合蛋白質中切出衍生物hPTH(1-34)，需要更多的分泌型Kex2衍生物。因此，為了得到產量高且尿素溶液的溶解度高的嵌合蛋白質，在上述保護肽和接頭Met-Ser-Val-Lys-Lys-Arg之間插入由親水性且在中性附近保持緩沖能力、阻礙嵌合蛋白質的二級結構形成的氨基酸組成的接頭LN。作為LN使用由{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)組成的肽。{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)的導入，以合成編碼(His)4-Pro-Gly或者{(His)4-Pro-Gly}2的DNA片段，然后以適當?shù)哪柋炔迦刖幋a保護肽的DNA片段的3’末端來進行，可以制作編碼包含接頭肽的嵌合蛋白質的基因，所述的接頭肽含有一個或數(shù)個上述氨基酸序列。再者，DNA片段反轉而插入者，以DNA堿基序列分析來確認并除外。用編碼這些嵌合蛋白質的質粒轉化大腸桿菌M25株，提高嵌合蛋白質的生產率(圖8)。其結果表明，在保護肽βGal-97S和βGal-139S的場合，n＝3，在βGal-117S的揚合，n＝1-6，嵌合蛋白質的產量高。另外，將這些嵌合蛋白質包涵體進行菌體破碎，用離心分離進行洗凈、分離，用尿素進行溶化和稀釋，供給Kex2-660反應(圖9)。其結果表明，由于{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)的導入，所有嵌合蛋白質對Kex2-660的感受性變高。因此，考慮嵌合蛋白質產量、對Kex2-660的反應性和保護肽的大小，在hPTH(1-34)生產用的嵌合蛋白質中，作為保護肽采用βGal-117S，作為接頭肽采用由(His)4-Pro-Gly組成的βGal-117S4HPPH34。由以上結果可知，作為利用分泌型Kex2衍生物切出生理活性肽用的嵌合蛋白質的設計，不僅為了改善大腸桿菌體內的生產率，而且為了改善分泌型Kex2衍生物反應條件下的溶解性，可適當插入{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)這樣的肽。在該過程中，分泌型Kex2衍生物按摩爾比需要1/1000的嵌合蛋白質，占制造原材料費的大半。因此，有必要設計利用分泌型Kex2衍生物更容易切斷的嵌合蛋白質。βGal-117S4HPPH34的分泌型Kex2衍生物識別部位使用人副甲狀腺激素前體的前序列Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg。但是，還不清楚該序列在利用分泌型Kex2衍生物的切斷中是否最合適，像在許多其他蛋白酶中看到的那樣，應考慮通過最合適化進一步增加切斷效率的可能性。在識別部位的C末端側，因為hPTH(1-34)連續(xù)，所以氨基酸不能取代，但是如果不重新創(chuàng)造識別部位就可以任意選擇N末端一側的序列。因此，嘗試將是底物的嵌合蛋白質的P3部位(X2)轉換成任意的氨基酸。對10中所示18種氨基酸序列進行研究的結果已清楚，如果在X2中導入His或Phe，從嵌合蛋白質中切出hPTH(1-34)的效率就變高。接著，將副反應少的His固定在X2上，研究圖1中所示P4部位的20種氨基酸序列，結果表明，如果在X1中導入Arg、Lys或His，從嵌合蛋白中切出hPTH(1-34)的效率就變高。其中切出效率最好者是在LC中選擇Arg-His-Lys-Arg。進而在本研究的過程中已清楚，存在于βGal-117S的13位、14位的Arg-Arg序列的C末端側的鈦鍵被Kex2衍生物切斷，該結果產生的βGal(1-34)，在利用以后的酸性沉淀進行精制工序中，與hPTH(1-34)相同在上清級分中被回收，因此將14位的Arg取代成Ays而控制切斷，就抑制βGal(1-34)的生成。以上結果表明，在hPTH(1-34)生產用嵌合蛋白質中，作為保護肽使用將14位的Arg取代成Lys的βGal-117S(βGal-117KS)，作為接頭肽使用具有Pro-His-His-His-His-Pro-Gly-Gly-Arg-Pro-Ser-Arg-His-Lys-Arg這樣的氨基酸序列的肽。接著本發(fā)明人等，以大腸桿菌表達像這樣設計的嵌合蛋白質βGal-117KS4HRHPH34，作為包涵體，在洗凈回收后進行可溶化，研究供給分泌型Kex2衍生物反應時的精制方法。包含來自大腸桿菌的不純物、未反應嵌合蛋白質和保護肽的肽，利用在從中性至弱酸性時溶解性極端降低，通過使pH從適合分泌型Kex2衍生物反應的pH7.8-8.2向6.2-6.5移動，可以進行沉淀。進一步通過稀釋降低變性尿(尿素)濃度，能使大部分不純物沉淀。通過離心分離或壓濾除去沉淀，在上清液中高效率地回收hPTH(1-34)。將上清液調整到pH5.0后使hPTH(1-34)吸附在陽離子交換色譜柱(例如PorosHS/SPトヨパ-ル)上，以0.3mol-0.4molNaCl進行洗脫。向洗脫液中添加乙酸，使hPTH(1-34)吸附在低壓逆相色譜上，以30％程度的乙腈進行洗脫，除去對濃縮和逆相HPLC產生惡劣影響的不純物。減壓蒸餾除去洗脫液中的乙腈，用0.22μm的膜濾品進行過濾，使hPTH(1-34)吸附在逆相HPLC(例如，InertsilPrepODS、TSK120T)上，在用乙腈的梯度洗脫中進行分級，集中高純度的級分，以回收率40％-70％得到純度99.5％的hPTH(1-34)。由以上的結果可知，回收率在到目前為止的報導中是最高，證實了本發(fā)明的有用性。根據(jù)實施例具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限定于這些實施例。下面描述作為本發(fā)明的材料使用的質粒、大腸桿菌、在各實施例中共同的基本實驗操作。質粒質粒pG210ShCT[G]是用大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子能表達嵌合蛋白質的質粒，所述的嵌合蛋白質是在由從β-半乳糖苷酶的N末端1位至210位的氨基酸組成的肽中，通過谷氨酸殘基，將hCT[G](在人降鈣素的32位的氨基酸的C末端上附加甘氨酸殘基的肽)結合在76位、122位和154位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的殘基(βGal-210S)上。