專利名稱：氨基酸核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域是缺少呋喃環(huán)的多聚核苷酸類似物。
本發(fā)明的背景通過氫鍵結(jié)合序列專屬性地結(jié)合到互補性核酸(即有意義鏈)以便抑制基因表達(dá)的寡核苷酸一般稱為反義寡核苷酸。這些合成的寡核苷酸結(jié)合到靶(mRNA)上，進(jìn)而抑制信使RNA的翻譯。這種反義原理在自然界被用于調(diào)控基因表達(dá)(見Uhlmann，E.et al.，Chem.Reviews，1990，90，543-584；and Stein，C.A.et al.，Cancer Res.，1988，48，2659-2688)。在實驗室里，這種反義原理不僅一直用于抑制基因表達(dá)，還一直用于活化基因表達(dá)。Zamecnik and Stephenson在1978年最早假設(shè)了將合成的寡核苷酸用于治療目標(biāo)(見Stephenson，M.L.；and Zamecnik，P.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75，280和285)。反義寡核苷酸專屬性抑制作用的基礎(chǔ)是反義寡核苷酸和病毒核酸的雜環(huán)堿基之間的專屬性Watson-Crick堿基配對。寡核苷酸結(jié)合到互補性核酸的過程稱雜交。具有與編碼疾病發(fā)展必須的蛋白的mRNA的堿基序列互補的寡聚體特別有意義。通過往mRNA上專屬性地雜交，可以干擾由這種mRNA編碼的蛋白的合成。
制備未修飾的寡核苷酸，即具有DNA結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，一直是過去的10年里許多研究組的興趣中心。Caruthers(見McBride，L J.；andCaruthers，M.H.，Tetrahedron Letts，1983，24，245)的經(jīng)由氨基磷酸酯(phosphoramidites)的合成方法最初是由Letsinger作為亞磷酸三酯法引入的(見Letsinger，R.L.；and Lunsford，W.B.，J.Amer.Chem.Soc.，1976，98，3655)，該法現(xiàn)在是制備磷酸二酯(phosphodiaster)寡核苷酸的最有效的方法。使用正常的即未修飾的寡核苷酸作為反義寡核苷酸時出現(xiàn)的問題是對核酸酶的不穩(wěn)定性和膜穿透性不足。為了使反義寡核苷酸有能力抑制翻譯，它們就必須到達(dá)未改變的細(xì)胞內(nèi)部。用于反義抑制的寡核苷酸的有用的性質(zhì)包括(i)寡核苷酸對細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)酶的穩(wěn)定性；(ii)穿透細(xì)胞膜的能力；(iii)與靶性DNA或RNA的雜交能力(見Agawal，K.Let al.，Nucleic Acids Res.，1979，6，3009；Agarwal S.et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA.1988，85，7079)。這樣一來，提供具有用作反義或用作引物或雜交和探針的優(yōu)秀性質(zhì)的多聚核苷酸類似物很有意義。
過去曾合成過修飾的多聚核苷酸，這些多聚核苷酸修飾包括甲基磷酸酯(methylphosphoates)，硫代磷酸酯(phosphorathioates)，各種酰胺和核酸部分的糖殘基的修飾。這些骨架取代雖然在一定程度上增強(qiáng)了穩(wěn)定性，但在起連接作用的手性磷上造成了負(fù)面結(jié)果，即導(dǎo)致生成2n個非對映異構(gòu)體，其中n為寡聚物中修飾的二酯連接物的個數(shù)。這些多個非對映異構(gòu)體的存在明顯削弱了修飾的寡核苷酸雜交到靶序列上的能力。有些這樣的取代也保持支持負(fù)電荷的能力，而且存在這種負(fù)電荷基團(tuán)可降低化合物穿透細(xì)胞膜的能力。還存在與修飾的連接物相聯(lián)系的一系列其它缺點，這些缺點取決于連接物的精確性質(zhì)。
曾合成一些包含糖環(huán)修飾的寡核苷酸類似物。以前使用的去氧核糖核酸的糖修飾包括α-DNA，同DNA，嗎啉代和硫代核苷與多肽核苷酸(PNA)以便提供已經(jīng)理解的被改進(jìn)的結(jié)構(gòu)獲得改進(jìn)的DNA，尤其是提供細(xì)胞攝入獲得改進(jìn)的結(jié)構(gòu)。一般的合成這類類似物的路線包括將核苷或它的核苷酸的一級羥基通過5價或3價氧化態(tài)磷原子或者結(jié)合到高聚載體上，或者接到一序列專屬的3’-核苷酸上。專一性的偶聯(lián)方法稱為亞磷酸三酯法(氨基磷酸酯法)，亞磷酸二酯法和磷酸氫酯法。市場上可以買到用于這類方法的單聚體和高聚載體連接的單聚體，為便于保存和防止偶聯(lián)反應(yīng)中發(fā)生非專屬性反應(yīng)，所述單聚體的堿基(G，A，C，T，U和其它雜環(huán))和磷原子都已保護(hù)。
含修飾糖環(huán)、非離子化骨架或非環(huán)聚酰胺(PNA)的核酸在一定程度上具有一種或多種對介導(dǎo)基因有用的如下性質(zhì)增強(qiáng)復(fù)式穩(wěn)定性(雜交率)、增加對靶的專屬性，抗核酸酶的穩(wěn)定性，改善細(xì)胞攝入，以及協(xié)助核酸的重要終止事件(例如RNase H的活性，催化裂解，終止雜交，以及其它)。也已建議使用碳酸二酯。不過，這些化合物高度不穩(wěn)定，而且碳酸二酯連接不保持磷酸二酯中的亞磷顯示的四面體構(gòu)型。類似地氨基甲酸酯連接造成三角對稱性為非手性的，而且已經(jīng)明確了具有這種連接的聚dT與聚dA不發(fā)生強(qiáng)雜交作用(見Coull，J.M.et al.，Tetra-hedron Letts，1987，28，745；Strichak，E.P.et al.，J.Org.Chem.，1987，52，4202)。
更近以來文獻(xiàn)中報道了非環(huán)糖類似物(Augustyns，K.A.et al.，NucleicAcids Res.，1991，19，2587-2593)。將這些非環(huán)核苷酸插入到寡核苷酸中引起Tm減小，減小的程度取決于寡聚物中的連接體的數(shù)目。發(fā)現(xiàn)這些寡核苷酸對酶穩(wěn)定以及與互補序列的堿基配對。多聚核苷酸和已知的多聚核苷酸類似物的給定缺點使得提供新的多聚核苷酸類似物用于反義抑制和用于使用寡聚物的其它技術(shù)中變得格外有意義。
在糖環(huán)和骨架兩個成分中的修飾的嘗試對于治療和其它方法中的使用來說有些缺點。所以，在有效的治療、診斷和研究工具實用化之前這些質(zhì)量仍需進(jìn)行較大的改進(jìn)。相應(yīng)地，改進(jìn)作為藥物的寡核苷酸的寡聚類似物是長期需要。
本發(fā)明提供了新的寡核苷酸及它們的結(jié)構(gòu)前體，這些化合物的抗酶降解性質(zhì)得到改善，生理條件下的穩(wěn)定性得到提高，電中性或電正性可增強(qiáng)細(xì)胞穿透能力。而且，本發(fā)明的新寡核苷酸對核酸雜交靶的雜交性能得到改善。
本發(fā)明的寡聚物一般的特征是包含一系列適合于雜環(huán)堿基以序列專屬的方式結(jié)合到靶性核酸上的強(qiáng)制性連接物或單聚體。這里描述的強(qiáng)制性連接物當(dāng)插入到寡聚體中時，可以具有比單純的氫鍵還要大的力，通過這種力有利于形成結(jié)合允許的構(gòu)象。
