專利名稱：受體配體vegf-c的制作方法
本申請是1996年6月28日提交的序號為08/671,573的美國專利申請的部分繼續(xù)申請，而后者又是1996年2月14日的提交的序號為08/601,132的美國專利申請的部分繼續(xù)申請，而后者又是1996年1月12日提交的序號為08/585,895的美國專利申請的部分繼續(xù)申請，而后者又是1995年8月1日提交的序號為08/510,133的美國專利申請的部分繼續(xù)申請。本申請也是1994年11月14日提交的序號為08/340,011的美國專利申請的部分繼續(xù)申請。
本發(fā)明一般涉及基因工程領(lǐng)域且特別涉及內(nèi)皮細胞生長因子及生長因子基因。
成熟組織的發(fā)育生長，重建和再生以及實體瘤的生長只有伴隨著血管形成才能進行。成血管細胞和造血前體細胞分化于中胚層并形成卵黃囊的血島和胚胎的初級血管系統(tǒng)。來源于這些早期(原位)分化的內(nèi)皮細胞的血管的發(fā)育稱為血管發(fā)生。已確信大部分胚胎血管通過血管發(fā)生而產(chǎn)生，而其余血管樹的形成被認(rèn)為是源于先存在的管的血管生長(一種稱為血管生成的過程)的結(jié)果，Risau等，“發(fā)育生物學(xué)”(Devel.Biol.)，125441-450(1988)。
內(nèi)皮細胞形成幾種功能和形態(tài)不同的管。當(dāng)組織分化并開始執(zhí)行其特定功能時，內(nèi)皮細胞的表型多相性增加?；谏裳艽碳?，內(nèi)皮細胞可以重新進入細胞周期，遷移，從細胞周期中退出并隨后又分化形成功能適應(yīng)其組織環(huán)境的新管。經(jīng)歷血管生成的內(nèi)皮細胞降解原來的基膜并遷移，形成進入血管周基質(zhì)的毛細管生長。Ausprunk等人，“微血管綜述”(Microvasc.Rev.)，1451-65(1977)。在組織發(fā)育和再生過程中的血管形成依賴于內(nèi)皮細胞增殖，遷移，分化，及存活的緊密控制的過程。內(nèi)皮細胞調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能失調(diào)是許多疾病的主要特征。最重要的是，已發(fā)現(xiàn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是血管生成依賴性的。Folkman等人，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)，26710931-10934(1992)。
調(diào)節(jié)細胞生前和分化的主要信號是通過多肽生長因子及其許多為酪氨酸激酯酶的跨膜受體來介導(dǎo)的。酪氨酸激酶插入片段的自身磷酸化肽和活化的受體的羧基末端序列通常能為相關(guān)于效應(yīng)細胞內(nèi)的基因表達重調(diào)的信號傳導(dǎo)的激酶底物所識別。已描述了幾族受體酪氨酸激酶。Van der Geer等人，“細胞生物學(xué)年鑒”(Ann.Rev.Cell Biol.)10251-337(1994)。主要的生長因子和傳導(dǎo)血管生成刺激的受體圖示于

圖1。
已知成纖維細胞生長因子也和血管生成的調(diào)節(jié)相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)其能對培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞促有絲分裂和趨化。成纖維細胞生長因子也能刺激諸如膠原蛋白酶和纖溶酶原激活劑的蛋白酶的生成，并通過內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)管的形成。Saksela等人，“細胞生物學(xué)年度綜述”(Ann.Rev.Cell Biol.)，493-126(1988)。有兩類常見的成纖維細胞生長因子，F(xiàn)GF-1和FGF-2，兩者都缺少常規(guī)的信號肽。兩類都對肝素具有親和力而且FGF-2能結(jié)合于內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)中的硫酸肝素粘蛋白，該硫酸肝素粘蛋白能從位基質(zhì)中于創(chuàng)傷后釋放。肝素能通過生成血管的FGFs而強化內(nèi)皮細胞增殖刺激，兩者都通過預(yù)防該FGFs變性和降解及二聚化。培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞表面FGF-1受體但不表達顯著水平的其它高親和力成纖維細胞生長因子受體。
在受體酪氨酸激酶的其它配體中，已發(fā)現(xiàn)血小板衍生的生長因子，PDGF-BB，在雞絨毛尿囊膜有弱的血管生成作用。Risau等人，生長因子，7261-266(1992)。轉(zhuǎn)化生長因子α(FGFα)是由幾種腫瘤細胞型和巨噬細胞分泌的血管生成因子。肝細胞生長因子(HGF)，C-met原癌基因編碼的受體的配體，也有強烈的血管生成作用。
最近的證據(jù)表明存在有內(nèi)皮細胞特異的生長因子和受體，其可能主要引起刺激內(nèi)皮細胞生長，分化及某些分化的功能。研究得最清楚的是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，PDGF族的一員。VEGF是二硫鍵連接的糖蛋白二聚體的23KD亞單位。報道的VEGF的其它效應(yīng)包括胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)纖溶酶原激活劑和纖溶酶原激活劑抑制劑-1的合成，刺激己糖在內(nèi)皮細胞內(nèi)運輸，及在體外試驗中促進單核細胞遷移。由不同的mRNA剪接變體編碼的四種VEGF同工型表現(xiàn)出相同的刺激內(nèi)皮細胞分裂的能力。然而，每個同工型對細胞表面的粘蛋白具有不同的親和力，而該粘蛋白作為VEGF的低親和力受體。121個和165個氨基酸的VEGF同工型(VEGF121)和(VEGF165)是以可溶形式分泌的，而189個和206氨基酸殘基的同工型保留了細胞表面連接并對肝素具有強烈的親和力。VEGF最初是基于對內(nèi)皮細胞的促分裂活性，同時也可以根據(jù)通過其誘導(dǎo)微血管通透性能力而從幾種來源中提取的，因此，其也稱作血管滲透因子(VPF)。
VEGF表達模式提示其相關(guān)于正常血管系統(tǒng)的發(fā)育和維持以及腫瘤的血管生成。在鼠發(fā)育過程中，在整個交配后(P.C.)的7.5天內(nèi)，內(nèi)胚層表達VEGF，而心室神經(jīng)外胚層在毛細管向內(nèi)生長階段產(chǎn)生VEGF。見Breier等人，“發(fā)育”(Development)，114521-523(1992)。發(fā)育兩天時的鵪鶉，卵黃囊及整個胚胎的血管化區(qū)域有VEGF表達。此外，成年小鼠的跟有孔內(nèi)皮相鄰的上皮細胞有持續(xù)的VEGF表達，提示其在維持此特定的內(nèi)皮表型和功能中的作用。
已描述了VEGF的兩種高親和力受體。它們是VEGFR-1/Flt-1(fms樣酪氨酸激酶-1)和VEGFR-2/Kdr/Flk-1(含有受體的激酶插入片段在/胎兒肝激酶-1)。這些受體歸入PDGF-受體族，但它們有七個而不是五個免疫球蛋白樣環(huán)位于其胞外區(qū)域(如圖1)并且它們比此族中通?？吹降挠懈L的激酶插入片段。VEGF受體的表達主要出現(xiàn)在血管內(nèi)皮細胞，雖然也有一些出現(xiàn)于造血母細胞，單核細胞和黑素瘤細胞。據(jù)報道，只有內(nèi)皮細胞隨VEGF而增殖，而不同來源的內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。因此，通過VEGFR-1和VEGFR-2介導(dǎo)的信號表現(xiàn)出細胞型的特異性。最近發(fā)現(xiàn)VEGF相關(guān)的胎盤生長因子(PLGF)以高度的親和力結(jié)合于VEGFR-1。PLGF能增強VEGF的生長因子活性，但其本身不刺激內(nèi)皮細胞。天然產(chǎn)生的VEGF/PLGF異源二聚體幾乎和VEGF同源二聚體對內(nèi)皮細胞是同樣強度的促細胞分裂劑。Cao等人，生物化學(xué)雜志，2713154-62(1996)。
Flt4受體酪氨酸激酶(VEGFR-3)在結(jié)構(gòu)上和VEGFR-1和VEGFR-2基因的產(chǎn)物密切相關(guān)。盡管有這種相似性，F(xiàn)lt4的突變型不同于VEGF受體，其中在胞外區(qū)被蛋白酶解剪切成兩個二硫鍵連接的多肽。Pajusola等人，“腫瘤研究”(Cancer Res.)，525738-5743(1992)。4.5和5.8kb Flt4mRNAs編碼多肽，而因為使用了變更的3′外顯子，所以它們在其C-末端不同。VEGF或者PLGF同工型并不表現(xiàn)出對Flt4的特異結(jié)合或者誘發(fā)其自身磷酸化。
Flt4的表達顯示出比VEGFR-1或者VEGFR-2的表達更具有限制性。Flt4表達首先在P.C.8.5天鼠胚胎的頭間質(zhì)的成血管細胞，主要靜脈，以及胚胎外，尿囊可通過原位雜文而檢測到。在P.C.12.5天的胚胎中，F(xiàn)lt4信號可在正發(fā)育的靜脈以及推測的淋巴管內(nèi)皮處觀察到，但動脈內(nèi)皮卻呈陰性。在發(fā)育的后期，F(xiàn)lt4 mRNA變得局限于發(fā)育著的淋巴管。淋巴管內(nèi)皮和一些成熟的高級內(nèi)皮小靜脈在成人組織內(nèi)表達Flt4 mRNA并在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)的淋巴竇和淋巴管瘤中有增強表達。這些結(jié)果支持了靜脈起源于淋巴管的理論。
至此，已描述了五種內(nèi)皮細胞特異的受體酪氨酸激酶Flt-1(VEGFR-1)，KDR/Flk-1(VEGFR-2)，F(xiàn)lt4(VEGFR-3)，Tie，以及Tek/Tie-2，它們具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必需的固有酪氨酸激酶活性。已發(fā)現(xiàn)在鼠胚胎中定向突變滅活Flt-1，F(xiàn)lk-1，Tie，及Tek在分子水平上對血管發(fā)生和血管生成起著必要的和特殊的作用。VEGFR-1和VEGFR-2以高親和力(kd分別為16pM和760pM)結(jié)合VEGF而VEGFR-1也結(jié)合相關(guān)的胎盤生長因子(PLGF；kd約為200pM)。于PCT申請公開WO96/11269中報導(dǎo)了Tek的一個配體。
本發(fā)明提供了一個稱為VEGF-C的酪氨酸激酶Flt4受體(VEGF-3)的配體。因此，本發(fā)明提供了一個提純和分離的能結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的Flt4配體能在宿主細胞內(nèi)刺激Flt4受體酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化并表達Flt4受體酪氨酸激酶。本發(fā)明優(yōu)選的配體是哺乳動物多肽。高度優(yōu)選的配基是人多肽。如下文所詳述，將含有彼此相聯(lián)的或者和其它多肽相聯(lián)的本發(fā)明的多肽的二聚體和多聚體特別地考慮作為本發(fā)明的配體。
在一實施方案中，F(xiàn)lT4配體多肽是有通過在還原SDS-PAGE測定的大約為23KD的分子量。例如，本發(fā)明包括由大約為23KD的一種或多種多肽所組成的配體，而該多肽可于條件培養(yǎng)基中從PC-3前列腺癌細胞系中純化，該細胞系具有ATCC保藏號No.CRL 1435。該PC-3細胞衍生配體多肽的氨基酸測序表明該配體多肽包括序列13所示的氨基末端氨基酸序列。含F(xiàn)lt4配體的條件培養(yǎng)基本身是本發(fā)明的一個方面。本發(fā)明也提供了PC-3前列腺癌細胞系的新的用途，即產(chǎn)生Flt4配體。在一個優(yōu)選的實施方案中，該配體可以直接從PC-3細胞培養(yǎng)基中提純和分離。
在一個高度優(yōu)選的實施方案中，配體多肽包含序列33所示的氨基酸序列片段，其可特異地和人Flt4受體酪氨酸激酶結(jié)合。典型的片段包括含有序列33的從大約112位殘基到大約213位殘基的氨基酸序列的多肽；含有序列33的從大約104位到大約227位殘基的氨基酸序列的多肽；及含有序列33的從大約112到227位殘基的氨基酸序列的多肽。其它典型片段包括序列33的橫跨序列33的大約以下殘基的氨基酸序列的多肽31-213，31-227，32-227，103-217，103-225，104-213，113-213，103-227，113-227，131-211，161-211，103-225，227-419，228-419，31-419，及1-419位，如下文所詳述。
本發(fā)明也提供Flt4配體的一種或多種多肽前體，其中的一個這樣的前體(稱為“前-VEGF-C”)包括序列33所示的全部氨基酸序列(氨基酸殘基1-419)。因此，本發(fā)明包括具有如序列33所示的氨基酸序列1-419位殘基的純化的和分離的多肽。當(dāng)在合適的宿主細胞中表達時，根據(jù)本發(fā)明的配體前體通過裂解產(chǎn)生特異結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽。一個推定的102個氨基酸前導(dǎo)(前)肽和序列33所示的氨基酸序列相同。因此，在一個相關(guān)的方面，本發(fā)明包括一個純化并分離的具有如序列33所示的103-419位殘基的氨基酸序列的多肽。
在一個實施方案中，一個表達的Flt4配體多肽前體在表達時被蛋白酶切成大約23KD Flt4配體多肽。因此，提供了一個Flt4配體多肽，其為如序列33所示的前體多肽的裂解產(chǎn)物并具有在還原態(tài)下的大約23KD的分子量。
一個由分子量約29和32KD多肽組成的推定VEGF-C前體或者剪接變體也作為本發(fā)明的一個方面。
在另一個實施方案中，一個表達的Flt4配體在表達時被蛋白酶切成大約21KD VEGF-C多肽。序列分析表明所測的21KD型具有23KD型的氨基末端下游大約9個氨基酸的氨基末端，提示可變的切割位點的存在。
從前文可知本發(fā)明的一方面包括具有如序列33所示的1-419位殘基的氨基酸序列的提純的和分離的多肽片段，該片段能特異結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶。優(yōu)選的實施方案包括在還原態(tài)下通過SDS-PAGE測定的表觀分子量約為21/23 KD和29/32 KD的片段。
數(shù)據(jù)提示保留Flt4配體活性所必需的氨基酸包括于序列33的大約103/112-226/227位的氨基酸序列，并且C-末端蛋白酶切以產(chǎn)生成熟的天然的Flt4配體發(fā)生于序列33的大約226-227位氨基酸位點。相應(yīng)地，一個優(yōu)選的Flt4配體包括序列33的大約103-227位氨基酸。
本文所述的VEGF-C突變分析表明通過限定C-末端的天然加工剪切而產(chǎn)生的天然的橫跨序列33的103-227位氨基酸的VEGF-C多肽存在并有如Flt4配體的活性。已發(fā)現(xiàn)由序列33的104-213位殘基所組成的多肽片段保留了VEGF-C的生物活性。此外，突變分析表明只有橫跨序列33的113-213位氨基酸的多肽才保留Flt4配體活性。相應(yīng)地，優(yōu)選的多肽包括大約橫跨序列33的103-227，104-213，或者113-213位殘基的序列。
此外，VEGF族的成員的多肽序列對比表明更小的片段還會保留生物學(xué)活性，而這些更小的片段也要作為本發(fā)明的方面。尤其是，多肽VEGF族的八個高度保守的半胱氨酸殘基定義了序列33的131-211位殘基區(qū)域(見圖10和31)；因此，預(yù)測橫跨大約131-211位殘基的多肽可以保留VEGF-C生物學(xué)活性。事實上，含有大約161-211位殘基并保留了進化上保守的RCXXCC基序的多肽被假定為保留了VEGF-C活性，因此也作為本發(fā)明的一個方面。VEGF-C的一些保守的半胱氨酸殘基參于了鏈間二硫鍵以生成各種天然的VEGF-C多肽的同源和異源二聚體。除開先前的考慮，還有缺乏鏈間二硫鍵的VEGF-C多肽保留了VEGF-C生物學(xué)活性的證據(jù)。相應(yīng)地，本發(fā)明的材料和方法包括所有的至少保留了VEGF-C的一種生物學(xué)活性VEGF-C片段，無論其存在或不存在鏈間二硫鍵。本發(fā)明也包括含有彼此連接或者連接于其它多肽的這種片段的多聚體(包括二聚體)。片段連接可以通過多肽鏈的共價連接(如二硫鍵)或者非共價連接(如氫鍵，通過穩(wěn)定的或者誘導(dǎo)的偶極間相互作用的鍵，通過疏水的或者親水的相互作用的鍵，這些鍵的機理的組合，及類似作用)。
在另一個相關(guān)的方面，本發(fā)明包括前述多肽的變體和類似物，包括VEGF-C，VEGF-C前體，及VEGF-C片段。本發(fā)明所考慮的變體包括具有不同于VEGF-C，VEGF-C前體及VEGF-C片段的氨基酸序列的純化的和分離的多肽，其是通過本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所知的保守取代，或者通過與至少保留VEGF-C的一種生物學(xué)活性的氨基酸殘基相一致的加入或刪除而形成。
本發(fā)明考慮的類似物包括具有不同于VEGF-C，VEGF-C前體，或者VEGF-C片段中所見的對一種或多種氨基酸殘基進行修飾但與保留VEGF-C，VEGF-C前體，或者VEGF-C片段的至少一種生物學(xué)活性相一致的多肽。例如，本發(fā)明范圍內(nèi)的類似物包括糖基化變體和綴合物(前述多肽結(jié)合到如標(biāo)記物，毒素等化合物上)。
本發(fā)明也提供了用于編碼本發(fā)明的多肽的純化的和分離的多核苷酸(即核酸)，例如cDNA或相應(yīng)的編碼VEGF-C前體，VEGF-C，或者生物活性片段或其變體的基因組DNA。本發(fā)明優(yōu)選的核酸包括編碼序列33的1-419位氨基酸殘基或者一種前述片段的DNA。由于遺傳密碼的簡并性，可能有許多這樣的編碼序列，每個均有共同的編碼序列33或其他片段所示的氨基醇序列的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也包括這些多核苷酸的類似物，或者任何一種編碼至少保留了VEGF-C的一種生物學(xué)活性的這些多核苷酸的衍生物。根據(jù)本發(fā)明DNA多核苷酸包括基因組DNAs，cDNAs，以及含有VEGF-C片段的編碼序列的寡聚核苷酸，或者至少保留了VEGF-C的一種生物活性VEGF-C片段的類似物。基于遺傳密碼的簡并性，編碼本發(fā)明的多及的不同多核苷酸均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)計了具有在某種意義上不同于編碼VEGF-C片段的多核苷酸的序列的多核苷酸，從而如本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所理解的那樣，導(dǎo)致了所編碼的多肽間保守氨基酸的差異。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的多肽包括序列32所述的352-1611位核苷酸的人VEGF-C cDNA序列。其它按本發(fā)明的多核苷酸編碼來源于，如除人類外的哺乳動物，鳥類(如鵪鶉鳥)，及其它的VEGF-C多肽。本發(fā)明的其它多肽還包括VEGF-C片段的編碼序列，以及DNAs的那些編碼部分或全部VEGF-C的等位變體。
本發(fā)明還包括那些能和前述的多核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。典型的嚴(yán)格雜交條件如下在50％甲酰胺，5×SSC，20mMNa.PO4，pH6.8于42℃下雜交并在0.2×SSC于55℃下洗滌。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能理解的是這些條件的改變可以基于待雜交序列長度和GC核苷酸含量。本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)公式適于檢測合適的雜交條件。見Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(第二版，冷泉港實驗室出版社1989)§§9.47-9.51。這些能和編碼VEGF-C，VEGF-C片段，或者VEGF-C類似物雜交的多核苷酸用作核苷酸探針以鑒定，提純和分離編碼其它(非人類)哺乳動物VEGF-C型的多核苷酸。此外，這些多核苷酸用于本發(fā)明如下文所述的篩選方法。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸探針包括序列32的至少大約16個連續(xù)核苷酸的核酸序列。更優(yōu)選地，這些核酸探針至少具有序列32的子序列的大約20個核苷酸。在使用這些核酸探針時，優(yōu)選地，該探針特異地雜交到序列32所示序列的一部分。這里的特異雜交定義為在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格雜交條件下的雜交。為了特異地鑒定和分離其它哺乳動物VEGF-C基因，核酸探針優(yōu)選地為那些不能和VEGF-C相關(guān)基因雜交的(如不飽和人VEGF或者人VEGF-B基因雜交的)。
因此，本發(fā)明包括至少含有大約16個核苷酸的多核苷酸，其中的多核苷酸能和編碼VEGF-C的基因(如人基因)特異雜交。該雜交的特異性確保了本發(fā)明的多核苷酸能在一定雜交條件下雜交于編碼VEGF-C的核酸，而該條件不支持該多核苷酸雜交于編碼諸如VEGF或者VEGF-B的核酸。在一個實施方案中，至少大約16個核苷酸和優(yōu)選的至少大約20個核苷核苷酸的多核苷酸選作序列32的連續(xù)核苷酸序列或者序列32所述的核苷酸序列的互補序列。
本發(fā)明的另外的方面包括含有本發(fā)明的核酸的載體；以及用本發(fā)明的核酸或者載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。本發(fā)明優(yōu)選的載體是這樣的表達載體，其中本發(fā)明的核酸操作地連接于合適的啟動子和其它控制序列，從而用該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的合適的宿主細胞能表達Flt4配體。優(yōu)選的本發(fā)明載體是質(zhì)粒pFlT4-L，其具有ATCC登記號第97231。這種載體和宿主細胞用于重組生產(chǎn)VEGF-C多肽。
本發(fā)明還包括制備本發(fā)明的多肽的方法。在一優(yōu)選的方法中，本發(fā)明的核酸或載體在宿主細胞中表達，而本發(fā)明的多肽從宿主細胞或宿主細胞生長培養(yǎng)基中提純。
在一個相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明包括制備能特異性地結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽，包括步驟(a)用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞；(b)培養(yǎng)該宿主細胞以表達該核酸；以及(c)從宿主細胞或該宿主細胞生長培養(yǎng)基中提純能特異性地結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽。
本發(fā)明也包括用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的純化的和分離的Flt4的多肽配體。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括事實上沒有其它人源多肽的人VEGF-C多肽或其生物活性片段。
在另一方面，本發(fā)明包括能特異地和本發(fā)明的多肽，或者和本發(fā)明的多肽共聚體特異反應(yīng)的抗體。單克隆和多克隆的抗體均可以根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)制備以抗本發(fā)明的多肽。該抗體可用于診斷的用途以監(jiān)測血管生成，血管化，淋巴管及其疾病狀態(tài)，傷口愈合，或者某些腫瘤細胞，造血的，或白血病細胞。該抗體可用于封閉活化的Flt4受體的配體。
根據(jù)本發(fā)明配體可用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記并用于在原位鑒定其相應(yīng)的受體。標(biāo)記的Flt4配體和抗-Flt4配體抗體可用作造影劑用于檢測淋巴管，高級的內(nèi)皮微靜脈及其疾病狀態(tài)，以及在組織化學(xué)組織切片中表達的Flt4受體。該配基或者抗體可共價地或非共價地偶聯(lián)到合適的超磁性，順磁性，電子稠密，產(chǎn)生回聲，或放射性的試劑上以造影。其它諸如生物素和親和素的非放射性標(biāo)記物也可以使用。
本發(fā)明的一個相關(guān)的方面是檢測特定細胞如內(nèi)皮細胞的方法。這些細胞可見于體內(nèi)或者來自體內(nèi)的生物組織標(biāo)本中。該檢測方法包括以下步驟將含諸如內(nèi)皮細胞的生物組織在本發(fā)明的多肽能結(jié)合于細胞上的條件下接觸該能結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽，任選洗滌該生物組織，并在檢測結(jié)合至該生物組織的細胞的多肽，從而檢測該細胞。
本發(fā)明也提供了所要求的配體的診斷和臨床用途。在一優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)lt4配體或前體用于加速血管形成(如在創(chuàng)傷愈合中)或者促進淋巴管的內(nèi)皮功能。也建議利用VEGF-C作為血管生成誘發(fā)劑而用于組織移植，眼病，梗塞后的動脈狹窄周圍并進入創(chuàng)傷組織的旁系管的形成。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以用任何使用合適的藥學(xué)可接受的賦形劑如藥學(xué)可接受的稀釋劑，輔劑，賦形劑或者載體的合適的方式給藥。VEGF-C多肽也可用。在結(jié)合檢測或使用可檢測的標(biāo)記的VEGF-C的試劑盒中檢測活檢材料中活性受體或配體的存在而測定未來的轉(zhuǎn)移危險性。根據(jù)本發(fā)明的Flt4配體也可用于促進諸如組織移植病人的淋巴管的重建或滲透性。此外，F(xiàn)lt4配體也可用于癌癥(如乳腺癌)治療中的外科手術(shù)后后減輕輔助淋巴管的損失。根據(jù)本發(fā)明的配體也可用于治療或預(yù)防炎癥，浮腫，淋巴管發(fā)育不全，淋巴阻塞，象皮病和Milroy′s病。最后Flt4配體可用于刺激淋巴細胞產(chǎn)生和成熟，并促進或抑制組織和淋巴管間的白細胞運輸或者影響胸腺內(nèi)外的遷移。
本發(fā)明包括一種篩選受治療哺乳動物體的內(nèi)皮細胞病的方法。該方法包括從該受治療體者內(nèi)取內(nèi)皮細胞樣，將內(nèi)皮細胞樣和根據(jù)權(quán)利要求4的多肽接觸，測定該細胞的生長率，并建立起生長率和疾病的關(guān)系。在一個優(yōu)選的實施方案中，該受治療哺乳動物是人類而內(nèi)皮細胞是人細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該疾病是脈管病，如淋巴管病，諸如由于外科手術(shù)的淋巴管損失或者由于阻塞而致的現(xiàn)有淋巴管的功能減弱。在另一實施例中，該內(nèi)皮細胞在體外和該多肽接觸。在該方法中測定的生長速率是每一單位每時間的細胞分裂速率，其是通過本領(lǐng)域周知的許多技術(shù)之任一種測定的。生長速率和疾病的關(guān)系可以是正或負相關(guān)，例如，如下文所述的該多肽是否有Flt4配體活性或是該活性的抑制劑。