將含有編碼以限制性內切酶Pvull和EcoRI消化pGHα210(Ser)rop-得到的βGal-210S的一部分的基因的DNA片段與含有以限制性內切酶Pvull和EcoRI消化pG97S4DhCT[G]得到的載體部分的DNA片段連接而制作(圖13)。再者，關于pGHα210(Ser)rop-的制作方法，在特公平6-87788中已公開，含有質拉pG97S4DhCT[G]的大腸桿菌W3110株，命名為大腸桿菌SBM323，以保藏號微工研條寄第3503號(FERMBP-3503)、于1991年8月8日保藏在工業(yè)技術院微生物工業(yè)技術研究所。如果該編碼目的肽的DNA領域與閱讀框架相吻合、以EcoRI-SalIDNA片段導入質粒pG210ShCT[G]中，就能表達與βGal-210S有關的嵌合蛋白質。作為合成人副甲狀腺激素前體(hProPTH(1-84))基因的克隆和質粒pGP#19的制作材料使用(圖13)。大腸桿菌大腸桿菌JM109株以感受細胞狀態(tài)從東洋紡(株式會社)購入，用于質粒的調制。大腸桿菌M25株(W3110/0mpTSugimulaetal.，Biochem.Biophys.Res.Commun，153，737-759，1988)用于嵌合蛋白質的表達。培養(yǎng)基在大腸桿菌的培養(yǎng)中使用以下的培養(yǎng)基。SB培養(yǎng)基0.5％(W/V)甘油、2.4％(W/V)酵母提取物、1.2％(W/V)胰化胨、0.1mol磷酸氫鉀緩沖液(pH7.5)。NU1合成培養(yǎng)基0.4％(W/V)酵母提取物、0.4％(W/V)K2HPO4、0.4％(W/V)KH2PO4、0.27％(W/V)Na2HPO4、1.2％(W/V)(NH4)2SO4、0.02％(W/V)NH4Cl、0.3％(W/V)L-甲硫氨酸、0.2％(W/V)MgSO4·7H2O、40gm/LFeSO4·7H2O、40mg/LCaCl2·2H2O、10mg/LAlCl2·6H2O、10mg/LCoCl2·6H2O、2mg/LZnSO4·7H2O、2mg/LNa2Mo4·2H2O、1mg/LCuCl2·2H2O、0.5mg/LH3BO3和10mg/LMnSO4·nH2O?；镜膶嶒灢僮髟趯嵤├形淳唧w地表示的情況下，實施操作遵循以下的方法。以使用磷酸酰胺法的全自動合成機(アプライドバイオツステムズモデル320A)合成DNA引物。以雙脫氧法決定DNA堿基序列。DNA切斷使用事先購入的指定的3-10倍量的限制性內切酶進行1小時反應。使用0.5-1μg的DNA在20μl反應液中進行質粒結構的解析，在DNA的調制中，使用3-10μg的DNA在50-100μl反應液中進行。反應溫度、反應緩沖劑等條件按照購入品中的指定。在反應液中添加1/5容量的色素液(含有0.25％(W/V)溴酚藍的15％(W/V)Ficoll水溶液)調制成瓊脂糖凝膠電泳試樣。在瓊脂糖凝膠電泳用緩沖劑中使用TAE緩沖劑(40mmolTris/乙酸、2mmolEDTA)。在質粒的結構解析中，使用Mupid-2(コスモバイオ(株式會社)，進行100伏、1小時的電泳，在為了DNA的調制中，使用水平凝膠(20cm×15cm×0.7cm)，進行150伏、4小時或者35伏、13小時的電泳。凝膠用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁溶液(0.5μg、ml)染色20分鐘后，照射紫外線，檢測到DNA光譜。瓊脂糖凝膠濃度對照要分級的DNA片段的大小使用1.0％、2.0％(W/V)。將凝膠放入充滿0.1×TAE緩沖劑的透析管內，施加電壓使瓊脂糖凝膠中的DNA溶出，從凝膠中提取出。將DNA溶液進行苯酚處理、氯仿處理后，進行乙醇沉淀，將DNA精制。連接反應，向含有0.05-1μg的DNA片段的反應液(67mmolTris/HCl(pH7.5)、5mmolMgCl2、5mmolDTT、1mmolATP)30μl中添加10單位的T4DNA連接酶，在16℃進行12-18小時反應，或者使用TAKARA連接試劑盒(寶酒造(株式會社)進行。大腸桿菌JM109株的轉化按照購入前的指示進行，大腸桿菌25株的轉化法按照氯化鈣法進行，按照耐藥性(四環(huán)素)選擇轉化株。添加同量的SDS試樣緩沖劑(63mmolTris/HCl(pH6.8)、10％(W/V)甘油、10％(W/V)SDS、10mg/ml溴酚藍，煮沸3分鐘調制成SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)試樣。使用16％(W/V)SDSPAGEmini(TEFCO)凝膠，每1枚以20mA進行70分鐘，凝膠用考馬斯亮藍G染色。hPTH(1-34)的定量，首先以試樣緩沖劑(1mol乙酸/2mol尿素)將含有hPTH(1-34)的溶液從10倍稀釋至20倍后，得到離心上清液，接著，將其供給連接YMC-ODS-A302(d4.6mm×150mm)柱((株式會社)山村化學研究所)的HPLC(島津制作所(株式會社)LC10A)，在A液(0.1％(V/V)三氟乙酸(TFA)/10％(V/V)乙腈)、B液(0.094％(V/V)TFA/50％(V/V)乙腈)，B40％→80％/20min梯度體系進行展開，將以214nm的吸光度測定檢測出的hPTH(1-34)的峰面積與既知濃度的標準hPTH(1-34)的峰面積進行比較。其他，除另外表示的以外，基本的基因操作按照在MolecularCloning(Maniatis等編，ColdSpringHarborlaboratory，NewYork(1982))中記載的方法進行。實施例1hProPTH(1-84)基因的制作hProPTH(1-84)基因，如圖1所示，分成U1-U7(序列號1-7)和L1-L7(序列號8-14)的14個片段，進行合成。像以下那樣連接各片段制成hProPTH(1-84)基因(圖2)。首先，使DNA片段U1(序列號1)和L7(序列號14(各約1μg)與16單位的T4多核苷酸激酶在含0.5nmol(1molBq以上)的[γ-32P]dATP的磷酸化反應液15μl中(50mmolTris/HCl(pH7.6)、10mmolMgCl2、5mmolDTT)、在37℃反應15分鐘。再向其中添加含5mmolATP的磷酸化反應液5μl，在37℃再反應45分鐘。關于U2(序列號2)和L6(序列號13)、U3(序列號3)和L5(序列號12)、U4(序列號4)和L4(序列號11)、U5(序列號5)和L3(序列號10)、U6(序列號6)和L2(序列號9)、U7(序列號7)和L1(序列號8)也同樣地進行。將上述7個反應液集中到一起，進行乙醇沉淀而回收DNA。