專利名稱：：從未成熟大麥葉提取物中分離新的肽并用其抑制人血小板凝集的制作方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分離并鑒定來自未成熟大麥葉提取物中獲得的新的肽。更特別地是，本發(fā)明涉及分離并鑒定來自未成熟大麥葉提取物中獲得的抑制人血小板凝集的新的肽?，F(xiàn)有技術(shù)描述大麥被廣泛用作食品原料。在日本和其它一些國家，嫩的未成熟大麥葉的汁及其凍干產(chǎn)品也被廣泛用作營養(yǎng)補充。嫩大麥植物的未成熟葉子的提取物富含微生素和微量元素，含有具有多種多樣所謂生物活性的大量未確定分子的復(fù)雜混合物。近來研究表明，加熱的和未加熱的大麥葉提取物含有能增強生長激素(GH)和催乳激素的釋放，其超出具有GH釋放因子(GRF)或促甲狀腺釋放激素(TRH)而單獨獲得的生長激素和催乳激素的釋放程度。(GRF和TRH分別是生長激素和催乳激素的天然刺激物。)[Badamchian等人“未成熟大麥葉提取物(BLE)的免疫內(nèi)分泌活性催乳激素和白介素-2體外釋放的調(diào)節(jié)”，F(xiàn)ASEBJ.，5，A567(1991)]。據(jù)報導(dǎo)嫩的未成熟大麥葉含有生物活性物質(zhì)，和抗氧化劑和抗癌劑。至今也有報導(dǎo)，未成熟大麥葉提取物有多種免疫調(diào)節(jié)特性，如體外抗炎性和抗白血病活性，以及減少大鼠體內(nèi)潰瘍性損傷的愈合時間。[Osawa等人“從嫩的未成熟大麥葉中分離新的抗氧化劑”，《農(nóng)業(yè)食品化學(xué)》(J.Agric.FoodChem.)，40，1135-1138(1992)；Itoh等人”禾本科植物綠汁粉末抗癌活性的研究“(StudyontheAnticancerActivityofGreenJuicePowerofGramineaePlants)，日本藥學(xué)會第98屆年會(1978)；Kubota等人”“自大麥葉中分離有藥效的抗炎蛋白質(zhì)”，《日本炎癥雜志》，(“IsolationofPotentAntiInflammatoryProteinFromBarleyLeaves”，JapaneseJ.Inflam.)3，4(1983)]。Badamchian等人“自未成熟大麥葉提取物中分離刺激催乳激素和自大鼠前垂體細(xì)胞體外的生長激素的釋放的維生素E類似物”，《營養(yǎng)生物化學(xué)》(“IsolationofAVitaminEAnalogFromAGreenBarlegLeafExtractThatStimulatesReleaseOfBolactinAndGrowthHormoneFromRatAnteriorPituitaryCellsInVitro”，J.Nutr.Biochem.)1994，第5卷，3月，pp.145-150，公開了丁二酸α-生育酚酯作為增強自大鼠前垂體細(xì)胞體外的生長激素和/或催乳激素釋放的未成熟大麥葉提取物中的活性元素。應(yīng)用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)來分離并在化學(xué)上鑒定了作為這種神經(jīng)內(nèi)分泌活性的來源丁二酸α-生育酚酯分子。Badamchian等人“丁二酸α-生育酚酯而不是α-生育酚或其它維生素E類似物刺激催乳激素自大鼠前垂體細(xì)胞體外釋放”，《營養(yǎng)生物化學(xué)》(“α-TocopherolSuccinate，ButNotα-TocopherolOrOtherVitaminEAnalogs，StimulatesProlactinReleaseFromRatAnteriorPituitaryCellsInVitro”，J.Nutr.Biochem.)，1995，第6卷，6月，pp1-5，公開了只有丁二酸α-生育酚酯引起催乳激素自大鼠前垂體細(xì)胞體外釋放的明顯增強，而其它可商購的形式的α-生育酚(例如，α-生育酚，δ-生育酚，乙酸α-生育酚酯和煙酸α-生育酚酯)或丁二酸(例如丁二酸二鈉鹽和琥珀酸(丁二酸))則不引起該現(xiàn)象。