Flt4配體的抑制劑可用于控制內(nèi)皮細胞增殖，淋巴管瘤和癌癥轉(zhuǎn)移。例如，該抑制劑可用于阻止轉(zhuǎn)移癌生長或擴散，或者控制內(nèi)皮細胞表達和生長的其它方面。抑制劑包括抗體，反意寡核苷酸，以及阻斷該Flt4受體的多肽，以上都將要為本發(fā)明的一個方面。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受治療哺乳動物體內(nèi)皮細胞生長的方法，包括以下步驟將哺乳動物內(nèi)皮細胞暴露于按本發(fā)明的有效量的多肽以調(diào)節(jié)該哺乳動物內(nèi)皮細胞的生長。在一個實施方案中，該生長的調(diào)節(jié)可通過使用能在宿主細胞中刺激Flt4受體酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化并表達Flt4受體酪氨酸激酶而實現(xiàn)。在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的生長中，本發(fā)明考慮了對與內(nèi)皮細胞有關(guān)的疾病的調(diào)節(jié)。本發(fā)明考慮的內(nèi)皮細胞疾病包括，但不局限于，淋巴管(如腋部淋巴組織的外科手術(shù)去除)的機械損失，淋巴管阻塞(如象皮病)，和淋巴管瘤。在一個優(yōu)選的實施方案中，受治療者和內(nèi)皮細胞是人類。該內(nèi)皮細胞可在體外或體內(nèi)試驗中提供，并且可包含于組織移植中。這里將有效量多肽定義為通過經(jīng)驗確定的要達到細胞生長速率的可重現(xiàn)的改變所必需的多肽量(通過顯微或肉眼觀察顯示以及測定細胞增倍時間，或者核酸合成檢測)，正如任何一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的那樣。
本發(fā)明也提供了用所要求的核酸(如多核苷酸)篩選內(nèi)皮細胞疾病的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一個篩選受試驗哺乳動物體中內(nèi)皮細胞病的方法，包括步驟從受試者中取內(nèi)皮細胞核酸樣，將該樣品和本發(fā)明的能雜交于編碼VEGF-C(及優(yōu)選地能雜交于VEGF-C mRNA)的基因的多核苷酸接觸，測定該內(nèi)皮細胞核酸和該多核苷酸間的雜交水平，以及確定該雜交水平和疾病的關(guān)系。優(yōu)選的哺乳動物受試者及內(nèi)皮細胞核酸來源是人類。本方法考慮的用多核苷酸篩選的疾病包括，但不局限于，諸如前述的淋巴管病，及缺氧的脈管疾病。
純化的和分離的編碼其它(非人類)VEGF-C型的多核苷酸也是本發(fā)明的方面，由其編碼的多肽以及和該非人類VEGF-C變體特異地免疫反應(yīng)的抗體也是本發(fā)明的方面。優(yōu)選的非人類VEGF-C型是衍生于其它脊椎動物種類(包括鳥類和哺乳動物種類)的類型。高度優(yōu)選的是哺乳動物型。因此，本發(fā)明包括純化和分離的哺乳動物VEGF-C多肽，也包括純化和分離的編碼這些多肽的多核苷酸。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括純化的和分離的具有序列41的第1-415個殘基的氨基酸序列的多肽，而該氨基酸序列與推斷的小鼠VEGF-C前體相一致。據(jù)認(rèn)為該推斷的小鼠VEGF-C前體被以與加工人前多及相類似的方式來加工成成熟的小鼠VEGF-C。因此，在一個相關(guān)的方面，本發(fā)明包括純化的和分離的能特異結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶(如人或小鼠Flt-4受體酪氨酸激酶)的多肽，該多肽包括具有序列41的第1-415位殘基的氨基酸序列的純化和分離多肽片段，而該片段能特異結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶。本發(fā)明還包括前述多肽和編碼前述多肽的純化和分離的核酸(如包括序列40所示的序列的全部或部分的核酸)的多聚體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括純化和分離的鵪鶉VEGF-C多肽，生物活性片段及其多聚體，以及編碼前述多肽的多核苷酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括含VEGF-C啟動子的DNA，其能在天然宿主細胞中于VEGF-C能在這些細胞中表達的條件下促進VEGF-C基因或另一個操作地連接的編碼蛋白質(zhì)的基因的表達。
附圖的簡要說明圖1示相關(guān)于血管發(fā)生和血管生成的主要內(nèi)皮細胞受體酪氨酸激酶和生長因子。圖示的主要結(jié)構(gòu)域包括免疫球蛋白樣區(qū)域(IGH)，表皮生長因子同源區(qū)域(EGFH)，纖維結(jié)合蛋白III型區(qū)域(FNIII)，跨膜(TM)和近膜(JM)區(qū)域，酪氨酸激酶(TK1，TK2)區(qū)域，激酶插入片段區(qū)域(KI)，以及C-末端區(qū)域(CT)。
圖2示PLTRFLt4L表達載體的構(gòu)建。
圖3示編碼分泌的可溶性的Flt4胞外區(qū)域(Flt4Ec)的桿狀病毒載體的構(gòu)建。
圖4示通過條件培養(yǎng)基從PC-3細胞培養(yǎng)物中刺激Flt4自身磷酸化的結(jié)果。
圖5A，5B和5C示用PC-3條件培養(yǎng)基刺激的Flt4轉(zhuǎn)染的細胞的主要酪氨酰磷酸化多肽是125KD Flt4多肽(VEGFR-3)，并且該Flt4刺激活性不被吸附于肝素-瓊脂糖凝膠。
圖6示分離自PC-3條件培養(yǎng)基的Flt4配體活性的Western免疫印跡檢測。
圖7示源自分離于濃縮的PC-3條件培養(yǎng)基的Flt4配體(VEGF-C)親和純化的色譜組分的凝膠電泳結(jié)果。
圖8示對齊排列以示其相似性的人，鼠，和鵪鶉VEGF-C多肽的氨基酸序列。全部三個物種中的保守殘基以黑體排出。
圖9示Flt4配體，VEGF-C的克隆和結(jié)構(gòu)。該VEGF同源區(qū)(陰影盒)和氨基及羧基末端前肽(分別為淺陰影盒和無陰影盒)以及推定的信號序列(SS)圖示于5′和3′非翻譯(μt)核酸區(qū)之間。信號序列和氨基及羧基末端前肽的切割位點用三角表示。
圖10示推定的PDGF-A，-B，PLGF-1，VEGF-B167，VEGF165，及Flt4配體(VEGF-C)的氨基酸序列的對照。
圖11示人VEGF-C基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。七個外顯子圖示為開放盒，外顯子大小用堿基對表示。內(nèi)含子圖示為線，內(nèi)含子大小(堿基對)示于線上。推定的2.4kb成熟mRNA的5′和3′非翻譯序列表示為陰影盒。用于描述VEGF-C基因的基因組克隆的定位圖示于基因圖譜下。
圖12示在兩個人腫瘤細胞系和腦組織中編碼VEGF，VEGF-B和VEGF-C(稱為“FLT4-L”)的基因的Northern印跡檢測。
圖13A示脈沖追蹤實驗后分離的并通過在還原態(tài)下SDS-PAGE電泳的重組VEGF-C的放射自顯影。
圖13B是示重組VEGF-C型是在非還原態(tài)下二硫鍵連接的聚丙烯酰胺凝膠照片。
圖14A和14B示證明VEGF-C刺激VEGFR-2(KDR)的自身磷酸化但并不影響PDGFR-β磷酸化的Western印跡。
圖15A示VEGF-C在三維膠原凝膠檢測中刺激內(nèi)皮細胞遷移。
圖16A示人成熟組織中VEGF-C mRNA的表達。
圖16B示所選擇的人胎兒組織中VEGF，VEGF-B，和VEGF-C的表達。
圖17示人類和鼠VEGF-C基因的基因組結(jié)構(gòu)。外顯子-內(nèi)含子連接序列用外顯子和內(nèi)含子長度共同表示。內(nèi)含子序列用下行字母表示。VEGF-C cDNAs中所測定的開放閱續(xù)框的核苷酸如上行三聯(lián)體字母所示(相當(dāng)于在接頭處編碼的密碼子)。
圖18示VEGF-C加工，包括主要的VEGF-C型。
圖19示脈沖追蹤免疫沉淀試驗的放射自顯影，其中用VEGF-C表達載體(VEGF-C)轉(zhuǎn)染的細胞和模擬轉(zhuǎn)染細胞(M)是以放射性氨基酸脈沖標(biāo)記并在不同的時間長度時追蹤。
圖20示K14-VEGF-C載體構(gòu)建的圖。
圖21A-C示轉(zhuǎn)染的293 EBNA細胞產(chǎn)生的各種類型重組VEGF-C的電泳分離。圖21B示在非還原態(tài)下的電泳分離模擬(M)軌染細胞，用野生型(wt)VEGF-A cDNA轉(zhuǎn)染的細胞，以及用編碼VEGF-C-R102S的cDNA變體轉(zhuǎn)染的細胞。將圖21B鑒定的每一條帶切除并在還原態(tài)下于一分離的泳道中電泳分離。相當(dāng)于VEGF-C重量的帶的分級分離圖示于圖21A；相當(dāng)于R102S變體的帶分級分離圖示于圖21C。
圖22A-B示通過非還原態(tài)凝膠電泳檢測的野生型和突變型重組VEGF-Cs的類型和大小。圖22A示分泌入培養(yǎng)基的VEGF-C類型；圖22B示由細胞保留的VEGF-C類型。模擬(M)轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。
圖23A-B代表使用抗血清882和抗血清905免疫沉淀，標(biāo)記的VEGF-C類型的模式對比。相鄰的泳道含有經(jīng)過(標(biāo)記+泳道)或未經(jīng)過(標(biāo)記為一的泳道)還原和烷基化的免疫沉淀物。
圖24A-B代表分離自生長于有或無白細胞介素(IL-1)和/或地塞米松(DEX)中指定時間的總RNA的Northern印跡。圖24B的Northern印跡是以來源于含堿基對57-638(Gene bank登記號X15997)的VEGF 581 bp cDNA，和人VEGF-B167 cDNA片段(核苷酸1/382，Gene bank，登記號U 48800)的放射標(biāo)記DNA探測的。圖24A的Northern印跡是用來源于人全長VEGF-C cDNA(Genebank登記號X94216)的放射標(biāo)記DNA探測的。18S和28S-rRNA作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。
圖25示用VEGF-C cDNA轉(zhuǎn)染，單獨用載體轉(zhuǎn)染的巴斯德畢赤氏酵母(P.Pastoris)培養(yǎng)物，或者模擬(M)轉(zhuǎn)染在用甲醇于誘發(fā)所示的各段時間后的VEGF-C表達。取大約10μl培養(yǎng)基凝膠電泳檢測，隨后通過Western印跡并用抗VEGF-C抗血清檢測。
圖26示-Western印跡結(jié)果，其中表達VEGFR-3(Flt4)的NIH 3T3細胞，以及表達VEGFR-2(KDR)的PAE細胞是用5×濃縮的源于用含VEGF-C cDNA載體(+)轉(zhuǎn)染的畢赤氏酵母的培養(yǎng)基，用缺插入片段(-)的載體刺激的，或者用陽性對照礬酸鹽刺激的。將該刺激的細胞裂解并用VEGFR特異性的抗體免疫沉淀，并將該免疫沉淀物印跡并用抗磷酸酪氨酸抗體探測。
圖27A-B示人VEGF-C(wt)和宿主293EBNA細胞分泌(圖27A)或保留(圖27B)的VEGF-C變體。模擬(M)轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。分子量標(biāo)記物如左邊用千道爾頓(KD)所示。
圖28A-B示以野生型(wt)VEGF-C，以及三種VEGF-C多肽變體刺激成自身磷酸化的VEGFRs的Western印跡。細胞裂解物(VEGFR-3的NIH 3T3及VEGFR-2的PAG)經(jīng)過受體-特異性的抗血清而該受體被免疫沉淀。然后，凝膠分離該免疫沉淀物并印跡以進行Western檢測。用抗磷酸化酪氨酸抗體探測該Western印跡。
圖29A-D蘇木精-伊紅染色的K14-VEGF-C轉(zhuǎn)基因的和對照鼠同窩幼畜組織的顯微照片。顯示是從背部皮膚和吻部的區(qū)域，如圖示。白色箭頭表示無紅細胞的腔隙的內(nèi)皮排成的界限。
圖30代表來源于所示組織的聚腺苷酸化RNA，用VEGF，VEGF-B167，以及VEGF-C探針的集合庫雜交的Northern印跡。預(yù)計的轉(zhuǎn)錄物大小以千堿基(kb)標(biāo)于右側(cè)。
圖31代表人和鼠VEGF-C氨基酸序列的對照。鼠VEGF-C的氨基酸序列列于上線而人序列中的差異標(biāo)于下線。標(biāo)記該序列以描述圖9中所示的區(qū)域。箭頭示信號肽酶的推定切割位點；BR3P基序以及CR/SC基序裝于盒中；而保守的半胱氨酸殘基以黑體標(biāo)示序列上。精氨酸殘基158也以黑體標(biāo)記。數(shù)字指鼠VEGF-C殘基。
圖32示SDS-PAGE分離的免疫沉淀于或親和純化于各種35S-標(biāo)記的培養(yǎng)基的樣品。在左側(cè)的泳道中，來源于只含載體的Bosc 23的細胞的對照培養(yǎng)基，來源于表達人VEGF-C細胞的培養(yǎng)基，以及源于表達鼠VEGF-C細胞的培養(yǎng)基分別用偶聯(lián)到瓊脂糖的人VEGFR-3胞外域沉淀。在右側(cè)泳道，類似的條件培養(yǎng)基用抗-VEGF-C抗體沉淀。mwm分子量標(biāo)記物；m-鼠；h-人；α-抗。
圖33示凝膠分離的源于來自表達VEGFR-3或者VEGFR-2的NIH3T3細胞的裂解物的免疫沉淀物的Western印跡，如圖示，而該細胞已通過和含裂解物(或者載體對照)接觸而刺激，作為VEGF-C-誘發(fā)的受體自身磷酸化的測定。用抗磷酸化酪氨酸(α-PTyr)或抗-受體抗血清(抗VEGFR-3和抗VEGFR-2)探測該Western印跡。作為對照，用礬酸鹽處理(VO4)誘發(fā)受體自身磷酸化。箭頭和數(shù)字代表酪氨酰磷酸化受體多肽帶的表觀分子量。bVEGF人桿狀病毒VEGF-C蛋白；C-FGEVm源于帶有以反義方向克隆入載體的鼠VEGF-C cDNA的細胞的裂解物。
圖43A-D示在12.5天鼠胚胎的旁矢狀面切片上的原位雜交檢測VEGF-C和VEGF-B mRNAs的表達的顯微照片。圖34AVEGF-C探針；i-頸靜脈，mn-后腎，m-小腸系膜(箭頭)，VC-椎間管，lu-肺(箭頭)。圖34BVEGF-B探針；h-心臟，鼻咽區(qū)(箭頭)。圖34CVEGF-C有義鏈探針作為對照。圖34D34C所示的同樣區(qū)域的亮視野顯微照片。
圖35A-H示提供VEGF-C和VEGFR-3在頸靜脈和腸系膜區(qū)域表達的對比的鼠胚胎切片。圖35A和35C示VEGF-C轉(zhuǎn)錄體在大囊一樣結(jié)構(gòu)周圍的后腎在頸靜脈區(qū)域(箭頭)的表達。圖35B和35D示VEGFR-3轉(zhuǎn)錄體在頸靜脈囊的表達。圖35E和35G示P.C.15天的胚胎的后腎區(qū)以及腸周圍的VEGFR-3 mRNA分布。圖35F和35H示14.5天胚胎的腸系膜區(qū)，以及腸區(qū)，發(fā)育著的淋巴管，以及靜脈的VEGFR-3 mRNA。
圖36A-D示P.C.16天的鼠胚胎頭部的FLT4和VEGF-C的原位雜交的顯微照片。用Flt4探針(圖36A)雜交的頭部切片示發(fā)育著的口鼻部，鼻結(jié)構(gòu)和眼睛。較后位置的切片示和VEGF-C探針(圖36B)的雜交。上部兩側(cè)的圓形結(jié)構(gòu)代表發(fā)育著的磨牙。中線兩側(cè)上(背)部，可見發(fā)育著的甲的后部。這些結(jié)構(gòu)也顯示于高倍放大的暗視野(圖36C)以及亮視野(圖36D)顯微鏡。
本發(fā)明的詳述本文描述的是新的血管內(nèi)皮生長因子的分離以及從制備于人前列腺癌細胞系PC-3的cDNA文庫進行的編碼該新的生長因子的DNA的克隆。該分離的cDNA編碼一種能蛋白酶解加工并分泌入細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)。稱為VEGF-C的該分泌蛋白結(jié)合于Flt4的胞外域并誘發(fā)Flt4和VEGFR-2的酪氨酸自身磷酸化。VEGF-C也刺激內(nèi)皮細胞在膠原凝膠中的遷移。
這里報道的資料顯示VEGF-C是以一較大的前體表達的，然后再切割成該配體。某些情況下的共表達區(qū)源于該配體基因的RNA的其它剪切。該共表達區(qū)可隨著用于獲得該配體的特定表達系統(tǒng)而變化。熟練的技術(shù)人員明白在蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)中，附加序列可以伴隨著依賴于用于表達該蛋白的特定重組構(gòu)建體的功能多肽而表達，并隨后除去以獲得所需的配體。某些情況下，可制得缺少內(nèi)源/天然配體的某些殘基的重組配體。此外，周知的是在蛋白質(zhì)中可進行保守取代而不改變該蛋白的功能。相應(yīng)地，可想像該變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，可預(yù)料的是一種或更多種VEGF-C前體(最大推定的天然分泌型VEGF-C前體具有序列33的從32到419位殘基的全部氨基酸序列)能在無任何進一步加工的條件下刺激該Flt4配體，其是以類似于VEGF在信號序列分泌和伴隨的釋放后以未加工形式刺激其受體的方式而進行。
本文報道的結(jié)果顯示Llt4(VEGFR-3)遞送VEGF-C信號。該結(jié)論是基于VEGF-C對重組Flt4 EC(Flt4胞外域)蛋白的特異結(jié)合以及源于VEGF-C轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基對VEGF-3自身磷酸化的誘導(dǎo)而得出的。相反，VEGF和PLGF均不顯示特異結(jié)合于VEGFR-3或誘發(fā)其自身磷酸化。
如下文中更詳?shù)乃?，推定的?VEGF-C具有推定分子量46,883；一種推定的前-VEGF-C加工中間體是具有約32KD的測定分子量；而由條件培養(yǎng)基分離的成熟的VEGF-C是有通過還原態(tài)下的SDS-PAGE測定的約23KD的分子量。純化的和重組的VEGF-C的測定分子量和由VEGF-C開放閱讀框(ORF)編碼的前VEGF-C的推定分子量的主要不同處是由于蛋白酶切去該前-VEGF-C多肽的氨基末端和羧基末端區(qū)域的序列。然而，由于由序列33的103-419位氨基酸組成的多肽的推定分子量為35,881KD，所以認(rèn)為該推定的102個氨基酸的前導(dǎo)序列的蛋白酶切并不導(dǎo)致該推定的分子量46,883和測定的分子量約23KD的整個差異。證據(jù)表明分子量的測定差異的一部分是由于該VEGF-C前體的氨基和羧基末端的氨基酸殘基的蛋白酶切。從PDGF結(jié)構(gòu)研究(Heldin等人，“生長因子”(GrowthFactors)，8245-52(1993))外推提示受體結(jié)合和由VEGF-C激活的關(guān)鍵區(qū)域包括于104-213的氨基酸殘基，其發(fā)現(xiàn)于分泌型的VEGF-C蛋白(如缺乏推定的前導(dǎo)序列和某些羧基末端序列的類型)。該結(jié)合VEGFR-3的23 KD的多肽可能代表VEGF同源區(qū)域。生物合成后，該新生的VEGF-C多肽可在于推定的VEGF-C氨基酸序列中鑒定的三個推定的N-連接的糖基化位點被糖基化。含修飾的(諸如N-連接的糖基化)多肽，是本發(fā)明的一個方面。
和本族的其它配體相比增加該VEGF-C多肽長度的羧基末端氨基酸序列表現(xiàn)使人想起巴爾比亞尼環(huán)3蛋白(BR3P)序列(Dignam等人，“基因”(Gene)，88133-40(1990)；Paulsson等人，“分子生物學(xué)雜志”(J.Mol.Biol.)，211133-40(1990))的半胱氨酸殘基間隔模型。VEGF-C的這種新的C-末端絲蛋白樣結(jié)構(gòu)基序可折疊成獨立區(qū)域，基于上述考慮，其是在生物合成后至少被部分切除的。有趣的是，至少也有一個BR3P型的半胱氨酸基序發(fā)現(xiàn)于該VEGF的羧基末端。在我們的實驗中，推定前體和切割配體在該細胞培養(yǎng)基中均有檢出，提示通過細胞蛋白酶的切割。VEGF-C分離物的氨基末端和羧基末端的序列測定使得可以鑒定蛋白酶解加工位點?？乖撉?VEGF-C分子的不同部分的抗體的產(chǎn)生使得可以精確測定前體產(chǎn)物關(guān)系和比例，其細胞分布，以及加工和分泌動力學(xué)。
VEGF-C具有八個半胱氨酸殘基的保守模式，其可以參與鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵的形成，從而產(chǎn)生出類似于PDGF的反平行二聚的生物活性分子。有關(guān)于該鏈間二硫鍵橋的半胱氨酸殘基的突變分析表明VEGF二聚體不同于PDGF，其需要通過這些共價相互作用結(jié)合在一起以維持生物活性。該VEGF-C多肽鏈的二硫鍵在于非還原態(tài)下的VEGF-C分析中是顯示易見的，雖然重組體蛋白也含有配體活性的無多肽間二硫鍵的VEGF-C型。
把VEGF和VEGF-C區(qū)分開的VEGFR-3在結(jié)構(gòu)上緊密地相關(guān)于VEGFR-1和VEGFR-2。Finerty等人，“癌基因”(Oncogene)，82293-98(1993)；Galland等人，癌基因，81233-40(1993)；Pajusola等人，“癌癥研究”(Cancer Res.)，525738-43(1992)。除VEGFR-3外，VEGFR-2酪氨酸激酶也隨VEGF-C而被激活。VEGFR-2介導(dǎo)的信號引起過量表達該受體的豬動脈內(nèi)皮細胞的形態(tài)學(xué)的顯著變化，即，肌動蛋白重組以及膜邊緣波動。在這些細胞中，VEGFR-2也介導(dǎo)配體誘發(fā)的趨化性和促分裂性。Waltenberge等人，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)，26926988-95(1994)。類似地，當(dāng)該受體嵌合體CSF-1R/VEGFR-3在NIH 3T3成纖維細胞中異位表達時，其是促分裂的，但在豬動脈內(nèi)皮細胞中卻不是(Pajusola等人，1994)。和該結(jié)果相同，表達VEGFR-2mRNA但不表達或很少表達VEGFR-1或VEGFR-3mRNA的牛毛細管內(nèi)皮(BCE)細胞在用VEGF-C刺激時表現(xiàn)出增強的遷移。在膠原凝膠中BCE細胞的光學(xué)顯微鏡觀察地提示VEGF-C刺激這些細胞的增殖。因此，資料表明該VEGF配體和受體在其信號中表現(xiàn)出可能是細胞型依賴性的大的特異性。
VEGFR-3的表達模式(Kaipainen等人，“美國國家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA)，923566-70(1995))提示VEGF-C可能在胚胎發(fā)生中的靜脈和淋巴管系統(tǒng)形成中起作用。本文所示的VEGF-C在成熟組織中的組成型表達進一步提示了這種基因產(chǎn)物也與其中表達VEGFR-3的淋巴管和某些靜脈內(nèi)皮的分化功能的維持相關(guān)。淋巴毛細管沒有成熟的基層并保持了一個令人感興趣的可能性，即該絲樣BR3P基序與能調(diào)節(jié)組織中的VEGF-C的有效性的超分子結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生相關(guān)。然而，如本文所示，VEGF-C也激活VEGFR-2，其富含于胚胎組織的血管芽和分支的管的正增殖著的內(nèi)皮細胞中，但并不同樣富含于成人組織中。Millauer等人，“自然”(Nature，367576-78(1993)。這些資料提示VEGF-2是血管發(fā)生和血管生成的一種主要調(diào)節(jié)因子。因此，VEGF-C可能對淋巴內(nèi)皮具有獨特的效應(yīng)并和VEGF一起在血管生長中以及可能在調(diào)節(jié)幾種類型的內(nèi)皮的滲透性中具有更多的功能。由于VEGF-C刺激VEGFR-2并促進內(nèi)皮遷移，VEGF-C可在創(chuàng)傷愈合，組織移植，眼病，以及梗塞后動脈狹窄周圍并進入受傷組織的旁系管的形成中用作血管和淋巴管的發(fā)生誘發(fā)劑。
總之，這些結(jié)果顯示出血管內(nèi)皮信號的增強的復(fù)雜性。其強化了這一概念，即當(dāng)組織分化并開始執(zhí)行它們的特定功能時，該內(nèi)皮細胞的表型不均一性在幾類功能和形態(tài)不同的管中增加。然而，基于合適的血管生成刺激的刺激，內(nèi)皮細胞可以重入細胞循環(huán)，遷移，撤出細胞循環(huán)并隨后又分化成新的功能性適應(yīng)于其組織環(huán)境的脈管。這種和組織發(fā)育和再生同時發(fā)生的血管發(fā)生過程依賴于對內(nèi)皮細胞增殖，遷移，分化和生存的正負信號間嚴(yán)格控制的平衡。
先前鑒定的促進血管形成的生長因子包括成纖維細胞生長因子，肝細胞生長因子/散射因子，PDGF和TGF-α。(見如Folkman，“自然醫(yī)學(xué)”(NatureMed.)127-31(1995)；Friesel等人，F(xiàn)ASEB雜志，9919-25(1995)；Mustonen等人，細胞生物學(xué)雜志，129895-98(1995)。然而，VEGF是唯一的對內(nèi)皮細胞相對特異性的生長因子。因而，新鑒定的因子VEGF-B[Olofsson等人，美國國家科學(xué)院院刊，932578-81(1996)]和VEGF-C增加了我們對內(nèi)皮細胞的有關(guān)血管發(fā)生，血管生成，通透性，以及也許還有其它內(nèi)皮功能的特異性和豐富的陽性信號的復(fù)雜性的理解。使用Northern印跡的表達研究表明在心臟和骨骼肌中豐富的VEGF-C表達；其它組織，如胎盤，卵巢，小腸，甲狀腺，腎，前列腺，脾，睪丸和大腸中也表達該基因。而PLGF主要在胎用盤中表達，VEGF，VEGF-B和VEGF-C的表達模式在許多組織中重疊，提示VEGF族的成員可以形成異源二聚體并互相作用以完成其生理功能。
引起鼠基因組中VEGF受體基因座的失活的定點誘變表明VEGFR-1是形成血管內(nèi)皮的內(nèi)皮細胞的固有結(jié)構(gòu)所必需的，而VEGF-2是內(nèi)皮和造血細胞的產(chǎn)生所必需的。這提示VEGF族的四個基因可以是導(dǎo)致血管畸形和心血管疾病的突變的靶。
下列實施例闡明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其中描述了根據(jù)本發(fā)明的Flt4配體以及編碼配體的核酸的分離，鑒定，及功能。
實施例1pLTRFlt4l表達載體的制備編碼長型Flt4受體酪氨酸激酶的LTR-Flt4l載體的構(gòu)建如圖2所示。全長的Flt4s(Flt4短型)cDNA(Genbank登記號X68203，序列36)是通過首先將含有Flt4s的56-2534堿基對的S2.5片段(見于以參考文獻形式并入本發(fā)明的Pajusola等人，癌癥研究，525738-5743(1992))亞克隆入pSP73載體(Promega，Madison，WI)的EcoRI位點而裝配。
由于用于篩選Flt4 cDNA的cDNA文庫并不含編碼蛋白序列的極端5′，所以反義PCR用于擴增相當(dāng)于頭12個氨基酸殘基(MQRGAALCLRLW)的Flt4 5′端。分離自人HEL紅白血病細胞和雙鏈cDNA的Poly(A)+RNA是使用Amersham cDNA合成系統(tǒng)Plus試劑盒(Amersham公司，Buckinghamshire，U.K.)和基因-特異性引物5′-TGTCCTCGCTGTCCTTGTCT-3′(序列1)(其定位于克隆S2.5的5′端的下游195bp處)合成的。用T4DNA聚合酶處理雙鏈cDNA使末端平端化并用Centricon100濾器(Amicon公司，Beverly，MA)過濾純化cDNA。通過在為150μl的總體積中連接進行平端cDNA的環(huán)化。該反應(yīng)混和物含有一種標(biāo)準(zhǔn)連接緩沖液。5％PEG-8000，1mM DTT和8UT4 DNA連接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)。該連接反應(yīng)在16℃下進行16小時。取15μl反應(yīng)液用于含100ng Flt4-特異性的引入Sac I和Pst I限制性位點的引物，和1u Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)的常規(guī)PCR反應(yīng)。用每次33個循環(huán)(95℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延長4分鐘)進行PCR兩次。先后用Sac I和Pst I限制性酶處理該PCR混合物，并在用Magic PCR Preps(Promega)純化后，將DNA片段亞克隆入用于測序(Promega)的pGEM 3zf(t)載體。對應(yīng)于Flt4s cDNA克隆的5′端序列貯藏于登記號為X68203的基因文庫數(shù)據(jù)庫。