將其溶解到80μl的100mmolTris/HCl(pH7.6)、6.5mmolMgCl2、300mmolNaCl中。將其中的40μl在95℃放置5分鐘后，經(jīng)30分鐘使溫度降到43℃。冰冷卻后添加40μl的連接液B(寶酒造(株式會社))，在26℃放置15分鐘。將該試樣供給5％聚丙烯酰胺電泳。電泳后用自動X射線照像術檢測已連接的DNA片段。從凝膠中提取相應約280bp的DNA片段后，按照常規(guī)方法進行精制。實施例2βGal-139S(FM)PPH84表達質粒pGP#19的制作在含有合成hProPTH(1-84)基因的約280bp的DNA片段中，在5’末端存在限制性內切酶EcoRI部位，在3’末端存在限制性內切酶SalI部位。在pG210ShCT[G]的EcoRI/SalI部位插入該EcoRI/SalIDNA片段進行hProPTH(1-84)基因的克隆。用限制性內切酶EcoRI和SalI切斷pG210ShCT[G]后，調制成含載體部分的約3.5KbDNA片段。將其與由實施例1得到的約280bp組成的hProPTH(1-84)基因的DNA片段連接，得到質粒pG210ShProPTH(圖3)。用pG210ShProPTH使大腸桿菌JM109株進行轉化，得到JM109[pG210ShProPTH]。再在pG210ShProPTH的限制性內切酶XhoI/EcoRI部位導入接頭KM091(序列號15)和KM092(序列號16)，制成質粒pG210S(S/X)(圖3)。再者，該接頭在兩端保持限制性內切酶XhoI和EcoRI部位，在其中間保持SacI部位。pG210S(S/X)用限制性內切酶SacI和XhoI消化后，使用Kilo-測序用Deletion試劑盒(寶酒造(株式會社；)，使編碼βGal-210的DNA領域隨時間變化且特異地進行缺失。以Klenow片段進行末端修復后，進行細胞連接，得到編碼嵌合蛋白質βGal-139S(FM)PPH84的質粒pGP#19(圖4)，所述的嵌合蛋白質是通過Phe-Met將βGal-139S和hProPTH(1-84)連接的嵌合蛋白質。將導入pG#19的大腸桿菌JM109株稱作JM109[pGP#19]。實施例3βGal-117SmHPPH34表達質粒pG117SmHPPH34的制作在本實施例中，雖然例舉出βGal-117SmHPPH34表達質粒pG117SmHPPH34的制作，但通過使用βGal-97S或βGal-139S轉變成βGal-117S，能夠制作βGal-97SmHPPH34表達質粒pG139SmHPPH34。1)pG#19PPH34的制作pG#19PPH34的制作過程是，在模板上以S01(序列號17)和S02(序列號18)作為引物，利用PCR法將hPTH(1-84)的35位的纈氨酸殘基的密碼GTT轉換成翻譯停止密碼TAA的DNA片段擴增后，按照常規(guī)方法將限制性內切酶AatII-SalIDNA片段離析精制，與對應pGP#19的對應部分交換而制成pGP#19PPH34(圖5)。2)pG117SPPH34的制作在模板上以S03(序列號19)和S05(序列號20)作為引物、利用PCR法將pG210(S/X)擴增后，以限制性內切酶PVuI和SmaI消化形成DNA片段，在模板上以S07(序列號21)和S02作為引物、利用PCR法將pGP#19PPH34擴增后，以限制性內切酶SalI和SmaI消化形成DNA片段，用T4連接酶將上述兩個DNA片段和包含pGP#19PPH34的復制開始起點的限制性內切酶PvuI-SalIDNA片段連接，就制成pG117SPPH34(圖6-7)。3)pG117SmHPPH34(m＝4或8)的制作在pG117SPPH34的限制性內切酶SmaI部位插入編碼(His)4-Pro-Gly的接頭S08(序列號22)和S09(序列號23)、編碼{(His)4-Pro-Gly}2的接頭S10(序列號24)和S11(序列號25)制成pG117SmHPPH34(m＝4或8)。通過變化接頭的長度可以制作m＝12、16或24的質粒(圖6-7)。再有，在pG117SPPH34的限制性內切酶SmaI部位插入編碼(Lys)4-Pro-Gly的接頭S12(序列號26)和S13(序列號27)，制成pG117S4KPH34。同樣進行能夠制成pG97S4KPH34、pG139S4KPPH34。另外，所插入的接頭數(shù)目和方向，在調制質粒后，決定DNA堿基序列后來確認，在本實施例中將制成的嵌合蛋白質示于表1中。表1表中，H表示組氨酸殘基，K表示賴氨酸殘基、數(shù)字各表示氨基酸數(shù)目。實施例4hPTH(1-34)嵌合蛋白質的生產使用SDS-PAGE調查了表1所示的嵌合蛋白質的生產率。將16個含有編碼表1所示嵌合蛋白質的基因的質粒分別導入大腸桿菌JM109株中，在2ml的SB培養(yǎng)基上于37℃在試管內振動培養(yǎng)16小時后，用生理鹽水稀釋，使培養(yǎng)液濁度(OD660)達到10。向100μl該懸浮液中添加同量的SDS試樣緩沖劑，煮沸3分鐘，使用其10μl上清液進行SDS-PAGE，比較每個菌體的嵌合蛋白質的產量。結果示于圖8中。結果表明，通過β-半乳糖苷酶衍生物和組氨酸殘基數(shù)的組合變化表達量，βGal-97S，在{(His)4-Pro-Gly}n中，n＝2.3，βGal-117S，n＝1、2、3、4、6，βGal-139S，n＝2.3獲得高產量。尤其，在βGal-117S的衍生物中，由于導入{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)，表達量顯著增加，它們的產量更多利用賴氨酸殘基單獨改變電荷。實施例5從嵌合蛋白質中切出hPTH(1-34)關于高產量的嵌合蛋白質(βGal-97SmHPPH34(n＝12)、βGal-117SmHPPH34(m＝0、4、8、12、16、24)、βGal-139SmHPPH34(m＝0、12)；控制m＝0)，為了調查作為Kex2-660的底物的適用性，回收嵌合蛋白質包涵體，以8mol尿素溶解后，進行稀釋以形成反應液組成(20mmolTris/HCl(pH8.2)、100mmolNaCl、3.0mol尿素、2.0mmolCaCl2、8ml/ml嵌合蛋白質)，添加Kex2-660，使終濃度成為20kU/ml，進行hPTH(1-34)的切出。在本條件下，在1小時控制的βGal-117SPPH3490％以上被切斷。各衍生物的Kex2-660反應性根據(jù)與pG117SPPH34的Kcat的比示于圖9中。以“基本的實驗操作”所示的方法進行hPTH(1-34)的定量。