專利名稱：海藻源生物活性有機硅化合物的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物活性硅化合物，特別涉及從海藻中提取生物活性硅化合物的方法、該化合物在海藻具體部位的定位方法和用于提取這些化合物的海藻的栽培方法。
硅是一種在自然界廣泛存在的元素，最為人們所知的是它的天然無機形式，如氧化硅和硅酸鹽或者是其合成聚合物聚硅氧烷。這些硅化合物在水介質(zhì)中是微溶或不溶，這解釋了它們在活的生物體出現(xiàn)很少的原因。
本申請人的工作表明，如果含硅化合物具有能在水溶液中以低分子量低聚物形式存在的特性，一定含硅形式的硅化合物能被身體消化吸收(與礦物硅或聚硅氧烷相反)。此外，在水溶液中的這些低聚物具有活性的另一個必要特征是具有數(shù)個Si-OH官能團。因此，只有當其在溶液中通過Si-O-Sc硅氧烷鍵形成富含Si-OH官能團的可溶性低聚物時，可被人體消化的硅化合物才表現(xiàn)出生物特性。
具有上述大部分生物機理的化學物是可溶的硅硅酸，其化學式是Si(OH)4。但已知其具有很強的形成二氧化硅的縮聚物性能，該化合物提取后必須立刻穩(wěn)定化。
申請人發(fā)現(xiàn)的一個困難是得到的硅骨架化合物，其中硅連接的鍵可以水解以得到含一個或多個Si-OH官能團的生物活性化合物。這種化合物可來源于合成，但更有利的是直接從植物中提取。不幸的是所有的植物中都不含這類硅骨架化合物。
本發(fā)明基本構思的產(chǎn)生基于兩種論點。一方面，人類生理液體中礦物質(zhì)含量與海水中的含量大致相等，另一方面，人類胚組織的增殖機理和海藻源組織的類似。
這就是為什么本發(fā)明的主要目的是從海藻源提供生物活性有機化合物和精確定位海藻的哪一部位含所述的生物活性有機硅化合物。
本發(fā)明的另一個目的是實現(xiàn)從海藻中提取生物活性硅有機化合物。
本發(fā)明的另一個目的是實現(xiàn)從其中可以提取生物活性硅有機化合物的海藻的栽培方法。
因此本發(fā)明的主要目的是通式如下的生物活性硅有機化合物
其中R1、R2、R3和R4是有機基團，并且至少一個是可水解的，為-X-R′型，X是雜原子和R′是H或有機基團，所述化合物是基本來自海藻源繁殖器和嫩組織的提取物。
本發(fā)明的另一個目的是可從海藻的哪一部位提取本發(fā)明化合物的定位方法，包括用以下步驟從上述海藻各部位樣品中提取將樣品固定在一塊聚合樹脂上，在聚合樹脂塊上進行切片，然后對每塊切片進行分光光度法微量分析，以確定哪部分含硅濃度高出預定水平。
本發(fā)明的另一個目的是本發(fā)明有機硅化合物的提取方法，包括使含要提取化合物的細胞脹破，通過沉淀除去增稠劑，穩(wěn)定化有機硅化合物中原有的Si-OH-鍵或水解Si-OR′鍵得到的SiOH鍵，以及純化經(jīng)超離心法穩(wěn)定化得到的濃縮物。
本發(fā)明的另一個目的是一種培養(yǎng)海藻的方法，將從這些海藻中提取有機硅化合物，其中要栽培的海藻苗切成許多碎塊，以形成許多細枝，將其浸入充滿海水的箱中，然后拽出的成形栽培支承物如繩索被置入箱中，以使細枝附著在栽培支承物上，和最后，在其上附著有細枝的栽培支承物以預先確定的深度被置于海中的栽培區(qū)中，并且其平行于海平面。