將編碼頭12個氨基酸殘基的序列通過連接Sph I-消化的用反轉(zhuǎn)錄PCR擴增分離于HEL細胞的poly(A)+RNA產(chǎn)生的PCR片段而加入表達構(gòu)建體。正向引物用具有如下序列5′-ACATGCATGC CACCATGCAGCGGGGCGCCG CGCTGTGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGGGACTCCTGGA-3′(序列2)(SphI位點下劃線，翻譯起始密碼子用黑體表示)。該翻譯起始密碼子正好是最優(yōu)的Kozak共有序列的下游。(Kozak，核酸研究，158125-8148((1987))。反向引物5′-ACATGCATGCCCCGCCGGT CATCC-3′(序列3)(Sph I位點下劃線)，該S2.5片段5′端，因而取代了S2.5質(zhì)粒的唯一Sph I片段。用EcoRI和Cla I消化該所得的載體并連接到138bp的PCR片段上，而該PCR片段擴增于編碼如Pajnsola等人，癌癥研究，525738-5743(1992)圖1所示的Flt4 3′端的0.6kb EcoRI片段(基因文庫X68263序列中3789-4416位堿基對)，其用寡核苷酸5′-CGGAATTCCC CATGACCCCA AC-3′(序列4)(正向引物，EcoR位點下劃線)和5′-CCATCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTT CTT-3′(序列5)(反向引物，Cla I位點下劃線)。該編碼區(qū)域通過將1.2kb EcoRI片段(見于基因文庫登記號為X68203序列的2535-3789bps)連接到上述構(gòu)建體而完成。該完整的cDNA作為Hind III-Cla I(平端化)片段(該Cla I位點還包括于用于構(gòu)建該編碼序列的3′端的3′引物)通過其Hind TII-Acc I(平端化)限制性位點亞克隆λPLTR poly表達載體，該載體報道于Makela等人，基因，118293-294(1992)(基因文庫登記號X60280，序列37)，其以參考文獻形式并入本發(fā)明。
長型的Flt4(Flt4l)是通過如下置換短型的3′端而制備該Flt4l cDNA 3′區(qū)域是分別使用基因特異性寡核苷酸(序列7，如下)和pGEM 3Z載體-特異性(SP6啟動子)寡核苷酸5′-ATTTAGGTGACACTATA-3′(序列6)作為反向和正向引物而進行PCR擴增的。PCR的模板是含有從基因文庫X68203序列(該EcoRI位點的下游序列以Flt4長型3′序列并以基因文庫登記號S66407)(序列38)保藏)的3789位核苷酸的EcoRI位點向下游延伸的495bp EcoRI片段的Flt4l cDNA克隆。該基因-特異的寡核苷酸含有剛好定位于編碼區(qū)末端的Bam HI限制性位點并具有以下序列5′-CCATCGATGGATCCCGATGCTGCTTAGTAGCTGT-3′(序列7)(BamHI位點下劃線)。用EcoRI和BamHI消化該PCR產(chǎn)物并以框轉(zhuǎn)化到其EcoRI位點2535bp(見序列X68203)下游的編碼序列已用EcoRI-BamHI消化切除的LTRFlt4s載體片段中。所得的克隆稱為pLTRTlt4l。該編碼區(qū)又通過連接1.2kb的EcoRI片段(序列X68203的2535-3789堿基對)到所得載體中。
實施例2Flt4l轉(zhuǎn)染細胞的制備和檢測NIH 3T3細胞(60％融合)使用基于DOTAP脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer-Mannheim，Mannheim，德國)用5μg pLTRFlt4l構(gòu)建體和0.25μg的含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Southern等，“應(yīng)用分子遺傳學(xué)雜志”(J.Mol.Appl.Genet)，1327(1982)一起共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染一天后，將該細胞轉(zhuǎn)入含0.5mg/ml遺傳霉素(GIBCO，Grand Island，N.Y.)的選擇的培養(yǎng)基。分離遺傳霉素抗性的細胞集落并檢測該Flt4蛋白的表達。在煮沸的含3.3％SDS 125mM Tris，pH6.8的裂解緩沖液中裂解細胞。用BCA方法(Pierce，Rockford，IL)測定該樣品的蛋白質(zhì)濃度。每個裂解物的大約50μg蛋白質(zhì)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和使用抗Flt4羧基末端的抗血清的免疫印跡檢測Flt4的存在。Western印跡的信號通過ECL法(Amersham)檢測。
為生產(chǎn)抗-Flt4抗血清，將編碼短型的羧基端40個氨基酸殘基的Flt4cDNA片段NH2-PMTPTTYKG SVDNQTDSGM VLASEEFEQIESRHRQESGFR-COOH(序列8)以657bp EcoRI-片段克隆入讀框內(nèi)帶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)的pGEX-1λT細菌表達載體(Pharmacia-LKB，公司，Uppsala，Sweden)。所得的GST-Flt4s融合蛋白在E.coli中生產(chǎn)并通過谷胱甘肽-除脂糖凝膠4B柱的親和層析純化。將純化的蛋白質(zhì)凍干，溶于磷酸緩沖鹽液(PBS)，和Freund′s佐劑混合并用于以雙周間隔通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法免疫兔(Harlow等，“抗體實驗手冊”(AntibodiesA laboratoryManual)(冷泉港實驗室出版社，1988))。在四次強化免疫后，抗血清用于從轉(zhuǎn)染細胞中免疫沉淀Flt4。表達Flt4的細胞集落也用于配體刺激檢測。
實施例3Flt4 EC桿狀病毒載體的構(gòu)建及其產(chǎn)物的表達和純化Flt4胞外域(EC)桿狀病毒載體的構(gòu)建圖示于圖3。該編碼Flt4的cDNA以長型和短型制備，每個類型均在Moloney鼠白血病病毒LTR啟動子的控制下?lián)饺胼d體。短型Flt4受體的核苷酸序列獲自登記號為X68203的基因文庫數(shù)據(jù)庫而特異性的長型cDNA的3′區(qū)段獲取基因文庫登記號S66407。
編碼Flt4 EC的cDNA區(qū)段的末端如下進行修飾用引物1116(5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′，序列9，SalI位點下劃線)和引物1315(5′-CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3′；(序列10，BamHI位點下劃線)擴增該Flt4cDNA(基因文庫登記號X68203)EC序列3′端的胞外區(qū)的序列。引物1315的5′端序列并非互補于Flt4編碼區(qū)。檢查互補于引物1315的此區(qū)的序列發(fā)現(xiàn)從5′到3′方向有一個終止密碼子，六個鄰接的His密碼子(隨后的用Ni-NTA柱；Qiagen，Hilden，德國，色譜純化該編碼的多肽)，以及附加的BamHI位點。用SalI和BamHI消化該擴增的片段并用于代替圖3所示LTRFlt4載體中獨特的SalI-BamHI片段。該被取代的SalI-BamHI片段編碼Flt4跨膜和胞質(zhì)區(qū)。所得的是一種修飾的LTRFlt4載體。
該無Flt4信號序列的5′端編碼區(qū)通過使用引物1335(5′-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3′(序列11)，該引物含附加的HindIII(AAGCTT)和BamHI(GGATCC)限制性位點，其有下劃線)的PCR擴增。用于擴增編碼Flt4信號序列區(qū)的第2個引物是引物1332 5′-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3′(序列12)，該擴增的片段用HindIII和SphI消化(在引物1335中該HindIII位點(AAGCTT)以下劃線表示而該SphI位點在Flt4cDNA的擴增區(qū)內(nèi))。所得的HindIII-SphI片段用于置換以上剛剛描述的修飾的LTRFlt4載體的HindIII-SphI片段(該HindIII位點位于該Flt4插入片段和該載體的pLTR poly區(qū)段的5′連接頭處，該SphI位點位于Flt4 cDNA)。然后，該所得的Flt4 EC插入片段作為BamHI片段連接入pVTBac質(zhì)粒的BamHI位點，如Tessier等人，基因，98177-183(1991)所述，其以參考文獻形式并入本發(fā)明。通過部分測序證實該插入片段的相對方向以便使該載體的信號序列-編碼區(qū)段的開放閱讀框在框內(nèi)相鄰于Flt4編碼區(qū)序列。該Flt4EC構(gòu)建體和桿狀病毒基因組DNA一起通過脂轉(zhuǎn)染而轉(zhuǎn)染入SF-9細胞。純化，擴增該重組體病毒并用于通過本領(lǐng)域常規(guī)方法感染High-Five細胞(Invitrogen，San Diego，CA)。根據(jù)制造商說明書(Qiagen)用Ni-NTA親和層析來結(jié)合并洗脫重組體Flt4EC的羧基端編碼的6×His標(biāo)記而被感染的Hign-Five細胞的培養(yǎng)基中純化該Flt4EC。
實施例4從條件培養(yǎng)基中分離Flt4配體根據(jù)本發(fā)明的人Flt4配體分離于條件培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是PC-3前列腺癌細胞系(ATCC CRL 1435)培養(yǎng)于含7％胎牛血清(FCS)的Ham′s F-12營養(yǎng)混和物(GIBCO)中。該細胞按產(chǎn)品說明書培養(yǎng)。為制備該條件培養(yǎng)基，融合PC-3細胞在Ham′3 F-12營養(yǎng)混合物(GIBCO)中于無胎牛血清(FCS)存在下培養(yǎng)七天。然后，于1000g離心該培養(yǎng)基20分鐘使之澄清。然后，篩選該培養(yǎng)基以檢測其暴露于已用編碼Flt4的cDNA通過pLTRFlt4l載體轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細胞而誘發(fā)Flt4酪氨酸磷酸化的能力。對于受體刺激實驗，將亞融合的NIH 3T3細胞在含0.2％BSA而無血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCo)中饑餓過夜。用條件培養(yǎng)基刺激該細胞5分鐘，用含100μmol礬酸鹽的冷PBS洗滌兩次，并在用于受體免疫沉淀檢測的RIPA緩沖液(10mM Tris pH7.5，50mM NaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，0.5％Nonidet P40(BDH，Poole，英國)，0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1 u/ml抑蛋白酶肽(Aprotinin)(BoehringerMannheim)，1mM礬酸鹽)中裂解。1,5000×g下離心該裂解物20分鐘。上清液用3μl的如實施例2所述的抗Flt4(末端的抗血清于冰上培育2小時。也見于Pajusola等人，癌基因，8293-2937(1993)，其以參考文獻形式并入本發(fā)明。
在有抗-Flt4抗血清存在下培育2小時后，加入蛋白A-瓊脂糖凝膠(Pharmacia)并旋轉(zhuǎn)下繼續(xù)培養(yǎng)45分鐘。在SDS-PAGE檢測前，分別用免疫沉淀緩沖液和10mM Tris，pH 7.5洗滌三次和二次。將多肽轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上并用Flt4-或者磷酸酪氨酸-特異性抗血清和ECL法(Amersham公司)Western印跡檢測。抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(抗-PTyr；PY20)購自Transduction實驗室(Lexington，Kentucky)。在某些情況下，剝離后的濾器又染有了第二抗體。該濾器的剝離是在100mM 2-巰基乙醇，2％SDS，62.5mMTris-HCl，pH 6.7中于50℃下偶爾攪動并持續(xù)30分鐘進行。
如圖4所示，該PC-3條件培養(yǎng)基(PC-3CM)，在表達Flt4的NIH 3T3細胞用所述培養(yǎng)基制劑處理時，刺激125KD多肽的酪氨酸磷酸化，裂解，而該裂解物在SDS-PAGE后用抗Flt4抗血清免疫沉淀，Western印跡，并用抗-PTyr抗體染色。該所得帶在用未濃縮的PC-3條件培養(yǎng)基刺激的基礎(chǔ)上而被輕微磷酸化(泳道2)。該125KD帶和源于過礬酸鹽處理的細胞的成熟Flt4的酪氨酸磷酸化的，加工型的(比較圖4的泳道2和7，也見于圖5A)一起共遷移。共遷移也被如圖5A(右圖)所示的再沾染抗-Flt4抗體所證實。為顯示該125KD多肽并非能與抗-磷酸酪氨酸抗體反應(yīng)的條件培養(yǎng)基的非特異性組分，將15μl的條件培養(yǎng)基通過SDS-PAGE分離，印跡于硝酸纖維素膜，并用抗-PTyr抗體染色該印跡。無信號得出(圖5B)。非條件培養(yǎng)基也不能刺激Flt4磷酸化，如圖4，泳道1所示。
圖5C示PC-3CM刺激(+)未轉(zhuǎn)染(泳道4和5)，F(xiàn)GFR-4-轉(zhuǎn)染(泳道8和9)和Flt4轉(zhuǎn)染NIH 3T3細胞(泳道1-3，6和7)的效果對比。這些結(jié)果表明未轉(zhuǎn)染NIH 3T3細胞和用FGFR-4轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細胞均不顯示基于該源于PC-3細胞的條件培養(yǎng)基刺激的約125KD蛋白的酪氨酸磷酸化。通過已用肝素-瓊脂糖凝膠CL-6B(Pharmacia)于室溫下預(yù)處理2小時(泳道2)的PC-3CM刺激分析顯示Flt4配體并不結(jié)合于肝素。
如圖4，泳道3所示，當(dāng)該PC-3條件培養(yǎng)基用Centricon-10濃縮器(Amicon)濃縮4倍時，其刺激活性并不顯著增加。圖4，泳道4顯示用50μl的偶聯(lián)到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠CL-4B(Pharmcia；大約1mg Flt4EC區(qū)/ml瓊脂凝膠樹脂)的Flt4EC預(yù)處理濃縮的PC-3條件培養(yǎng)基徹底消除了Flt4酪氨酸磷酸化。類似的用來取代的瓊脂糖凝膠CL-4B預(yù)處理該條件培養(yǎng)基并不影響刺激活性，如圖4，泳道5所示。濃縮后所得的流通(其包括分子量低于10,000的蛋白質(zhì))并不刺激Flt4磷酸化，如圖4，泳道6所示。
在另一個實驗中，分別用非條件培養(yǎng)基，源自表達Flt4配體的PC-3細胞的培養(yǎng)基，或者含50ng/ml VEGF165或50ng/ml PLGF-1的非條件培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)化的表達LTRFlt4l的NIH 3T3細胞的FLt4自身磷酸化對比。將該細胞裂解，用抗FLt4抗血清免疫沉淀并通過Western印跡用抗磷酸酪氨酸抗體檢測。唯有表達Flt4配體(泳道Flt-4L)的PC-3條件培養(yǎng)基刺激Flt4自身磷酸化。
前述資料顯示該PC-3細胞產(chǎn)生結(jié)合于Flt4 EC的配體并活化該受體。
實施例5Flt4配體的純化由如實施例4所述的人PC-3細胞表達的配體通過在親和層析中使用重組生產(chǎn)的Flt4 EC純化和分離。
兩次共8升的無血清條件培養(yǎng)基收獲物收集于含PC-3細胞鋪滿層的500鋪滿直徑15cm培養(yǎng)器。以10,000×g離心澄清該條件培養(yǎng)基并以Ultrasette Tangential流量儀(Filtron，Northborough，MA)用10KD截留Omega超濾膜根據(jù)說明書的方法濃縮80倍。重組Flt4 EC在重組桿狀病毒細胞系統(tǒng)中表達并通過Ni-瓊脂糖(Ni-NTA親和柱，購自Qiagen)親和層析純化。該純化的胞外區(qū)以5mg/ml的濃度偶聯(lián)到CNBr-活化的Sepharose CL-4B上并用作配體親和層析的親和基質(zhì)。
將濃縮的條件培養(yǎng)基用2ml重組的Flt4 EC Sepharose親和基質(zhì)在滾管中于室溫下培養(yǎng)3小時。隨后所有的純化步驟都在+4℃下進行。然后，將該親和基質(zhì)轉(zhuǎn)入內(nèi)徑15mm的柱中并用100ml PBS和50ml 10mM的磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)連續(xù)洗滌。用100mM甘氨酸-HCl分步洗滌脫該結(jié)合材料，連續(xù)的6ml洗脫pH分別為4.0，2.4和1.9。在含0.5ml 1M磷酸鈉(pH8.0)的管中收集幾份2ml洗出液組分。立即混合合組份并在1mM Tris-HCl(pH 7.5)中透析。檢測每75μl的各等份的刺激Flt4酪氨酸磷酸化的能力。還檢測了超濾液，配體親和層析前后的100μl的各等份濃縮的條件培養(yǎng)基，以及15倍濃縮的在洗滌過程中從Flt4 EC-Sepharose基質(zhì)中釋放的物質(zhì)組分的刺激Flt4酪氨酸磷酸化。
如圖6，泳道3所示，濃縮的條件培養(yǎng)基誘發(fā)了過量表達Flt4的轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細胞中Flt4顯著的酪氨酸磷酸化。此活性沒有發(fā)現(xiàn)于取自暴露于上述(圖6，泳道4)Flt4 Sepharose親和基質(zhì)后的培養(yǎng)基的條件培養(yǎng)基。該特異性-結(jié)合Flt4-刺激材料在用PBS，10mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)，及pH 4.0(圖6，分別為泳道5-7洗滌后仍保留于親和基質(zhì)上，并且其在pH2.4時洗脫在頭2ml等份中，(泳道8和9)中段洗脫。洗脫緩沖液pH的進一步降低并不導(dǎo)致另外的Flt4-刺激物質(zhì)(圖6，泳道11)的釋放。圖6，泳道1示其中的表達Flt4細胞用非條件培養(yǎng)基處理的對照；泳道2示用含分子量小于10KD的多肽的條件培養(yǎng)基的超濾組分處理表達Flt4的細胞后的結(jié)果。
將色譜組分的小的等分在SpeedVac濃縮儀(Savant，F(xiàn)armingdale，N.Y.)中濃縮并進行還原態(tài)下的SDS-PAGE，隨后用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)即銀染該凝膠。如圖7示，分子量約為23KD(還原態(tài))的主要多肽檢測于含刺激Flt4活性(相當(dāng)于圖6中的泳道8和9)組分中。該多肽并不發(fā)現(xiàn)于其它色譜組分中。另一方面，除了這些帶和一個具有32KD遷移率的很弱帶外，檢測于兩活性組分的全部其它成分也分布于起始材料以及以少量分布于濃縮后的洗滌和洗脫步驟中。類似的結(jié)果也在三個獨立的親和純化中得到，表明該23KD多肽特異性地結(jié)合于Flt4并誘發(fā)Flt4的酪氨酸磷酸化。
將含23KD多肽的組分混和，在Speed Vac濃縮儀中干燥并于12.5％凝膠中進行SDS-PAGE。然后，將凝膠中的蛋白質(zhì)電印跡到Immobilon-P(PVDF)轉(zhuǎn)移膜(Millipore，Marlborough，MA)并通過用考馬斯藍R-250染色觀察。由印跡將只含染色的23KD帶的區(qū)域切下并在Prosite蛋白測序系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中進行N末端氨基酸序列分析。用610A數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。分析表明有一單個N-末端序列NH2-XEETIKFAAAHYNTEILK-COOH(序列13)。
實施例6在真核表達載體中構(gòu)建PC-3細胞cDNA文庫。
用寡脫氧胸苷(oligo(dT))(III型，Collaborative Biomedical Products，Becton-Dickinson Labwane，Bedford，MA)纖維素親和層析(Sambrook等，1989)通過一步法從5個鋪滿PC-3細胞的直徑15cm的皿中分離人poly(A)+RNA。收量為70μg。取6μg poly(A)+RNA用于在哺乳動物表達載體pcDNA I和Invitrogen Librarian試劑盒中按試劑盒說明書的方法制備oligo(dT)-引物cDNA文庫。估計該文庫含大約106個獨立的且平均插入片段大小約為1.8kb的重組體。
實施例7編碼Flt4配體氨基末端的特有核苷酸序列的擴增。
基于分離的人Flt4配體的N-末端氨基酸序列設(shè)計簡并的寡核苷酸并用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中作為引物以擴增編碼Flt配體且源自該PC-3 cDNA文庫的cDNA。實施例7和8中所述的總策略圖示于圖9，其中以箭頭示不同的引物。
用1μg源于擴增的PC-3cDNA文庫的DNA及以下引物的混合物進行PCR，這兩種引物是同樣比例存在的48有義鏈引物(該引物序列總共含有序列5′-GCAGARGARACNATHAA-3′(序列14)(其中的R是A或G，N是A，G，C或T而H是A，C或T)，編碼氨基酸殘基2-6(EETIK，序列15))的序列和以同樣比例存在的384反義鏈引物(該反義鏈引物總共有序列5′-GCAYTTNARDATYTCNGT-3′(序列16)(其中的Y是C或T而D是A，G，或T)，且對應(yīng)于氨基酸殘基14-18(TEILK，序列17))。在每個引物的5′端加入三個額外的核苷酸(GCA)以增加退火穩(wěn)定性。每反應(yīng)用1U的DynaZyme(F-500L，F(xiàn)innzymes，Espoo，F(xiàn)inland)(一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶)溶于由制造商提供的緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 8.8，25℃，1.5mM MgCl2，50mM KCl，.01％Triton-X100)中且于72℃的延伸溫度下進行兩個連續(xù)的PCR反應(yīng)。第一個PCR進行43個循環(huán)。首先的三個循環(huán)的退火溫度為33℃，時間為2分鐘，而其余的循環(huán)在42℃下進行1分鐘。
從凝膠上切下含預(yù)計大小(57bp)的弱帶的凝膠區(qū)并洗脫。再用上述同樣的引物對于42℃，1分鐘下重擴增該洗脫物30個循環(huán)。用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將擴增的片段克隆入PCRII載體中(Invitrogen)并用Sanger放射性雙脫氧核苷酸測序法測序。檢測了六個克隆且全部六個克隆株都含有編碼目的肽(Flt4配體前體的104-120位氨基酸殘基)的序列。橫跨密碼子6的第三個核苷酸到密碼子13的第三個核苷酸(延伸區(qū))的核苷酸序列在全部六個克隆株中是相同的5′-ATTCGCTGCAGCACACTACAAC-3′(序列18)并因此代表源于編碼Flt4配體的氨基末端部分的特有序列的擴增產(chǎn)物。
實施例8編碼Flt4配體的cDNA的5′-末端的擴增基于特有的編碼分離的人Flt4配體N-末端的核苷酸序列，設(shè)計了兩對嵌套引物以便在兩個嵌套式PCR反應(yīng)中擴增源于1μg上述PC-3 cDNA文庫的DNA的相應(yīng)cDNAs的完整5′端。首先，用4個共同定義序列5′-TCNGTGTTGTAGTGTGCTG-3′(序列19)的引物(其是對應(yīng)于氨基酸殘基9-15(AAHYNTE，序列20)的反義鏈引物)，以及對應(yīng)于用于構(gòu)建文庫的pcDNA I 載體的 T7 RNA 啟動子的有義鏈引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(序列21)的同樣混和物進行擴增。所用的著陸(“Touchdown”)PCR如Don等人，核酸研究，194008(1991)所公開，其以參考文獻形式并入本發(fā)明。頭兩個循環(huán)中的退火溫度是62℃而隨后的退火溫度在每個循環(huán)中漸減1℃直至達到終溫度53℃，在此溫度進行另外16個循環(huán)。退火時間為1分鐘而每個循環(huán)的延伸在72℃下進行1分鐘。在第一個反應(yīng)中得到多次擴增的DNA片段。第一次擴增產(chǎn)物(1ul的以水進行1∶100的稀釋液)用于第二次擴增反應(yīng)，而后者使用含有編碼Flt4配體的氨基酸殘基6-13(KFAAAHYN，序列23)反義鏈引物(5′-GTTGTAGTGTGCTGCAGCGAATTT-3′；序列22)，以及對應(yīng)于pcDNAI載體的2179-2199位核苷酸的有義鏈引物(5′-TCACTATAGGGAGACCCAAGC-3′，序列24)的一對嵌套引物。該有義和反義引物序列重疊于第一次PCR所用的相應(yīng)引物的3′端?！爸憽?“Touchdown”)PCR通過將退火溫度從72℃降至66℃并在66℃下連續(xù)進行另外18個循環(huán)而進行。退火時間為1分鐘而每個循環(huán)的延伸在72℃進行2分鐘。得到了約為220bp的一個主要產(chǎn)物以及約為270bp，150bp，以及100bp的三個次要產(chǎn)物。
將約220bp的擴增片段從瓊脂糖凝膠上切下，用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆到PCR II載體并測序。檢測了三個重組克隆株并且含有序列5′-TCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCT CGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGGTGGAATTCGACGAACTCATGACTGTACTCTACCCAGAATATTGGAAAATGTACAAGTGTCAGCTAAGGCAAGGAGGCTGGCAACATAACAGAGAACAGGCCAACCTCAACTCAAGGACAGAAGAGACTATAAAATTCGCTGCAGCACACTACAAC-3′(序列25)。序列的起始代表pc DNAI載體而劃線序列代表cDNA插入片段5′端的擴增產(chǎn)物。
