專利名稱：11β－21－二羥基－2'－甲基－5'βH－孕－1,4－二烯并[17,16－D]噁唑－3,20－二酮的 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種式Ⅰ化合物11β-21-二羥基-2’-甲基-5’βH-孕-1,4-二烯并[17,16-d-]噁唑啉-3,20-二酮的新的純化方法。
上述化合物涉及去氟可特(INN-國際非專利藥品名稱)，即去氟可特的C-21的乙酸酯部分被羥基取代。
去氟可特作為保鈣糖皮質素劑在治療中已應用數(shù)年。
這些化合物屬于孕烯并噁唑啉類，據(jù)報道其具有抗炎、糖皮質素和激素樣藥理活性。所述類別的化合物實例公開于US 3413286和US 4440764。
式Ⅰ化合物的制備公開于EP-B-322630，其中所述的化合物是11β-21-二羥基-2’-甲基-5’βH-孕-1,4-二烯并[17,16-d-]噁唑啉-3,20-二酮。
按照上面引證的EP-B-322630中公開的發(fā)酵方法，將2’-甲基-4-孕烯-21-醇-[17a,16a-d-]噁唑啉基-3,20-二酮或2’-甲基-4-孕烯-21-乙酰氧基-[17a,16a-d-]-噁唑啉基-3,20-二酮與彎孢屬菌株和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)菌株順序地生長的混合培養(yǎng)物接觸。更具體地說，根據(jù)優(yōu)選的實施方案，將上述化合物加到新月彎孢(C.lunata)NRRL 2380在適宜發(fā)酵培養(yǎng)基中的、接種12-24小時后的生長培養(yǎng)物中，接種48-72小時后，將培養(yǎng)18-36小時的簡單節(jié)桿菌(A.simplex)ATCC 6946的生長培養(yǎng)物加到該混合物中并再培養(yǎng)40-55小時；發(fā)酵在浸沒條件下，溫度保持在27-32℃并且pH為6-8的條件下進行；然后如下回收式Ⅰ的發(fā)酵產(chǎn)物通過用有機溶劑(如氯仿)萃取發(fā)酵液，濃縮該有機萃取液并加入非溶劑(如石油醚)沉淀該化合物。
由于式Ⅰ化合物在發(fā)酵液中的濃度非常低，為完全萃取該化合物需要大量的有機溶劑。大量有機溶劑，尤其是鹵代溶劑的使用給安全性、工業(yè)衛(wèi)生和環(huán)境保護帶來一些問題。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)式Ⅰ化合物可方便地從由發(fā)酵液或工藝流得到的水溶液回收，通過將所述水溶液中含有的該化合物吸附于具有苯乙烯或丙烯酸基質的吸附性聚合物樹脂上，隨后通過用水和與水混溶的有機溶劑的適宜混合物洗脫解吸所述化合物。
伴隨有不希望的產(chǎn)物的、含式Ⅰ化合物的代表性水溶液是從適宜菌絲體過濾的發(fā)酵液，任選含有所述菌絲體的洗滌水溶液或部分純化的工藝流。所伴隨的不希望的產(chǎn)物的實例包括有色雜質、副產(chǎn)物、未耗盡的原料、發(fā)酵培養(yǎng)基的鹽和水溶性成分。
本發(fā)明的純化方法尤其可方便地用于從由EP-B-322630公開的發(fā)酵方法獲得的過濾發(fā)酵液回收式Ⅰ化合物。
用于本發(fā)明純化方法的適宜樹脂具有的平均粒徑為約20-50目并具有下述平均物理特性孔隙體積約30-75％；表面積約140-800m2/g；骨架密度約1.06-1.10g/ml(苯乙烯樹脂)；約1.20-1.26g/ml(丙烯酸樹脂)；平均孔直徑約20-100。