通過參考附圖閱讀以下說明可以更好地了解本發(fā)明的目的和特征，其中

圖1是海門冬屬有棘類海藻魚叉狀枝叉的草圖，它的某些部分含本發(fā)明有機硅化合物。
圖2是安裝好的小船草圖，在其上裝有被裝入海中栽培區(qū)之前的海藻栽培支承物。
圖3是卷軸的草圖，用于傳送在海中栽培區(qū)中用作栽培支承物的繩索。
圖4是漏斗狀物草圖，用來套封繩索，繩索是用作本發(fā)明栽培方法中的栽培支承物。
申請人發(fā)現(xiàn)肉眼可見的海藻的某一部位含有生物活性有機硅化合物，通式為
其中R1、R2、R3和R4為有機基團，至少一個為-X-R′型可水解的有機基團，X是雜原子，R′是H或者有機基團。雜原子優(yōu)選是氧原子。
如下所述的具有獨創(chuàng)性的定位方法證明硅化合物主要位于特定海藻種類的繁殖器官和或嫩組織中。定位方法一般海藻含有硅，為無機有機化合物。因此已知無機硅存在于單細胞硅藻類海藻中，其中硅化的殼是由外部細胞硅沉積組成的。但申請人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明有機化合物大部分在海藻細胞內(nèi)部，雖然在本發(fā)明中不適當?shù)墓杌衔镌诩毎g的膠接劑中。
僅在本發(fā)明中感興趣的有機硅化合物以不同的量存在于不同海藻中，并且不是在海藻的每一部位都有發(fā)現(xiàn)。因此，與其它相比，紅藻科或紅藻綱更讓人感興趣。
因此必須設計一種定位海藻部位的方法，和確定選擇哪種科目，以用上述方法提取有機硅化合物。
對于一種給定的海藻品種，優(yōu)選的定位方法包括將海藻樣品安置于樹脂上，然后將固定的樣品切成薄片，以實現(xiàn)組織的微量分析，包括X-射線光譜分析和接著的離子分析。
要將樣品固定在樹脂上，第一步包括將它們放入常用固定劑戊二醛或甲醛-戊二醛混合物的海水溶液，壓力為小于10-3巴的微真空。固定的樣品可用四氧化鋨進行后續(xù)固定。在第二步中，樣品可在醇比例不斷增加的連續(xù)浴中脫水。海水比純水能更好地與細胞中自然介質(zhì)保持相同的滲透壓。第三步包括在輕微減壓下，使樣品溶入液態(tài)熱硬化樹脂，以便在減壓消失后細胞中的醇和樹脂進行更好的擴散。這一技術導致樣品中的醇一步步被樹脂代替。所用樹脂優(yōu)選為環(huán)氧樹脂。在最后一步中，在加熱到70℃下實現(xiàn)了樹脂的聚合。
被固定的樣品切成薄片(0.7μ)和半薄片(2μ)，在其上進行微量分析，以選擇具體海藻的哪一部位含硅有機化合物。
最初的固定樣品微量分析是用X射線光譜對薄片(0.7μ)分析，以測定樣品中的硅。該方法根據(jù)其具體的X波段確定生物組織中的元素組成。為達到此目的，樣品被沉積到銅棒上。樣品用能量在0.1至50千電子伏特的稱為“電子探頭”進行電子窄照射成殼。用能量分光計分析從樣品發(fā)射的X射線譜。以脈沖對其能量作圖，并由一專家系統(tǒng)解釋結果。用此技術，所有原子序數(shù)大于4的元素被測出。檢測極限為約10-14至10-15g，相當于濃度小于100ppm。
如果被分析的樣品含硅，進行二級離子分析，以確定樣品的哪部分含硅。由于二級離子分析導致切片的浸蝕，對于本技術優(yōu)選使用經(jīng)四氧化鋨后續(xù)固定的半薄片(2μ)。