實施例9編碼Flt4配體的cDNA 3端的擴增基于擴增的編碼23KD人Flt4配體的氨基末端的克隆的5′序列，設(shè)計了兩對非重疊嵌套引物以擴增Flt-4-配體-編碼cDNA克隆的3′部分。對應(yīng)于所擴增的Flt4配體的5′序列(序列25)的152-169位核苷酸的有義鏈引物5′-ACAGAGAACAGGCCAACC-3′(序列26)，以及對應(yīng)于pc DNAI載體的2311-2329位核苷酸的反義鏈引物5′-TCTAGCATTTAGGTGACAC-3′(序列27)用于第一個“著陸”PCR。每兩個循環(huán)該反應(yīng)的退火溫度降低1℃，從72℃到52℃，在52℃下再進行15個循環(huán)。退火時間為1分鐘而每循環(huán)的延伸是在72℃下進行3分鐘。在第一個擴增中得到了幾種大小的DNA片段。用水以1∶200稀釋所得產(chǎn)物并在使用第二對引物5′-AAGAGACTATAAAATTCGCTGCAGC-3′(序列28)和5′-CCCTCTAGATGCATGCTCGA-3′(序列29)(對應(yīng)于pc DNAl載體的2279-2298位核苷酸的反義鏈引物)的PCR再擴增。得到了1350bp和570bp大小的兩個DNA片段。將這些片段克隆入PCR II載體并測序該克隆插入片段。發(fā)現(xiàn)這兩個片段都編碼同源于VEGF序列的氨基酸序列的序列。
實施例10用Flt4配體cDNA的5′PCR片段篩選PC-3細胞cDNA文庫通過使用上述的5′PCR片段以及引物5′-GTTGTAGTGTGCTGCAGCGAATTT-3′(反義鏈引物，序列30)和5′TCACTATAGGGAGACCCAAGC-3′(序列31)(對應(yīng)于pc DNAI載體的2179-2199位核苷酸的有義鏈)的PCR擴增人Flt4配體cDNA 219bp 5′末片段。用EcoRI(Boehringer Mannheim)消化該擴增產(chǎn)物以除去擴增于pc DNAI載體的DNA序列部分并用Ecoli DNA聚合酶I(Boehringer Mannheim)以[32P]-dCTP標(biāo)記所得的編碼Flt4配體5′端的153bp片段。該片段用作探針以雜交篩選擴增的PC-3細胞cDNA文庫。
將該文庫的濾膜影印在含50％甲酰胺，5×氯化鈉磷酸鈉緩沖液(SSPE)，5×Denhardt’s溶液，0.1％SDS和0.1mg/ml變性鮭精DNA的溶液中用放射性標(biāo)記的探針在42℃雜交20小時。在1×氯化鈉檸檬酸緩沖液(SSC)，0.1％SDS中于室溫下，30分鐘內(nèi)洗滌該濾膜兩次，然后，在65℃下30分鐘內(nèi)洗滌兩次并曝光過夜。
基于放射自顯影，從該文庫中用探針雜交篩選出二個陽性的重組細菌克隆株。從這些克隆株中純化質(zhì)粒DNA并用EcoRI和NotI消化和瓊脂糖電泳隨后用溴化乙錠染色分析?；诜謩e存在約1.7，1.9和2.1kb大小的插入片段將該十個質(zhì)?？寺≈攴殖扇M。用T7寡核苷酸作為引物以及隨后測序反應(yīng)的步驟引物測序每組質(zhì)粒的插入片段。
序列分析表明全部克隆株均含有編碼該23KD人Flt4配體的NH2-末端序列的開放閱讀框。用步移引物在下游方向繼續(xù)雙脫氧測序。完整的人cDNA序列和源于2kb克隆的推定的氨基酸序列分別如序列32和33所示。“前”導(dǎo)序列的一個推定切割位點位于序列33的102和103殘基之間。當(dāng)和基因文庫的數(shù)據(jù)庫中序列對比時，發(fā)現(xiàn)該閱讀框的預(yù)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物與圖10所示的PDGF/VEGF族生長因子的預(yù)測氨基酸序列同源。
含pc DNAI載體的2.1kb人cDNA克隆的質(zhì)粒pFLT4-L已保藏于ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，登記號97231。
實施例11
通過Flt4配體載體的蛋白產(chǎn)物刺激Flt4自身磷酸化將含有編碼如序列32和33所示的序列的開放閱讀框的2.1kb的質(zhì)粒pFlt4-1L的人cDNA插入片段(人VEGF-C，如下文)用Hind III和NotI限制性酶從pcDNAI載體上切出，分離于制備型瓊脂糖凝膠，并連接到pREP7表達載體(Invitrogen)的相應(yīng)位點。將該含pFlt4-L插入片段的pREP7載體用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到293-EBNA細胞(Invitrogen)(Samnbrook等人，1989)。轉(zhuǎn)染后約48小時，將所轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中并培育36小時。然后，5000×g離心20分鐘以收集該條件培養(yǎng)基，用Centriprep10(Amicon)將上清液濃縮5倍并用于刺激表達LTRFlt4l(Flt4受體的NIH3T3細胞，如實施例4所示。將該細胞裂解，用抗Flt4抗血清免疫沉淀并用抗磷酸酪氨酸抗體通過Western印跡檢測。
與僅給出背景水平的Flt4受體磷酸化的源于模擬轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基相比，源于轉(zhuǎn)染細胞的兩個不同的平皿的條件培養(yǎng)基刺激Flt4自身磷酸化。當(dāng)該濃縮的條件培養(yǎng)基用20μl的偶聯(lián)到Sepharose的Flt4EC區(qū)懸浮液預(yù)吸收時(見于實施例4)，未達到磷酸化，從而表明引起Flt4自身磷酸化的活性的確是Flt4配體。因此，這些結(jié)果證明具有約2.1kb的插入片段并含有如序列32所示的開放閱讀框的表達載體能在所轉(zhuǎn)染細胞中表達為一種生物活性的Flt4配體(VEGF-C)。由該開放閱讀。框編碼的序列如序列33所示。
由序列33的全部氨基酸序列(殘基1-419)所組成的多肽的推定分子量是46,883。由序列33的103-419位氨基酸殘基組成的多肽的推定分子量為35,881。用還原態(tài)的SDS-PAGE測定的純化于PC-3培養(yǎng)物的Flt4配體的分子量約為23KD。因此，顯然是該Flt4配體mRNA翻譯成了多肽前體，而通過蛋白酶切可從該前體衍生出成熟的配體。該Flt4配體也可以在三個推定的N-連接糖基化位點糖基化，該位點與可在推定的Flt4配體氨基酸序列(圖10中劃線的N-殘基)的共有序列相同。
和該族的其它配體相比，能增加Flt4配體亞單位的預(yù)定分子量的羧基末端氨基酸序列表現(xiàn)出使人想起B(yǎng)albiani環(huán)3蛋白(BR3P)序列的半胱氨酸殘基的間隔模式(Dignam等人，基因，88133-140(1990))，如圖9所示。該序列可以編碼存在于Flt4配體前體的一個獨立的折疊區(qū)并可以和諸如調(diào)節(jié)Flt4配體的分泌，溶解性，穩(wěn)定性，細胞表面定位或活性相關(guān)。有趣的是，在VEGF羧基末端氨基酸序列中也發(fā)現(xiàn)了該BR3P型的至少一個半胱氨酸基序。
因此，該Flt4配體mRNA似乎首先翻譯成源于和質(zhì)粒Flt4-1的cDNA插入片段對應(yīng)的mRNA的前體，從中通過蛋白酶切可以衍生出該成熟的配體。為定義該成熟的Flt4配體多肽，有人首先在諸如COS細胞的細胞中表達該cDNA克隆(沉積于pc DNAI表達載體)。有人用抗編碼的多肽，及其片段，或者細菌Flt4融合蛋白，如GST-融合蛋白的抗體產(chǎn)生抗VEGF-同源區(qū)和Flt4配體的氨基-和羧基-末端多肽的抗體。然后，有人在所轉(zhuǎn)染細胞中的Flt4配體生物合成和加工后，用放射性半胱氨酸標(biāo)記該細胞，免疫沉淀和凝膠電泳進行脈沖追蹤分析。用抗由質(zhì)粒FLT4-L的cDNA插入片段編碼的產(chǎn)物的三個區(qū)的抗體，分離出用于放射性或非放射線的氨基末端序列分析的物質(zhì)。該成熟的VEGF-C多肽的氨基末端序列的測定可以用于鑒定該氨基末端蛋白酶加工位點。該羧基末端前肽的氨基末端的測定將給出羧基末端加工位點。這可通過可阻止酶切的在切割位點的相鄰氨基酸殘基處定點誘變而證實。
該Flt4配體還可通過該Flt4配體前體克隆的3′編碼序列中的漸進性3′缺失來描述，其引入了一個引起其蛋白產(chǎn)物羧基末端截斷的終止子。該載斷型的活性如下測定例如，當(dāng)應(yīng)用于諸如表達LTRFlt4的NIH3T3細胞的細胞培養(yǎng)物時研究該截斷型蛋白誘導(dǎo)的Flt4自身磷酸化。通過相關(guān)的血小板衍生生長因子的結(jié)構(gòu)研究外推，有人認(rèn)為由Flt4配體的受體激活的關(guān)鍵區(qū)包含于缺少推定的102個氨基酸前導(dǎo)序列的分泌型VEGF-C蛋白的大約頭180個氨基酸殘基(序列33，103-282殘基，并顯然包含于大約頭120個氨基酸殘基(序列33，103-223殘基)。
另一方面，該純化的配體測定分子量和從該Flt4配體克隆的開放閱讀框推導(dǎo)的分子量間的不同量由于該可溶配體產(chǎn)生于能在衍生該分離配體的PC-3細胞中呈遞的可變剪接的mRNA。為分離該可變的cDNA克隆，有人用已保藏的克隆的cDNA片段和根據(jù)提供的序列制備的PCR引物以及本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)從PC-3細胞cDNA文庫中分離或擴增可變的cDNAs。還可以用(RT)-PCR直接從該PC-3mRNA中用質(zhì)粒FLT4-L的cDNA插入片段的序列中提供的引物擴增。從所得的cDNA克隆中測定可變cDNA序列。還可以用本領(lǐng)域的常規(guī)方法從人基因組DNA文庫中分離對應(yīng)于Flt4配體mRNA轉(zhuǎn)錄體的基因組克隆并測序該克隆或其亞克隆片段以檢測相應(yīng)的外顯子。然后，可變的外顯子可用許多本領(lǐng)域常規(guī)方法(如隨后描述的cDNA和基因組DNA的異源雙鏈分析)而鑒定。
實施例12編碼VEGF-C基因在人腫瘤細胞系中的表達對應(yīng)于Flt4配體(VEGF-C)的轉(zhuǎn)錄體的表達可通過含源于HT-1080和PC-3人腫瘤細胞系的分離poly(A)+的Northern印跡雜交而檢測。探針為放射性標(biāo)記的2.1kb cDNA克隆的插入片段(pFlt4-L/VEGF-C，比活性108-109cpm/mg DNA)。用50％甲酰胺，5×SSPE緩沖液，2％SDS，10×Denhardt′s液，100ng/ml鮭精DNA以及1×106cpm標(biāo)記探針/ml在42℃下雜交該印跡過夜。先后分別用含0.05％SDS的2×SSC和含0.1％SDS的0.1×SSC在室溫和52℃下洗滌該印跡2×30分鐘和2×20分鐘。然后，用增感屏和Kodak XAR膠片在-70℃下曝光該印跡三天。二個細胞系都表達Flt4配體mRNA(約2.4kb)以及VEGF和VEGF-B mRNAs(圖12)。
實施例13VEGF-C鏈在生物合成后被蛋白酶切加工和二硫鍵合如同從VEGF-C開放閱讀框推定的那樣，分泌型人VEGF-C多肽的預(yù)測分子量為46,883KD，提示該VEGF-C mRNA可首先翻譯成一個前體，而從該前體中通過蛋白酶切可生成21/23KD和29/32KD的配體。
此可能性可以通過代謝標(biāo)記的表達VEGF-C的293EBNA細胞而研究。最初，用VEGF-C構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293EBNA細胞。通過加入100μCi/mlPro-mixTML-[35S]體外細胞標(biāo)記混和物((含35S-Met和35S-Cys)Amersham，Backinghamslior，England)到無Cys和Met的培養(yǎng)基中而標(biāo)記該表達產(chǎn)物。兩小時后，用PBS洗滌該細胞層兩次，然后用DMEM-0.2％BSA代替該培養(yǎng)基。隨后培育1，3，6，12和24小時后，收集該培養(yǎng)基，離心澄清并濃縮，而人VEGF-C在+4°下結(jié)合到30μl的Flt4EC-Sepharose懸浮液并過夜，隨后在PBS中洗三次，在20mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌二次，烷化，SDS-PAGE并放射自顯影。烷化是通過用10mM 1，4-二硫蘇糖醇(Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany)在25℃下處理1小時，并隨后用30mM碘乙酰胺(Fluka，Buchs，Switzerland)處理而進行。
這些實驗證實推定的32KD表觀分子量的前體多肽結(jié)合于來自用人VEGF-C表達載體(圖13A)轉(zhuǎn)染的代射標(biāo)記細胞的條件培養(yǎng)基的Flt4 EC親和基質(zhì)上，而不結(jié)合于那些來自模擬(M)轉(zhuǎn)染的細胞。一個23KD受體結(jié)合多肽的增加量在隨后的三小時追蹤期在VEGF-C轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基中累積，但此后則沒有(泳道2-4，未出示數(shù)據(jù))，提示該23KD型是通過蛋白酶切加工而產(chǎn)生的，而這種加工至少在瞬時轉(zhuǎn)染細胞中是不完全的。圖13A的箭頭指示該32KD和23KD的分泌型VEGF-C多肽。隨后的實驗表明該32KDVEGF-C型含有如29和32KD多肽的在無烷基化下遷移的兩個成分(圖21-23)。
在一個相關(guān)的實驗中，將在4小時的連續(xù)代謝標(biāo)記后的Flt4 EC-Sepharose分離的人VEGF-C通過在非還原態(tài)下的PAGE檢測(圖13B)。在非還原態(tài)下測定出較大的分子量，提示該VEGF-C多肽能形成二硫鍵合二聚體和/或者多聚體(圖13B箭頭)。
實施例14VEGF-C刺激VEGFR-2自身磷酸化用人VEGF-C載體轉(zhuǎn)染的源于293EBNA細胞的條件培養(yǎng)基(CM)也用于刺激表達VEGFR-2(Kdr)豬動脈內(nèi)皮(PAE)細胞。Pajusola等人，生物化學(xué)雜志，26926988-26995(1994)。將該細胞裂解并用VEGFR-2特異性抗血清免疫沉淀(Waltenberger等人，1994)。
將PAE-KDR細胞(Waltenberger等人，1994)在Ham′s F12培養(yǎng)基-10％胎牛血清(FCS)中生長。將鋪滿的NIH 3T3-Flt4細胞或者PAE-KDR細胞分別在補充有0.2％BSA的DMEM或Hams F12培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)過夜，然后，用檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)5分鐘。作為刺激劑的重組人VEGF(P&D系統(tǒng))和PDGF-BB用作對照。用含100mM正礬酸鈉的冰冷Tris緩沖鹽(TBS)洗滌該細胞兩次并在含1mM苯甲基磺酰氟，0.1U/ml抑蛋白酶肽和1mM正礬酸鈉的RIPA緩沖液中裂解。將該裂解物聲處理，16,000×g離心20分鐘澄清并用3-5μl Flt4(Pajusola等，1993)，VEGFR-2或PDGFR-β(Claesson-Welsh等人，生物化學(xué)雜志，264 1742-1747(1989)；Waltenberger等人，1994)的特異性抗血清在冰上培養(yǎng)3-6小時。將該免疫沉淀物結(jié)合于蛋白A-Sepharose，用含1mM PMSF，1mM正礬酸鈉的RIPA緩沖液洗滌三次，用10mM Tris-HCl(pH 7.4)洗滌兩次，并用7％凝膠進行SDS-PAGE。通過Western印跡將多肽轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上并用PY20磷酸酪氨酸-特異性單克隆抗體(Tranduction Laboratories)或受體-特異性抗血清和ECL檢測法(Amersham公司)檢測。
該實驗結(jié)果如圖14A和14B所示。如圖14A所示，表達VEGFR-2的PAE細胞用10-或2倍濃縮的源于模擬-轉(zhuǎn)染的293-EBNA細胞(泳道1和2)的培養(yǎng)基，或用2，5-或10倍濃縮的源于表達重組VEGF-C泳道3-6)的293-EBNA細胞刺激。用特異性抗體免疫沉淀該VEGFR-2并通過SDS-PAGE和Western印跡(使用磷酸酪氨酸抗體)檢測。為對比起見，用非還原態(tài)的含50ng/ml純化的重組VEGF(泳道7和8)培養(yǎng)基進行刺激。泳道6和7示用VEGF-C或含VEGF的用Flt4EC預(yù)處理的培養(yǎng)基的刺激。如圖14B所示，用非還原培養(yǎng)基(泳道1)，5倍濃縮的源自模擬轉(zhuǎn)染(泳道2)或VEGF-C轉(zhuǎn)染(泳道3和4)的細胞的CM，或用含50ng/ml重組人PDGF-BB(泳道5)的非條件態(tài)培養(yǎng)基刺激表達PDGFR-β的NIH 3T3細胞。也用重組Flt4 EC(泳道4)預(yù)處理含VEGF-C的培養(yǎng)基。用特異性抗體免疫沉淀PDGFR-β并通過SDS-PAGE和抗體的Western印跡用磷酸酪氨酸以及隨后剝離并用PDGFR-β特異性抗體重探測檢測。
再參考到圖14A，在由源于模擬轉(zhuǎn)染的細胞的CM刺激的細胞中檢測出基礎(chǔ)水平的VEGFR-2的酪氨酸磷酸化。進一步濃縮該培養(yǎng)基只引起VEGFR-2磷酸化(泳道1和2)的輕微增加。含重組VEGF-C的CM刺激VEGF-2的酪氨酸磷酸化而自身磷酸化多肽帶的強度也隨著VEGF-CCM濃縮而增加(泳道3-5)。此外，在用Flt4 EC親和基質(zhì)(比較泳道1，5和6)預(yù)處理該培養(yǎng)基后，其失去了刺激效果。在本試驗中的VEGF-C最大效應(yīng)可相當(dāng)于以50ng/ml的濃度加入到非條件培養(yǎng)基的重組VEGF效應(yīng)(泳道8)。用Flt4 EC預(yù)處理含VEGF的培養(yǎng)基并沒有除去其刺激VEGFR-2的效應(yīng)(比較泳道7和8)。這些結(jié)果提示該VEGF-C表達載體不但編碼Flt4(VEGFR-3)配體也編碼VEGFR-2(Kdr)配體。
為進一步證實VEGF-C對VEGFR-3和VEGFR-2的酪氨酸磷酸化的刺激效應(yīng)是受體-特異性的，我們檢則了VEGF-C對大量表達于成纖維細胞的PDGF受體β(PDGFR-β)的酪氨酸磷酸化的效應(yīng)。由圖14B可見，檢測出基于用源于模擬轉(zhuǎn)染細胞的CM對表達Flt4的NIH 3T3細胞的刺激的PDGFR-β的弱的酪氨酸磷酸化(比較泳道1和2)。當(dāng)用源自經(jīng)過或不經(jīng)過Flt4 EC預(yù)處理的VEGF-C轉(zhuǎn)染的細胞的CM培養(yǎng)該細胞時，可觀測到類似低水平的PDGFR-β磷酸化(泳道3和4)。相反，50ng/ml PDGF-BB的加入誘發(fā)了PDGFR-β顯著的酪氨酸磷酸化(泳道5)。
實施例15VEGF-C刺激內(nèi)皮細胞在膠原凝膠中遷移將源自用表達VEGF-C的載體轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基(CM)置于在膠原凝膠中所制的孔中并用于如下文所述刺激中毛細管內(nèi)皮(BCE)細胞在三維膠原細胞中的遷移。
BCE細胞(Folkman等人，美國國家科學(xué)院院刊，765217-5221(1979))如Pertovaara等人，生物化學(xué)雜志，2696271-74(1994)中所述培養(yǎng)。該膠原凝膠是通過將I型膠原貯備液(5mg/ml于1mMHCl中)和同樣體積2×MEM和2倍體積含10％新生牛血清的MEM混合以達到膠原終濃度1.25mg/ml而制備。用約1mm厚層使在37℃下聚合的該溶液覆履蓋該組織培養(yǎng)平板。在此層的上部接種BCE細胞。關(guān)于遷移檢測，可以讓該細胞附著于置于該第一個膠原層的上部的塑料環(huán)(直徑1cm)的內(nèi)壁。30分鐘后，除去環(huán)并漂洗去未附著的細胞。加入第二層膠原和一層通過0.75％低熔點瓊脂(FMC生物產(chǎn)品，Rockland，ME)固化的生長培養(yǎng)基(5％新生牛血清(NCS))。在該細胞斑點的兩側(cè)以4mm的距離穿過所有層打一個孔(直徑3mm)，每天移入樣品或?qū)φ张囵B(yǎng)基到該孔中。六天后，用裝有相差光鏡片的Olympus CK 2倒置顯微鏡拍下移出斑點邊緣的細胞的顯微照片。用熒光染料二苯并酰亞胺(1mg/ml，Hoechst 33258，Sigma)染色核酸后，計數(shù)該遷移細胞。
圖15示在加入培養(yǎng)基六天后，在從附著的最初區(qū)域到含由非轉(zhuǎn)染(對照)或轉(zhuǎn)染的(模擬；VEGF-C；VEGF)細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的孔的不同距離遷移的細胞的數(shù)量對比。用顯微鏡光學(xué)透鏡柵和10×放大的熒光顯微鏡在5個相鄰的0.5mm×0.5mm正方形中計數(shù)從最初附著環(huán)中遷出的細胞數(shù)目。通過以0.5mm的每步移動該柵以類似方式計數(shù)遷移超過0.5mm的細胞。兩次進行該實驗得到類似的結(jié)果，而一個實驗的中值用標(biāo)準(zhǔn)差直方圖表示。從該直方圖可見，含VEGF-C的CM對細胞遷移刺激作用超過由非轉(zhuǎn)染或模擬轉(zhuǎn)染細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基但不如源于用VEGF表達載體轉(zhuǎn)染的細胞的培養(yǎng)基。與源于VEGF轉(zhuǎn)染的細胞的CM刺激相比，每天加入1ng FGF2到該孔中引起了約兩部數(shù)量的細胞的遷移。
實施例16在多個組織中表達VEGF-C含有2μg分離于多個人類組織的poly(A)+RNA的Northern印跡(克隆技術(shù)實驗室公司的印跡，Palo Alto，CA)用放射性標(biāo)記的2.1kb VEGF-CcDNA插入片段探測。Northern印跡和雜交分析表明該2.4kb RNA和少量2.0kb mRNA在多個人類組織中，尤其顯著地在心臟，胎盤，肌肉，卵巢和小腸(圖16A)中表達。VEGF-C RNA極少見于腦，肝臟或胸腺中，并且在外周血白細胞(PBL)中是陰性的。類似地分析人胎兒組織(圖16B)RNA表明VEGF-C在腎和肺中高度表達而在肝臟則是較低水平的，并且檢測出在腦中基本上沒有表達。有趣地是，VEGF表達在這些組織中和VEGF-C表達相關(guān)，而VEGF-B在所有檢測的組織中高度表達。
實施例17VEGF-C基因定位于染色體4q34保留了一個或兩個人染色體的24個種間體細胞雜交體的DNA系列用于該VEGF-C基因(Bios Laboratories，Inc.，New Haven，CT)的染色體定位。設(shè)計引物以擴增源于體細胞雜交體DNA的大約250bp VEGF-C基因片段。對于VEGF-C，PCR引物和條件5′-TGAGTGATTTGTAGCTGCTGTG-3′(正向)[序列34]和5′-TATTGCAGCAACCCCCACATCT-3′(反向)[序列35](94℃，60s/62℃，45s/72℃，60s)。PCR產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳以及溴化乙錠染色并在紫外燈下觀察。[α-32P]-dCTP標(biāo)記的代表完整的VEGF-C編碼區(qū)的質(zhì)粒的cDNA插入片段用作如說明書所示的Sonthern印跡和體細胞雜交體DNAs的雜交分析中的探針(Bios Laboratories)。
用于熒光原位雜交(FISH)的細胞系獲自ATCC(Rockville，MD)通過EcoRI消化DNA的Southern印跡隨后用VEGF-C cDNA雜交證實純化P1克隆株7660和7661(VEGF-C)(Genome Systems，Inc.，St.Louis，MO)是陽性的。然后，根據(jù)常規(guī)方法用生物素-11-dUTP，生物素-14-ATP(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)或地高率配基11-dUTP(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)通過缺口翻譯標(biāo)記該P1克隆。用5-溴脫氧尿苷(BrdU)在早期復(fù)制階段處理PHA-刺激的外周血淋巴細胞培養(yǎng)物以誘導(dǎo)G帶。見于Takahashi等人，“人類遺傳學(xué)”(Human Genet)，8614-16(1995)；Lemieux等人，Cytogenet.Cell genet.，59311-12(1992)。在溶于2×SSC的50％甲酰胺，10％葡聚糖硫酸酯中用周知的方法進行該FISH步驟。見如Rytknnen等人，Cytogenet Cell Genet.，6861-63(1995)；Lichter等人，美國國家科學(xué)院院刊，859664-68(1988)。用與標(biāo)記的探針相比起過50倍的Cet-1DNA(BRL，Gaithersburg，MD)抑制該重復(fù)序列。通過在標(biāo)記的抗地高率配基抗體中培育該雜交的載玻片，隨后用0.1mmol/L 4，6-二氨基-2-苯基吲哚復(fù)染檢測特異和雜交信號。雙色實驗的探針檢測是通過在異硫氰酸熒光素(FITC)-抗-地高率配基抗體(Sigma Chemical Co.)和德克薩斯紅-親和素(Vector Laboratories，BurlingaMe，CA)或者羅丹明-抗-地高率配基和FITC-親和素中培育該載玻片而進行。
多色數(shù)字成像分析用于獲取，顯示和定量中期染色體的雜交信號。該系統(tǒng)包括連接于PowerMac 7100/AV工作站的PXL攝相機(Photometrics Inc.，Tucson，AZ)。IPLab軟件控制該攝相機操作，影像獲取和Ludl濾輪。計數(shù)了至少50個核。忽略了重疊核和細胞群。在每個實驗中包括一個含有正常淋巴細胞中期擴散和分裂間期核的載玻片以作為該雜交的有效性和特異性的對照。
為了測定人VEGF-C基因在染色體上的定位，用Southern印跡和VEGF-C cDNA探針雜交測定含有一定套數(shù)的人染色體的人和嚙齒類的體細胞雜交體的DNAs。在該雜交體系列上的代表不同的人類染色體的24個DNA樣中，只在含人類染色體4的雜交體中觀測到了人特異性信號。用以VEGF-C特異性引物的體細胞雜交體DNAs的PCR證實了該結(jié)果，其中擴增帶僅來自含人類染色體4的DNAs。
VEGF-C的基因組P1質(zhì)粒通過特異性引物和PCR分離并通過Southern印跡和用VEGF-C特異性cDNA探針的雜交證實。用中期FISH進一步研究VEGF-C的染色體定位。在FISH中用VEGF-C的P1探針，可以在44個中期細胞的40中檢測出對4q34染色體帶的特異性雜交。用天冬氨酰氨基葡糖酶(AGA)基因的特異性粘粒核探針的雙熒光染料雜交表明VEGF-C剛好定位于以前標(biāo)于4q34-35染色體帶的AGA基因的鄰位。
將生物素標(biāo)記的VEGF-C P1和地高辛配基標(biāo)記的AGA粘粒探針同時和中期染色體雜交。該實驗證實該AGA基因比VEGF-C基因更端粒地定位。前述實施例證實本發(fā)明的多肽的作為染色體標(biāo)記物的應(yīng)用以及在正?；蚣膊〖毎杏谢驘oVEGF-C基因區(qū)的應(yīng)用。該VEGF-C于4q34上的位點也是能致血管畸形或心血管病的突變的候選靶。
實施例18葡萄糖濃度和低氧對C6惡性膠質(zhì)瘤細胞中VEGF，VEGF-B和VEGF-C mRNA水平的影響。