該結果表明，在所有的實施的例子中，由于導入{(His)4-Pro-Gly}nKex2-660的反應性也得到改善。尤其，βGal-117S4HPPH34插入1個(His)4-Pro-Gly接頭，嵌合蛋白質的產量和Kex2-660的反應性被改善，而且還知道，βGal-139SPPH34的15g/L以上與8g/L相比，Kex2反應條件下的溶解度也得到改善。實施例6hPTH(1-34)的大量生產為了大量地得到高表達而且也適合作為Kex2-660的底物的嵌合蛋白質βGal-117S4HPPH34，以具有編碼本嵌合蛋白質的基因的質粒pG117S4HPPH34使大腸桿菌M25株(W3110/ompT)進行轉化，得到M25[pG117S4HPPH34]株。使用由2％(W/V)酵母提取物、1％(W/V)胰化胨、1.2％(W/V)K2HPO4、0.3％(W/V)KH2PO4、0.5％(W/V)甘油組成的培養(yǎng)基，在20L培養(yǎng)槽中在37℃進行培養(yǎng)。菌體濃度，在OD660＝1.0時，添加IPTG(異丙基β硫代半乳糖苷)，使最溶濃度達到1mmol，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體濃度OD660＝12。集中菌體后，懸浮在TE(10mmolTris/HCl、1mmolEDTA(pH8.0)中，用高壓勻漿器(Manton-Gaullin)被碎菌體后，離心分離所得到的勻漿產物，得到含有嵌合蛋白質的沉淀，接著用TE和去離子水洗凈該沉淀。這樣，從20L的培養(yǎng)物中得到含有嵌合蛋白質的包涵體100g。向250ml包涵體懸浮液(160g/L)中添加1molTris/HCl(pH8.2)100ml、5molNaCl50ml、去離子水500ml、尿素900g，在30℃的恒溫槽中進行30分鐘攪拌溶解，用溫去離子水稀釋，在30℃形成5L。一面攪拌，一面向其中平穩(wěn)地添加250mmolCaCl2溶液500ml，再以Kex2-660形成20kU/ml添加Kex2-660。2小時后，(切斷效率90％以上)用乙酸調節(jié)至pH6.4，再用去離子水稀釋至2倍，使未反應嵌合蛋白質和保護肽凝聚而沉淀。通過離心分離得到含有hPTH(1-34)的上清液，用乙酸調節(jié)至pH5.0，通過以10mmol乙酸鈉緩沖液平衡的陽離子交換樹脂(SPトヨパ-ル)柱，吸附hPTH(1-34)，用0.4molNaCl使hPTH(1-34)洗脫出。向其中使最終形成3％(V/V)那樣添加乙酸，通過以3％(V/V)乙酸平衡化的低壓逆相柱(SodenODS-W)，吸附hPTH(1-34)，用含乙酸的30％(V/V)乙腈溶液洗脫出hPTH(1-34)。在減壓下除去乙腈，用0.22μm的膜濾器進行過濾，逆相HPLC分離柱(TSKgelODS120Tφ55×600)進行精制。以乙腈的直線濃度梯度(A5％(V/V)乙酸/10％(V/V)乙腈；B5％(V/V)乙酸/40％(V/V)乙腈；％B＝20％→80％/60分、流速40ml/min)進行洗脫。各過程的hPTH(1-34)的回收率示于表2中。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="898">過程名稱PTH量(g)回收率(％)Kex2-660反應7.0100酸沉淀上清液6.795陽離子交換柱6.085低壓逆相柱5.882HPLC4.07</table></tables>實施例7嵌合蛋白質的Kex2-660識別部位P3的氨基酸取代為了將P3部位的氨基酸(Lys)轉換成其他的氨基酸，合成已轉換對應P3部位的密碼的多核苷酸S14-S18(序列號28-32)，以它們和S02(序列號18)作為引物，以pG117S4HPPH34作為模板，用PCR法合成DNA片段。用乙醇沉淀法精制該DNA片段，以StuI和SalI切斷后，進行2.0％(W/V)瓊脂糖電泳，將作為目的的0.4Kbp的StuI-SalI片段精制。接著，將該DNA片段和將以StuI和SalI消化、進行同樣的精制的pG17S4HPPH34的β-半乳糖苷酶部分編碼的DNA片段供給連接反應。反應后，使大腸桿菌JM109株進行轉化。每個組合選擇10個四環(huán)素耐性克隆，利用DNA序列決定分析來自這些克隆的質粒，得到作為目的表達的載體。即得到下述的嵌合蛋白質βGal-117S4HVXPH34的表達pG117S4HVXPH34，所述的蛋白質保持pG117S4HPPH34的編碼嵌合蛋白質的Kex2-660識別部位Ser-Val-Lys-Lys-Arg被Ser-Val-X-Lys-Arg(X＝Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、Phe、Tyr、Trp、His、Pro)取代的氨基酸序列。為了調查各嵌合蛋白質和Kex2-660反應性，在50ml的SB培養(yǎng)基中培養(yǎng)各克隆，在菌體濃度OD660＝1.0時，用IPTG誘導表達后，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后收集菌體，進行TE緩沖液洗凈、懸浮、破碎、離心分離，得到包涵體。再用1％(W/V)TritonX100、10mmolEDTA和TE洗凈，得到精制的包涵體。在該包涵體中包含的肽成分的90％以上是作為目的的嵌合蛋白質。向各嵌合蛋白質的包涵體懸浮液中添加1molTrIs/HCl(pH8.2)20μl、5molNaCl20μl、10mol尿素300μl，溶解包涵體用650μ去離子水稀釋后，在30℃的恒溫槽中保溫10分鐘，向其中添加250mmolCaCl2溶液10μl，再形成20kU/ml那樣添加Kex2-660。在此條件下，在1小時對照的βGal-117SPPH34，90％以上被切斷。hPH(1-34)的生成，以使用上述的ODS柱的HPLC進行定量。各衍生物的Kex2-660反應性，以與pG117S4HPPH34的Kcat之比表示(圖10)。在X＝Phe、His時，由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率良好，在X＝Pro時，幾乎沒有看到由Kex2-660引起的切出。實施例8嵌合蛋白量的Kex2-660識別部位P4的氨基酸取代從實施例7的結果以及因為切斷時的副產物少，所以選擇在P3部位保持組氨酸殘基的嵌合蛋白質βGal-117S4HVHPH34作為用于生產hPTH(1-34)的嵌合蛋白質，試驗由P4部位的氨基酸取代而引起的Kex2-660反應性的提高。