二級離子分析是一種微量分析方法，其結合了質(zhì)譜法和顆粒顯微鏡法。對于質(zhì)譜法，分子通過化學反應離子化。不同的離子根據(jù)其質(zhì)荷比(m/z)的分析系統(tǒng)分離。二級離子發(fā)射機制是通過最初的樣品離子照射殼化達到(最初照射的勢能可調(diào)節(jié)到約12KV)。原離子沖擊樣品原子和表面內(nèi)的原子。樣品被剝離的原子帶電或處于中性。帶電粒子(二級離子)用于分析。二級離子可以具有單原子結構或多原子結構。雙向聚焦光學的顆粒給出固體樣品表面過濾的二級離子像。本方法的特點在于它識別出了按周期分組的所有元素，并且分布圖像的空間分辨率低于1微米。
不幸的是，光譜測定質(zhì)量分析導致矯作物和可能將硅和質(zhì)量為28的化合物混雜。該化合物僅可能是Al-H+，因為其它的，象C2H4，N2，CO，CNH2通常是生物化合物的一部分并在所有樣品中給出漫射的像。有必要進行鋁(原子量＝27)的離子分析，以確認樣品的那部分含Al。如果結果與硅分析獲得的某一結果相同，就意味著是Al-H+化合物而不是硅。該樣品必須被排除。如果結果沒有重迭，就意味著，所定位樣品部位(進行微量分析的部位)確實含硅。
以上定位方法允許硅處于特定種類海藻的不同部位和培育方法的實現(xiàn)產(chǎn)生了更令人感興趣的海藻特定部位。因此，在海門冬屬有棘類(紅藻綱)中，我們通過一個重要途徑將硅定位到事囊果(繁殖器官)和頂端組織(嫩組織)中，硅在主干(thalle)和老枝叉中分布很少。栽培方法本發(fā)明的有機硅化合物具有很大的經(jīng)濟意義，其證明我們用來提取有機硅化合物的海藻和其變種可以集約栽培。
這就是為什么申請人根據(jù)上述的原始栽培方法進行了改進(參見圖1至4)。
雖然以下方法可適用于許多種，但對于柏桉藻科更好，特別是對于海門冬屬有棘類種。事實上，一些海藻象海門冬屬有棘類枝叉每株海門冬屬植物有5至10個枝叉，如圖1的枝10和其上的叉12。在自然環(huán)境下，經(jīng)海水力學作用脫離的枝被水流沖走，附著在新的支承體上，通過這種方式進行種類傳播和常年生長。
本發(fā)明的栽培方法用細枝，其包括將每個枝叉(枝上有10至20個叉)切成一或二厘米小塊。每次切割枝上有1或多個叉。因此可以推測沒有不能繁殖的碎塊(要避免非常困難)，獲得50至200倍的繁殖是可能的。
本方法的一個基本特征是在浸入海水前將細枝置于支承物上。在此法中，我們用固定的箱中裝滿海水的小船(20)(如圖2所示)進行海門冬屬有棘類細枝(每進行1kg細枝用5L海水)。象繩索或小網(wǎng)的支承物用移動小船(未畫出)牽引通過箱22。通過移動小船裝入栽培區(qū)的支承物24優(yōu)選粗糙和不柔軟物以便在其通過箱22時固定細枝。這就是為什么舊的聚乙烯繩索比新的更優(yōu)選，繩索的直徑必須在25至50mm之間，其表面需適合數(shù)種普通海藻生長。存放的繩索(或網(wǎng))放在存放箱28中。
受牽引力牽引的繩索(或網(wǎng)24)，由于其受外力牽引，在3個定向器作用下通過箱22第一個(30)(導向)是用軟塑料制造的圓管，其可以繞其軸自由轉(zhuǎn)動。第二個(32)是一個置于密封球軸承上的空塑料管。繩索的類型(如圖3所示)優(yōu)選為六角形和線性的(34)，其與繩索24進行有限的接觸。這種有限接觸是必須的，可以避免細枝從繩索岔開，如導向器(32)是平滑的就能做到。第三個(36)具有與圖3所示相同的型狀，以避免細枝的剝落。但我們可以預設該定向器(36)被驅(qū)動旋轉(zhuǎn)(非自由地)，以便讓栽培支承物繩索24通過箱22。其可以是帶有齒狀平面的“動力滑車”型(水驅(qū)動)，以減小與栽增支承物的接觸。