在含2.5ml DMEM和5％FCS加抗生素的直徑10cm的組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)鋪滿的C6細胞(ATCC CCL 107)培養(yǎng)物。將該培養(yǎng)物暴露于含5％CO2的正常細胞培養(yǎng)箱的正常氧含量中或者通過用密封的玻璃管中封閉培養(yǎng)基并在其中燃燒一塊木頭直至其由于缺氧而熄滅的低氧含量中16小時。分離聚腺苷酸化RNA(如其它實施例)，并將8μg RNA電泳并用VEGF，VEGF-B和VEGF-C探針混和物(見圖12)印跡雜交。結(jié)果表明低氧是在低和高葡萄糖中都能強烈地誘發(fā)VEGF-mRNA表達，但對VEGF-B mRNA水平無明顯影響。分離于低氧細胞的VEGF-C mRNA在凝膠電泳中泳動稍快并且一個稍快遷移的額外常見于上端mRNA帶下。此結(jié)果顯示低氧影響VEGF-C RNA加工。有人對該觀察結(jié)果的解釋是VEGF-C mRNA剪接被改變從而影響VEGF-C開放閱讀框并導(dǎo)致低氧細胞產(chǎn)生可變的VEGF-C蛋白。這些VEGF-C的可變型和編碼VEGF-C多核苷酸也作為本發(fā)明的一個方面。此結(jié)果表明了本發(fā)明的多核苷酸和多肽的篩選和診斷應(yīng)用，如作為從一生物樣品中篩選VEGF-C和/或者VEGF-C mRNA的低氧-誘發(fā)型方法。結(jié)果還提示VEGF-C的低氧誘發(fā)型或正常型的抗體和/或其它抑制劑的治療指標(biāo)。
實施例19源自用VEGF-C表達載體轉(zhuǎn)染的293 EBNA細胞的VEGF-C多肽的脈沖-追蹤標(biāo)記和免疫沉淀合成下列稱為PAM 126的VEGF-C分枝氨基末端肽用以制備抗VEGF-C抗血清NH2-E-E-T-I-K-F-A-A-A-H-Y-N-T-E-I-L-K-COOH(序列39)。
特別地，合成PAM 126作為具有連接到兩個有效賴氨酸(K)殘基的四個肽酸(PA)鏈的分枝多賴氨酸結(jié)構(gòu)K3PA4。用Fmoc-化學(xué)和TentaGel S MAPRAM 10樹脂混合物(RAPP Polymere GmbH，Tubingen，Germany)在433A肽合成儀(Applied Biosystems)上進行該合成，得到可切割和樹脂-結(jié)合肽。通過反相HPLC純化該可切割肽并和樹脂-結(jié)合肽一起用于免疫。該合成產(chǎn)物的正確性用質(zhì)譜(Lasermatt)證實。
將該PAM 126肽溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)，并和Freund′s肽劑混合用于通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法以雙周間隔免疫兔(Harlow和Lane，抗體，實驗手冊，冷泉港實驗室出版社(1988)。四次加強免疫后所得的抗血清在下述脈沖追蹤實驗中用于免疫沉淀VEGF-C。
對于脈沖追蹤檢測，用VEGF-C表達載體(即FLT4-L cDNA插入到上述的pREP 7表達載體中)所轉(zhuǎn)染的293EBNA細胞在無Met，無Cys，無血清DMEM培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后，改變該培養(yǎng)基，并加入200μCi的Pro-mixTM(Amersham)。將該細胞層在此標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩小時，用PBS洗滌，并在無血清DMEM(追蹤)中培養(yǎng)0，15，30，60，90，120，或180分鐘。在各個追蹤時間后，收集培養(yǎng)基，再在PBS中洗滌該細胞兩次，并在免疫沉淀緩沖液中裂解。用引起抗23KD VEGF-C型的NH2-端肽(PAM 126)的VEGF-C特異性抗血清在培養(yǎng)基和細胞裂解物中檢測VEGF-C多肽。通過SDS-PAGE接著放射自顯影檢測免疫沉淀的多肽。
參照圖19，所得的放射自顯影表明在剛好2小時標(biāo)記(追蹤時間0)后，該VEGF-C載體轉(zhuǎn)化的細胞含一個放射活性的55KD多肽帶，而其不見于模擬轉(zhuǎn)染細胞(M)中。隨著追蹤時間的增加，該55KD多肽帶的強度漸漸減弱，并且在180分鐘追蹤的細胞中沒有檢出。在VEGF-C轉(zhuǎn)染的細胞中也觀察到了一個32KD多肽帶(而不見于模擬轉(zhuǎn)染細胞)。該32KD帶以和55KD帶相似的動力學(xué)消失。同時，增加量的32KD(箭頭)和隨后的23KD(箭頭)及14KD多肽出現(xiàn)于該培養(yǎng)基中。
總之，脈沖追蹤實驗的結(jié)果表明該55KD胞內(nèi)多肽代表非細胞分泌的前-VEGF-C多肽，其首先被蛋白酶切成32KD型。該32KD型被分泌并同時進一步蛋白酶加工成23KD和14KD型。并不是意欲局限于某一特定的理論，據(jù)認(rèn)為該VEGF-C前體的加工是以除去信號序列，除去該COOH-末端區(qū)(BR3P)，以及除去氨基末端多肽的形式出現(xiàn)，從而產(chǎn)生具有TEE以氨基末端的VEGF-C多肽。
在高分辨的情況下，該23KD多肽帶以小間距的多肽雙聯(lián)體形式存在，提示切割或糖基化中的異質(zhì)性。
實施例20編碼VEGF-C的鼠和鵪鶉cDNA克隆的分離為了克隆VEGF-C鼠變體，用放射性標(biāo)記的含序列32的495-1661位核苷酸的人VEGF-C cDNA片段篩選可購買到的12天鼠胚胎cDNA文庫(λEXlox文庫，Novagen，分類號69632-1)的約1×106λ噬菌體λ克隆株。分離出一個陽性克隆株。
將分離的鼠cDNA克隆的插入片段的一個1323bp EcoRI/HindIII片段亞克隆到pBluescript SK+載體(Stratagene)的相應(yīng)位點并測序。該克隆的cDNA序列除了在鼠克隆中沒有人克隆中存在的約710bp的5′端序列外，其它與人VEGF-C序列同源。
為進一步篩選鼠cDNA文庫，將源于鼠cDNA克隆的編碼區(qū)的881bp的Hind III-BstXI(源自pBluescript SK+多接頭的Hind III位點)片段放射標(biāo)記并用作探針篩選另外兩個鼠cDNA文庫。鑒定源于成年鼠心臟ZAP II cDNA文庫(Stratagene，分類號936306)的另外兩個cDNA克隆。還從鼠心臟5′-延伸-+cDNA文庫在λgt11(Clontech實驗室公司，編碼936306)中分離三個另外的克隆株。在后來的三個克隆中，發(fā)現(xiàn)有一個含有約1.9kb的插入片段。將該cDNA克隆的插入片段亞克隆到pBluescript SK+載體的CcoRI位點而該克隆的兩條鏈均被完全測序，得到的核苷酸和推動的氨基酸序列示于序列40和41中。
可考慮將對應(yīng)于序列41的多肽以類似于人VEGF-C前體肽的加工方式裝配到成年鼠VEGF-C蛋白中。用上述鑒定人VEGF-C多肽的切割位點的方法鑒定該鼠蛋白的推斷割位點。
前述結(jié)果證明本發(fā)明的多核苷酸用于鑒定和分離編碼其它非人哺乳動物VEGF-C變體的用途。鑒定的和分離的多核苷酸本身又可被表達(用類似于前面實施例所述的方法)以生產(chǎn)對應(yīng)于非人哺乳動物VEGF-C變體的重組多肽。
鼠和人VEGF-C序列用于設(shè)計從鵪鶉cDNA文庫中分離鵪鶉VEGF-C cDNA的探針。將PCR擴增所得的含序列32的495-1670位核苷酸的人VEGF-C cDNA片段按說明書方法克隆到pCRII載體(Invitrogen)，并擴增。用EcoRI消化和制備型凝膠電泳分離該插入片段并再用放射性dCTP和隨機引發(fā)標(biāo)記。然后，用此探針篩選pcDNA-1載體中的源于E-4階段鵪鶉胚胎的cDNA文庫。將約200,000個克隆鋪板并用放射性探針雜交影印濾膜。將九個陽性克隆鑒定并第二次鋪板。九個克隆中有兩個在第二次篩選中雜交。該純化的克隆(克隆1和14)具有約2.7kb EcoRI插入片段。將兩個克隆都擴增并隨后用T7和SP6引物(對該載體退火)測序。此外，鑒定出一個內(nèi)部的SphI限制性內(nèi)切位點距該載體的T7引物側(cè)約1.9kb，將其用于亞克隆5′-和3′-Sph I片段，隨后從該亞克隆的Sph I端測序。得到的序列在兩個克隆中是相同的并且表現(xiàn)出和人VEGF-C編碼區(qū)具高度的相似性。隨后，在兩個方面制備步移引物并完成雙鏈序列為含有開放閱讀框長全的1743bp。
所得的cDNA序列含有一個長開放閱讀框和5′非翻譯區(qū)。該DNA和推定鵪鶉cDNA的氨基酸序列分別如序列52和53所示。如圖8所示，人，鼠，和鳥類(鵪鶉)VEGF-C前體氨基酸序列表現(xiàn)出明顯的保守度。這種高度的同源性允許用本發(fā)明的多核苷酸作為探針和本文所述的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)從其它物種，特別是脊椎動物種，以及更特別的哺乳動物和鳥類物種中分離編碼VEGF-C的序列。
實施例21重組VEGF-C的N-末端肽序列分析用VEGF-C cDNA(見于實施例13)轉(zhuǎn)染的細胞(293 EBNA)分泌幾種類型的重組VEGF-C(圖21A，泳道IP)。在無烷基化時，三種主要的VEGF-C蛋白酶加工型在SDS-PAGE中作為表現(xiàn)分子量為32/29KD(二聯(lián)體)，21KD和15KD的蛋白而遷移。兩種次要的多肽分別表現(xiàn)約63和52DK的分子量。這些多肽的一個被假定為糖基化的和非加工型；而其它多肽被假定為糖基化的和部分加工的。
為測定該VEGF-C前體的蛋白酶切位點，用一個免疫親和柱從用VEGF-C cDNA轉(zhuǎn)染的293EBNA細胞的條件培養(yǎng)基中純化VEGF-C多肽。為制備該免疫親和柱，用對應(yīng)于序列33的104-120位氨基酸H2N-EETIKFAAAHYNTEILK(見實施例19中的PAM 126)合成肽免疫兔。用蛋白A Sepharose (Pharnacia)從該免疫兔的血清中分離IgG片段。用常規(guī)技術(shù)將該分離的IgG片段以5mg IgG/ml Sepharose的濃度結(jié)合到CNBr-活化的Sepharose CL-4B(Pharmacia)。該免疫親和基質(zhì)用于從1.2升條件培養(yǎng)基(CM)中分離加工的VEGF-C。
用凝膠電泳和Western印跡分析該由柱洗脫的純化物?；旌衔颲EGF-C多肽的組分，對10mM Tris HCl透析，真空干燥，電轉(zhuǎn)移到Immobilon-p(聚偏氟乙烯或PVDF)轉(zhuǎn)移膜(Millipore，Marlborough，MA)并進行N-末端氨基酸序列分析。
32KD的多肽帶產(chǎn)生兩個不同的序列NH2-FESGLDLSDA…和NH2-AVVMTQTPAS…(序列51)，前者對應(yīng)切除該信號肽后的VEGF-CN末端部分，起始于32位氨基酸(序列33)，而后者對應(yīng)于IgG的Kappa鏈，其由于親和基質(zhì)在洗脫過程中的滲漏而存在于純化的材料中。
為了獲得29KD VEGF-C的N末端肽序列，產(chǎn)生了編碼VEGF-C變體的構(gòu)建體(VEGF-C NHis)。尤其是，該構(gòu)建體編碼一個將6×His標(biāo)記物融合到該分泌的前體(即序列33的31和33氨基酸之間)的VEGF-C變體。除去32位點的Phe以防止可能的該標(biāo)記序列在分泌VEGF-C過程中切除。將VEGF-C NHis構(gòu)建體克隆到作為載體的pREP7；該構(gòu)建體更詳細地描述于下文的實施例28中。
用磷酸鈣共沉淀技術(shù)將VEGF-C NHis轉(zhuǎn)染到293 EBNA細胞。在15cm細胞培養(yǎng)皿中，(共25個平板)用DMEM/10％FCS中培養(yǎng)細胞。次日，將該細胞重新接種到含同樣培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿(75個平板)并培養(yǎng)48小時。然后，用PBS洗滌一次并加入無FCS的DMEM培養(yǎng)基。細胞在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時并收集該培養(yǎng)基，以5000×g離心澄清，用Ultrasette Tangential FlowDevice(Filtron，Northborough，MA)濃縮500倍，如上述實施例5所述。用TALONTM金屬親和樹脂(Clontech Laboratories，Inc.)和制造商的用含吲哚的緩沖液純化天然蛋白的說明書所述方法，從濃縮的條件培養(yǎng)基中純化VEGF-CNHis。用含20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NaCl，和200mM吲哚的溶液洗脫該蛋白。通過用抗血清882(源于用PAM-126多肽免疫的兔882的抗血清)的免疫印跡檢測含純化的VEGF-CNHis的洗脫組分?；旌秃琕EGF-C NHis的組分，透析并真空干燥。如圖27所示，由于這種類型的VEGF-C的N末端的6×His標(biāo)記物的存在，該VEGF-C NHis的主要二聯(lián)體的上層組分比32KD型野生型VEGF-C遷移得稍慢，因此用SDS-PAGE中改進了該VEGF-C NHis 32KD變體從29KD帶的分離。將約15μg的純化VEGF-C進行還原態(tài)下的SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移到Immobilon-P(PVDF)轉(zhuǎn)移膜(Millipore，Inc.，Marlborough，MA)并將29KD的帶進行N末端氨基酸序列分析。該序列分析表明N末端序列H2N-SLPAT…，對應(yīng)于VEGF-C(序列33)的228-232位氨基酸。
該21KD的多肽帶發(fā)生了序列H2N-AHYNTEILKS…，對應(yīng)于起始于序列33的112個氨基酸的氨基末端。因此，導(dǎo)致21KD型的通過轉(zhuǎn)染的293EBNA細胞產(chǎn)生的VEGF-C蛋白酶加工位點明顯地產(chǎn)生于導(dǎo)致23KD型的由PC-3細胞分泌的VEGF-C的切割位點的下游的九個氨基酸。
該15KD型的N末端和32KD型的相同(NH2-FESGLDLSDA…)。當(dāng)由COS細胞產(chǎn)生重組VEGF-C時沒有檢測出15KD型。這提示此型的產(chǎn)生是細胞譜系特異性的。
實施例22VEGF-C的二聚和單體型VEGF-C聚合體組合物如下分析。用如實施例11的pREP7 VEGF-C載體轉(zhuǎn)染的細胞(293 EBNA細胞)用Pro-mix L-[35S]代謝標(biāo)記混合物(Amersham公司)代謝標(biāo)記到100uci/ml的終濃度。
平行地，也制備并分析了稱為“R102S”的VEGF-C突變體。為制備編碼VEGF-C-R102S的DNA，序列33中102位點的Arg密碼子為Ser密碼子所取代。將這個在pREP7載體中的VEGF-C-R102S-編碼DNA轉(zhuǎn)染到293 EBNA細胞中并如上述表達。用抗血清882(通過用對應(yīng)于序列33的104-120位殘基的多肽免疫兔而獲得(見以前的實施))和抗血清905(通過用對應(yīng)于前體VEGF-C前導(dǎo)部分的多肽H2N-ESGLDLSDAEPDAGEATAYASK(序列33的33-54位殘基)免疫兔而得到)免疫沉淀VEGF-C多肽。
將每個細胞培養(yǎng)物的免疫沉淀物進行非變性態(tài)的SDS-DAGE(圖21B)。從該凝膠上切出1-6帶，在含200mM β-巰基乙醇的1×凝膠-負載的緩沖液中浸30分鐘，并分別進行變性態(tài)下的SDS-PAGE(21A和12C，泳道1-6)。
如圖21A-C所示，每個高分子量型的VEGF-C(圖21B，帶1-4)由至少通過二硫鍵結(jié)合的兩個單體)比較圖21A和21C，泳道1-4，在還原凝膠中)。該1-3帶的主要成分是32/29KD的二聚體，其中的兩個蛋白22等摩爾比存在。該主要的21KD型組分以單體或通過除二硫鍵連接的同源二聚體形式分泌(圖21A和21C的泳道6)。
該R102S突變在序列33的第100位點處的Asp殘基產(chǎn)生一個用于N-連接糖基化的附加位點。在此附加的糖基化位點的糖基化增加了含該位點的多肽的表觀分子量，如圖21A-C和圖22A-B所證實。和初級結(jié)構(gòu)類似于VEGF-C的多肽相比，該附加的糖基化降低了含該附加的糖基化位點VEGF-C-R102S型的遷移率。圖21A-C和圖22A-B表示了對應(yīng)于32KD和15KD型wt VEGF-C的VEGF-C-R102S多肽增加了表觀分子量，表明這些多肽的每一個都含有新引入的糖基化位點。尤其是，對應(yīng)于源自VEGF-C的15KD多肽的VEGF-C-R102S和21KD型野生型(wt)VEGF-C在凝膠上共遷移，反應(yīng)在凝膠上是其遷移到對應(yīng)于更大表觀分子量的位置(比較圖21A和21C中的泳道4)。
在相關(guān)的實驗中，制備和分析了另一個稱為“R226，227S”的VEGF-C突變體。為制備編碼VEGF-C-R226，227S的DNA，通過定點誘變用Ser密碼子替代序列33的226和227位置的Arg密碼子。將所得的DNA如上所述轉(zhuǎn)化入293 EBNA細胞并在如對VEGF-C和VEGF-C-R102S所述的同樣條件下表達和分析。在源自表達VEGF-C-R226，227S的細胞的條件培養(yǎng)基中，沒有檢測出32KD型的VEGF-C。這些結(jié)果提示wt VEGF-C的C末端切割位點相鄰于序列33的殘基226和227，并通過Arg到Ser的突變而破壞。該二聯(lián)體的29KD組分的遷移率也沒改變(圖22A-B)。
總之，這些數(shù)據(jù)提示該主要的加工的VEGF-C型是一個由含通過二硫鍵連接到開始于序列33的228位氨基酸的29KD的多肽的前-VEGF-C(序列33的32-227氨基酸)的32KD多肽所組成的異源二聚體。這些數(shù)據(jù)也可以通過比較抗血清882和抗血清905標(biāo)記的VEGF-C型的免疫沉淀模式而支持。
當(dāng)用條件培養(yǎng)基進行VEGF-C免疫沉淀時，兩種血清(882和905)都能識別主要的VEGF-C加工型(32/29KD，21KD和15KD)中的部分或全部三種。當(dāng)該條件培養(yǎng)基通過在10mM二硫蘇糖醇存在下于室溫下培育兩小時而還原并隨后通過用25mM碘乙酰胺于室溫下另外培養(yǎng)20分鐘而烷化時，兩種抗體都不沉淀29KD組分，雖然抗體882還能識別32KD，21KD和15KD多肽。這些結(jié)果和該寡核苷酸抗原的用于誘發(fā)含于抗血清882中的一個含有序列33的104-120位氨基酚殘基的寡核苷酸的抗體的性質(zhì)相一致。另一方面，抗體905只識別32KD和15KD多肽，其包括用于免疫以獲得抗血清905的寡核苷酸序列(序列33的35-54位氨基酸)?？紤]到32KD和15KD型的遷移率，用R102S寬變體的免疫沉淀結(jié)果是類似的(圖23A-B)?？贵w905的特異性可以通過其不能識別VEGF-CΔN變體型(其中的跨未加工多肽的32-102位殘基的N末端多肽已被刪除)而證實。
這些實驗的結(jié)果也證明該21KD多肽也發(fā)現(xiàn)于(1)和其它分子型的異源二聚體中(見圖21A-C和圖22A-B)，并且(2)以單體或者通過非二硫鍵合的同源二聚體形式分泌(圖21A和21B，泳道6)。
本實施例中公開的實驗證明了幾種類型VEGF-C的存在。能觀察到VEGF-C單體的變體并且這些單體可基于糖基化水平和模式而變化。此外，檢測出VEGF-C為多聚體，如同源二聚或異源二聚體。VEGF-C的加工扼要描述于圖18(未示二硫鍵)。所有的VEGF-C型均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例23鼠胚胎的原位雜交為了分析VEGF-CmRNA在各種細胞和組織中的分布，制備P.C.12.5和14.5的鼠胚胎切片并通過用標(biāo)記的VEGF-C探針的原位雜交檢測。組織切片的原位雜交如Vstrik等人，細胞生物學(xué)雜志，1281197-1208(1995)所述進行。鼠VEGF-C反義RNA探針產(chǎn)生于含有對應(yīng)于鼠VEGF-CcDNA(序列40)的499-979位核苷酸的cDNA片段的線性化pBluescript II SK+質(zhì)粒(Seratagene Inc.，La Jolla，CA)。用T7聚合酶和[35S]-UTP(Amersham)合成放射性標(biāo)記的RNA。鼠VEGF-B反義和有義RNA探針以類似方式從含有如Olofsson等人，美國國家科學(xué)院院刊，932576-2581(1996)中所述鼠VEGF-B cDNA插入片段的線性化pCR III質(zhì)粒中合成。在含有30mMDTT和4×SSC的溶液中于65℃下高度嚴(yán)格洗滌45分鐘。暴光該載玻片28天，顯影并用蘇木精染色。為對比，用VEGFR-3探針雜交類似切片并且也檢測了P.C.12.5天胚胎的VEGF-B mRNA。
圖34A-D示用反義(圖34A)和有義(圖34C-D)VEGF-C探針探測的P.C.12.5天胚胎切片的暗視野(圖34A-C)和亮視野(圖34D)顯微照片。圖34A示一旁矢狀面切片，其中的VEGF-C mRNA在包圍著發(fā)育著的后腎(mn)的血管附近的間質(zhì)中尤其突出。此外，雜交信號也觀察于發(fā)育著的脊椎(vc)間，發(fā)育著的肺(lu)，頸部和額中。與在相鄰切片(圖34B)中的VEGF-B表達相比，這些信號的特異性是明顯的，其中心肌給出極強的信號而在其它的幾個組織中也檢測出低水平的VEGF-B mRNA。兩基因似乎均在vc間，lu中及額中表達。該VEGF-C有義探針的雜交顯示在這些結(jié)構(gòu)中(圖34C)無特異性表達。
圖35A-D示VEGF-C和VEGFR-3在P.C.12.5天鼠胚胎的頸部(其中定位有發(fā)育著的脊動脈和心靜脈)中表達模式的對比。這就是根據(jù)長期存在的Sabin，Am.J.Anat.，943-91(1909)理論的第一個淋巴管從靜脈囊樣結(jié)構(gòu)發(fā)芽的部位。如圖35A-D所示，在對VEGFR-3陽性(圖35B和35D)發(fā)育著的靜脈囊(圖35A和35C)周圍的間質(zhì)中檢測出強烈的VEGF-C信號。
腸系膜提供發(fā)育著的帶有血的腸并含有發(fā)育著的淋巴管。發(fā)育著的P.C.14.5天的腸系膜對VEGF-C mRNA是陽性的，其尤其在某些管(圖35E-H中箭頭)周圍的結(jié)締組織中高度表達。圖35E的該信號可從血管內(nèi)紅血細胞的光反射的假陽性信號中區(qū)分出。圖35F中所示的相鄰腸系膜的VEGF-3信號起源于腸系膜(箭頭)的小毛細管。因此，似乎在VEGF-C的mRNA產(chǎn)生及其受體間有一旁分泌關(guān)系。此資料表明VEGF-C在各種組織中表達。此外，該表達模式和VEGF-C在靜脈和淋巴管發(fā)育中的作用具有一致性。而且，資料顯示VEGF-C在非人類動物中表達。
實施例24在胎兒和成人組織中的VEGF，VEGF-B，及VEGF-C mRNA表達的檢測。
含有2μg源于腦，肺，肝和腎(Clontech公司)的聚腺苷酸化RNAs的人胎兒組織的Northem印跡用下列探針的混合液雜交人全長VEGF-CcDNA插入片段(基因文庫登錄號×94216)，獲自PCR擴增的人VEGF-B167cDNA片段(核苷酸1-382，基因文庫登錄號U148800)；以及含堿基對57-638的人VEGF的581bp cDNA片段(基因文庫登記號X15997)。用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)在嚴(yán)格條件下洗滌印跡。
用鼠VEGF-C cDNA片段(堿基對499-656)雜交含2μg源于P.C.7，11，15和17天胚胎的聚腺苷酸化的RNAs的鼠胚胎多種組織Northem印跡(Clontech公司)。用人VEGF，VEGF-B167，VEGF-C的探針以及VEGFR-3 cDNA片段(核苷酸1-595；基因文庫登記號X68203)雜交鼠成熟組織Northem印跡。
在成年鼠組織中，用VEGF-C探針，以約4∶1的比率，檢測出2.4kb和2.0kb的mRNA信號。最明顯的信號獲自肺和心臟RNA，而腎，肝臟，腦，和骨骼肌中水平較低，并且脾和睪丸中僅有可見水平。如同在人類組織中，在成年鼠中的VEGF mRNA表達在肺和心臟RNA中最充分，而其它樣品表現(xiàn)出較少的和VFGF-C表達的律動調(diào)節(jié)。成年鼠的骨骼肌和心臟組織產(chǎn)生最高的VEGF-B mRNA水平，如前文提到的Olofsson等人，美國國家科學(xué)院院刊，932576-2581(1996)所述。與VEGFR-3表達相比，顯示出表達VEGF-C的組織也含有其同源受體酪氨酸激酶的mRNA，雖然在成熟肝臟中的VEGFR-3 mRNA是不相稱地豐富。
為了更好地檢測胚胎發(fā)育過程中的VEGF-C mRNA調(diào)節(jié)，分離于各種妊娠期(P.C.7，11，15，17天的聚腺苷酸化RNA用鼠VEGF-C探針雜交。這些分析顯示2.4kb VEGF-C mRNA量在妊娠期內(nèi)是有相對的穩(wěn)定性。
實施例25在人或纖維細胞培養(yǎng)基中通過血清、白介素-1和地塞米松調(diào)節(jié)VEGF族成員的mRNA。
人IMR-90或纖維細胞生長于含10％FCS和抗生素的DMEM培養(yǎng)基。該細胞生長到8％鋪滿時，在含0.5％FCS的的DMEM中饑餓48小時。然后，將生長培養(yǎng)基改成含或不含10ng/ml白介素-1(IL-1)及含或不含1mM地塞米松的且含5％FCS的DMEM，如圖24A-B所示。用這些添加劑培養(yǎng)這些培養(yǎng)板指定的時間，而總細胞RNA用TRIZOL試劑盒(GIBCO-BRL)純化。將約20μg源自每個樣品的總RNA在1.5％甲醛-瓊脂糖凝膠中如Sambrook等人，同上(1989)中電泳。將該凝膠用于Northern印跡并用放射性標(biāo)記的源自人VEGF克隆(含堿基對57-638的581bp cDNA，基因文庫登記號15997)的插入片段DNA和人VEGF-B167 cDNA片段(核苷核1-382，基因文庫登錄號U48800)雜交(圖25B)。隨后，用放射性標(biāo)記的源于VEGF-C cDNA質(zhì)粒(圖24A)的插入片段探測。用有關(guān)于隨機引物的酶延伸反應(yīng)的常規(guī)技術(shù)標(biāo)記引物，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)所理解的那樣。在轉(zhuǎn)移前基于溴化乙錠染色的RNA的UV照相可見18S和28S rRNA的遷移率。
如圖24A-B所示，可通過饑餓的IMR-90細胞以及刺激一小時后的細胞表達極低水平的VEGF-C和VEGF。相反，在這些條件下可見豐富的VEGF-B mRNA信號。4小時刺激后，對VEGF-C和VEGF mRNAs有強烈的誘發(fā)作用，并且在IL-1處理的樣品中有進一步的加強。IL-1的作用在地塞米松存在時似乎被消除。在8小時樣品中維持類似的增強模式，但在24小時和48小時樣中兩種RNA均發(fā)生了全部信號的逐漸下調(diào)。相反，VEGF-B mRNA水平維持恒定并因此在整個時間段內(nèi)表示出明顯的穩(wěn)定性。該結(jié)果用于指導(dǎo)使用VEGF-C及其片段，其拮抗劑，及抗-VEGF-C抗體治療多種疾病方法的嘗試。
實施例26重組鼠VEGF-C的表達和檢測該鼠VEGF-C cDNA表達為重組蛋白且檢測了該分泌蛋白的受體結(jié)合特性。通過用在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的VEGF-C cDNA轉(zhuǎn)染的Bosc23細胞培養(yǎng)基研究鼠VEGF-C對人VEGFR-3胞外區(qū)的結(jié)合。