本發(fā)明的核單聚體一般的特點是以一種氨基酸或修飾的氨基醇的殘基代替天然存在的核苷酸中的呋喃糖環(huán)。本發(fā)明的單聚物和寡聚物的實例見于分子式1至41。將這里描述的這些單聚體插入到寡核苷酸中引發(fā)性能改進(jìn)的化合物的合成，這些改進(jìn)的性能包括(i)通過消除與磷酸二酯鍵相聯(lián)系的電荷增加脂溶性(Dalge，J.M.et al.，NucleicAcids.Res.，1991，19，1805)；和(ii)阻止被核酸酶一類的酶降解。含這些單聚體的寡聚體對靶序列的雜交可以十分穩(wěn)定，而且在一種或多種應(yīng)用中比未修飾的核苷殘基優(yōu)越。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供了各種具有一種或多種性質(zhì)的新寡核苷酸類似物，這些性質(zhì)使得標(biāo)題化合物在運用寡核苷酸的操作中比使用常規(guī)的寡核苷酸優(yōu)越。本發(fā)明的化合物為寡核苷酸類似物，其中天然核酸的呋喃糖環(huán)被氨基酸或修飾的氨基醇?xì)埢〈?。本發(fā)明的新化合物的一些實例對于基因表達(dá)的反義控制特別有用。本發(fā)明的化合物還可用作核酸雜交的探針或引物。
本發(fā)明的另一個方面是提供本發(fā)明的寡核苷酸類似物的單聚前體。這些單聚前體可用于合成標(biāo)題寡核苷酸類似物。
本發(fā)明的另一個方面是提供設(shè)計用于治療或預(yù)防疾病的標(biāo)題多聚核苷酸類似物的配方。本發(fā)明還有一個方面是提供治療或預(yù)防疾病的方法，尤其是治療或預(yù)防病毒感染和細(xì)胞生長失調(diào)一類的疾病的方法。所述疾病的治療方法包括服用有效量的用作反義抑制劑的標(biāo)題多聚核苷酸類似物的步驟。
圖的簡介

圖1到圖25是可用于合成本發(fā)明的單聚體和寡核苷酸的化學(xué)反應(yīng)順序圖解。特別是，圖1表述在胸腺嘧啶和絲氨醇之間用-CH2-CO-連接合成L-絲氨醇偶聯(lián)到胸腺嘧啶單聚體氨基磷酸酯。
圖2表述在胸腺嘧啶和絲氨醇之間用-CH2-CH2-連接，合成L-絲氨醇偶聯(lián)的胸腺嘧啶單聚體氨基磷酸酯。
圖3和圖4表示在胸腺嘧啶和絲氨醇之間用-CH2-CO-連接合成取代的L-絲氨醇偶聯(lián)的胸腺嘧啶單聚體氨基磷酸酯。
圖5表示含一個中央含羥胺的5個原子長的核苷酸間鍵，該核苷酸間鏈中的胸腺嘧啶和絲氨醇之間用-CH2-CO-連接的T-T二聚體的合成。
圖6表示其中胸腺嘧啶通過-CH2-CO-鍵連接到N-乙基羥胺上的胸腺嘧啶單聚體氨基磷酸酯的合成。
圖7表示其中L-絲氨酸的氨基連接到2-羥乙?；土u基功能基用DMT基封鎖的L-絲氨醇偶聯(lián)的其中絲氨酸的NH2連接到2-羥基乙?；?，而且羥基用DMT封鎖的胸腺嘧啶單聚體氨基磷酸酯的合成。這種建筑塊被用于2’-5’連接。該圖還表示其中L-絲氨酸的氨基連接到2’-羥乙基功能基上的胸腺嘧啶單聚體的合成。
圖8表示含2’-5’鍵的具有異羥肟酸酯(hydroxamate)骨架的T-T二聚體的合成。在該二聚體中，一個建筑塊是由L-天冬氨酸和胸腺嘧啶構(gòu)成的，另一個建筑塊是由L-絲氨酸與胸腺嘧啶構(gòu)成的。該二聚體的骨架中有兩個外加的酰胺鍵。
圖9表示含2’-5’鍵的具有異羥肟酸酯骨架的T-T二聚體的合成。在該二聚體中，一個建筑塊是由L-天冬氨酸和胸腺嘧啶構(gòu)成的，另一個建筑塊是由L-絲氨酸與胸腺嘧啶構(gòu)成的。該二聚體骨架中沒有酰胺鍵。
圖10表示其中由β-丙氨酸連接胸腺嘧啶和絲氨醇的L-絲氨醇-β-丙氨酸偶聯(lián)的胸腺嘧啶單聚體氨基磷酸酯的合成。
圖11表示其中由烷基胺連接胸腺嘧啶和絲氨醇的L-絲氨醇-烷基胺偶聯(lián)的胸腺嘧啶單聚體氨基磷酸酯的合成。
圖12表示含4’-5’鍵的具有異羥肟酸酯骨架的T-T二聚體的合成。該圖中二聚體通過乙?；谛叵汆奏ず吞於彼嶂g連接，由兩個L-天冬氨酸單元和兩個胸腺嘧啶單元構(gòu)成。
圖13表示含4’-5’鍵的具有異羥肟酸酯骨架的T-T二聚體的合成。該圖中二聚體通過乙基在胸腺嘧啶和天冬氨酸之間連接，由兩個L-天冬氨酸單元和兩個胸腺嘧啶單元構(gòu)成。
圖14表示N-羥基氨基酸偶聯(lián)的胸腺嘧啶建筑塊的合成。
圖15表示用N-羥基胺在胸腺嘧啶和天冬氨酸之間連接的L-天冬氨酸偶聯(lián)的胸腺嘧啶建筑塊的合成。
圖16表示含4’-5’鍵的具有異羥肟酸酯骨架的T-T二聚體的合成。在該圖中二聚體中，羧酸基通過N-羥胺連接物偶聯(lián)到胸腺嘧啶建筑塊上。
圖17表示取代的N-羥基氨基酸胸苷乙酸建筑塊150和它的類似物149。這些單聚體建筑塊可用于制備含異羥肟酸酯骨架的核酸。
圖18表示含氨基酸建筑塊157和158的胸苷乙酸取代的羥胺的合成。這些單聚體可用于設(shè)計具有含羥胺功能基的酰胺骨架的核酸。
圖19表示在胸腺嘧啶和絲氨醇之間含羥胺殘基的L-絲氨醇偶聯(lián)的胸苷核苷建筑塊166的合成。該建筑塊可用于設(shè)計4’-5’鍵連的核酸。
圖20表示谷氨酸-甘氨酸偶聯(lián)的胸苷單聚體174的合成。該單聚體建筑塊可用于合成含酰胺骨架和2’-5’鍵連的核酸。
圖21表示在胸腺嘧啶和甘氨醇之間具有羥胺殘基的甘氨醇-甘氨酸偶聯(lián)的胸苷建筑塊181和182的合成。這些建筑塊可用于制備2’-5’鍵連的核酸。
圖22至圖25表示核糖氨基酸偶聯(lián)的胸苷建筑塊191，199和207的合成。這些建筑塊可用于制備含核糖-酰胺骨架的寡核苷酸的合成。
圖22表示含核糖-酰胺骨架的寡核苷酸211的固相合成。
圖23表示1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶基乙?；?〕-L-丙基-3-O-(N，N-二異丙基-1)基-β-氰乙基氨基磷酸酯的合成。
圖24表示1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶基乙?；?〕-D-丙基-3-O-(N，N-二異丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯的合成。
圖25表示2-〔(β-4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙基-1-O-(N，N-二異丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯的合成。
圖26表示N-(胸腺嘧啶基乙酰基)-N-〔〔(2-異丁酰)氧〕乙基〕-O-芐基羥胺的合成。
圖27表示(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶-1-基)〕甲基-4-鄰苯二甲酰亞胺基-吡咯烷的合成。
特殊實例的詳細(xì)描述A.定義和縮寫描述本發(fā)明時，將使用如下述語，并按如下指明的那樣定義這些術(shù)語。
這里使用的“反義”治療是服用或就地生成DNA或RNA寡聚體，或它們的類似物，這些寡聚體或類似物可以專屬性地結(jié)合到互補的靶核酸序列上。這種結(jié)合既可以是常規(guī)的互補性堿基配對，也可以是經(jīng)歷別的機(jī)制的結(jié)合，例如在結(jié)合到DNA雙鏈時，就是通過在雙螺旋的主要溝區(qū)發(fā)生特異的相互作用?！胺戳x”是指在文獻(xiàn)中按這種描述一般使用的技術(shù)范圍，并且包括依賴于和寡核苷酸序列專屬性結(jié)合的任何治療。反義基因調(diào)控技術(shù)為分子生物學(xué)領(lǐng)域里的一般技術(shù)人員熟悉，在文獻(xiàn)中可以查到有關(guān)反義基因調(diào)控的描述，例如見于美國專利U.S.5,107,065，U.S.5,166,195，US 5,087,617和Crooke，Annual Review PharmacologyToxicology 992 32，329-376。