本發(fā)明以繼續(xù)努力鑒定自嫩大麥植物提取物中發(fā)現(xiàn)的各種分子的生物活性為基礎(chǔ)。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供自大麥植物得到的生物活性物質(zhì)。在一種實施方案中，本發(fā)明提供新五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn和Asp-Asp-Ser-Gln-Gln。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供一種用于抑制血小板凝集的組合物，該組合物包括所述五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn和其藥物上可接受的載體。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制血小板凝集的組合物，該組合物包括五肽Asp-Asp-Ser-Gln-Gln和其藥物上可接受的載體。在又一實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于抑制需要治療的患者的血小板凝集的方法，其包括給所述患者施用血小板凝集抑制有效量的五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于抑制需要治療的患者的血小板凝板的方法，其包括給所述患者施用血小板凝集抑制有效量的五肽Asp-Asp-Ser-Gln-Gln。通過參閱本發(fā)明的詳細(xì)說明，本發(fā)明的其它方面將變得更清楚。附圖的簡要說明附1A是日本大麥葉提取物的反相高效液相色譜。圖1B是加熱的日本大麥葉提取物的反相高效液相色譜。圖2是加熱的日本大麥葉提取物制備的分離物的反相高效液相色譜。圖3說明級分13(F13)對腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)的血小板凝集的影響。圖4說明級分14(F14)對ADP誘導(dǎo)血小板凝集的影響。圖5A是級分13(F13)反相高效液相色譜。圖5B是級分14(F14)反相高效液相色譜。圖6說明級分13(F13)抑制ADP誘導(dǎo)血小板凝集的劑量依賴性。圖7說明級分14(F14)抑制ADP誘導(dǎo)血小板凝集的劑量依賴性。圖8A說明ADP誘導(dǎo)血小板凝集作用。圖8B說明加熱的大麥葉提取物(H-BLE)抑制ADP誘導(dǎo)的血小板凝集作用。圖9說明加熱的大麥葉提取物(H-BLE)抑制ADP誘導(dǎo)的血小板凝集的劑量依賴性。圖10A說明級分14(F14)肽的UV譜。圖10B說明級分13(F13)肽的UV譜。圖11A說明級分13(F13)肽的高分辨快原子轟擊質(zhì)譜。圖11B說明級分14(F14)肽的高分辨快原子轟擊質(zhì)譜。圖12A說明級分14(F14)肽的高效毛細(xì)管電泳。圖12B說明級分13(F13)肽的高效毛細(xì)管電泳。本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明提供自未成熟大麥植物得到的生物活性分子。發(fā)芽后，例如大約兩周，立刻收獲大麥植物未成熟的葉子。葉子被凍干并接著研磨生成細(xì)小而均勻的粉末。(盡管可以使用稍大或稍小粒度的顆粒，但一般情況下將粉末通過2mm篩目。)將如此制得的粉末懸浮于水(一般情況下每ml水用約50mg粉末)中并在室溫至約100℃下攪拌幾分鐘至幾小時(溫度越高所需時間越短)。較大粉末粒度或較小相對量的粉末需要相對較長的時間和/或較高溫度以從粉末中充分提取物質(zhì)。然后將混合物離心和/或過濾，以從中除去固體成分。(如果不是立即使用如此制得的提取物，則可以在低溫，例如0℃，優(yōu)選-20℃下貯存)。