1.8kb鼠VEGF-C cDNA作為EcoRI片段克隆到含有SV 40早期啟動子區(qū)的反轉(zhuǎn)錄病毒表達載pBabe-puro中[Morgenstern等人，核酸研究，183587-3595(1990)]，并通過磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染到Bosc23包裝細胞系(Pearet等人，美國國家科學(xué)院院刊908392-8396(1994)]。為對比，Bosc 23細胞也用前述的在pREP7表達載體中的人VEGF-C構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。將該轉(zhuǎn)染細胞在代謝標(biāo)記前培養(yǎng)48小時。將細胞轉(zhuǎn)入無Cys和Met的DMEM培養(yǎng)基，并在預(yù)培養(yǎng)和培養(yǎng)基更換45分鐘后，在同樣培養(yǎng)基中，即將Pro-mixTML-[35S]體外細胞標(biāo)記的混合物(Amersham公司)加到終濃度約120μCi/mlo培養(yǎng)6小時后，收集培養(yǎng)基并離心澄清。
為進行免疫沉淀，將1ml的分別用空載體或鼠或人重組VEGF-C轉(zhuǎn)染的代謝標(biāo)記Bosc23細胞的培養(yǎng)基樣各等份用2μl抗成人VEGF-CN-末端17個氨基酸寡肽(H2N-EETIKFAAAHYNTEILK)(序列33，104-120殘基)的兔多克隆抗血清在冰上培養(yǎng)過夜。然后，用蛋白A Sepharose在4℃下輕攪培養(yǎng)該樣品40分鐘。分別先后用免疫沉淀緩沖液和20mMTris-HCl，pH 7.4洗滌該Sepharose粒兩次和四次。在Laemmli緩沖液中煮沸該樣品并通過12.5％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
轉(zhuǎn)染和代謝標(biāo)記細胞的培養(yǎng)基的VEGF-C免疫沉淀顯示了約30-32×103Mr(二聯(lián)體)和22-23×103Mr在12.5％SDS-PAGE中的帶。在非轉(zhuǎn)染或如圖32模擬轉(zhuǎn)染(即標(biāo)有“載體”的泳道)細胞樣中沒有檢出這些帶。這些結(jié)果表明抗人VEGF-C的抗體能識別相應(yīng)的鼠配體。
對應(yīng)受體結(jié)合實驗，用共價偶聯(lián)到Sepharose的VEGFR-3胞外區(qū)(見例3)在4℃下稍稍混合培養(yǎng)1ml源自代謝標(biāo)記Bosc23細胞的培養(yǎng)基的等份4小時。用冰冷PBS洗滌該Sepharose粒四次，并通過凝膠電泳如Joukov等人，“歐洲分子生物學(xué)聯(lián)合會雜志”(EMBOJ)，15290-298(1996)所示分析。
正如從圖32可見，與免疫沉淀實驗相比，在受體結(jié)合實驗中獲得了類似的30-32×103Mr二聯(lián)體和22-23×103Mr多肽帶。因此，鼠VEGF-C結(jié)合于人VEGFR-3。序列分析得到的四個氨基酸殘基的差異(殘基H88-E91，圖31)可能導(dǎo)致了鼠VEGF-C多肽的稍快的遷移率。
還研究了鼠重組VEGF-C誘發(fā)VEGFR-3自身磷酸化的能力。至于VEGFR-3受體刺激實驗，亞鋪滿的NIH 3T3-Flt4細胞(Pajusola等，癌基因，93545-3555(1994))在含0.2％BSA而無血清的培養(yǎng)基中饑餓過夜。一般地，該細胞用源于VEGF-C載體轉(zhuǎn)染的細胞的條件培養(yǎng)基刺激5分鐘，用含200μm礬酸鹽的冰PBS洗滌三遍，并在免疫沉淀分析的RIPA緩沖液中裂解。以16000×g離心該裂解物25分鐘并用特異性抗血清培養(yǎng)將該所得上清液在冰上培養(yǎng)2小時，再用蛋白A-Sepharose免疫沉淀并在7％SDS-PAGE中分析。將該多肽轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上并用抗磷酸酪氨酸(Transduction實驗室)和抗受體抗體免疫印跡分析，如Pajusola等，癌基因，93545-3555(1994)所述。在50℃下的100mM 2-巰基乙醇，2％SDS，62.5mM Tris-HCl，pH 6.7中通過偶爾攪拌進行濾膜剝離。實驗結(jié)果如圖33所示。結(jié)果證明含鼠VEGF-C的培養(yǎng)基刺激VEGFR-3的自身磷酸化到相當(dāng)于人桿狀病毒VEGF-C或酪氨酰磷酸酶抑制劑過礬酸鹽的程度。
VEGFR-2刺激在亞鋪滿的表達Kdr(VEGF-2)(PAE-VEGFR-2)的豬動脈內(nèi)皮(PAE)細胞中研究[Walten berger等人，生物化學(xué)雜志，26926988-26995(1994)]，其是在含0.2％BSA的無血清培養(yǎng)基中饑餓過夜。如上述進行刺激和制備裂解物，為進行受體免疫沉淀中，使用了VEGFR-2的特異性抗血清[Waltenberger等人，生物化學(xué)雜志，26926988-26995(1994)]。如上述針對VEGFR-3在7％SDS-PAEG中檢測該免疫沉淀物，隨后用抗磷酸酪氨酸抗體進行Western印跡，剝離該濾膜，并用抗VEGFR-2抗體(Santa Cruz)重新探測。
鼠VEGF-C似乎是VEGFR-3自身磷酸化的有力誘導(dǎo)物，有195×103Mr前體和該受體(Pajusola等，癌基因，193545-3555(1994))的蛋白酶切的125×103Mr酪氨酸激酶多肽被磷酚化。首先用未濃縮的源于表達重組VEGF-C細胞的培養(yǎng)基進行VEGFR-2刺激，但免疫印跡分析沒有顯示任何的受體自身磷酸化。
為了進一步測定鼠重組VEGF-C是否也能如人VEGF-C所測的那樣誘導(dǎo)VEGFR-2自身磷酸化，用10倍濃縮的源自用鼠VEGF-C表達載體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基刺激表達VEGFR-2的PAE細胞并檢測其自身磷酸化。為了對比，使用了用十倍濃縮的含人重組VEGF-C(Joukov等，(1996))的培養(yǎng)基，未濃縮源于人VEGF-C桿狀病毒感染的昆蟲細胞的培養(yǎng)基，或者過礬酸鹽(酪氨酰磷酸酶抑制劑)處理的細胞。如圖33所示，對應(yīng)于人桿狀病毒VEGF-C以及過礬酸鹽的處理，顯著地磷酸化了VEGF-2，而人和鼠重組VEGF-C分別引起了弱的和僅可測的自身磷酸化的增強。用空載體或者以反義方向克隆的VEGF-C轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基并不誘發(fā)VEGFR-2的自身磷酸化。因此，鼠VEGF-C結(jié)合于VEGFR-3并以比VEGF-2激活所需的較低的濃度激活該受體。然而，本發(fā)明包括那些用本發(fā)明的材料利用VEGF-C和VEGFR-2，以及VEGF-C和VEGFR-3的相互作用的方法。
實施例27在Pichia酵母中表達的VEGF-C E104-S213片段刺激Flt4(VEGFR-3)和KDR(VEGFR-2)的自身磷酸化構(gòu)建了一個截短型人VEGF-C cDNA，其中(1)將編碼推定的成熟VEGF-C氨基末端H2N-E(104)ETIK(序列33，殘基104 et seq.)序列符合讀框融合到酵母PH 01信號序列(Invitrogen Pichia表達試劑盒，編號#K1710-01)，并(2)將一個終止密碼子引入213位氨基酸后(H2N-…RCMS；即序列32的213位密碼子后)。然后將所得的截短型cDNA構(gòu)建體插入到PichiaPastoris表達載體pHIL-S1(Invitrogen)。為克隆，突變了編碼VEGF-C序列的內(nèi)部BglII位點而沒有改變該編碼多肽的序列。
然后，將該VEGF-C表達載體轉(zhuǎn)染到Pichia細胞并通過用Western印跡在該培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中篩選VEGF-C蛋白的表達而鑒定陽性克隆。使一個陽性克隆生長于50ml培養(yǎng)物，并且用甲醇誘導(dǎo)從0到60小時的不同時間。將約10ul培養(yǎng)基通過凝膠電泳分析，隨后Western印跡并用抗VEGF-C抗血清檢測，如上述。如在圖25中可見，一個約24KD多肽(注明該帶由于糖基化而擴散)在用重組VEGF-C構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞的培養(yǎng)基中累積，但在模擬轉(zhuǎn)染細胞或僅用載體轉(zhuǎn)染的細胞的培養(yǎng)基中則沒有。
含重組VEGF-C蛋白的培養(yǎng)基通過(Centricon 30KD截斷的超濾濃縮并用于刺激表達Flt4(VEGFR-3)的NIH 3T3細胞以及表達KDR(VEGFR-2)的豬動脈內(nèi)皮(PAE)細胞。將所刺激的細胞裂解并用VEGFR-特異性抗血清免疫沉淀，并通過用抗磷酸酪氨酸抗體，化學(xué)發(fā)光，和熒光自顯影的Western印跡檢測該免疫沉淀物。作為該VEGFRs的最大自身磷酸化的陽性對照，用釩酸根(VO4)處理該細胞10分鐘。如圖26所示的結(jié)果，源于分泌該重組VEGF-C多肽的Pichia培養(yǎng)物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)195KD和125KD Flt4l多肽以及約200KD KDR多肽的自身磷酸化。另一方面，礬酸根誘導(dǎo)該受體帶以及其它可能和該受體共沉淀的帶的強烈的酪氨酰磷酸化。
這些結(jié)果證明由104E-213S(序列33，104-213殘基)氨基酸殘基組成的VEGF-C的VEGF同源區(qū)可在酵母中重組生產(chǎn)并能刺激Flt4(VEGFR-3)和KDR(VEGFR-2)的自身磷酸化。如本文所述的能刺激Flt4或者KDR自身磷酸化的重組VEGF-C片段也作為本發(fā)明的方面；使用這些片段的方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例28VEGF-C的不同加工型的特征下列寡核苷酸用于產(chǎn)生一系列VEGF-C變體5′-TCTCTTCTGTGCTTGAGTTGAG-3′(序列42)，用于產(chǎn)生VEGF-C R102S(102位點的Arg突變?yōu)镾er(序列33))；5′-TCTCTTCTGTCCCTGAGTTGAG-3′(序列43)，用于產(chǎn)生VEGF-C R102G(102位點的Arg突變?yōu)镚ly(序列33))；5′-TGTGCTGCAGCAAATTTTATAGTCTCTTCTGTGGCGGCGGCGGCGGCGGGCGCCTCGCGAGGACC-3′(序列44)，用于產(chǎn)生VEGF-CΔN(刪除對應(yīng)于32-102氨基酸(序列33)的N末端前肽)；5′-CTGGCAGGGAACTGCTAATAATGGAATGAA-3′(序列45)，用于產(chǎn)生VEGF-C R226，227S(序列33)位點的Arg密碼子突變?yōu)镾er；5′-GGCCTCCGCGTCCGAGAGGTCGAGTCCGGACTCGTGATGGTGATGGTGATGGGCGGCGGCGGCGGCGGGCGCCTCGCGAGGACC-3’(序列46)，用于產(chǎn)生VEGF-C NHis(該構(gòu)建體編碼帶有融合到該分泌的前體(序列33的32位氨基酸)N末端的6×His標(biāo)記物的多肽)。
進一步將某些前述的VEGF-C變體構(gòu)建體修飾成另外的構(gòu)建體。例如，pALTER(Promega)中的VEGF-2 R102G和寡核苷酸5′-GTATTATAATGTCCTCCAAATTTTATAG-3′(序列47)用于產(chǎn)生VEGF-C4G，其編碼帶有四個點突變的多肽R102G，A110G，A111G，和A112G(在110-112位點Ala突變成Gly)。此四個定點突變位點相鄰于在PC-3中表達以及在293 EBNA中重組表達VEGF-C的預(yù)定裂解位點。
用VEGF-CΔN和寡核苷酸5′-GTTCGCTGCCTGACACTG TGGTAGTGTTGCTGCTGGCGGCCGCTAGTGATGGTGATGGTGATGAATAATGGAATGAACTTGTCTGTAAACATCCAG-3′(序列48)制備另一個構(gòu)建體產(chǎn)生VEGF-CΔNHis。該構(gòu)建體編碼帶有刪除的N末端前肽(32-102位氨基酸)；刪除的C末端前肽(序列33的226-419位氨基酸)；以及C末端附加的6×His標(biāo)記物的多肽。
用Hind III和Not I進一步消化所有構(gòu)建體，亞克隆到Hind III/Not I消化的pREP7載體，并用于轉(zhuǎn)染293 EBNA細胞。轉(zhuǎn)染后約48小時，該細胞或者如上述用Pro-mixTM代謝標(biāo)記，或者在無血清培養(yǎng)基中饑餓2小時。然后，收培養(yǎng)基并用于隨后的實驗。如圖27A-B所見，wt VEGF-C，VEGF-C NHis和VEGF-CΔNΔC His在293 EBNA細胞中表達到類似水平。同時，VEGF-C 4G多肽的表達相當(dāng)?shù)?，可能是由于翻譯產(chǎn)物的構(gòu)象改變和穩(wěn)定性降低。然而，上述全部VEGF-C變體都分泌于該細胞(比較圖27A和27B)。將源于轉(zhuǎn)染和饑餓細胞的條件培養(yǎng)基濃縮五倍并用于測定其刺激表達于NIH 3T3細胞的Flt4(VEGFR-3)和表達于PAE細胞的KDR(VEGFR2)的酪氨酸磷酸化的能力。
圖28A-B示wt VEGF-C以及三個突變體多肽刺激VEGFR-3的酪氨酸磷酸化。最顯著的刺激是通過短成熟的VEGF-CΔNΔC CHis而完成的。此突變體，以及VEGF-C NHis還刺激VEGFR-2的酪氨酸磷酸化。因此，雖然分泌的重組VEGF-C的主要成份是32/29KD的二聚體，引起VEGF-C結(jié)合于VEGFR-3和VEGFR-2的活性部分定位于VEGF-C前體的102-226位氨基酸之間(序列33)。用諸如本文所述的檢測方法分析和對比這些VEGF-C蛋白及變體的結(jié)合特性及生物活性將提供有關(guān)所測的主要的32/29KD和21-23KD VEGF-C加工型的重要性的資料。資料表明編碼該VEGF-C前體(序列33)的103-225位氨基酸殘基的構(gòu)建體產(chǎn)生出能同時對VEGFR-3和VEGF-2起作用的重組配體。
本實施例和前述實施例的資料證明許多VEGF-C多肽片段保留了生物活性。已發(fā)現(xiàn)通過天然加工切割確定C末端而生產(chǎn)的天然的跨序列33的103-226(或103-227)位氨基酸的VEGF-C多肽有活性。實施例27證實帶有序列33的104-213位殘基的片段保留了生物活性。
此外，實施例21的結(jié)果證明具有序列33的112位點處的氨基末端的VEGF-C多肽保留活性。其它實驗顯示缺少序列33的1-112位殘基的片段保留了生物活性。
在一個相關(guān)的實驗中，序列33(序列32，991-993位核苷酸)的214位的Lys為終止子所代替。所得的重組多肽還能誘導(dǎo)Flt4自身磷酸化，提示跨序列33的113-213位氨基酸殘基的多肽是生物活性的。
VEGF族成員的多肽序列比較顯示即使比如序列33所示的多肽更小的片段也還有生物活性。尤其是，該VEGF族多肽的8個高度保守的Cys殘基確定了有進化意義的由序列33(見圖31)的131至211位殘基的區(qū)域。因此，預(yù)計跨約131位到約211位的多肽保留有VEGF-C生物活性。事實上，推定那些保留保守基序RCXXCC的多肽(即含序列33的大約161-大約211殘基的多肽)保留有VEGF-C生物活性。為維持這些片段的天然構(gòu)象，優(yōu)選地保留羧基末端的大約1-2個額外的氨基酸和氨基末端的1-2或更多的氨基酸。
出乎上述考慮，證據(jù)顯示缺少保守的Cys的較小的片段和/或片段變體仍保留著VEGF-C生物活性。相應(yīng)地，本發(fā)明的材料和方法包括全部的至少保留了VEGF-C的一種生物學(xué)活性的VEGF-C片段和變體，而不論其有或無該保守的Cys殘基系列的成員。
實施例29在轉(zhuǎn)基因小鼠中的于人K14角蛋白啟動子控制下的人VEGF-C的表達誘導(dǎo)了淋巴管在其皮膚中的大量生長。
Flt4受體酪氨酸激酶在淋巴管內(nèi)皮中相對特異性地表達。Kaipainen等人，美國國家科學(xué)院院刊，923566-3570(1995)。此外，該VEGF-C生長因子刺激Flt4受體，而對血管的KDR受體的活性較低(Joukov等人，“歐洲分子生物學(xué)聯(lián)合會雜志”(EMBO J.)，15290-298(1996)；見實施例26)。
在轉(zhuǎn)基因小鼠中進行實驗以分析VEGF-C在組織中過量表達的特異效應(yīng)。人K14角蛋白的啟動子在分層的鱗狀內(nèi)皮的基細胞中有活性(Vassoar等，美國國家科學(xué)院院刊，861563-1567(1989))并在重組VEGF-C轉(zhuǎn)基因中用作表達控制因子。含K14角蛋白啟動子的載體描述于Vassar等，GenesDev.，5714-727(1991)和Nelson等，細胞生物學(xué)雜志，97244-251(1983)。
用人全長VEGF-C cDNA(基因文庫登記號X94216)構(gòu)建重組VEGF-C轉(zhuǎn)基因。該序列是用XhoI/NotI從pCI-neo載體(Promega)切下，并分離出所得的含開放閱讀框和終止子(序列32的352-1611位核苷酸)的2027 bp片段。然后，將該分離的片段用DNA聚合酶的Klenon片段進行末端補平反應(yīng)。然后將平端片段連接到K14載體中的類似開放的Bam HI限制性位點。所得的構(gòu)建體含有衍生于pCI-neo載體的多接頭的EcoRI位點。該EcoRI位點用常規(guī)技術(shù)(用EcoRI部分消化該重組的中間體后的Klenow介導(dǎo)的補平反應(yīng))除去以便可隨后的待注射入受精鼠卵母細胞的DNA片段的切除。稱為K14-VEGF-C的所得克隆圖示于圖20。
從含K14啟動子，VEGF-C cDNA，和K14聚腺苷酸化信號的克隆K14 VEGF-C中分離EcoRI-Hind III片段并注射入FVB-NIH鼠品系受精的卵母細胞中。將所經(jīng)注射的接合子移植到假孕C57 BL/6×DBAJ2]雜交鼠的輸卵管。通過用引物5′-CATGTACGAACCGCCAG-3′(序列49)和5′-AATGACCAGAGAGAGGCGAG-3′(序列50)的尾DNA PCR反應(yīng)檢測所建鼠的轉(zhuǎn)基因的存在。此外，將尾DNAs進行EcoRV消化并隨后用注入到該鼠的EcoRI-Hind III片段進行Southern分析。在三周齡的8個幼仔的分析中發(fā)現(xiàn)了2個陽性，其基因組中分別帶有該轉(zhuǎn)基因的約40-50個拷貝和4-6個拷貝。
帶有高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的鼠是小的，比其同窩仔發(fā)育得更慢且進食(如吮乳)有困難。進一步的檢查發(fā)現(xiàn)鼻部腫脹且紅并且毛皮不佳。雖然喂以特殊的液體飼食，其在喂食后出現(xiàn)上呼吸道和消化道水腫并且有呼吸困難。此鼠出生八天后死亡并即行進行組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，和原位雜交的處理。
組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)與同窩仔相比，該K14-VEGF-C轉(zhuǎn)基因小鼠的背部的皮是萎縮且結(jié)締組織為缺少紅細胞的大腔隙所代替，但襯有薄的內(nèi)皮層(圖29A-D中的白箭頭)。這些擴張的管樣結(jié)構(gòu)類似于在人淋巴管瘤中所見的那些。減少了皮膚附屬器官和毛囊。在鼻部，還可見管的數(shù)目的增加。因此，VEGF-C在基部表皮中的過量表達能促進下面的皮膚中包括大的腔隙的管結(jié)構(gòu)的大量生長。包圍著這些腔隙的內(nèi)皮細胞在原位雜交中含豐富的Flt4 mRNA(方法見實施例23和30)。管形態(tài)學(xué)顯示VEGF-C刺激具有淋巴管特征的管的生長。其它的K14-VEGF-C轉(zhuǎn)基因鼠具有類似的皮膚組織病理學(xué)。
前述體內(nèi)實驗資料表明(i)具有VEGF-C生物活性的VEGF-C多肽和多肽變體，以及(ii)抗VEGF-C抗體和抑制VEGF-C活性(如通過結(jié)合VEGF-C或干涉VEGF-C/受體相互作用)的VEGF-C拮抗劑的用途。例如，資料表明VEGF-C多肽對需要淋巴組織生長的病人的治療應(yīng)用(如那些乳腺癌手術(shù)或其它外科手術(shù)后的已除去了淋巴組織并且淋巴引流又因此而受損導(dǎo)致腫脹的病人；或者那些患象皮病的病人)。資料表明抗VEGF-C抗體物質(zhì)和VEGF-C拮抗劑對那些可能需要抑制淋巴組織生長的疾病的治療應(yīng)用(如治療淋巴管瘤)。相應(yīng)地，給藥VEGF-C和VEGF-C變體和拮抗劑的方法也作為本發(fā)明的方法和材料。
實施例30在發(fā)育著的鼠中表達VEGF-C和Flt4制備P.C.16天懷孕鼠的胚胎并固定于4％多聚甲醛(PFA)，石蠟包埋，并切成6μm厚。將切片置于硅烷化顯微鏡載玻片上并用二甲苯處理，再水化，在4％PFA中固定20分鐘，用蛋白酶K(7mg/ml；Merck，Darmstadt，德國)于室溫下處理5分鐘，再固定于4％PFA并用乙酐處理，在增加乙醇濃度的溶液中脫水，干燥并用于原位雜交。
如Vstrik等，細胞生物學(xué)雜志，1281197-1208(1995)中所述進行切片的原位雜交。從線性化的pBluescript II SK+質(zhì)粒(Stratagene公司)中產(chǎn)生鼠VEGF-C反義RNA探針，其含有對應(yīng)于鼠VEGF-C cDNA499-979位核苷酸的片段，其中的非編碼區(qū)和BR3P重復(fù)通過核酸外切酶III處理而切去。該片段已克隆λpBluescript II SK+的EcoRI和Hind III位點。用T7 RNA聚合酶和[35S]-UTP(Amersham，Little Chalfont，UK)合成放射性標(biāo)記的RNA。每個載玻片應(yīng)大約二百萬cpm的VEGF-C探針。雜交過夜后，該載玻片首先在2×SSC和20-30mM DDT中于50℃下洗滌1小時。繼續(xù)處理，嚴(yán)格洗滌，4×SSC和20mM DTT和50％去離子化甲酰胺，在65℃下30分鐘，隨后用RNase A在37℃下處理(20μg/ml)30分鐘。重復(fù)該高度嚴(yán)格的洗滌45分鐘。最后，將該載玻片脫水并在室溫下干燥30分鐘。將該載玻片浸入照相乳膠中并曝光4周。用Kodak D-16顯影劑顯色，用蘇木精襯染并用Permount(Fisher Chemical)計數(shù)。
在Flt4序列的原位雜交中，使用了包括公開序列(Finnerty等，癌基因，82293-2298(1993))的1-192bp的鼠Flt4 cDNA片段，并且除了下述外，根據(jù)上述方法。每個載玻片應(yīng)用了約一百萬CPM的Flt4探針。雜交后的嚴(yán)格洗滌在1×SSC和30mM DTT中進行105分鐘。
圖示了該雜交的切片在暗視野顯微鏡(圖36A-C)和亮視野顯微鏡(圖36D)下的顯微照片。照片的放大倍數(shù)是4×(圖36A-B)和10×(圖36C-D)。所示的橫切片源自頭部且所示的VEGF-C和FLT4區(qū)的是在約14個分開的部分，F(xiàn)lt4更多地定位于該胚胎頭部。在圖36A中(Flt4探針)，發(fā)育著的鼻咽腔位于上部中線，后部；圖36A的前部是帶有產(chǎn)生著的纖維囊的鼻部以及，在中線上，形成的鼻腔。在兩邊，視黃醛染料在暗視野顯微鏡下產(chǎn)生一個假陽性信號。最顯著的Flt4-雜交結(jié)構(gòu)似乎是對應(yīng)于發(fā)育著的淋巴和靜脈內(nèi)皮。注明有叢樣內(nèi)皮血管結(jié)構(gòu)包圍著發(fā)育著的鼻咽粘膜。在圖36B中，最顯著的信號獲自發(fā)育著的鼻甲的后部，其以較高的放大倍數(shù)(圖36C-D)顯示包圍疏松的結(jié)締組織/形成軟骨的上皮。此結(jié)構(gòu)在原位雜交中給出強烈的VEGF-C信號。圖36B中也發(fā)現(xiàn)了鼻部周圍有更弱的雜交區(qū)，雖然此信號看起來均勻的多。因此，VEGF-C的表達在發(fā)育著的鼻甲中驚人地高。
該甲被豐富的靜脈叢包圍，作為表皮細胞產(chǎn)生的粘膜來源以及溫暖吸入空氣而在鼻生理中是重要的。提示該VEGF-C在粘膜的甲靜脈叢的形成中是重要的，而且其也可調(diào)節(jié)鼻粘膜分泌所需的滲透性。VEGF-C及其衍生物和拮抗劑也可能用于調(diào)節(jié)甲組織和粘膜的充盈并因此調(diào)節(jié)上呼吸道的直徑，以及粘液生產(chǎn)的數(shù)量和質(zhì)量。這些因素在上呼吸道炎癥(包括過敏)和傳染性疾病中具有極大的臨床意義。相應(yīng)地，本發(fā)明考慮了本發(fā)明的材料在包括VEGF-C Flt4，及其衍生物在診斷和治療影響上呼吸道(包括鼻結(jié)構(gòu))的炎癥和傳染性疾病方法中的應(yīng)用。
實施例31人VEGF-C基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的鑒定用VEGF-C cDNA片段作為探針從人基因組DNA文庫中分離含人VEGF-C基因的1，2，和3外顯子的兩個基因組DNA克隆。尤其是，用PCR產(chǎn)生的對應(yīng)于人VEGF-C cDNA(序列32)的629-746位核苷酸片段篩選在入噬菌體EMBL-3λ中的人基因文庫(Clontech)。鑒定出一個稱為“λ3”的陽性克隆株，而將該插入片段作為14kb XhoI片段亞克隆到pBSK II載體(Stratagene)。也用標(biāo)記的130bp Not I-Sac I片段從VEGF-C cDNA的5′-非編碼區(qū)篩選基因文庫(Not I位點是在克隆載體的多接頭中；Sac I位點對應(yīng)于序列32的92-97位核苷酸)。得到了稱為“λ5”和“λ8”的兩個陽性克隆。限制性圖譜分析表明λ3克隆含有外顯子2和3，而λ5克隆含有外顯子1和推定的啟動子區(qū)。
從基因組VEGF-C P1質(zhì)核克隆中亞克隆含外顯子4，5，6和7的三個基因組片段。尤其是，使用了從基因組P1質(zhì)?？寺?660(Paavonen等人，Circulation，931079-1082(1996)中分離的DNA。將P1插入片段DNA的EcoRI片段連接到pBSK II載體。使用全長VEGF-C cDNA作為探針通過菌落雜交鑒定出含人VEGF-C cDNA同源序列的克隆7660的亞克隆。鑒定并分離出含有保留的外顯子4-7的三個不同的基因片段。
為測定基因組結(jié)構(gòu)，用限制性內(nèi)切酶切對該克隆作圖。編碼區(qū)和外顯子-內(nèi)顯子連接還進行了部分測序。該分析結(jié)果圖示于圖11和17。所有的內(nèi)含子-外顯子邊界序列(圖17，序列57-68)與共有序列剪接信號一致(Mount，核酸研究，10459-472(1982))。外顯子5和6間的內(nèi)含子長度通過核苷酸測序而直接測定并發(fā)現(xiàn)為301bp。外顯子2和3間的內(nèi)含子長度通過限制性圖譜和Southern雜交測定并發(fā)現(xiàn)為大約1.6kb。每一個其它的內(nèi)含子的長度均超過10kb。
一個類似的分析用于鼠基因組VEGF-C基因。鼠VEGF-C內(nèi)含子-外顯子邊界序列圖示于圖17和序列69-80。
限制性圖譜和測序資料表明由外顯子1編碼信號序列和N-末端前肽的第一個殘基。第二個外顯子編碼N末端前肽的羧基末端部分和VEGF同源區(qū)的氨基末端。VEGF同源區(qū)的最保守序列分布于外顯于3(含6個保守的Cys殘基)和4(含Cys殘基)。其余的外顯子編碼C-6X-C-10X-CRC(外顯子5和7)型的富含Cys的基序以及C-6X-B-3X-C-C-C型的五倍重復(fù)基序，其是絲蛋白的特征。
為進一步鑒定VEGF-C基因啟動子，進一步分析了λ5克隆。用單和雙消化及Southern雜交的組合對此克隆進行限制性酶切作圖發(fā)現(xiàn)其包括(1)一個位于可推定的起始密碼子ATG密碼子上游的約5kb的區(qū)域，(2)外顯子1，以及(3)VEGF-C基因的內(nèi)含子I部分。