合成多核苷酸S19-S24(序列號33-38)，以它們和S02作為引物，以pG117S4HVHPH34作為模板，按照PCR法合成導入變異的DNA質粒。按照實施例7所示方法，得到下述的嵌合蛋白質βGal-117S4HXHPH34的表達載體pG117S4HXHPH34，所述的嵌合蛋白質保持嵌合蛋白質的Kex2-660識別部位Ser-Val-His-Lys-Arg被Ser-X-His-Lys-Arg(X＝Gly、Ala、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、Cys、Met、Phe、Tyr、Trp、His、Pro、Val)取代的結構。以該嵌合蛋白質作為底物，以和實施例6相同的條件，判斷對Kex2-660的感受性。在X＝Lys、Arg時，由Kex2-660引起為hPTH(1-34)的切出效率變好，在X是酸性氨基酸(Asp、Glu)時，幾乎看不到由Kex2-660引起的hPTH(1-34的切斷(圖11)。由此初次清楚，Kex2-660蛋白酶不僅在P1部位要求精氨酸殘基，在P2部位要求強堿性氨基酸或脯氨酸殘基，而且在P3部位希望是組氨酸殘基或苯丙氨酸殘基，在P4部位是強堿性氨基酸，以及如果在P3部位有丙氨酸殘基，或者在P4部位有酸性氨基酸，就極端地降低嵌合蛋白質的切斷活性。實施例9保護肽的Kex2-660切斷部位的除去隨時間變化對實施例7和8中的Kex2-660切斷反應追蹤的結果表明，保護肽βGal-117S的13、14位的Arg-Arg序列的C末端的肽鍵已切斷。預料在利用酸性沉淀進行精制時混入由此產生的βGal(1-14)。因此，將14位的Arg取代成Lys，抑制由Kex2-660引起的切斷，抑制βGal(1-14)的生成。像以下那樣制作編碼14位的Arg被Lys取代的嵌合蛋白質(βGal-117KS4HRHPH34)的質粒pGKSPH34(圖12)。首先，以低聚核苷酸S25(序列號39)和S26(序列號40)作為引物，以pG117S4HRHPH34作為模板，用PCR法合成導入變異的DNA片段、AseI-RK。同樣以低聚核苷酸S27(序列號41)和S28(序列號42)作為引物，合成DNA片段、RK-BglII。將各DNA片段精制，分別各混合約1ng，在引物不存下進行4次PCR，合成導入變異的AseI-BglII質粒。向其中再添加低聚核苷酸S25和S28，繼續(xù)PCR，將同一質粒擴增。用乙醇沉淀法精制該質粒，以AseI和BglII切斷后，進行2.0％(W/V)瓊脂糖電泳，調制成作為目的的0.35Kbp的片段。將pG117S4HRHPH34的AseI/SphI(1.8Kbp)片段和SphI/BglII(1.4kbp)片段進行1.0％(W/V)瓊脂糖電泳，并進行精制。在上述3個片段進行連接反應后，使大腸桿菌JM109進行轉化，得到耐四環(huán)素菌株，用堿性法調制質粒后，解析變異導入部分的DNA堿基序列，選擇保持下述質粒pGKSPH34的目的克隆，所述質粒包含編碼保護肽14位的Arg的DNA序列CGG被AAG取代的基因。以實施例5所示的方法，得到嵌合蛋白質的包涵體，Kex2-660反應的結果表明，通過上述取代基本能完全抑制保護肽的切斷，能減輕精制工序的負擔。實施例10嵌合蛋白質βGal-117KS4HRHPH34的大量調制和hPTH(1-34)的生產以試管規(guī)模被認為最適合作為Kex2-660的底物的嵌合蛋白質Gal-117KS4HRHPH34在大量培養(yǎng)條件下的生產率和利用Kex2-660蛋白酶的切出，以及進行hPTH(1-34)的精制。用pGKSPH34進行大腸桿菌M25株的轉化，得到耐四環(huán)素菌株，制成生產菌株M25][pGKSPH34]。將M25[pGKSPH34]株在包含2％(W/V)葡萄糖的NU1培養(yǎng)基中進行大量培養(yǎng)。消耗葡萄糖后，作為碳源供給甘油，邊調整到pH7.0，邊培養(yǎng)24小時。最終達到的菌體濃度是150-200OD。該嵌合蛋白質即使在大量培養(yǎng)條件下也顯示穩(wěn)定的生產率，盡管大量表達，也未出現(xiàn)顯著地妨礙宿主大腸桿菌的生育。包涵體產量是約5g/L培養(yǎng)基。用TE和去離子水洗凈菌體破碎后的不溶性級分后，得到精制的包涵體。用尿素進行可溶化后進行稀釋，以20mmolTris/HCl(pH8.2)、50mmolNaCl、2.5mmolCaCl、2.7mol尿素、8.0mg/ml嵌合蛋白質作為反應液組成，在30℃反應溫度，使成為5kU/ml地添加Kex2-660，進行從嵌合蛋白質中切出hPTH(1-34)，對hPTH(1-34)的生成進行定量。在30分鐘，切斷率達到90％以上，與βGal-117S4HPH34相比，Kex2-660量減少到1/4。反應終了后，hPTH(1-34)進行與實施例5相同地精制。精制工序的回收率與實施例5大體相同。實施例11βGal-117S4HGP生產質粒、pG117S4HGP的制作生產包含胰高血糖素樣的肽I(hGLP-I(7-37))的嵌合蛋白質(βGal-117S4HGP)的質粒、pG117S4HGP按以下序列制作。首先，合成如圖4所示的4種DNA(GLP-1(序列號43)、GLP-2(序列號44)、GLP-3(序列號45)、GLP-4(序列號46)，使用多核苷酸磷酸化酶將它們5’末端磷酸化后，將它們混合，進行退火，調制成HGLP-1(7-37)基因(DNA(I))。另一方面，圖14(b)所示的2種合成DNA(117S4HSphI引物(序列號47)、117S4HBg1II引物(序列號48)作為RCR引物使用，以pGKSPH34作為模板進行PCR。得到的PCR產物以BglII和SphI消化，調制成保持BglII和SphI的粘附末端的DNA片段(DNA(II))。接著，以BglII和SalI消化pGKSPH34后，進行1％瓊脂糖電泳，用凝膠回收大的一方的DNA片段(DNA(III))。用T4DNA連接酶連接如此得到的DNA(I)、DNA(II)和DNA(III)，制作成pG117S4HGP(圖15)。