我們必須要注意的是栽培支承物24(繩索或網(wǎng))必須先用海水浸濕，以避免將箱22中的海水吸干。為了這樣做，一個解決辦法包括將存放的繩索浸在裝滿貯箱28的海水中。
包鞘是通過外裝置(40)沉積在栽培支承體周圍(細節(jié)見圖4)，以避免在浸入海水時從支承體上切走。該設備可用細目的棉網(wǎng)(1/10mm)。其貯室42包裹著尾端彎曲的聚氯乙烯套或噴嘴44。鞘46以與繩索24相同的方法被移動小船(未畫出)牽引。離開套44后，鞘46逐步接近繩索并由于網(wǎng)目縱向接緊而靠近繩索。因此鞘46獲得一個合適的附著力，接著其直徑減小到正好貼在繩索24上，噴嘴44的出口裝有一個橡膠環(huán)制的制動器48。
鞘46用來固定對栽培支承物微切的鉤形物。應該注意的是它是由“可降解”的材料制成的，因此在海水中10至20天將慢慢腐蝕，在支承物上的微切物的充分固定時間不妨礙其開始生長。
然后套著鞘的栽培支承物或繩索24被浸入培養(yǎng)區(qū)，選擇深度為約1米，以便讓日光很好地透入。該支承物通過浮漂保持與表面平行的深度。在培養(yǎng)區(qū)(邊長100米的正方形)中，栽培支承物每四個一組用裝有浮漂塑料(PVC)棒分開。因此該設備需要50米長80根栽培支承物，也就是說對于100米×100米的區(qū)需要4km栽培支承物。
因此，本發(fā)明栽培方法優(yōu)選的支承物是通過微切物容器的連續(xù)的繩索，不超出本發(fā)明范圍的各種設備變化是可能的。因此可使用分段的繩索(10，20或50米)代替使用連續(xù)的繩索，其在置入培養(yǎng)區(qū)前浸入微切物容器中。
如前所述，有機硅化合物存在于海藻的嫩器官里。所以由于這一事實和因為海藻經(jīng)第一次收割后很快長出新枝，海藻將每隔1月進行連續(xù)收獲得。這樣將會收獲得到很多富含有機硅化合物的新枝。枝的月收割法可一年四季地進行。此外，海藻的生物個體發(fā)育導致每年生成的每殖器官適于在7月和8月來摘。提取方法如前所述的定位方法使選擇適于提取本發(fā)明有機硅化合物的海藻種類成為可能。同樣它使選擇本提取方法最感興趣的用于提取有機硅化合物的海藻部位成為可能。
要實現(xiàn)提取有機硅化合物，必須脹破海藻的細胞壁?？捎枚N方法冷凍粉碎法或超高壓法。
冷凍粉碎法包括預先冷凍5-6kg海藻葉片。這些葉片裝入注有液氮的壓碎機，于是最終得到一50℃的化合物。這些化合物呈顆狀，為空泡狀(這些顆粒相隔很大距離)，因此體積很大，因為冷凍粉碎法導致大量細胞脹破并因此放出細胞內(nèi)容物。應注意的是其它技術也可以用來導致細胞脹破。
對于超高壓法，先將海藻在6至30分鐘內(nèi)加壓至40000至10000巴。因此所有海藻細胞處于等壓和全方位高壓狀態(tài)，導致其破裂。
一旦細胞壁破裂，用銨類化合物或其它方法將海藻增稠劑(即角叉膠)沉淀。