然后，如此制得的提取物進(jìn)行高效液相色譜(即反相高效液相色譜)，以將提取物分離成遞增疏水性的級分(例如洗脫劑A可以是三氟乙酸水溶液，洗脫劑B可以是三氟乙酸有機溶劑(例如乙腈)溶液，線性梯度可以是自0至80％B)。這些級分可以凍干，用水稀釋，并測定生物活性(在本發(fā)明情況下測定抑制腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)血小板凝集的生物活性)。為了進(jìn)一步純化活性物質(zhì)，可以將具有生物活性的級分再次進(jìn)行反相高效液相色譜。然后用本領(lǐng)域定性定量分析已知技術(shù)進(jìn)行活性物質(zhì)的鑒定。利用這些技術(shù)，已分離出兩種五肽，Asp-Asp-Asn-Asp-Asn和Asp-Asp-Ser-Gln-Gln，它們體外抑制ADP誘導(dǎo)的血小板凝集。以在這些體外研究中具有的活性為基礎(chǔ)，相信對需要抑制血小板凝集的患者施用抑制有效量(例如每kg體重0.1-10mg)的這些五肽將會有效抑制這種血小板凝集作用。當(dāng)然，有效量將隨患者年齡和總體健康狀況以及其它因素而不同。通過直接注射或利用靜脈滴注可以有效地施用五肽。與五肽一起使用的藥物上可接受的載體包括蒸餾水(無菌)和生理緩沖鹽水(無菌)等。實施例下述實施例詳細(xì)說明制備，分離和鑒定本發(fā)明的新肽。提取方法(i)制備來成熟大麥葉粉末發(fā)芽后兩周收獲未成熟大麥葉。在冷凍干燥器(50-SRC-5型(Virtis公司，Gardner，N.Y.，U.S.A.))中將大麥葉冷凍干燥3天。接著用裝有篩(篩目大小2mm)的標(biāo)準(zhǔn)3型Wiley粉磨機(ArthurH.Thomas公司，Philadelphia，Pa.U.S.A.)將凍干的葉子研磨成細(xì)小而均勻的粉末以備提取。(ii)大麥葉提取物(BLE)將上面制得的未成熟大麥葉粉末懸浮于水(50mg/ml)中，并在室溫下攪拌1小時。然后用臺式離心機以3,000×g將混合物離心30分鐘。棄去片狀沉淀物，上清液以30,000×g離心30分鐘。接著上清液以30,000×g離心30分鐘。然后經(jīng)0.45μm膜(Millipore公司，Bedford，Mass)過濾并在-20℃貯存以用于高效液相色譜(HPLC)或生物測定。(iii)加熱的大麥葉提取物(H-BLE)將如上制得的未成熟大麥葉粉末懸浮于水(50mg/ml)中并在室溫下攪拌1小時。然后用臺式離心器以3,000×g將混合物離心30分鐘。棄去片狀沉淀物并將上清液以30,000×g離心30分鐘。然后將上清液煮沸10分鐘，再以30,000×g離心30分鐘。然后通過0.45μm膜(Millipore公司，Bedford，Mass.)過濾并在-20℃下貯存以用于高效液相色譜(HPLC)或生物測定。高效液相色譜在裝有490型多波長檢測器，在214nm和280nm，及300×3.9mmDeltaPak30015μmC18柱(Waters，Milford，Mass.U.S.A)的440型HPLC系統(tǒng)(Waters，Milford，Mass.U.S.A.)中進(jìn)行BLE或H-BLE分級反相色譜最佳條件選擇。洗脫劑A是0.1％(重量)三氟乙酸(TFA)水溶液，洗脫劑B是含0.1％(重量)的乙腈。以1ml/min的流速進(jìn)行60分鐘自0至80％B線性梯度洗脫。圖1A顯示BLE反相HPLC，圖1B顯示H-BLE反相HPLC。在裝有441型吸光度檢測器(Waters)，在214nm，和300×19mmDeltaPak300，15μmC18柱的600型HPLC系統(tǒng)(Waters)進(jìn)行H-BLE(300mg)的制備反相色譜。選擇該條件用作BBLE或BLE中所有肽/分子分級的最初步驟。洗脫劑A是0.1％(重量)三氟乙酸(TFA)水溶液，洗脫劑B是含0.1％(重量)TFA的乙腈。以5ml/min流速進(jìn)行60分鐘自0至80％B線性梯度洗脫。