術(shù)語“寡聚體”或“寡核苷酸”交互使用并包括RNA和DNA一類天然化合物，以及它們的合成類似物，這些合成類似物中又包括本發(fā)明的化合物。只要不特別指明，術(shù)語“寡聚體”和“寡核苷酸”就是指DNA/RNA和指它們的合成類似物兩類化合物。術(shù)語“寡聚體”指由兩個或多個核單聚體通過磷酸二酯鏈或任何其它取代鏈以共價鍵相互連接的化合物。只要不特別指明，就不應(yīng)把長度限制理解到術(shù)語“寡聚體”中去。這樣一來，一個寡聚體或可以有少至2個共價鍵連接的核單聚體(一種二聚體)，或可以長很多。寡聚體可以互補性地結(jié)合，因而能夠與單鏈或雙鏈核酸序列的堿基配對。寡聚體(例如二聚體至六聚體)也可用于這里描述的更長的寡聚體的合成子。寡聚體可以含非堿性位置和偽核苷。
寡聚體包括寡核苷酸、寡核苷、聚去氧核糖核酸(含2’-去氧-D-核糖或它們的修飾體)，即DNA，聚核糖核苷酸(含D-核糖或它們的修飾體)，即RNA，和嘌呤或嘧啶為堿基，或修飾的嘌呤或嘧啶為堿基的氮苷或碳苷的任何類型的聚核苷酸。這里使用的寡聚體還包括鄰接的核單聚體通過異羥肟酸酯鏈連接的化合物寡聚體中的一般元素，例如呋喃糖環(huán)和/或磷酸二酯鏈可以被任何別的合適的功能等價元素取代。術(shù)語“寡聚體”包括用作堿基的底盤或載體的任何結(jié)構(gòu)，其中底盤允許以序列依賴的方式結(jié)合到靶性核酸上。目前已知可分為四類的寡聚體的特點是具有(i)磷酸二酯或磷酸二酯類似物(硫代磷酸酯，甲基磷酸酯等等)鏈；(ii)含非亞磷電子等排體的取代鏈(核糖縮醛，甲醛縮醛，氨基甲酸酯，等等)，(iii)嗎啉代殘基，碳環(huán)殘基，或其它呋喃糖，例如阿拉伯糖，或己糖取代核糖或去氧核糖，和(iv)經(jīng)酰胺鍵連接的核單聚體或經(jīng)任何其它合適的取代鏈連接的非環(huán)核單聚體。
這里使用的術(shù)語“核單聚體”指包含(1)以共價鍵連接到(2)第二個殘基上的殘基。核單聚體包括核苷，核苷酸或與氨基醇相連的堿基。核單聚體能夠連接形成寡聚體，該寡聚體能夠以序列專屬的方式結(jié)合到靶或核酸的互補性堿基序列上。
這里使用的“第二殘基”指連接到核單聚體上的化合物，并包括氨基酸/氨基醇?xì)埢?，通常是絲氨醇、天冬氨酸、谷氨酸。甘氨酸和含有修飾的氨基酸殘基的那些化合物，例如其中的一個或多個氫被別的功能基取代(見分子式24-41)，或一個羧酸初功能化醇、胺、硫醇、羥胺等。這里定義的核單聚體還包括連接到連接到一氨基酸或氨基醇和/或氨基酸/具有游離羧基和/或游離氨基和/或它們的保護(hù)形態(tài)的醇類似物上的。
這里使用的術(shù)語“核苷”是指下面描述的它們的氨基酸和氨基醇衍生物，如同下面定義的那樣，這些類似物含嘌呤，嘧啶或它們的類似物，但不含磷酸二酯類似物或修飾的核苷間鍵的一類的連接殘基。“5’”核苷是指核苷提供5’位碳與連接殘基結(jié)合。連接殘基的“5’”端與“5’”核苷偶聯(lián)。連接殘基的“3’”端連接到下一個核苷的3’位。若存在明確不包括3’和/或5’碳的修飾核苷，技術(shù)人員就應(yīng)理解為該“3’”和“5’”術(shù)語用于描述與DNA和RNA中使用的鏈極類似。
這里使用的術(shù)語“核苷”指堿基以共價鍵連接到氨基醇/氨基酸類似物，并且在堿基和氨基醇及氨基酸之間含有連接基。正常情況下，術(shù)語核苷包括核糖核苷，去氧核糖核苷或任何其它堿基的氮苷或碳苷的核苷。
這里使用的術(shù)語“核苷酸”指具有磷酸酯基或磷酸酯基類似物(含與磷酸酯中的亞磷相同氧化態(tài)的磷的基團(tuán)，例如硫代磷酸酯，酰胺)。
這里使用的術(shù)語“堿基”指各種核苷堿基，包括嘌呤，嘧啶雜環(huán)，雜環(huán)類似物和它們的互變異構(gòu)體。嘌呤包括腺嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤，范例性的嘌呤類似物包括8-氧代-N6-甲基腺嘌呤和7-去氮雜黃嘌呤。嘧啶包括尿嘧啶和胞嘧啶，以及它們的類似物例如5-甲基胞嘧啶，5-(1-丙炔基尿嘧啶)，5-(1-丙炔基胞嘧啶)，5-甲基尿嘧啶和4，4-橋亞乙基胞嘧啶?！皦A基”連接到一個合適的分子骨架上時，例如連接到磷酸二酯骨架上時該堿基即有能力進(jìn)入雙鏈DNA或其它類似結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸的堿基配對關(guān)系。堿基還有能力進(jìn)入三重螺旋核酸的堿基配對關(guān)系。
這里使用的術(shù)語“糖修飾”指2’-去氧核糖以外的任何氨基酸或氨基醇?xì)埢?br> 這里使用的術(shù)語“氨基酸/氨基醇”指任何天然氨基酸和醇的“R”和“S”兩種異構(gòu)體。
這里使用的術(shù)語“核苷鏈”是指存在于單聚體中的鏈。
這里使用的術(shù)語“鏈”是指用于連接堿基與氨基酸/氨基醇及它們的衍生物的殘基。
這里使用的術(shù)語“核苷酸間鏈”指以共價鍵連接相鄰的核單聚體的磷酸二酯殘基(-O-P(O)(O)-O-)或任何其它功能等價的殘基。
這里使用的術(shù)語“取代鏈”指以共價鍵偶聯(lián)相鄰核單聚體天然基團(tuán)或任何合適的殘基的類似物。取代鏈包括磷酸二酯類似物，例如磷酸硫代酯和甲基磷酸酯，以及含非磷的鏈，例如酰胺，異羥肟酸酯，羥胺等。取代鏈包括本發(fā)明的含非磷鏈(2’，5’-鏈，3’，5’鏈和4’，5’鏈)。
這里使用的術(shù)語“交連殘基”指與靶性核酸共價鍵結(jié)合的寡聚體中的基團(tuán)或殘基。交連殘基包括將寡聚體與靶性核酸共價鍵連接的共價結(jié)合的亞基，或者即時發(fā)生結(jié)合(例如N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶)或經(jīng)光活化發(fā)生結(jié)合(例如補骨脂靈)等等。
這里使用的術(shù)語“封鎖基”指H以外的取代基，該取代基以共價鍵偶聯(lián)到寡聚體或核單聚體上，或作為保護(hù)基，或作為合成中的偶聯(lián)基，OPO3-2，或其它常規(guī)的共價共軛物，例如固相載體，標(biāo)記物，抗體，單克隆抗體或它們的片段，等等。正如這里使用的，俚語“封鎖基”單純指不保護(hù)基，還包括H-磷酸酯或氨基磷酸酯一類的偶合基。
這里使用的術(shù)語“保護(hù)基”指能夠保護(hù)與之相連的氧原子，硫原子或氮原子的任何基團(tuán)，使這些原子不參加反應(yīng)或結(jié)合。核單聚體堿基氮原子上的這類保護(hù)基以及這些保護(hù)基的引入按常規(guī)為文獻(xiàn)已知。非限制性的合適保護(hù)基的例子包括二異丁基甲咪基，苯甲?；?，硅烷基，等等。氧原子和硫原子的合適保護(hù)基有DMT，MMT，F(xiàn)MOC或酯類。這里使用的“保護(hù)基”包括能夠保護(hù)與之相連的氧原子，硫原子或氮原子不參與反應(yīng)或結(jié)合的任何基團(tuán)。核單聚體中的氧原子，硫原子和氮原子的這類保護(hù)基的描述及其引入方法常規(guī)地都有文獻(xiàn)報道。保護(hù)基還包括能夠防止羧酸和硫醇等反應(yīng)和結(jié)合的任何基團(tuán)。
這里使用的“偶聯(lián)基”指適合于核單聚體之間生成鏈或取代鏈的任何基團(tuán)，例如磷酸氫酯和氨基磷酸酯。