適用于上述回收方法的吸附性苯乙烯基聚合物樹脂的實例是市售樹脂，如KastelS/112(Dow Chemical)或者AmberliteXAD/2、XAD/4或XAD/16(Rohm & Haas)等。適用于上述回收方法的吸附性丙烯酸基聚合物樹脂的實例是市售的樹脂，如KastelS/221或S/223(Dow Chemical)和AmberliteXAD/7或XAD/8(Rohm & Haas)等。
對于本發(fā)明方法，優(yōu)選使用丙烯酸基聚合物樹脂，尤其優(yōu)選的是那些粒徑約為20-50目并具有下述平均物理特性的丙烯酸基聚合物樹脂孔隙體積約30-60％；表面積約350-550m2/g；骨架密度約1.24-1.25g/ml；平均孔直徑約20-80。
適用的具有上述特性的吸附性丙烯酸基聚合物樹脂的實例是前面提及的KastelS/221和AmberliteXAD/7。
對于本發(fā)明方法，特別優(yōu)選的是那些粒徑約為20-50目并具有下述平均物理特性的丙烯酸基聚合物樹脂孔隙體積約30-60％；表面積約350-550m2/g；骨架密度約1.25g/ml；平均孔直徑約20-40。
例如，適用的是市售的樹脂KastelS/221。
適宜的洗脫混合液是0％-80％水與水混溶的有機溶劑如低級酮(如丙酮、乙基甲基酮)、低級醇(如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)等的混合液。
優(yōu)選使用10％-50％水與上述有機溶劑之一的混合液，尤其優(yōu)選含約30％水的混合液。丙酮是優(yōu)選的溶劑。
當采用本發(fā)明的方法純化按照EP-B-322630描述的發(fā)酵方法獲得的式Ⅰ化合物時，常方便地應用下列通用方法。
當所述發(fā)酵方法完成時，首先將發(fā)酵物按已知方法過濾。將菌絲體餅重復地用水洗滌，然后將洗滌液與過濾發(fā)酵液合并?；蛘?，菌絲體可用選自那些上面列出的有機溶劑洗滌，以回收其中含有的活性成分；在此情況下，洗滌液只有除去溶劑，如真空除去后才與過濾發(fā)酵液合并。
然后將與洗滌液合并的過濾的發(fā)酵液加載到裝有吸附樹脂的柱的頂部；通常，洗脫溶液僅含痕量產(chǎn)物。然后將樹脂用水洗滌除去鹽和其它水溶性雜質(如上，該水洗滌液通常也只含有痕量產(chǎn)物)。
然后通過用水與上述限定的有機溶劑的混合液，優(yōu)選30/70水/丙酮混合物洗脫從樹脂上解吸式Ⅰ化合物。將洗脫液濃縮并過濾回收產(chǎn)物。采用該方法，可從過濾的發(fā)酵液中回收主要量的產(chǎn)物；通常，該第一次洗脫可回收高于當初加載到柱上的總量90％的所需產(chǎn)物。
可通過將第一次洗脫母液與水洗滌液合并后，重復上述方法回收剩余產(chǎn)物?？偦厥章蕿榧s96％。
為更好地說明本發(fā)明，給出下列實施例。
實施例1 新月彎孢和簡單節(jié)桿菌的順序生長Ⅰ)斜面培養(yǎng)基Sabouraud培養(yǎng)基(用于新月彎孢)抗菌瓊脂1號(Antibiotic Agar No.1)(用于簡單節(jié)桿菌)Ⅱ)營養(yǎng)和預培養(yǎng)培養(yǎng)基a)用于新月彎孢的大豆粉13g/lKH2PO45g/l葡萄糖10g/l胨5g/l高壓滅菌前將pH調(diào)至6.5-7.5；b)用于簡單節(jié)桿菌的葡萄糖 1.0g/l大豆粉 5.0g/l胨 5.0g/lBasamin Busch 3.0g/lKH2PO45.0g/l
NaCl 5.0g/l硅氧烷 0.1ml/l高壓滅菌前將pH調(diào)至6.5-7.5；Ⅲ)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基與上述新月彎孢使用的預培養(yǎng)培養(yǎng)基組成相同。