實施例12嵌合蛋白質βGal-117S4HGP的生產在32℃、在含有1.5％葡萄糖、4g/LK2HPO4、4g/LKH2PO4、2.7g/LNa2HPO4、0.2g/LNH4Cl、1.2g/L(NH4)2)SO4、4g/L酵母提取物、2g/LL-甲硫氨酸、2g/LMgSO4·7H2O、40mg/LCaCl2·2H2O、40mg/LFeSO4·7H2O、10mg/LMnSO4·nH2O、10mg/LAlCl3·H2O、4mg/LCoCl2·6H2O、2mg/LZnSO4·7H2O、2mg/LNaMoO4·2H2O、1mg/LCuCl2·2H2O、0.5mg/LH3BO4、10mg/L四環(huán)素的培養(yǎng)基中、以pH7.0培養(yǎng)具有已制成的pG117S4HGP的大腸桿菌W3110M25株，葡萄糖枯竭后，以甘油作為碳源，在37℃再培養(yǎng)8小時，使在菌體內產生βGal-117S4HGP的包涵體。培養(yǎng)終了后，使用マントンゴリ勻漿器(マントンゴリ公司制，型號15M-8tA)、在600KG/cm2的條例上處理培養(yǎng)液，通過離心分離(CEPA離心分離機)回收沉淀級分。將得到的沉淀懸浮在與培養(yǎng)液等量的緩沖液(10mmolTris-HCl(pH8.0)、1mmolEDTA)中后，再次以離心分離回收沉淀，懸浮在與培養(yǎng)液等量的去離子水中。然后，再進行離心分離，回收沉淀后，懸浮于與沉淀等量的去離子水中，用于以后的操作。實施例13從嵌合蛋白質中切出hGLP-1(7-37)回收以實施例12得到的嵌合蛋白質包涵體，以8mol尿素溶解后進行稀釋，以形成反應組成(20mmolTris-HCl(pH8.2)、100mmolNaCl、3.0mol尿素、2.0mmolCaCl2、8mg/ml嵌合蛋白質)，以10000U/ml添加Kex2-660，進行hGLP-1(7-37)的切出。在此條件下，在1小時控制的βGal-117S4HGP，90％以上被切斷。實施例14hGLP-1(7-37)的均分(圖16、表3)為了大量得到高表達而且也適合作為Kex2-660的底物的嵌合蛋白質βGal-117S4HGP，用編碼該嵌合蛋白質的質粒pG117S4HGP進行大腸桿菌M25(W3110/ompT)的轉化，在20L培養(yǎng)槽中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基由酵母提取物20g/L、細菌胰化胨10g/L、K2HPO412g/L、KH2PO43g/L、甘油5g/L組成，在菌體濃度是OD660＝1.0，添加IPTG(異丙基β硫代半乳糖苷，使最終濃度成為1mmol。使用消泡劑(デイスフオムCC-222，(株式會社)日本油脂)。在37℃繼續(xù)培養(yǎng)至菌體濃度OD60＝12。集中菌體后，懸浮在TE(10mmolTris/HCl、1mmolEDTApH8.0)中，用高壓勻漿器(Manton-Gaulline)破碎菌體，離心分離得到的勻漿產物，得到含有嵌合蛋白質的沉淀，接著用TE和去離子水洗凈該沉淀。這樣從20L的培養(yǎng)物中得到約100g含有嵌合蛋白質的包涵體。向250ml包涵體懸浮液(160g/L)中添加1molTirs/HCl(pH8.2)100ml、5molNaCl溶液50ml、去離子水500ml、尿素900g，在30℃的恒溫槽中進行30分鐘攪拌溶解，用溫去離子水稀釋，在30℃形成5L。邊攪拌邊緩慢地向其中添加250mmolCaCl2溶液50ml，再形成20000單位/ml(約4.0mg/L)地添加Kex2-660。2小時后，(切斷率90％以上)用乙酸調整至pH6.4，再用去離子水稀釋至2倍，使未反應嵌合蛋白質和保護肽凝集沉淀。用離心分離得到含hGLP-1(7-37)的上清液，用乙酸調整至pH5.0，通過用2mol尿素·10mmol乙酸鈉緩沖液(pH5.0)平衡化的陽離子交換樹脂(SPトヨパ-ル)柱，吸附hGLP-1(7-37)，用2mol尿素·10mmol乙酸鈉緩沖液(pH6.2)洗凈后，以0mol至300mmol的氯化鈉濃度梯度洗脫hGLP-1(7-37)。預先在級分管中放入乙酸，最終形成3％，抑制hGLP-1(7-37)的凝集。集中含有hGLP-7(7-37)的級分，通過以5％乙酸平衡化的低壓逆相柱(SokenODS-W)，吸附hGLP-1(7-37)，用含5％乙酸的50％乙腈溶液洗脫hGLP-1(7-37)。在減壓下除去乙腈，用0.22μm的磨濾器過濾后，進行凍結干燥。以下詳述hGLP-1(7-37)的定量。以試樣緩沖劑(1mol乙酸/2mol尿素)將含有hGLP-1(7-37)的溶液從10倍稀釋至20倍，得到離心上清液。在HPLC(島津LC10A)中接續(xù)YMC-C8-A302)4.6mmI.D.×150mm)柱，用A液(0.1％TFA/10％乙腈)、B液(0.094％TFA/60％乙腈)、B40％→80％/20min梯度的體系將該上清液的10μl至20μ展開，從以220nm的吸光度測定檢測的hGLP-1(7-37)與已知濃度的標準hGLP-1(7-37)的峰面積比進行定量。回收率示于表3中。表3hGLP-1(7-37)回收率工序名稱容積/[l]hGLP-1/[g]回收率/[％]Kex2-6604.04.8100酸沉淀上清液7.83.368陽離子交換柱0.52.860低壓逆相柱2.040序列表序列號1序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTCATGAAATCTGTTAAAAAGCGTTCTGTTTCTGAAAT序列號2序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCAGCTGATGCATAACCTGGGCAAACACCTGAATAGCATGG序列號3序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AACGCGTCGAGTGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTCCAC序列號4序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AACTTCGTTGCGCTGGGTGCACCGCTGGCTCCACGTGATGC序列號5序列長39序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AGGATCCCAACGTCCGCGTAAGAAAGAAGATAACGTACT序列號6序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGTTGAATCTCATGAGAAATCCCTGGGCGAAGCTGACAAA序列號7序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GCCGATGTTAACGTGCTGACCAAAGCGAAAAGCCAGTAAG序列號8序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGACTTACTGGCTTTTCGCTTTGGTCAGCACG序列號9序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TTAACATCGGCTTTGTCAGCTTCGCCCAGGGATTTCTCAT序列號10序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GAGATTCAACCAGTACGTTATCTTCTTTCTTACGCGGACG序列號11序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀順序種類合成DNA序列TTGGGATCCTGCATCACGTGGAGCCAGCGGTGCACCCAGCG序列號12序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列CAACGAAGTTGTGGACGTCCTGCAGTTTCTTACGCAGCCAC序列號13序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGACGCGTTCCATGCTATTCAGGTGTTTGCCCAGGTTATG序列號14序列長46序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列CATCAGCTGAATTTGAGAAACAGAACGCTTTTTAACAGATTTCATG序列號15序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGAGGTCGACGGTACCGAGCTCG序列號16序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTCGAGCTCGGTACCGTCGACC序列號17序列長45序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AAACTGCAGGACGTCCACAACTTCTAAGCGCTGGGTGCACCGCGT序列號18序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列CATTAAAGCTTTGCGATGATAAGC序列號19序列長26序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列CGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTT序列號20序列長35序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TTTCCCGGGCCTCCGTGGGAACAAACGGCGGATTG序列號21序列長42序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TTTCCCGGGAGGCCTTCTGTTAAAAAGCGGTCTGTTTCTGAA序列號22序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列CACCATCATCACCCTGGA序列號23序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCCAGGGTGATGATGGTG序列號24序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列CACCACCATCATCCTGGACACCATCATCACCCTGGA序列號25序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCCAGGGTGATGATGGTGTCCAGGATGATGGTGGTG序列號26序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AAGAAGAAGAAGCCTGGA序列號27序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCCGGACTTCTTCTTCTT序列號28序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTNCAAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號29序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTNATAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號30序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTNTTAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號31序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTBGGAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號32序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTSAAAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號33序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTADTCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號34序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTAHGCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號35序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGHGCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