這里使用的術(shù)語“共軛物”或“共軛殘基”指連接到寡聚體末端或連接到寡聚體自身之內(nèi)的任何基團(tuán)。共軛物包括固相載體，例如硅膠，控制孔徑的玻璃和聚苯乙烯；標(biāo)記物，例如熒光粉，化學(xué)發(fā)光物，放射性原子或分子，酶性殘基，以及信息基團(tuán)；寡聚轉(zhuǎn)運劑，例如聚陽離子，血清蛋白和糖蛋白以及高聚物等等。其它共軛殘基，包括O-膽甾醇，聚乙二醇(PEG)，氨基酸，嵌入劑，多核苷酸純化殘基，交聯(lián)功能基，脂類，異羥肟酸酯，烷基化試劑等等。
這里使用的術(shù)語“合成子”指在本發(fā)明的寡核苷酸類似物內(nèi)的結(jié)構(gòu)單元。
這里使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染作用”指適合于加強(qiáng)寡聚體向細(xì)胞轉(zhuǎn)運的任何方法。
這里使用的術(shù)語“受試者”指植物或動物，包括哺乳動物，尤其是人。
術(shù)語“衍生物”和它們的單聚成分寡聚體包括文獻(xiàn)中常規(guī)認(rèn)可的那些衍生物和寡聚體。例如寡核苷酸可以經(jīng)共價鍵連接到各種殘基，例如連接到嵌入劑上，連接到專屬地與DNA雙螺旋的微溝相互作用的化合物上，以及連接到任意選擇的共軛物例如標(biāo)記物(放射性物質(zhì)，熒光物質(zhì)，酶等等)。這些附加的殘基可以(但不必須)通過作為鏈本身一部分的修飾的骨架鏈衍生。例如吖啶一類的嵌入劑可以通過與RNA或DNA末端的5’位或RNA的2’位的含有-OH或-SH用R-CH2-連接，或?qū)H基或SH基引入嘧啶的5位，例如以5位含-CH2CH2CH2OH或-CH2CH2CH2SH的衍生化形式代替胞嘧啶的5-甲基。可以連接范圍廣泛的取代基，包括通過常規(guī)鏈連接的那些取代基。這樣一來，通式(I)的寡聚物中指明的OH殘基可以被磷酸酯基取代，可以被標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基保護(hù)或可以被活化以便制備另外的與別的核苷酸相連的鏈，或可以結(jié)合到共軛取代基上。5’末端OH基按常規(guī)方法進(jìn)行磷酸化，2’-OH基或3’末端的羥基取代基也可以被磷酸化。羥基也可以被衍生化成標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基。
這里使用的術(shù)語“磷酸二酯類似物”指常規(guī)磷酸二酯鏈類似物以及變換的連接基團(tuán)。這些變換的連接基團(tuán)其中包括O-P-(O)以P(O)S，P(O)NR2，P(O)R，P(O)OR’取代，其中R為H或(C1-7)烷基，R’為(1-7C)烷基的實例，當(dāng)然不限于這些。相同寡聚體中的磷酸二酯鏈不必要相同，唯一的要求是這些鏈中至少有一個是這里描述的修飾的核苷酸間鏈。
嘌呤和嘧啶的“類似物”形態(tài)是文獻(xiàn)中一般都是已知的形態(tài)，它們中的許多化合物都用作化療劑。一個例證性清單包括4-乙?；奏?，8-羥基-N6-甲基腺嘌呤，吖丙啶基胞嘧啶，，偽異胞嘧啶，5-(羧羥甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基偽尿嘧啶，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶，β-D-甘露糖基鳥嘌呤，5’-甲氧羰基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤，N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，氧丁氧肌苷，偽尿嘧啶，gueosine，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，偽尿嘧啶，guesme，2-硫胞嘧啶，以及2，6-二氨基嘌呤。該清單并非遺漏無余。特別優(yōu)選的類似物為5-甲基胞嘧啶(這里縮寫為“Cme”)。
這里使用的術(shù)語“電子等排”指核苷間鏈的空間或取向性質(zhì)，以及這樣一個事實，即這些性質(zhì)與天然磷酸二酯鍵的性質(zhì)是如此相似，以至于含電子等排鍵的修飾的寡核苷酸將取代，仿生天然寡核苷酸和/或與天然寡核苷酸雜交。
這里使用的術(shù)語“核糖-酰胺”指存在于兩個核堿基之間的核苷酸間鏈。核糖-酰胺核苷酸間鏈兼有核糖/(2’-去氧)核糖和氨基酸功能。
本申請書使用了各種縮寫表示功能基和化合物。這些縮寫容易為有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人員理解，例如“Ph”指苯基，“Me”指甲基，“(1-7C)”指一給定的碳鏈含1個至7個碳原子，等等。
本發(fā)明的說明本發(fā)明提供了在堿基和骨架(磷酸二酯、磷酸硫酯和表1中所示的其它亞基)之間含修飾氨基酸/氨基醇的新寡核苷酸類似物，本發(fā)明還涉及修飾的寡核苷酸鏈。本發(fā)明也涉及它每的的修飾或功能基的等價變換，即用氨基酸衍生物取代處于骨架和堿基之間的糖殘基，例如分子式24所示的那種方式。本發(fā)明還提供了新核單聚體和把它們插入到含核單聚體的寡聚體中的方法學(xué)。
本發(fā)明提供了具有分子式1-23的各種核單聚體化合物。
本發(fā)明的寡聚體為高聚體，這類高聚體包括1個或多個連接的標(biāo)題單聚體化合物，以便提供DNA或RNA的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明的寡聚體包括兩種或多種核單聚體，雖然200個殘基的寡聚體或200殘基以下的核寡聚體一般容易合成，但可以實質(zhì)性地含有任何數(shù)目的核單聚體。分子式1-23的化合物可以象分子式24-41中所示的那樣通過4’-5’鏈，3’-5’鏈和2’-5’鏈相互連接。
本發(fā)明的化合物中的核苷酸鏈由絲氨酸和甘氨酸一類的氨基酸或它們的衍生物構(gòu)成。本發(fā)明的寡核苷酸在體內(nèi)穩(wěn)定，具有抗內(nèi)源性核酸酶的性能，能夠雜化到靶性核苷酸序列上。本發(fā)明的化合物的范例見于分子式24至41，而且從構(gòu)象上看更加嚴(yán)格地與未修飾的DNA或RNA中的磷酸二酯鏈相關(guān)。這種構(gòu)象限制部分可由于標(biāo)題化合物與多聚核苷酸靶性序列的互補性結(jié)合的性能增強(qiáng)；不過本發(fā)明的應(yīng)用并不依賴于增強(qiáng)結(jié)合性能的理論。
在另一個具體例中，本發(fā)明指向修飾的寡核苷酸或它們的衍生物，其中天然寡核苷酸例如DNA或RNA中的呋喃糖殘基被氨基酸/氨基醇?xì)埢〈?，包括在氨基酸位置上取代的修飾，見于分子?5至41。相鄰核單聚體間的核苷酸間鏈?zhǔn)窍噜彽暮藛尉垠w的4’和5’位之間的鏈。換句話說，磷酸二酯核苷酸間鏈或它們的功能等價物原始來源于一個核單聚體的5’位和相鄰單聚體的4’位連接，作為范例見于分子式24-33。
其中每個”R”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7C和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“堿基”各自獨立為核苷堿基。