圖2顯示H-BLE的制備反相HPLC。一分鐘收集一個級分，凍干并用1mlH2O稀釋。試驗各級分對腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)的血小板凝集的影響。試驗結(jié)果表明10μl級分14(F14)和級分B(F1)對ADP誘導(dǎo)的血小板凝集具有明顯的抑制作用，見圖3和4。因此，將F13和F14進(jìn)行進(jìn)一步純化。在3.9mm×30cmDeltaPak300，5μm，C18柱上進(jìn)行F13和F14的分析反相色譜。洗脫劑A是0.1％(重量)TFA水溶液，洗脫劑B是含0.1％(重量)TFA的乙腈。以1ml/min的流速進(jìn)行20分鐘自0至5％B線性梯度洗脫，接著進(jìn)行5分鐘自5至20％B線性梯度洗脫。在214和218nm外檢測。每半分鐘收集一個級分，并測定其對ADP誘導(dǎo)的血小板凝集的影響。圖5A和5B分別顯示F13和F14級分的分離結(jié)果。表1是以蛋白質(zhì)濃度和干重表示的肽MB-F13和肽MB-F14的收率。圖6和圖7分別表明F13和F14對ADP誘導(dǎo)的血小板凝集抑制的劑量依賴性。表1自1gH-BLE得到的肽MB-F13和MB-F14的蛋白質(zhì)濃度和干重樣品干重(mg)蛋白質(zhì)％產(chǎn)率(干重)MB-F137.20.110.72MB-F14141.08.3314.1用BSA為標(biāo)準(zhǔn)通過Lowry蛋白質(zhì)分析來測定蛋白質(zhì)濃度。血小板凝集分析在每個實驗中，用雙注射器技術(shù)，從禁食，不吸煙，健康自愿者身上采取9ml血，加到含3.8％(重量)檸檬酸鈉的聚丙烯試管中。每個樣品用2ml磷酸鹽緩沖鹽水稀釋。將血樣在室溫下在2000RPM條件下離心3分鐘制得富血小板血漿(PRP)。移取PRP后，樣品再次以2700RPM離心10分鐘制得含血小板少的血漿(PPP)。對于PRP和PPP兩者，校準(zhǔn)凝集計量計，使PRP給出零而PPP產(chǎn)生100％光透射。在每個實驗中，在實驗開始、中間和最后做三個對照。對于每個對照，將400μlPRP樣品與4μl1μmCaCl2一起溫育1分鐘，然后與加入的水(與樣品體積等量)溫育2分鐘。然后向樣品中加入5-20μl1-10μm腺苷二磷酸(ADP)以達(dá)到100％凝集。圖8A顯示如上表示的ADP(1μmol)對誘導(dǎo)對照樣品血小板凝集的影響。注意雙相反應(yīng)(第一凝集作用和第二凝集作用)。圖8B顯示40μl(2mg)H-BLE對ADP誘導(dǎo)的血小板凝集的影響。圖9說明H-BLE對ADP誘導(dǎo)的血小板凝集抑制的劑量依賴性。下面表2列出了關(guān)于含各種濃度活性成分的H-BLE的各級分對ADP誘導(dǎo)的血小板凝集抑制的附加實驗。表2</tables>氨基酸分析(i)氨基酸組成用Pico-Tag氨基酸分析系統(tǒng)(Waters，Miford，Mass.U.S.A.)進(jìn)行肽MB-F13和MB-F14的氨基酸分析。本方法以生成蛋白質(zhì)酸解氨基酸的苯基硫代氨基甲酰衍生物為基礎(chǔ)。具體地，肽MB-F13和MB-F14(1-5μg)樣品在Pico-Tag工作站于110℃在200μl恒定煮沸的含1％(體積/體積)苯酚的HCl中水解24、48、72和120小時。水解產(chǎn)物在室溫下與異硫氰酸苯酯反應(yīng)20分鐘，得到相應(yīng)的苯基硫代氨基甲酰衍生物。用Pico-Tag氨基酸分析系統(tǒng)分析這些衍生物，該分析系統(tǒng)事先用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合校正。表3顯示肽MB-F13和MB-F14的氨基酸組成其它氨基酸的計算值是零或忽略不計。(2)天冬氨酸和谷氨酸值是它們的酸和酰胺的總和。