Ⅳ)發(fā)酵方法用斜面分別接種500ml燒瓶，在100ml上述營養(yǎng)培養(yǎng)基存在下于28℃培養(yǎng)12-24小時(新月彎孢)或18-36小時(簡單節(jié)桿菌)。在下述方法中使用這些接種物將上述獲得的新月彎孢培養(yǎng)物的等份物(約1-5％)轉移到盛有上述發(fā)酵培養(yǎng)基的8升發(fā)酵罐并于29-32℃培養(yǎng)約24小時。
然后將4g2’-甲基-4-孕烯-21-醇-[17a,16a-d-]噁唑啉基-3,20-二酮加入并繼續(xù)發(fā)酵至接種后36-72小時。
之后，往其中加入簡單節(jié)桿菌的18-36小時培養(yǎng)物并繼續(xù)發(fā)酵40-55小時。
反應過程通過本領域已知TLC或優(yōu)選HPLC跟蹤原料的消失和/或產(chǎn)物的出現(xiàn)來監(jiān)測。作為進一步的對比，還可跟蹤中間體的出現(xiàn)或消失。根據(jù)HPLC的轉化率為70-75％。
實施例2式Ⅰ化合物的回收加入簡單節(jié)桿菌40-55小時后，通常認為轉化已完成，可對發(fā)酵產(chǎn)物進行后處理，以分離所需的式Ⅰ化合物。
用硫酸將發(fā)酵產(chǎn)物的pH調(diào)至3-4，通過使用助濾劑過濾分離該混合物；然后將濾出的菌絲體用酸性水(3＜pH＜4)重復洗滌。將過濾的發(fā)酵液和洗滌液合并，得到11升含式Ⅰ化合物的混合液，其含量(title)為270ppm(通過HPLC經(jīng)硅膠柱測定；Spherisorb柱3μm,100×4.6mm；流速1.3ml/min，流動相0.0025M NaH2PO4:CH3CN 7:3,UV檢測器于254nm測定)。然后在室溫下將上述混合液加載到裝有約300ml水溶脹的丙烯酸基聚合物樹脂(KastelS/221,Dow Chemical)的色譜柱(6×11cm)頂部，流速為約300ml/小時。分別收集洗脫下來的發(fā)酵液(母液)，該母液含有低于2ppm的活性成分。
然后，該樹脂用600ml軟化水洗滌以除去鹽和其它水溶性雜質。再次分別收集洗脫液(洗滌液)，該洗滌液也含有低于2ppm的活性成分。
通過用70/30丙酮/水混合液以150ml/小時的速率洗脫，從樹脂上解吸產(chǎn)物，收集約200ml洗脫液。
將洗脫液真空濃縮至約100ml，產(chǎn)物沉淀。
將該懸浮液冷卻至約5℃，2小時后，過濾收集沉淀并用冷水洗滌。于50℃真空干燥后，獲得2.8g式Ⅰ化合物(純度(title)98％)。
將母液和洗滌液合并，用水稀釋(約母液體積的1-2倍)后，以約40ml/小時的速率加載到裝有40ml上述溶脹樹脂的柱(2×13cm)的頂部。
用80ml水洗滌樹脂后，用70/30丙酮/水混合物以約20ml/小時的流速解吸產(chǎn)物。真空濃縮后，冷卻，過濾，用冷水洗滌并干燥，又得到0.14g式Ⅰ化合物。
從發(fā)酵混合液獲得的總回收率一般為96％。
重復實施例1和2描述的方法，但使用2’-甲基-4-孕烯-21-乙酰氧基-[17a,16a-d]噁唑啉基-3,20-二酮代替2’-甲基-4-孕烯-21-醇[17a,16a-d]-惡唑啉基-3,20-二酮，以基本相同的收率獲得式Ⅰ化合物。
權利要求
1．式Ⅰ化合物11β-21-二羥基-2’-甲基-5’βH-孕-1,4-二烯并[17,16-d-]噁唑啉-3,20-二酮的純化方法
該方法包括將從發(fā)酵液或工藝流得到的水溶液中含有的該化合物吸附于具有苯乙烯或丙烯酸基質的吸附性聚合物樹脂上，隨后通過用水和與水混溶的有機溶劑的適宜混合物洗脫解吸所述化合物。