其中每個“R1”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R2”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R3”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7C和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R4”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7C和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中各個“A”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5，和Se，其中“x”是1-7。
其中各個“B”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5，和Se，其中“x”是1-7。
其中各個“X”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，和NR5，其中“x”是1-7。
其中各個“Z”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，和NR5，其中“x”是1-7。
R5為H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，低級烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，-(CH2)xF；其中“x”是1-7，和“F”獨立為H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“V”各自獨立的磷酸二酯類似物，磷酸硫代酯，甲基膦酸酯，磷酸二硫代酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，氨基磷酸酯，乙?；０坊?，氧化甲酰胺基，氧化乙酰胺基，二異丙基硅烷，氨基甲酸酯，二亞甲基硫醚，二亞甲基亞砜，二亞甲基砜和/或2至4個原子長的核苷間鏈，這些原子選自碳、氮、氧、硫、和硒。寡聚體的長度可以從2聚體變至200聚體，甚至更長。優(yōu)選的修飾核苷酸間鏈包括表1中的結(jié)構(gòu)“V”。
相應(yīng)地通式的化合物可以共軛到1個或多個共軛殘基上。適宜的共軛殘基包括O-甾醇、聚乙二醇、氨基酸、嵌入劑，分隔殘基(Cleavingmoieties)(例如咪唑)，交聯(lián)功能基(例如補骨脂靈)、類酯、多肽、烷基化試劑、異羥肟酸酯、以及熒光標(biāo)記物。共軛殘基可以獨立地取代R， R1，R2，R3，R4，和R5中的1個或多個。
在其它實例中，本發(fā)明提供了分子式34-36中指明的寡聚體結(jié)構(gòu)和它們的衍生物
式34
在分子式34-36的化合物中，相鄰核單聚體為3’至5’連接。
其中每個”R”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“堿基”各自獨立為核苷堿基。
其中每個“R1”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R2”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R3”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R4”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中各個“A”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5，和Se，其中“x”是1-7。
其中各個“B”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5，和Se，其中“x”是1-7。
其中各個“X”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5，其中“x”是1-7。
其中各個“Y”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5，其中“x”是1-7。
其中各個“Z”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5，其中“x”是1-7。
R5為H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，低級烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，-(CH2)xF；其中“x”是1-7，和“F”獨立為H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“V”各自獨立為磷酸二酯類似物，磷酸硫代酯，甲基膦酸酯，磷酸二硫代酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，氨基磷酸酯和/或2至4個原子長的核苷間鏈，這些原子選自碳、氯、氧、硫、和硒。寡聚物的長度可以由二聚體變至200聚體或更長。優(yōu)選的修飾核苷間鏈包括表1中的結(jié)構(gòu)“V”。
本發(fā)明的另一個實例中，本發(fā)明的目標(biāo)是提供分子式為37至41的寡聚體或它們的變形，提供包括2’，5’鏈的新核苷間鏈的寡聚體。這些寡核苷酸在體內(nèi)穩(wěn)定，已經(jīng)改善了對內(nèi)源性核苷酶的穩(wěn)定性，并有能力往靶性寡核苷酸序列上雜交。

其中每個”R”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“堿基”各自獨立為核苷堿基。
其中每個“R1”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R2”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R3”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“R4”各自獨立為H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph，-(CH2)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中各個“A”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5，和Se，其中“x”是1-7。
其中各個“B”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5，和Se，其中“x”是1-7。
其中各個“X”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5其中“x”是1-7。
其中各個“Z”各自獨立為(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5，其中“x”是1-7。
R5為H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，低級烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，-(CH2)xF；其中“x”是1-7，和“F”獨立為H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。