(ii)序列測定在貝克曼LF3400蛋白質(zhì)/肽序列測定儀(貝克更儀器有限公司，F(xiàn)ullerton，加利弗尼亞，美國)上進(jìn)行肽MB-F13和MB-F14氨基酸序列分析。用于動埃德曼降解反應(yīng)中的所有化學(xué)品是高敏感性序列測定試劑，其由降低濃度的異硫氰酸苯酯(PITC)(＜1％PITC/庚烷、二異丙基乙胺(DIPEA)堿、粒狀三氟乙酸(PFA)、乙酸乙酯和DTT、25％TFA/H2O、PTH氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物(Pierce)20pmole/200μl和乙腈/H2O組成，序列測定數(shù)據(jù)由與HPLC聯(lián)機的貝克曼LF3400蛋白質(zhì)/肽序列測定儀獲得，所述的HPLC配備有貝克曼126梯度泵系統(tǒng)、貝克曼168二極管陣列檢測器、柱加熱器、注射器、具有蛋白質(zhì)序列測定軟件的系統(tǒng)Gold軟件和2.1×15cm3μm，MicroPTH柱。肽MB-F13和MB-14各由5個氨基酸殘基組成，并具有下面的氨基酸序列MB-F13Asp-Asp-Asn-Asp-AsnMB-F14Asp-Asp-Ser-Gln-GlnUV光譜圖10A是肽MB-F14的UV光譜，圖10B是肽MB-F13的UV光譜。正如容易確定的，最大吸收度發(fā)生在210-218nm，在260nm沒有吸收。在210-218nm的吸收表明有肽鍵，在260nm無吸收表明肽中不存在芳環(huán)或芳香氨基酸。質(zhì)譜分析(1)儀器裝設(shè)將線性快速掃描質(zhì)譜儀(TOF101，Comstock，Inc.，OakRidge，Tenn.U.S.A)改變調(diào)節(jié)成兩個激光口，一個觀測口，高加速電壓高達(dá)30kv。壓力在離子源區(qū)持續(xù)低于10-8mbar。在探測器頂部上部，1cm加速區(qū)緊接著大直徑(7.13cm)離子透鏡以使透射率最大。透鏡要素的聯(lián)鎖設(shè)計減小了場透入并提供了極好的場均勻性。在215cm飛行軌跡末端，用兩種狀態(tài)微波板組合件檢測離子，偏流至-1800V。因為分析離子的相對低的質(zhì)量，在該項研究中加速電壓保持在10.00kv。即使在高離子流操作期間，兩個高穩(wěn)定性粉末供給(Series205B，BertanAssociates，Inc.，HickSville，N.Y.7)提供無漣波操作。該系統(tǒng)裝有兩個激光源氮激光器以337nm波長發(fā)射(VSL-337ND，LaserScince，Inc.，Newton，Mass.U.S.A.)，和染料激光器(LPD3000，LambadPhysik，Goettingen，德國)。染料激光器(Coumarin540Adye)雙倍輸出在275-290n范圍內(nèi)可調(diào)諧?？旃庾佣O管被用來測定脈沖強弱并監(jiān)測激光器的正常操作。用熱電焦耳儀記錄脈沖能量。在具有最大5％發(fā)射與發(fā)射間強度振幅的5nFWHM脈沖中氮激光傳輸高達(dá)110μJ。但是，平均128次發(fā)射的振幅只在大約1.4％。因此，平均強度振幅的變化可以反映關(guān)于解吸過程的信息。當(dāng)適當(dāng)調(diào)整時，具有12ns脈沖寬度的雙倍染料激光的輸出超過400μJ。用各種衰減器(935-5-OPT，NewportCorp.，F(xiàn)oantainValley，Calif.U.S.A.)調(diào)節(jié)激光輻射度，并通過254mm焦長石英透鏡聚焦到45℃的樣品探測器上。用10X快作用預(yù)放大器(9305型，EG&amp;GORTEC，OakRidge，Tenn.U.S.A.)，通過用各種增進(jìn)放大器組件來擴(kuò)大檢測的緩沖范圍。經(jīng)兩次擴(kuò)大狀態(tài)后，通過快速瞬時數(shù)字轉(zhuǎn)換器(TR8828D，Lecroy，Albuquergue，NM，U.S.A)記錄離子流。