2．根據(jù)權利要求1的方法，其中含有式Ⅰ化合物的發(fā)酵液是從為獲得上述化合物的發(fā)酵過程中獲得的，該過程包括將2’-甲基-4-孕烯-21-醇-[17a,16a-d-]噁唑啉基-3,20-二酮或2’-甲基-4-孕烯-21-乙酰氧基-[17a,16a-d-]噁唑啉基-3,20-二酮與彎孢屬菌株和節(jié)桿菌菌株順序地生長的混合培養(yǎng)物接觸。
3．根據(jù)權利要求1或2的方法，包括a)當式Ⅰ化合物包含在發(fā)酵液中時，過濾發(fā)酵物并任選洗滌菌絲體餅；b)將包含在由工藝流或過濾的發(fā)酵液得到的水溶液中的以及任選的菌絲體洗滌液中的式Ⅰ化合物吸附于具有苯乙烯或丙烯酸基質的吸附性聚合物樹脂上；c)通過用0％-80％水和與水混溶的有機溶劑的混合液洗脫樹脂解吸式Ⅰ化合物。
4．根據(jù)權利要求2或3的方法，其中步驟c)的洗脫混合液含有10％-50％水，優(yōu)選含有約30％水。
5．根據(jù)權利要求2或3的方法，其中a)首先將發(fā)酵物過濾，菌絲體餅重復地用水洗滌，然后將洗滌液與過濾發(fā)酵液合并；b)將與洗滌液合并的過濾的發(fā)酵液加載到裝有水溶脹的吸附樹脂的柱頂部；b’)將樹脂用水洗滌；c)用30/70水/丙酮混合物洗脫從樹脂上解吸式Ⅰ化合物d)洗脫液濃縮并過濾回收式Ⅰ化合物。
6．根據(jù)權利要求5的方法，其中對由步驟b和b’的洗脫獲得的洗滌液和合并的母液重復該純化方法。
7．根據(jù)權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中的吸附性聚合物樹脂是帶有苯乙烯或丙烯酸基質的聚合物樹脂，其粒徑為約20-50目并且具有下述平均物理特性孔隙體積約30-75％；表面積約140-800m2/g；骨架密度苯乙烯樹脂約為1.06-1.10g/ml；丙烯酸樹脂約為1.20-1.26g/ml；平均孔直徑約20-100。
8．根據(jù)權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中的吸附性聚合物樹脂是粒徑為約20-50目并且具有下述平均物理特性的丙烯酸基的聚合物樹脂孔隙體積約30-60％；表面積約350-550m2/g；骨架密度約1.24-1.25g/ml；平均孔直徑約20-80。
9．根據(jù)權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中的吸附性聚合物樹脂是粒徑為約20-50目并且具有下述平均物理特性的丙烯酸基的聚合物樹脂孔隙體積約30-60％；表面積約350-550m2/g；骨架密度約1.25g/ml；平均孔直徑約20-40。
10．根據(jù)權利要求1、2、3、4、7、8或9的方法，其中的水混溶的有機溶劑是低級酮或低級醇。
11．根據(jù)權利要求1、2、3、4、7、8或9的方法，其中的有機溶劑是丙酮。
12．根據(jù)權利要求1、2、3、7、8或9的方法，其中的洗脫混合液是30/70水/丙酮混合物。
全文摘要
式Ⅰ化合物11β－21－二羥基－2’－甲基－5’βH－孕－1,4－二烯并[17,16－d－]噁唑啉－3,20－二酮的制備方法,該方法包括將從發(fā)酵液或工藝流得到的水溶液中含有的該化合物吸附于具有苯乙烯或丙烯酸基質的吸附性聚合物樹脂上,隨后通過用水和與水混溶的有機溶劑的適宜混合液洗脫解吸所述化合物。
文檔編號C07J71/00GK1209137SQ96180009
公開日1999年2月24日 申請日期1996年12月4日 優(yōu)先權日1996年2月16日
發(fā)明者L·福特 申請人:格魯波萊佩蒂特公司