將含有外顯子1和5′及3′側(cè)翼序列的克隆λ5的3.7kb Xba I片段亞克隆并進一步分析。如前述，一個主要的VEGF-C mRNA帶于大約2.4kb的位置遷移。從1257 bp的編碼VEGF-C序列和391 bp3′非編碼序列加上大約50-200bp的poly A序列算起，該mRNA起始位點應(yīng)位于翻譯起始密碼子上游的大約550-700bp處。
為進一步鑒定人VEGF-C基因的啟動子，分離了包括翻譯起始位點上游的大約1.4kb的基因克隆，并且測序了5′非編碼cDNA序列和推定的啟動子區(qū)。所得的序列示于序列54。類似于在VEGF基因所觀測的那樣，該VEGF-C啟動子富含G和C殘基而缺少共有的TATA和CCAAT序列。而其有許多推定的SP1(一種普遍的核酸蛋白)結(jié)合位點可起動無TATA基因的轉(zhuǎn)錄。見于Pugh和Tjian，基因與發(fā)育，5105-119(1991)。此外，發(fā)現(xiàn)VEGF-C翻譯起點上游的序列含有AP-2因子結(jié)合位點的常見的共有序列。這提示作為AP-2轉(zhuǎn)錄因子[Curran和Franza，細胞，55395-397(1988)]的cAMP依賴性蛋白激酶和蛋白激酶C介導(dǎo)VEGF-C轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
該VEGF-C基因在成人組織如心臟，胎盤，卵巢和小腸中過量表達，并被各種因子所誘導(dǎo)。實際上，幾個組織特異性基因表達的調(diào)節(jié)因子，如NFKB和GATA的潛在結(jié)合位點的確位于VEGF-C啟動子的末梢部分。例如，已知NFKB調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中組織因子的表達。也考慮GATA族的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)細胞型特異性基因表達。
不像VEGF，VEGF-C基因不含低氧量一可誘導(dǎo)因子HIF-1的結(jié)合位點(Levy等人，生物化學(xué)雜志，27013333-13340(1995))。該發(fā)現(xiàn)提示若通過低氧量調(diào)節(jié)VEGF-C mRNA，其機理將主要是基于mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。在這方面，許多研究表明低氧量誘導(dǎo)VEGF基因的主要控制點是調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)態(tài)水平。見于Levy等，生物化學(xué)雜志，2712746-2753(1996)。該VEGF mRNA穩(wěn)定和衰變的相對比例已被認(rèn)為是通過在其非翻譯區(qū)(UTR)的已證明為調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的特異序列基序的存在而決定(Chen和Shgn，分子細胞生物學(xué)，148471-8482(1994))。該VEGF-C基因的3′-UTR還含有在序列32的1873-1878位點的該型的推定基序(TTATTE)。
實施例32一個VEGF-C剪接變體的鑒定如實施例16所述，主要的2.4kb VEGF-C mRNA和少量的2.0kb mRNA是可檢測的。為弄清這些RNAs的起源，分離和鑒定了另外幾個VEGF-CcDNA。用153bp人VEGF-C cDNA片段作為探針如實施例10所示篩選在λgt11載體(Clontech，產(chǎn)品編號#HL1048b)中的源于HT1080細胞的人纖維肉瘤cDNA文庫。也見于Joukov等，EMBO J.，15290-298(1996)。挑出九個陽性克隆并通過用寡核苷酸5′-CACGGCTTATGCAAGCAAAG-3′(序列55)和5′-AACACAGTTTTCCATAATAG-3′(序列56)的PCR分析。選擇這些寡核苷酸擴增對應(yīng)于序列32的495-1661位核苷酸的VEGF-C cDNA部分。用55℃的退火溫度和25個循環(huán)進行PCR。
在瓊脂糖凝膠上電泳該所得的PCR產(chǎn)物。所分析的九個克隆中產(chǎn)生了五個具有預(yù)期的1147bp長度的PCR片段，而一個稍短。將較短的片段和期望長度的片段中的一個克隆λpCRTMII載體(Invitorgen)并序列分析。測序表明較短的PCR片段帶有對應(yīng)于序列32的904-1055位核苷酸的153bp的缺失。這些缺失堿基對應(yīng)于人和鼠VEGF-C基因的外顯子4，圖示于圖17中。外顯子4的缺失導(dǎo)致了一個本身又導(dǎo)致全長VEGF-C前體的C末端截短的讀碼移位，而其有15個氨基酸殘基以不同于用于表達全長蛋白的讀框翻譯于外顯子5。因此，所得的截短多肽的C末端氨基酸序列為…Leu(181)-Ser-Lys-Thr-Val-Ser-Gly-Ser-Glu-Gln-Asp-Leu-Pro-His-Glu-Leu-His-Val-Glu(199)(序列181)。由該剪接變體編碼的VEGF-C變體不含VEGF-C前體的C-末端切割位點。因此，一個推定的無保守的外顯子4的可變剪接RNA型鑒定于HT-1080纖維肉瘤細胞并且預(yù)計該型編碼一個199個氨基酸的可作為VEGF-C拮抗劑的蛋白質(zhì)。
實施例33在不同細胞體外培養(yǎng)物中類似地加工VEGF-C為了研究VEGF-C是否在不同類型細胞中類似地加工，用wt人VEGF-C cDNA轉(zhuǎn)染293 EBNA細胞，COS-1細胞和HT-1080細胞并用Pro-MixTM如實施例22所述標(biāo)記。收集源于該培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基并用抗血清882(描述于實施例21，識別對應(yīng)于序列33的104-120位氨基酸的肽)進行免疫沉淀。通過SDS-PAGE分離該免疫沉淀的多肽，并通過放射自顯影檢測。從所有實驗細胞系中檢測的分泌重組VEGF-C的主要型是29/32KD二聯(lián)體。這兩個多肽通過二硫鍵如實施例22所述彼此結(jié)合。在該培養(yǎng)基中還檢測出約21KD的顯著性較低的帶。此外，檢測了非加工的63KDa的VEGF-C前體。這一類型在COS-1細胞中更顯著，提示COS細胞中VEGF-C的蛋白酶切加工沒有293 EBNA細胞中有效。在HT-1080細胞中于這些實驗條件下沒有檢測出內(nèi)源性VEGF-C(在非轉(zhuǎn)染細胞中)，但在PC-3細胞的條件培養(yǎng)基中易于檢出。分析PC-3細胞和293 EBNA細胞中該亞單位多肽大小和比例顯示了非常類似的結(jié)果最顯著型是29/32KDa的二聯(lián)體以及次顯著型是21KD多肽。由293 EBNA細胞產(chǎn)生的21KD型不能為Weste惹怒印跡中882抗體所識別，雖然在同樣抗體用于免疫沉淀(見于前例)時其能被識別。如實施例21所述，293 EBNA細胞中32KD型的剪切發(fā)生于氨基酸殘基111和112間(序列33)，PC-3細胞中切割位點的下游(102和103殘基間)。因此，293 EBNA細胞產(chǎn)生的21KD型不含用于產(chǎn)生抗血清882的完整的N-末端肽。
在相關(guān)的實驗中，將PC-3細胞于分離條件培養(yǎng)基前在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間(1-8天)。用Centricon device(Amicon，Beverly，USA)濃縮該條件培養(yǎng)基并用抗血清882進行Western印跡分析。培養(yǎng)一天后，檢測出一個顯著的32KD帶。在培養(yǎng)4天和8天的條件培養(yǎng)基中檢測出增加量的21-23KD型。在實施例5和幾個隨后的實施例中簡單地稱為23KD多肽的該多肽帶的擴散性最大可能是由于糖基化的異源性和不同量。這些結(jié)果表明該細胞最初分泌一個32KD多肽，其在培養(yǎng)基中進一步加工或切割成21-23KD型。然后，由于不同的糖基化程度以及，加工切割位點的微小的不均一性，如獲自PC-3和293 EBNA細胞培養(yǎng)基的氨基末端，導(dǎo)致了該多肽帶的微不均一性。該羧基末端切割位點還可能會變化，可能的切割位點的例子位于225-226，226-227和227-228位殘基間以及216-217位殘基間?？偟恼f來，這些結(jié)果提示分泌的細胞蛋白酶可能導(dǎo)致該21-23KD型VEGF-C由32KD多肽產(chǎn)生。該蛋白酶也可以用于體外實驗中以在VEGF-C生產(chǎn)過程中在溶液中切割VEGF-C前體蛋白，或用于細胞培養(yǎng)和體內(nèi)實驗中以釋放生物活性的VEGF-C。
實施例34通過VEGFR-3和VEGFR-2胞外區(qū)的VEGF-C型的不同結(jié)合在兩個平行試驗中，用一個編碼重組的wt VEGF-C或編碼VEGF-DNDCHis(實施例28)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293 EBNA細胞并在轉(zhuǎn)染后約48小時，用Pro-MixTM如前例如述代射標(biāo)記。收集模擬轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基并用于受體結(jié)合檢測。
受體結(jié)合在含約0.2μg(a)一個包括融合到免疫球蛋白序列(VEGFR-3-Ig)的VEGFR-3胞外區(qū)的融合蛋白或者(b)一個包括融合到堿性磷酸酶序列(VEGFR-2-AP；Cao等人，生物化學(xué)雜志，2713154-62(1996))的結(jié)合緩沖液(PBS，0.5％BSA，0.02％Tween 20，1μg/ml肝素)中進行。作為對照，將相同等份的293 EBNA條件培養(yǎng)基和2μl抗VEGF-C抗血清(VEGF-CIP)混合。
室溫下培養(yǎng)兩小時后，抗VEGF-C抗體和VEGFR-3-Ig蛋白吸附到蛋白A-Sepharose(PAS)并用抗AP單抗(Medix Biotech，GenzymeDiagnostics，San Carlos，CA，USA)和蛋白G-Sepharose免疫沉淀VEGFR-2-AP。在結(jié)合緩沖液和20mM Tirs-HCl(pH 7.4)中先后分別洗滌含結(jié)合于VEGFR-3-Ig或VEGFR-2-AP上的VEGF-C的復(fù)合物三次和兩次并將VEGF-C免疫沉淀物先后分別在RIPA緩沖液和20mM Tris-HCl(pH7.4)中洗滌三次和兩次，再通過在還原和非還原態(tài)下的SDS-PAGE檢測。作為對照，用抗AP和PGS或用PAS沉淀該同樣的培養(yǎng)基以控制可能的非特異性吸附。
這些實驗表明VEGFR-3結(jié)合于32/29KD和21-23KD型重組VEGF-C，而VEGF-R-2優(yōu)選結(jié)合于該條件培養(yǎng)基的21-23KD組分。此外，觀察到少量的63KD和52KD VEGF-C型結(jié)合于VEGFR-3。在非還原態(tài)下的進一步分析表明大部分結(jié)合于任一受體的21-23KD VEGF-C不含鏈間二硫鍵。這些發(fā)現(xiàn)支持了VEGF-C結(jié)合于VEGFR-2的結(jié)論。這資料提示僅對VEGFR-3有活性或?qū)EGFR-3和VEGFR-2同時有活性的重組型VEGF-C的應(yīng)用。另一方面，這些結(jié)果以及實施例28的結(jié)果并沒有排除32/29KD二聚體結(jié)合于VEGFR-3卻不激活它的可能。該32/29KD二聚體不能活化VEGFR-3可解釋N-His VEGF-C轉(zhuǎn)染的細胞的條件培養(yǎng)基比VEGF-C DNDCHis轉(zhuǎn)染細胞誘導(dǎo)出次顯著VEGFR-3酪氨酸磷酸化，即使前一個多肽的表達更高(見圖27和28)。結(jié)合于VEGF-C受體但不能活化該受體的穩(wěn)定VEGF-C多肽變化體用作VEGF-C拮抗劑。
生物材料保藏質(zhì)粒FLT4-L已按布達佩斯條約保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Dr.，Rockville MD 20952(USA)，并已得到保藏日1995年7月24日和ATCC登錄號97231。
雖然已按具體的實施方案描述了本發(fā)明，可以理解的是本領(lǐng)域的技術(shù)人員會進行變化和修改。相應(yīng)地，本發(fā)明僅加入那些出現(xiàn)于附加的權(quán)利要求書的限制。
序列表(1)一般資料(i)申請人Helsinki University Licensing Lts Oy(ii)發(fā)明題目受體配體VEGF-C(iii)序列數(shù)81(iv)通信地址(A)地址Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab(B)街道Iso Roobertinkatu 4-6A(C)城市Helsinki(E)國家Finland(F)郵編00120(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，Version#1.30(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/671,573(B)申請日1996年6月28日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/601,132(B)申請日1996年2月14日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/585,895(B)申請日1996年1月12日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/510,133
(B)申請日1995年8月1日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Karvinen，Leena(B)登記號28999(ix)電信資料(A)電話+358 0 648 606(B)電傳+358 0 640 575(C)電報123505 JALO FI(2)序列1資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列1TGTCCTCGCT GTCCTTGTCT 20(2)序列2資料(i)序列特征(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列2ACATGCATGC CACCATGCAG CGGGGCGCCG CGCTGTGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGG 60GACTCCTGGA 70(2)序列3資料(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列3ACATGCATGC CCCGCCGGTC ATCC 24(2)序列4資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列4CGGAATTCCC CATGACCCCA AC22(2)序列5資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列5CCATCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTT CTT 33(2)序列6資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列6ATTTAGGTGA CACTATA 17(2)序列7資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列7CCATCGATGG ATCCCGATGC TGCTTAGTAG CTGT34(2)序列8資料(i)序列特征(A)長度40個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列8Pro Met Thr Pro Thr Thr Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gln Thr Asp1 5 10 15Ser Gly Met Val Leu Ala Ser Glu Glu Phe Glu Gln Ile Glu Ser Arg20 25 30His Arg Gln Glu Ser Gly Phe Arg35 40(2)序列9資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列9CTGGAGTCGA CTTGGCGGAC T 21(2)序列10資料(i)序列特征(A)長度60個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列10CGCGGATCCC TAGTGATGGT GATGGTGATG TCTACCTTCG ATCATGCTGC CCTTATCCTC60(2)序列11資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列11CCCAAGCTTG GATCCAAGTG GCTACTCCAT GACC34(2)序列12資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列12GTTGCCTGTG ATGTGCACCA20(2)序列13資料(i)序列特征(A)長度18個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列13Xaa Glu Glu Thr Ile Lys phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile1 5 10 15Leu Lys(2)序列14資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列14GCAGARGARA CNATHAA 17(2)序列15資料(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列15Glu Glu Thr Ile Lys1 5(2)序列16資料(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列16GCAYTTNARD ATYTCNGT 18(2)序列17資料(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列17Thr Glu Ile Leu Lys1 5(2)序列18資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列18ATTCGCTGCA GCACACTACA AC 22(2)序列19資料(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述序列19TCNGTGTTGT AGTGTGCTG 19(2)序列20資料(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列20Ala Ala His Tyr Asn Thr Glu1 5(2)序列21資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列21TAATACGACT CACTATAGGG 20(2)序列22資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列22GTTGTAGTGT GCTGCAGCGA ATTT 24(2)序列23資料
(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列23Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn1 5(2)序列24資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列24TCACTATAGG GAGACCCAAG C 24(2)序列25資料(i)序列特征(A)長度219個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列25TCACTATAGG GAGACCCAAG CTTGGTACCG AGCTCGGATC CACTAGTAAC GGCCGCCAGT 60GTGGTGGAAT TCGACGAACT CATGACTGTA CTCTACCCAG AATATTGGAA AATGTACAAG 120TGTCAGCTAA GGCAAGGAGG CTGGCAACAT AACAGAGAAC AGGCCAACCT CAACTCAAGG 180ACAGAAGAGA CTATAAAATT CGCTGCAGCA CACTACAAC 219(2)序列26資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列26ACAGAGAACA GGCCAACC 18(2)序列27資料(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列27TCTAGCATTT AGGTGACAC 19(2)序列28資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列28AAGAGACTAT AAAATTCGCT GCAGC 25(2)序列29資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列29CCCTCTAGAT GCATGCTCGA20(2)序列30資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列30GTTGTAGTGT GCTGCAGCGA ATTT 24(2)序列31資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列31TCACTATAGG GAGACCCAAG C 21(2)序列32資料(i)序列特征(A)長度1997個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征
(A)名稱/索引CDS(B)位置352..1608(x)序列描述序列32CCCGCCCCGC CTCTCCAAAA AGCTACACCG ACGCGGACCG CGGCGGCGTC CTCCCTCGCC 60CTCGCTTCAC CTCGCGGGCT CCGAATGCGG GGAGCTCGGA TGTCCGGTTT CCTGTGAGGC 120TTTTACCTGA CACCCGCCGC CTTTCCCCGG CACTGGCTGG GAGGGCGCCC TGCAAAGTTG 180GGAACGCGGA GCCCCGGACC CGCTCCCGCC GCCTCCGGCT CGCCCAGGGG GGGTCGCCGG 240GAGGAGCCCG GGGGAGAGGG ACCAGGAGGG GCCCGCGGCC TCGCAGGGGC GCCCGCGCCC 300CCACCCCTGC CCCCGCCAGC GGACCGGTCC CCCACCCCCG GTCCTTCCAC C ATG CAC 357Met His1TTG CTG GGC TTC TTC TCT GTG GCG TGT TCT CTG CTC GCC GCT GCG CTG 405Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala Ala Leu5 10 15CTC CCG GGT CCT CGC GAG GCG CCC GCC GCC GCC GCC GCC TTC GAG TCC 453Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ser20 25 30GGA CTC GAC CTC TCG GAC GCG GAG CCC GAC GCG GGC GAG GCC ACG GCT 501Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala Thr Ala35 40 45 50TAT GCA AGC AAA GAT CTG GAG GAG CAG TTA CGG TCT GTG TCC AGT GTA 549Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser Ser Val55 60 65GAT GAA CTC ATG ACT GTA CTC TAC CCA GAA TAT TGG AAA ATG TAC AAG 597Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met Tyr Lys70 75 80TGT CAG CTA AGG AAA GGA GGC TGG CAA CAT AAC AGA GAA CAG GCC AAC 645Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln Ala Asn85 90 95CTC AAC TCA AGG ACA GAA GAG ACT ATA AAA TTT GCT GCA GCA CAT TAT 693Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr100 105 110AAT ACA GAG ATC TTG AAA AGT ATT GAT AAT GAG TGG AGA AAG ACT CAA 741Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln115 120 125 130TGC ATG CCA CGG GAG GTG TGT ATA GAT GTG GGG AAG GAG TTT GGA GTC 789Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val135 140 145GCG ACA AAC ACC TTC TTT AAA CCT CCA TGT GTG TCC GTC TAC AGA TGT 837Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys150 155 160GGG GGT TGC TGC AAT AGT GAG GGG CTG CAG TGC ATG AAC ACC AGC ACG 885Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr165 170 175AGC TAC CTC AGC AAG ACG TTA TTT GAA ATT ACA GTG CCT CTC TCT CAA 933Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln180 185 190GGC CCC AAA CCA GTA ACA ATC AGT TTT GCC AAT CAC ACT TCC TGC CGA 981Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg195 200 205 210TGC ATG TCT AAA CTG GAT GTT TAC AGA CAA GTT CAT TCC ATT ATT AGA 1029Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg215 220 225CGT TCC CTG CCA GCA ACA CTA CCA CAG TGT CAG GCA GCG AAC AAG ACC 1077Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr230 235 240TGC CCC ACC AAT TAC ATG TGG AAT AAT CAC ATC TGC AGA TGC CTG GCT 