在486D/33MHz個人電腦上用特別編制的軟件(TORWARE，IlysSoftware，Pittsburgh，Penn.U.S.A.)進(jìn)行數(shù)據(jù)獲得及分析。為了提供均勻的離子化作用條件，關(guān)鍵儀器參數(shù)-加速電壓、激光輻射度、檢測器偏移在整個研究中保持恒定不變。激光輻射度調(diào)至稍高于最弱響應(yīng)分析物的臨界值并對所有樣品保持該值不變。(ii)樣品制備用3，5-二甲氧基-4-羥基-肉桂酸(芥子酸，SA，Aldrich，Milwaukee，WI)和2，5-二羥基苯甲酸(DHBSigma，St.Louis，MO)作為基質(zhì)進(jìn)行試驗。DHB必須重結(jié)晶兩次以除去原產(chǎn)品中存在的過量的鈉鹽。每天在7∶3(V/V)HPLC級乙腈去離子水混合物中制得新鮮基質(zhì)溶液。分析物自Sigma(Sigma，St.Louis.MO)購得。在0.1％三氟乙酸(TFA)中制備肽母液，達(dá)到5×10-4M濃度。在該試驗中，2μl等份樣品與10μl基質(zhì)溶液在探測器端點(5mm直徑)混合，達(dá)到高于1000基質(zhì)對樣品的比值(為試驗預(yù)混的效果，在微離心試管中渦旋混合后進(jìn)行對照實驗。在干燥過程中基質(zhì)和樣品的自發(fā)混合和渦旋預(yù)混產(chǎn)生相同結(jié)果)。用冷空氣流除去溶劑并使結(jié)晶在探測器端點產(chǎn)生均勻分布。(iii)結(jié)論五肽的質(zhì)譜分析分別在592.3和592.8給出肽MB-F13和MB-F14的M+1離子峰。該數(shù)據(jù)表明分子量是591.3和591.8。由氨基酸組成和序列分析而計算的分子量對于五肽MB-F13和MB-F14分別是591.5和591.7。圖11A是肽MB-F13的高分辨率FAB-MS。圖11B是肽MB-F14的高分辨率FAB-MS。高效毛細(xì)管電泳在貝克曼P/ACE5010系統(tǒng)上進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳。在室溫、電壓20Kv、100mMpH8.3硼酸鹽緩沖液條件下，在75μmI.D.和375μmO.D.的57cm試管(對檢測器50cm)中進(jìn)行肽MB-F13和MB-F14的分離，并在214nm處檢測。圖12A是肽MB-F14的電泳圖，圖12B是肽MB-F13的電泳圖。權(quán)利要求1一種由五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn組成的組合物。2一種由五肽Asp-Asp-Ser-Gl-Gln組成的組合物。3一種抑制血小板凝集的組合物，其主要由血小板凝集抑制有效量的權(quán)利要求1的組合物和其藥物上可接受的載體組成。4一種抑制血小板凝集的組合物，其主要由血小板凝集抑制有效量的權(quán)利要求2的組合物和其藥物上可接受的載體組成。5一種抑制哺乳動物血小板凝集的方法，其包括對所述哺乳動物施用血小板凝集抑制有效量的五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn6一種抑制哺乳動物血小板凝集的方法，其包括對所述哺乳動物施用血小板凝集抑制有效量的五肽Asp-Asp-Ser-Gln-Gln。全文摘要本發(fā)明公開了自未成熟大麥葉中提取的兩種五肽，Asp-Asp-Asn-Asp-Asn和Asp-Asp-Ser-Gln-Gln，其被發(fā)現(xiàn)抑制腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)的人血小板凝集。文檔編號C07K1/14GK1165033SQ9710959公開日1997年11月19日申請日期1997年3月14日優(yōu)先權(quán)日1996年3月14日發(fā)明者M(jìn)·巴達(dá)姆奇恩,萩原義秀,萩原秀昭申請人:萩原義秀