號36序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTTKKCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號37序列長34序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTCVACATAAGCTTTCTGTTTCTG序列號38序列長34序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTBATCATAAGCTTTCTGTTTCTG序列號39序列長27序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTAATGTGAGTTAGCTCACCATTAG序列號40序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列ATCCCAGTCTTTAGCTTGTAAAAC序列號41序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GTTTTACAACGTAAAGACTGGGAT序列號42序列長31序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TTTAGATCTGACTCCAGCAAGCTGTCCGGCA序列號43序列長57序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列CGGAAGGTACCTTTACCAGCGATGTGAGCTCGTATCTGGAAGGTCAGGCGGCAAAAG序列號44序列長48序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列ACCTTCCAGATACGAGCTCACATCGCTGGTAAAGGTACCTTCCGCATG序列號45序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTCATCGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGTGGTTAAG序列號46序列長53序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGACTTAACCACGGCCTTTCACCAGCCACGCGATGAATTCTTTTGCCGCCTG序列號47序列長38序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列TGAATTTCAGAAGCATGCCGCTTATGTCGAGAAGGCCT序列號48序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓撲學直鏈狀序順種類合成DNA序列GACTCAGATCTTCCTGAGGCCGAT權利要求1.由下式表示的嵌合蛋白質，A-L-B式中，A是保護肽；B是目的肽；L是接頭肽，在其C末端部分具有序列X1-X2-(Pro、Lys或Arg)-Arg(式中，X1和X2是任意的氨基酸)，而且在N末端具有富有His的部分。2.權利要求1所述的嵌合蛋白質，其中，上述N末端的富有His的部分具有序列[(His)4-Pro-Gly]n(式中，n是1-6)。3.權利要求1或2所述的嵌合蛋白質，其中，在上述N末端部分的氨基酸序列和上述C末端部分的氨基酸序列之間存在1-5個任意的氨基酸。4.權利要求1-3中任一項所述的嵌合蛋白質，其中，X1是Arg、Lys或His，而X2是His或Phe。5.權利要求1-4中任一項所述的嵌合蛋白質，其中，A是不含氨基酸序列Pro-Arg、Arg-Arg和Lys-Arg的多肽。6.權利要求1-4中任一項所述的嵌合蛋白質，其中，A是含有氨基酸序列Pro-Arg、Arg-Arg或Lys-Arg的多肽的場合時，該氨基酸序列中至少一種氨基酸被其他氨基酸取代，以便在A中不含有該氨基酸序列。7.權利要求1-6中任一項所述的嵌合蛋白質，其中，A是220氨基酸殘基以下的多肽。8.權利要求7所述的嵌合蛋白質，其中，A是來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的N末端側的1位氨基酸至97位、117位或139位氨基酸的肽。9.權利要求1-8中任一項所述的嵌合蛋白質，其中，A中的半胱氨酸殘基被其他氨基酸取代。10.權利要求9所述的嵌合蛋白質，其中，上述其他氨基酸是絲氨酸殘基。11.權利要求1所述的嵌合蛋白質，其中，B是人副甲狀腺激素或其衍生物。12.權利要求11所述的嵌合蛋白質，其中，上述人副甲狀腺激素衍生物是具有從天然的人副甲狀腺激素的N末端的1位或3位氨基酸殘基至31位、34位、37位、38位或84位氨基酸殘基的序列的片斷，或者是在它們的C末端附加Gly的片段。13.權利要求1所述的嵌合蛋白質，其中，B是GLIP-1或其衍生物。14.權利要求1-13中任一項所述的嵌合蛋白質的制造方法，其特征在于，以包含編碼該嵌合蛋白質的DNA的表達載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)所得到的轉化體，從該培養(yǎng)物中提取上述嵌合蛋白質。15.目的肽(B)的制造方法，其特征在于，使加工酶作用于權利要求1-13中任一項所述的嵌合蛋白質，切斷接頭肽(L)的C末端與目的肽(B)的N末端之間的肽鍵，得到目的肽(B)。16.權利要求15所述的方法，其特征是，上述的加工酶是Kex2蛋白酶、フリン(Furin)、前體轉變酶1/3(PC1/3)或者前體轉變酶2(PC2)、或者它們的衍生物。17.權利要求14-16中任一項所述的方法，其特征是，在得到目的肽(B)時使用等電點沉淀處理。全文摘要提供一種包含目的蛋白質的嵌合蛋白質，該嵌合蛋白質利用加工酶能容易地開裂，能高效率地回收目的蛋白質，是以下式表示的嵌合蛋白質A-L-B。式中，A是保護肽，B是目的肽，L是接頭肽，在其C末端部分具有序列X1-X2-(Tro、Lys或Arg)-Arg(式中，X1和X2是任意的氨基酸)，而在N末端具有富有His的部分。文檔編號C07K14/635GK1167155SQ9710969公開日1997年12月10日申請日期1997年3月4日優(yōu)先權日1996年3月4日發(fā)明者鈴木雄司,孫田浩二,增田豐文申請人:三得利公司