1125Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala245 250 255CAG GAA GAT TTT ATG TTT TCC TCG GAT GCT GGA GAT GAC TCA ACA GAT 1173Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp260 265 270GGA TTC CAT GAC ATC TGT GGA CCA AAC AAG GAG CTG GAT GAA GAG ACC 1221Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr275 280 285 290TGT CAG TGT GTC TGC AGA GCG GGG CTT CGG CCT GCC AGC TGT GGA CCC 1269Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro295 300 305CAC AAA GAA CTA GAC AGA AAC TCA TGC CAG TGT GTC TGT AAA AAC AAA 1317His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys310 315 320CTC TTC CCC AGC CAA TGT GGG GCC AAC CGA GAA TTT GAT GAA AAC ACA 1365Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr325 330 335TGC CAG TGT GTA TGT AAA AGA ACC TGC CCC AGA AAT CAA CCC CTA AAT 1413Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn340 345 350CCT GGA AAA TGT GCC TGT GAA TGT ACA GAA AGT CCA CAG AAA TGC TTG 1461Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu355 360 365 370TTA AAA GGA AAG AAG TTC CAC CAC CAA ACA TGC AGC TGT TAC AGA CGG 1509Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg375 380 385CCA TGT ACG AAC CGC CAG AAG GCT TGT GAG CCA GGA TTT TCA TAT AGT 1557Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser390 395 400GAA GAA GTG TGT CGT TGT GTC CCT TCA TAT TGG AAA AGA CCA CAA ATG 1605Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met405 410 415AGC TAAGATTGTA CTGTTTTCCA GTTCATCGAT TTTCTATTAT GGAAAACTGT 1658SerGTTGCCACAG TAGAACTGTC TGTGAACAGA GAGACCCTTG TGGGTCCATG CTAACAAAGA1718CAAAAGTCTG TCTTTCCTGA ACCATGTGGA TAACTTTACA GAAATGGACT GGAGCTCATC1778TGCAAAAGGC CTCTTGTAAA GACTGGTTTT CTGCCAATGA CCAAACAGCC AAGATTTTCC1838TCTTGTGATT TCTTTAAAAG AATGACTATA TAATTTATTT CCACTAAAAA TATTGTTTCT1898GCATTCATTT TTATAGCAAC AACAATTGGT AAAACTCACT GTGATCAATA TTTTTATATC1958ATGCAAAATA TGTTTAAAAT AAAATGAAAA TTGTATTAT 1997(2)序列33資料(i)序列特征
(A)長度419個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列33Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe20 25 30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala35 40 45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser50 55 60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65 70 75 80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln85 90 95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala100 105 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys115 120 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe130 135140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145 150 155 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr165 170 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu180 185 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His 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Ser(2)序列34資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列34TGAGTGATTTGTAGCTGCTGTG 22(2)序列35資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列35TATTGCAGCAACCCCCACATCT 22(2)序列36資料(i)序列特征(A)長度4416堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列36CCACGCGCAG CGGCCGGAGA TGCAGCGGGG CGCCGCGCTG TGCCTGCGAC TGTGGCTCTG 60CCTGGGACTC CTGGACGGCC TGGTGAGTGG CTACTCCATG ACCCCCCCGA CCTTGAACAT 120CACGGAGGAG TCACACGTCA TCGACACCGG TGACAGCCTG TCCATCTCCT GCAGGGGACA 180GCACCCCCTC GAGTGGGCTT GGCCAGGAGC TCAGGAGGCG CCAGCCACCG GAGACAAGGA 240CAGCGAGGAC ACGGGGGTGG TGCGAGACTG CGAGGGCACA GACGCCAGGC CCTACTGCAA 300GGTGTTGCTG CTGCACGAGG TACATGCCAA CGACACAGGC AGCTACGTCT GCTACTACAA 360GTACATCAAG GCACGCATCG AGGGCACCAC GGCCGCCAGC TCCTACGTGT TCGTGAGAGA 420CTTTGAGCAG CCATTCATCA ACAAGCCTGA CACGCTCTTG GTCAACAGGA AGGACGCCAT 480GTGGGTGCCC TGTCTGGTGT CCATCCCCGG CCTCAATGTC ACGCTGCGCT CGCAAAGCTC 540GGTGCTGTGG CCAGACGGGC AGGAGGTGGT GTGGGATGAC CGGCGGGGCA TGCTCGTGTC 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320Lys Leu Leu Pro Ser Ser Cys Gly Pro Asn Lys Glu Phe Asp Glu Glu325 330 335Lys Cys Gln Cys Val Cys Lys Lys Thr Cys Pro Lys His His Pro Leu340 345 350Asn Pro Ala Lys Cys Ile Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Asn Lys Cys355 360 365Phe Leu Lys Gly Lys Arg Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg370 375 380Pro Pro Cys Thr Val Arg Thr Lys Arg Cys Asp Ala Gly Phe Leu Leu385 390 395 400Ala Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Arg Thr Ser Trp Lys Arg Pro Leu405 410 415Met Asn(2)序列54資料(i)序列特征(A)長度1582個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列54CTAGAGTTGA ACCAGATAAG AAAGTCTCTT CTTCCGGTAA GATATTATGG ACCTATAACA 60TCTGTGTACT TAAAAGTAGA TTGGGAGTGA AAGGCAGACT TTTGATGTTC TGTACACTGT 120TGAAACCCCT TAGCGTGGTC CTCTGTAACC TGCTCACCCT GCCCCAAGGA GGCAGCTAGC 180CAATGCCACC AGCCCAACGG AAACCCCAGT GCTTTTCCAA TGGGGAAATG CAGTCACTTT 240TCTTTGGATG CTACACATCC TTTCTGGAAT ATGTCTCACA CACATCTCTC TTTATCACCC 300CCTTTTTCAA GTAAACCAAC TTCTTGCAGA AGCTGACAAT GTGTCTCTTT ACTCTCCACG 360AAGATTCTGG CCCTTCTCTT CACCTGTCAG AAGTTTAGGA TTCCAAAGGG ATCATTAGCA 420TCCATCCCAA CAGCCTGCAC TGCATCCTGA GAACTGCGGT TCTTGGATCA TCAGGCAACT 480TTCAACTACA CAGACCAAGG GAGAGAGGGG ACCCCTCCGA GGTCCCATAG GGTTCTCTGA 540CATAGTGATG ACCTTTTTCC AAACTTTGAG CAGGGCGCTG GGGGCCAGGC GTGCGGGAGG 600GAGGACAAGA ACTCGGGAGT GGCCGAGGAT AAAGCGGGGG CTCCCTCCAC CCCACGGTGC 660CCAGTTTCTC CCCGCTGCAC GTGGTCCAGG GTGGTCGCAT CACCTCTAAA GCCGGTCCCG 720CCAACCGCCA GCCCCGGGAC TGAACTTGCC CCTCCGGCCG CCCGCTCCCC GCAGGGGACA 780GGGGCGGGGA GGGAGAGATC CAGAGGGGGG CTGGGGGAGG TGGGNCCGCC GGGGAGGAGN 840CGAGGGAAAC GGGGAGCTCC AGGGAGACGG CTTCCGAGGG AGAGTGAGAG GGGAGGGCAG 900CCCGGGCTCG GCACGCTCCC TCCCTCGGCC GCTTTCTCTC ACATAAGCGC AGGCAGAGGG 960CGCGTCAGTC ATGCCCTGCC CCTGCGCCCG CCGCCGCCGC CGCCGCCGCT CAGCCCGGCG1020CGCTCTGGAG GATCCTGCGC CGCGGCGCTC CCGGGCCCCG CCGCCGCCAG CCGCCCCGGC1080GGCCCTCCTC CCGCCCCCGG CACCGCCGCC AGCGCCCCCG CCGCAGCGCC CGCGGCCCGG1140CTCCTCTCAC TTCGGGGAAG GGGAGGGAGG AGGGGGACGA GGGCTCTGGC GGGTTTGGAG1200GGGCTGAACA TCGCGGGGTG TTCTGGTGTC CCCCGCCCCG CCTCTCCAAA AAGCTACACC1260GACGCGGACC GCGGCGGCGT CCTCCCTCGC CCTCGCTTCA CCTCGCGGGC TCCGAATGCG1320GGGAGCTCGG ATGTCCGGTT TCCTGTGAGG CTTTTACCTG ACACCCGCCG CCTTTCCCCG1380GCACTGGCTG GGAGGGCGCC CTGCAAAGTT GGGAACGCGG AGCCCCGGAC CCGCTCCCGC1440CGCCTCCGGC TCGCCCAGGG GGGGTCGCCG GGAGGAGCCC GGGGGAGAGG GACCAGGAGG1500GGCCCGCGGC CTCGCAGGGG CGCCCGCGCC CCCACCCCTG CCCCCGCCAG CGGACCGGTC1560CCCCACCCCC GGTCCTTCCA CC 1582(2)序列55資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列55CACGGCTTAT GCAAGCAAAG 20(2)序列56資料(i)序列特征
(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列56AACACAGTTT TCCATAATAG 20(2)序列57資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列57GCCACGGTAG GTCTGCGT18(2)序列58資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列58TTTCTTTGAC AGGCTTAT18(2)序列59資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列59ATCTTGAAAA GTAAGTATGG G 21(2)序列60資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列60ATGACTTGAC AGGTATTGAT20(2)序列61資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列61AGCAAGACGG TGGGTATTGT20(2)序列62資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列62CCCTTCTTTG TAGTTATTTG AA 22(2)序列63資料
(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列63CCACAGTGAG TATGAATTAA20(2)序列64資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列64TTCTTCCAAA GGTGTCAG 18(2)序列65資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列65GGAGATGGTA GCAGAATG 18(2)序列66資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列66CTATTTGTCT AGACTCAACA GAT23(2)序列67資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列67CAAACATGCA GGTAAGAGAT CC 22(2)序列68資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列68TGTTCTCCTA GCTGTTACAG A 21(2)序列69資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列69GGCGAGGTCA AGGTAGGTGC AAGG 24(2)序列70資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列70ATTGTCTTTG ACAGGCTTTT TGAAGG 26(2)序列71資料(i)序列特征(A)長度21 bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列71GAGATCCTGA AAAGTAAGTA G 21(2)序列72資料(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列72TGTGACTCGA CAGGTATTGA TAAT 24(2)序列73資料(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列73CTCAGCAAGA CGGTAGGTAT20(2)序列74資料(i)序列特征(A)長度25bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列74TTGTCCCTTG TAGTTGTTTG AAATT 25(2)序列75資料(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列75ACATTACCAC AGTGAGTATG20(2)序列76資料(i)序列特征(A)長度26bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列76
(2)序列77資料(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列77AATGTTGAAG ATGGTAAGTA AAA23(2)序列78資料(i)序列特征(A)長度16bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列78TCTAGACTCA ACCAAT16(2)序列79資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列79CAAACATGCA GGTAAGGAGT GT 22(2)序列80資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列80TTTTCCCCTA GTTGTTACAG AAGA 24(2)序列81資料(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述序列81Leu Ser Lys Thr Val Ser Gly Ser Glu Gln Asp Leu Pro H1s Glu Leu1 5 10 15His Val Glu
權(quán)利要求
1.一個能結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的純化的和分離的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的哺乳動物多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的人類多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的具有還原態(tài)下的SDS-PAGE測定的表觀分子量約為32KD的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的且基本上無其它的人類多肽的多肽。
6.按權(quán)利要求1的純化和分離的多肽，所述多肽通過保藏為ATCC登記號97231的質(zhì)粒pFLT4-L而編碼。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的且具有含序列33的一部分的氨基酸序列的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其包括如序列33所示的從序列33的約161位到約211位殘基的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其包括如序列33所示的從序列33的約131位到約211位殘基的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其包括序列33所示的從序列33的約113到213位殘基的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其包括序列33所示的約從序列33的約113到227位殘基的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其包括序列33的約103到217位氨基酸。
13.按權(quán)利要求1的多肽，其包括序列33的約103-225位氨基酸。
14.按權(quán)利要求1的多肽，其包括序列33的約103-227位氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其包括序列33的約32-227位氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項的多肽，其中所述多肽能刺激在表達該Flt4受體酪氨酸激酶的宿主細胞中的Flt4受體酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化。
17.按權(quán)利要求1所述的多肽，其具有序列33的約1到499位氨基酸殘基。
18.按權(quán)利要求1-17中任一項的多肽，其進一步包括一個可檢測的標(biāo)記。
19.一個純化的含有結(jié)合于第二個多肽的第一個多肽的蛋白質(zhì)，其中該第一個多肽和第二個多肽的至少一個是根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的多肽，而其中的蛋白能結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的純化蛋白，其中所述第一個多肽共價連接到所述的第二個多肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的純化蛋白，其中所述的第一個多肽和第二個多肽的每一個均是一個根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的多肽。
22.一個純化和分離的核酸，其包括編碼按權(quán)利要求1-17中任一項的多肽的核苷酸序列。
23.按權(quán)利要求22的核酸，其包括編碼由序列33的約113-213位氨基酸所組成的多肽的核苷酸序列。
24.按權(quán)利要求22的核酸，其包括編碼由序列33的約103-217位氨基酸所組成的多肽的核苷酸序列。
25.按權(quán)利要求22的核酸，其具有序列32的約352到1608位核苷酸的核苷酸序列。
26.按權(quán)利要求22的核酸，其包括編碼VEGF-C的以ATCC登記號97321保藏的質(zhì)粒pFLT4-L的插入片段的VEGF-C。
27.包括根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一項的核酸的載體。
28.用按權(quán)利要求22-26中任一項的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
29.能特異性地和根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的多肽反應(yīng)的抗體。
30.一個按權(quán)利要求29的抗體，其為單克隆抗體。
31.一種在藥學(xué)可接受的溶劑，佐劑，賦形劑，或載體中含有根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的多肽的藥用組合物。
32.制備能特異性地結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽的方法，該方法包括步驟(a)在宿主細胞中表達按權(quán)利要求22-26任一的核酸；以及(b)從該宿主細胞或所述宿主細胞的生長培養(yǎng)基中純化能特異性結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽。
33.能特異性地結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶的多肽，該多肽是通過根據(jù)權(quán)利要求32的方法生產(chǎn)的。
34.根據(jù)權(quán)利要求1的鼠多肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的多肽，其包括序列41所示的氨基酸序列的一部分，該部分能特異性地結(jié)合于Flt4受體酪氨酸激酶。
36.純化和分離編碼按權(quán)利要求34或35的多肽的核酸。
37.純化和分離至少具有大約16個核苷酸的核酸，該核酸能特異性地雜交到編碼VEGF-C的人基因。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的核酸，其雜交到編碼VEGF-C的人基因上，雜交條件為其中核酸不能雜交于編碼VEGF或VEGF-B的人基因，并且其中該核酸包括選擇于序列32和互補于序列32的核苷酸序列的至少20個核苷酸的連續(xù)的核苷酸序列。
39.在生物組織中檢測內(nèi)皮細胞的方法，包括步驟將含有內(nèi)皮的細胞生物組織暴露于按權(quán)利要求1-18中任一項的多肽，其是在該多肽能結(jié)合于內(nèi)皮細胞的條件下；以及檢測結(jié)合于所述生物組織中的內(nèi)皮細胞的所述多肽，從而檢測該內(nèi)皮細胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，進一步包括洗滌該生物組織的步驟，該洗滌步驟在所述暴露步驟后并在檢測步驟前進行。
41.調(diào)節(jié)哺乳動物內(nèi)皮細胞生長的方法，包括步驟將哺乳動物內(nèi)皮細胞暴露于以有效量存在的按權(quán)利要求1-17中任一項的多肽中以調(diào)節(jié)哺乳動物內(nèi)皮細胞的生長。
42.純化和分離的能結(jié)合于Kdr(VEGFR-2)的多肽，該多肽具有含序列33的一部分的氨基酸序列。
43.一種純化的含有VEGF-C啟動子的核酸。
44.按權(quán)利要求43的核酸，其包括序列54的一部分，而該部分能在VEGF-C表達于天然宿主細胞的條件下促進操作地與其連接的編碼蛋白的基因的表達。
全文摘要
本發(fā)明提供了受體酪氨酸激酶,Flt4的多肽配體。也提供了編碼該配體的cDNA和載體,含有該配體的藥用組合物和診斷試劑,以及制備和使用這些配體的方法。
文檔編號C07K16/24GK1242043SQ96197353
公開日2000年1月19日 申請日期1996年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月1日
發(fā)明者卡里·阿利塔羅, 弗拉迪米爾·喬科夫 申請人:赫爾辛基大學(xué)許可有限公司, 路德維格癌癥研究院