其中每個“V”各自獨立為磷酸二酯類似物，磷酸硫代酯，甲基膦酸酯，磷酸二硫代酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，氨基磷酸酯和/或2至4個原子長的核苷間鏈，這些原子選自碳、氮、氧、硫、和硒。寡聚物的長度可以由二聚體變至200聚體。優(yōu)選的修飾核苷間鏈包括表1中的結(jié)構(gòu)“V”。
在本發(fā)明的另一個實例中，標(biāo)題發(fā)明涉及下面分子式的寡聚體(分子式42)以及它們的單聚成分(分子式85-90)。
其中X為選自(CH2)n，其中n＝1-3，CO(CH2)n，其中n＝0-2，和(CH2)nSO2，其中n＝1-2的基團(tuán)，Y為選自CH2，CO，COOH，CS，及SO2的基團(tuán)。
Y’為選自CH2，CO，COOH，CS和SO2的基團(tuán)。
Z為選自O(shè)，S，NH和CH2的基團(tuán)。
R為選自CH2OH，CH2NH2，CH2NHCHO，CONH2和COOH的基團(tuán)。B為核苷堿基。
其中X為選自(CH2)n，其中n＝1-3，CO(CH2)n，其中n＝0-2，和(CH2)nSO2其中n＝1-2的基團(tuán)Y為選自CH2，CO，COOH，CS，及SO2的基團(tuán)。
Y’為選自CH2，CO，COOH，CS和SO2的基團(tuán)。
Z為選自O(shè)，S，NH和CH2的，基團(tuán)。
R為選自CH2OH，CH2NH2，CH2NHCHO，CONH2和COOH的基團(tuán)。B為核苷堿基。
在另一個實例中，本發(fā)明提供了通過核苷酸序列介導(dǎo)治療疼痛的方法，該方法包括給予需要進(jìn)行這種治療的對象服用一定量的上面修飾的寡核苷酸，這些寡核苷酸能夠?qū)傩缘亟Y(jié)合到核苷酸序列上，一般使該序列失活。
在本發(fā)明的寡核苷酸中，至少有一種包括在分子式24-41的“Vs”中的磷酸二酯基被這里描述的修飾核苷間鏈取代。理想的是未修飾寡核苷酸中的多個磷酸二酯鏈被可以反復(fù)在該結(jié)構(gòu)中使用的修飾的核苷間鏈取代，或者在期望時一系列修飾的核苷間鏈可用于各個寡核苷酸。在目標(biāo)寡核苷酸的優(yōu)選實例中，這些取代鏈?zhǔn)欠鞘中缘?，以便增?qiáng)寡核苷酸往期待的靶上雜交的能力，不過本發(fā)明的有用的化合物包括那些使用了手性形態(tài)的實例。
優(yōu)選的修飾核苷酸間鏈包括表1中的”V”結(jié)構(gòu)。Ｘ表1-O--S--S(O)--S(O)(O)--Se--Si--C(O)--C(S)--NH--NOH--NCH3--NR5--CH2--O-CH2--CH2-O--O-CH2-CH2--CH2-CH2-O--CH2-O-CH2--O-CH2-O--S-CH2--CH2-S--S-CH2-CH2--CH2-CH2-S--CH2-S-CH2--S-CH2-S--O-CH2-S--S-CH2-O--S(O)-CH2--CH2-S(O)--S(O)-CH2-CH2--CH2-CH2-S(O)--CH2-S(O)-CH2--S(O)-CH2-S(O)--O-CH2-S(O)--S(O)-CH2-O--S(O)(O)-CH2--CH2-S(O)(O)--S(O)(O)-CH2-CH2--CH2-CH2-S(O)(O)--CH2-S(O)(O)-CH2--S(O)(O)-CH2-S(O)(O)--O-CH2-S(O)(O)--S(O)(O)-CH2-O--S-S--S(O)-S(O)-
-S(O)(O)-S(O)-(O)--Se-CH2--CH2-Se--Se-CH2-CH2--CH2-CH2-Se--CH2-Se-CH2--Se-CH2-Se--O-CH2-Se--Se-CH2-O--Se(O)-CH2--CH2-Se(O)--Se(O)-CH2-CH2--CH2-CH2-Se(O)--CH2-Se(O)-CH2--Se(O)-CH2-Se(O)--O-CH2-Se(O)--Se(O)-CH2-O--Se(O)(O)-CH2--CH2-Se(O)(O)--Se(O)(O)-CH2-CH2--CH2-CH2-Se(O)(O)--CH2-Se(O)(O)-CH2--Se(O)(O)-CH2-Se(O)(O)--Se-Se--Se(O)-Se(O)--Se(O)(O)-Se(O)-(O)--O-CH2-Se(O)(O)--Se(O)(O)-CH2-O--S-CH2-Se--Se-CH2-S--S(O)-CH2-Se(O)--Se(O)-CH2-S(O)--S(O)(O)-CH2-Se(O)(O)--Se(O)(O)-CH2-S(O)(O)--S-S--S(O)-S(O)--S(O)(O)-S(O)(O)--Se-Se--Se(O)-Se(O)--Se(O)(O)-Se(O)(O)--N(R5)-CH2--CH2-N(R5)--N(R5)-CH2-CH2--CH2-CH2-N(R5)--CH2-N(R5)-CH2--N(R5)-O--O-N(R5)--N(R5)-O-CH2--CH2-O-N(R5)--CH2-N(R5)-O--O-N(R5)-CH2-
-O-CH2-N(R5)--N(R5)-CH2-O--N(R5)-S--S-N(R5)--N(R5)-S-CH2--CH2-S-N(R5)--CH2-N(R5)-S--S-N(R5)-CH2--S-CH2-N(R5)--N(R5)-CH2-S--N(R5)-S(O)--S(O)-N(R5)--N(R5)-S(O)-CH2--CH2-S(O)-N(R5)--CH2-N(R5)-S(O)--S(O)-N(R5)-CH2--S(O)-CH2-N(R5)--N(R5)-CH2-S(O)--N(R5)-S(O)(O)--S(O)(O)-N(R5)--N(R5)-S(O)(O)-CH2--CH2-S(O)(O)-N(R5)--CH2-N(R5)-S(O)(O)--S(O)(O)-N(R5)-CH2--S(O)(O)-CH2-N(R5)--N(R5)-CH2-S(O)(O)--O-N(R5)-S--S-N(R5)-O--O-N(R5)-S(O)--S(O)-N(R5)-O--O-N(R5)-S(O)(O)--S(O)(O)-N(R5)-O--O-S-O--O-S(O)-O--O-S(O)(O)-O--N(R5)-S-N(R5)--N(R5)-S(O)-N(R5)--N(R5)-S(O)(O)-N(R5)--CH2-S-O--CH2-S(O)-O--CH2-S(O)(O)-O--CH2-C(O)-O--CH2-C(S)-O--CH2-N(R5)-C(O)-O--CH2-N(R5)-C(S)-O--N(R5)-C(O)-O-CH2--N(R5)-C(S)-O-CH2--O-C(O)-N(R5)-O--O-C(S)-N(R5)-O--O-C(O)-N(R5)-CH2--O-C(S)-N(R5)-CH2--O-C(O)-CH2-N(R5)--O-C(S)-CH2-N(R5)--O-C(O)-CH2-O-N(R5)--O-C(S)-CH2-O-N(R5)--O-C(O)-N(R5)-O-CH2--O-C(S)-N(R5)-O-CH2--O-N(R5)-C(O)-O-CH2--O-N(R5)-C(S)-O-CH2--CH2-O-C(O)-N(R5)-O--CH2-O-C(S)-N(R5)-O--CH2-O-C(O)-N(R5)-CH2--CH2-O-C(S)-N(R5)-CH2--CH2-O-C(O)-CH2-N(R5)--CH2-O-C(S)-CH2-N(R5)--CH2-O-C(O)-N(R5)--CH2-O-C(S)-N(R5)--CH2-O-C(O)-N(R5)-O--CH2-O-C(S)-N(R5)-O--CH2-O-N(R5)-C(O)-O--CH2-O-N(R5)-C(S)-O--CH2-N(R5)-C(O)-S--CH2-N(R5)