即使有機硅化合物只能被海藻中天然穩(wěn)定劑局部穩(wěn)定化，該穩(wěn)定化也只能用這些天然穩(wěn)定劑完成。這種穩(wěn)定化產(chǎn)生的弱結合(氫鍵)阻止了Si-OH縮聚。所用穩(wěn)定劑可以是羧基羥基酸化合物，特別是a-和b-羥基酸，葡糖苷酸、羥基或酚基氨基酸，含多醇(或酚)基團的化合物。這當中我們要提到的是乙二醇、兒茶酚和兒茶酚胺，多元醇如甘油，單糖或酚酸如沒食子酸。
穩(wěn)定化后，有機硅化合物進行超速離心(極高速度離心)和透析純化。除想要的有機化合物以外的硅副產(chǎn)物被留在離心殘液中。在上述情況下，用此提取方法得到的溶液中硅含量約0.3g/L。應用通常，根據(jù)前述方法提取的化合物應用于多方面，這取決于有機硅的性質(zhì)(治療、膳食和美容特性)以及它們的抗炎性、水合性、組織再生性、抗退化、正?；⒅?、代射刺激、抗自由基或anti-glycation活性，或更普遍意義的組織排斥刺激活性。
所以以下在實施例中給出從海藻中提取的有機硅化合物在美容(實施例1)和在膳食(實施例2，3，4)中的活性。實施例1(膳食療法)制成膠囊。一個膠囊含0.59g粉狀的本發(fā)明從海藻提取的有機硅化合物(提取物用聚酰胺粉末吸附)，也就是說每個膠囊含0.1mg硅氧烷。
劑量為每天6至9個膠囊。海藻硅劑的日常吸收使骨痛減輕或消失，該治療要持續(xù)數(shù)月。實施例2(組織再生活性)我們在微滴定板上進行人類成纖維細胞培養(yǎng)。8ml來自海藻源的有機硅化合物被滴定的溶液被稀釋在1L MEM介質(zhì)中，加入2.5％FCS，并分布在凹孔上。
制備兩個含10％FCS的對照系。細胞的增殖用Neutral Red染色技術(Borenfreund 1984)監(jiān)測。染色一波長吸收測量與活細胞數(shù)成正比。在海藻有機硅存在下細胞增殖增加55％。實施例3(保溫活性)制備含12％由本發(fā)明得到的海藻有機硅的水凝膠。將該水凝膠涂在右預損傷部位(foreharm)3天。用Fourrier TransformedInfra Red技術測定保濕效果，水合程度由酰胺在1650cm-1(C＝O)吸收峰面積與酰胺在1550cm-1(C-N)吸收峰面積之比給出。我們在第四到第十天每天測定水合程序，并將其與涂在左預損傷(foreharm)的不含硅的對照膠比較。
該試驗在六個人身體進行。平均值如下在施用后D+1天，我們測得水合程度為2.3對照樣品的水合程度為1.5。
在施用后D+7天，水合程度為2.09，對照樣品為1.37。
這些結果為短期效果，對于長期效果，其具有明顯的生物保濕活性(保持水)。實施例4(脂解活性)我們將人脂肪細胞維持在存活狀態(tài)。我們將10μl海藻有機硅溶液(每升含30mg硅)在1000μlNH4HCO30.01M溶液中釋釋，用Krebs體系緩沖液加至3ml。
通過用酶法測定釋放的甘油定量脂解活性。結果用每克總脂毫微摩爾甘油表示。在選擇劑量下海藻含硅化合物刺激基本脂解在0至60mn之間。與對照相比改進為134％。
權利要求
1.一種具有以下通式的生物活性有機硅化合物
其中R1、R2、R3和R4是有機基團，其中至少一個為-X-R′型的可水解基團，X是雜原子和R′是氫原子或任意的有機基團；其特，征在于所述化合物是基本來自海藻的繁殖器官和嫩組織的海藻原料提取物。
2.一種如權利要求1所述的化合物，其中所述雜原子是氧原子。
3.一種確定從海藻何部位可以提取權利要求1或2化合物的定位方法，包括對海藻所述部位樣品進行以下步驟將所述樣品固定到一塊聚合樹脂上；將所述聚合樹脂切成細切片，和用光譜法對所述細切片進行元素分析，以確定海藻的哪部分含硅量超過預選水平。
4.一種如權利要求3所述的方法，其中將所述海藻樣品在聚合樹脂上固定包括以下步驟在輕微真空下用固定劑如戊二醛將所述樣品固定，在醇濃度不斷增加的含醇類浴中經(jīng)連續(xù)浸泡將所固定的樣品脫水，將所述脫水樣品置于非聚合樹脂上，這樣所述樹脂可慢慢置換樣品中所含的醇，和繼續(xù)進行樹脂的聚合。
5.一種如權利要求3或4的方法，其中所述元素分析由下列步驟組成用X射線光譜確定所分析樣品是否含硅，對二級離子進行離子分析，以確定哪部分樣品中含硅，和當所述部分與通過鋁離子分析緊密地相同時，將其從樣品的其余部分取出。
6.一種能夠從其提取如權利要求1或2所述有機硅化合物的海藻的栽培方法，其特征在于包括以下步驟將要栽培的海藻苗切成碎塊，以得到盡可能多的細枝，所以細枝被浸到充滿海水的箱(22)中，將長形栽培物(24)如繩索浸入所述箱中，這樣細枝可以附著在所述栽培物上，和在其上附著有所述細枝的栽培物被以預先確定的深度放入開放海域中，并保持與水平面平行。
7.一種如權利要求6的栽培方法，其中所述裝有細枝的箱(22)是一個固定小船(20)和所述培養(yǎng)物是連續(xù)的繩索(24)，其被移動的小船牽引以保持浸漬在所述容器中，當其前行時使細枝附著在繩索上。
8.一種如權利要求6的栽培方法，其中所述繩索(24)是粗糙的，以便讓細枝很好地附著在繩索上。
9.一種如權利要求6、7或8所述的栽培方法，其中所述栽培物(24)在被置入栽培區(qū)前由可生物降解的裹鞘(38)覆蓋。
10.一種如權利要求6至9任意一項的栽培方法，其中所述海藻苗選自長有魚叉狀細枝(10)的海藻，每個所述細枝至少有一個叉(12)，這樣容易在栽培物(24)上附著。
11.一種如權利要求9所述的栽培方法，其中所述長有魚叉狀細枝(10)的海藻屬于海門冬屬有棘類。
12.一種如權利要求1或2所述有機硅化合物的提取方法，其由下列步驟組成使含所述化合物的海藻部位細胞脹破，通過用銨類試劑選擇沉淀除去海藻中增稠劑，穩(wěn)定化所述有機硅化合物的天然Si-OH鍵或由水解Si-OR′得到的鍵，和純化由超速離心穩(wěn)定化物產(chǎn)生的提濃物。
13.一種如權利要求12所述的提取方法，其中脹破含所述有機硅化合物海藻部位細胞是在約-50℃冷凍粉碎實現(xiàn)的。
14.一種如權利要求12所述的提取方法，其中脹破含所述有機硅化合物海藻部位細胞是通過在4000至10000巴之間超高壓法實現(xiàn)的。
15.如權利要求1或2所述的有機硅化合物的用途，用于治療、膳食和美容，具有抗炎、組織再生、正?；?、脂解、代謝刺激、抗自由基或anti-glycation活性，或在更普遍范圍的人類或動物組織的排斥機理的刺激活性。
全文摘要
通式的生物活性有機硅化合物，其中R
文檔編號C07F7/08GK1168379SQ9611103
公開日1997年12月24日 申請日期1996年6月13日 優(yōu)先權日1996年6月13日
發(fā)明者M·C·塞古恩, A·夫朗科, E·費諾, J·Y·莫格尼, F·布理斯丁 申請人:阿爾格斯特梅爾公司, ?？讼Ｄ獱柟? 奧希利斯公司