-C(S)-S--N(R5)-C(O)-S-CH2--N(R5)-C(S)-S-CH2--S-C(O)-N(R5)-O--O-C(S)-N(R5)-S--S-C(O)-N(R5)-CH2--S-C(S)-N(R5)-CH2--S-C(O)-CH2-N(R5)--S-C(S)-CH2-N(R5)--S-C(O)-CH2-O-N(R5)--O-C(S)-CH2-S-N(R5)--O-C(O)-N(R5)-S-CH2--S-C(S)-N(R5)-O-CH2--S-N(R5)-C(O)-O-CH2--O-N(R5)-C(S)-S-CH2--CH2-S-C(O)-N(R5)-O--CH2-O-C(S)-N(R5)-S--CH2-S-C(O)-N(R5)-CH2--CH2-S-C(S)-N(R5)-CH2--CH2-S-C(O)-CH2-N(R5)--CH2-S-C(S)-CH2-N(R5)--CH2-S-C(O)-N(R5)--CH2-S-C(S)-N(R5)--CH2-S-C(O)-N(R5)-O--CH2-S-C(S)-N(R5)-O--CH2-S-N(R5)-C(O)-O--CH2-S-N(R5)-C(S)-O--CH2-O-C(O)-N(R5)-S--CH2-O-C(S)-N(R5)-S--CH2-O-N(R5)-C(O)-S--CH2-O-N(R5)-C(S)-S--N(R5)-N(R5)--N(R5)-N(R5)-CH2--CH2-N(R5)-N(R5)--N＝C(NH2)-N(R5)--N(R5)-N＝C(NH2)--S(O)-CH2-O--O-CH2-S(O)--S-CH(R5)-O--O-CH(R5)-S--O-CH2-CH＝CH--S-CH2-CH＝CH--S-CH2-C＝C--N(R5)-CH2-N(R5)--N(R5)-C(O)-N(R5)--N(R5)-C(S)-N(R5)--N(R5)-C(O)-S--N(R5)-C(S)-S--N(R5)-C(S)-O--N(R5)-C(O)-O--O-C(O)-N(R5)--O-C(S)-N(R2)--S-C(O)-N(R5)--S-C(S)-N(R5)-R5為H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，低級烷基(1-7C)，Me，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，-(CH2)xF，其中“x”為1-7，“F”獨立為H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，Ph。另外，一個或多個共軛物殘基可以并連接到鏈上以便形成寡聚共軛物。適宜的共軛物殘基包括O-膽甾醇，聚乙二醇，氨基酸，嵌入物，間隔殘基(例如咪唑)，交聯(lián)功能基(例如補骨脂靈)，類酯，多肽，烷化劑，異羥肟酸酯，以及熒光標(biāo)記物。
特別優(yōu)選的4’-5’鏈包括磷酸二酯，磷酸硫代酯，甲基磷酸酯，氨基甲酸酯，硫代氨基甲酸酯，異羥肟酸酯，磺胺，羥胺和氨基甲酸酯。相同的修飾對于2’-5’和3’-5’鏈也是優(yōu)選的。
本發(fā)明的寡聚體不限于均鏈型的寡聚體，也包括2’，5’鏈交替變化或隨機(jī)分布性取代的鏈。由于本發(fā)明的寡聚體可以一次合成一個核單聚體殘基，所以每一個鏈，和/或取代鏈，以及每一個“堿基”取代基的性質(zhì)都可以獨立地選擇，以便生成具有期望的序列的寡核苷酸。
本發(fā)明的寡聚體可以含有任何期望數(shù)目的取代鏈。通過選擇包括其它非發(fā)明取代鏈的“V”的實例的功能可以使這些取代鏈相同或不同。由于寡聚體是逐步制備的，所以可以使用任何鏈或取代鏈的類型，可使用任何堿基和糖基的任何修飾。
本發(fā)明的優(yōu)選實例中，本發(fā)明的取代鏈按規(guī)定的模式交替。例如，一個取代鏈后面接兩個磷酸二酯鏈，然后接一個本發(fā)明的取代鏈等等。另外的實例包括，改變的鏈例如一個取代鏈后接一個磷酸二酯類似物(例如磷酸硫酯等等)，然后再接一個本發(fā)明的取代鏈，該取代鏈之后再接磷酸二酯類似物等等。即本發(fā)明的寡聚體可以由兩種類型的取代鏈一個一個地交替排列。由一種以上類型的鏈組成的本發(fā)明的寡聚體可以具有任何數(shù)目有規(guī)律的模式，這種模式是由存在于寡聚體的亞單位之間的不同類型的鏈交替排列形成的。
本發(fā)明的寡聚體中的一個或多個核單聚體殘基都可以進(jìn)行糖修飾，不過當(dāng)氨進(jìn)行這類修飾時，氨基酸殘基之間的4’-5’，3’-5’和2’-5’核苷酸鏈優(yōu)選。在這種情況下，可以使用進(jìn)一步的縮寫表示寡核苷酸類似物堿基序列。例如在標(biāo)準(zhǔn)DNA(或RNA)中一般僅用堿基表示序列，例如ATG，CGC，TGA。一般情況下事先都簡單說明到底這是表示RNA序列還是表示DNA序列。這里使用一套對應(yīng)的表述體系以便描述具有給定的堿基序列的寡核苷酸類似物。另外的核單聚體修飾除本發(fā)明的取代鏈外，本發(fā)明的寡聚體也可以包括不同的修飾。另外的修飾包括寡聚體中(I)在2’，3’，4’，和5’位對一個或多個核單聚體殘基進(jìn)行修飾，(ii)插入一個或多個共價交聯(lián)的殘基，(iii)包括其它非發(fā)明的取代鏈，(iv)包括其它堿基類似物，例如8-氧代-N6-甲基腺嘌呤，和(v)包括分別增強(qiáng)對靶性核酸序列結(jié)合率或增強(qiáng)寡聚體與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的嵌入劑或聚賴氨酸。
本發(fā)明的寡聚體的序列特異性聚核苷酸對單股或雙股靶的結(jié)合性質(zhì)與對寡聚體進(jìn)一步進(jìn)行修飾是一致的。這些進(jìn)一步的修飾也可以貢獻(xiàn)別的有用的性質(zhì)，例如對核苷酶裂解的穩(wěn)定性(例如在具有磷酸二酯鏈的本發(fā)明的寡聚體的一個區(qū)域內(nèi))，或增強(qiáng)它們的穿透細(xì)胞膜的能力，等等。
本發(fā)明的寡聚體可以包括一個或多個取代鏈，例如硫化物鏈或砜鏈(Bemer，S.A.，International Publication No.wo 89/12060)，Sulfamate鏈(International Publication No.wo 91/15500)，嗎啉代連接的寡聚體中的氨基甲酸酯或其它取代鏈(Stirchak，E.P.et al.，Nucleic Acids Res，1989，17，6129-6141；Summerton，J.et al.，International Pubhcation No.216860)以及有關(guān)的鏈。
這樣一來，本發(fā)明的寡聚體的例證性實例包括具有以下特點的寡聚體(1)有至少一個取代鏈和一個連接到相鄰的單聚體上的氨基酸，以及(2)有一個或多個非發(fā)明的取代鏈，這些取代鏈選自磷酸硫代酯，甲基磷酸酯和硫代甲基磷酸酯和/或(3)有一個或多個磷酸二酯鏈和/或(4)有可以增強(qiáng)對互補性靶序列結(jié)合率的嘌呤或嘧啶。其它例證性寡聚體包括(1)在3’和/或5’端有發(fā)明的取代鏈和其它部位有磷酸硫酯鏈的寡聚體；(2)具有本發(fā)明的取代鏈和標(biāo)準(zhǔn)嘌呤或嘧啶堿基(例如腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶)的寡聚體；(3)具有本發(fā)明的取代鏈和一個或多個可以增強(qiáng)寡聚體的結(jié)合率或滲透感受態(tài)的寡聚體(例如5-甲基胞嘧啶，5’-(1-丙炔基)尿嘧啶，5-(1-丙炔基)胸腺嘧啶)。還包括含經(jīng)由異羥肟酸酯連接的核單聚體殘基的寡聚體。寡聚體的合成本發(fā)明的寡聚體可以單獨使用本發(fā)明的核單聚體或與常規(guī)的核單聚體結(jié)合來形成，并使用標(biāo)準(zhǔn)的固相(或液相)寡聚體合成技術(shù)來合成，這些原料現(xiàn)在都可以買到。一般來說，本發(fā)明的寡聚體可以通過由下述步驟組成的方法合成合成具有保護(hù)基的核單聚體或寡聚體合成子、堿基以及能夠往核單聚體或寡聚體上偶聯(lián)的偶聯(lián)基；將核單聚體或寡聚體合成子偶聯(lián)到收受性核單聚體或收受性寡聚體上；去保護(hù)基；按需要重復(fù)這個循環(huán)直至合成出期待的寡聚體。
本發(fā)明的寡聚體可以是包括比40，50，100，200或500個核單聚體還大的任何長度的寡聚體。一般說來，優(yōu)選的寡聚體含2-30個核單聚體。只要具有適當(dāng)?shù)膲A基序列大于或等于大約8至20個核單聚體的長度對于治療或診斷應(yīng)用就有用。本發(fā)明特別包括含2，3，4，或5個核單聚體的短寡聚體并可用作合成子。
具有隨機(jī)序列并含大約6，7或8個核單聚體的寡聚體可以用作克隆中的引物或用作隨機(jī)序列引物中的糖增強(qiáng)本底，只要寡聚物在3’端含大約1個或2個殘基就可用作聚合酶或遞轉(zhuǎn)錄酶的引物或者否則分話不干擾聚合酶的活性。
除了這里首次描述的鏈以外，本發(fā)明的寡聚體可以包括常規(guī)磷酸二酯鏈或可以含有除本發(fā)明的取代鏈以外的氨基磷脂鏈一類的其它取代鏈。這些取代鏈包括但不限于下述實例，其中通式-O-P(O)(S)-O-(“磷酸硫代酯”)，-O-P(O)(NR2”)-X2，-O-P(O)(R”)-O-，-O-P(S)(R”)-O-(“硫代烷基磷酸酯”)，-P(O)(OR”)-X2，-O-C(O)-X2，或-O-C(O)(NR2”)-X2-的殘基中R11為H(或一種鹽)或烷基(1-12C，包括甲基和乙基)，R3為烷基(1-9C)，而且鏈通過與核單聚體的碳連接的-O-或-S-連接到相鄰核單聚體上，X為O或S。磷酸硫酯和磷酸二酯鏈?zhǔn)且阎?。本發(fā)明的寡聚體中使用的特別優(yōu)選的取代鏈包括磷酸二酯、磷酸硫酯、甲基磷酸酯和硫甲基磷酸酯取代鏈。磷酸硫酯和甲基磷酸酯取代鏈為必需是同一的寡聚體提供了附加的穩(wěn)定性，本發(fā)明的特別優(yōu)選的寡聚體含有一個或多個磷酸硫酯或甲基磷酸酯取代鏈。
本發(fā)明的寡聚體或它們的片段可以使用本專業(yè)的技術(shù)人員已知的方法合成。采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)核單聚體按照該領(lǐng)域和這里描述的合成方法可以用來合成本發(fā)明的含取代鏈的寡聚體以及文獻(xiàn)中已知的其它鏈或取代鏈。已經(jīng)合成了具有含亞磷鏈的寡聚體的方法，例如見于Froehler，B.，etal.，Nucleic Acids Res.，1986，14，5399-5467；Nucleic Acids Res.，1988，16，4831-4839；Nucleosides & Nucleotides，1987，6，287-291；Froehler，B.，Tetrahedron Letts.，1986，27，5575-5578；Caruthers，M.H.in Oligodeoxynucleotides Antisense Inhibitions of Gene Expression，1989，J.S.Cohen，editor，CRC Press，Boca Raton，p7-24； Reese，C.B.et al，Tetrahedron Letts.，1985，26，2245-2248。經(jīng)由甲基氨基磷酸酯化學(xué)合成甲基磷酸酯鏈連接的寡聚體的方法業(yè)已有描述(Agrawal，S.etal.，Tetrahedron Letts.，1987，28，3539-3542；Klem，R.E.，et al，International Publication Number WO 92/07864)。
含本發(fā)明的鏈的寡聚體也可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^用液相方法制備二聚體或三聚體化合物，接著通過固相或液相法將合成子轉(zhuǎn)變?yōu)椴迦氲焦丫垠w中的衍生物來合成。典型的合成子為5’DMT或MMT封鎖的3’磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物，它們可通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備。(見Gait，M.J.ed.，Oligonucleotide Synthesis；A Practical Approach 1984，IRL Press，Oxford)。
包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的合成子包括用固相法或液相法制備的二聚體，三聚體，四聚體，六聚體和更長的寡聚體。三聚體和更長的合成子可以含1個以上類型的鏈。這種合成子可以包括上面敘述過的任何堿基，或諸如前面描述的OH，DMTO，MMTO，O-烯丙基，磷酸酯，phosphonate或酰胺化物一類的2’，3’4，和5’基。
使用標(biāo)準(zhǔn)的固相多肽合成(Fmoc化學(xué))條件可以合成核糖-酰胺寡聚核苷酸(見圖26)。用于本發(fā)明化合物合成的封鎖基1.偶聯(lián)基適宜的偶聯(lián)基包括，例如H-磷酸酯，甲基磷酰胺(methylphosphonamidite)，或氨基磷酸酯。能夠使用的氨基磷酸酯包括β-氰乙基氨基磷酸酯(優(yōu)選)。也可以使用甲基磷酰胺，烷基磷酸胺(包括乙基磷酰胺和丙基磷酰胺)。例證性的氨基磷酸酯見于圖1至圖21。
經(jīng)過氨基磷酸三酯化學(xué)，這里稱為“氨基酯(amidite)”化學(xué)，在2’，3’，4’或5’位合成寡聚體的“偶聯(lián)基”包括N，N-二異丙基氨基-β-氰乙氧基膦，N，N-二異丙基氨基-甲氧基膦，N，N-二乙氨基-氰乙氧基膦和(N-嗎啉代)-甲氧基膦(Moore，M.F.et al，J Org Chem.，1985，50，2019-2025；Uznanski，A.W.，et al，Tetrahedron Letts.，1987，28，3401-3404； Bjergarde，K.，et al，Nucl Acids Res.，1991，19，5843-5850；Dahl，O.Sulfur Reporrs，1991，11，167-192)。也可以使用相關(guān)的偶聯(lián)基例如N，N-二異丙基-甲基膦或N，N-二乙氨基-甲基膦制備甲基磷酸酯。使用N，N-二異丙基氨基-甲基氨基磷酸酯一類的偶聯(lián)基可以適當(dāng)?shù)睾铣杉谆姿狨ス丫垠w?？梢杂贸Ｒ?guī)方法合成本發(fā)明的氨基酯核單聚體(例如Gryaznov，S.M.，et al，Nucl Acids Res.，1992，20，1879-1882；Vinayak，R.，et al，Nucl Acids Res.，1992，20，1265-1269；Sinha，N.D.，et al，Nucl Acids Res.，1984，12，4539-4557；以及這里引用的其它參考文獻(xiàn))。2.保護(hù)基可以使用諸如二異丁基甲咪，苯甲?；惗□；?，F(xiàn)MOC，二烷基甲咪，二烷基乙咪或文獻(xiàn)報道的其它基保護(hù)胞嘧啶，腺嘌呤，或鳥嘌呤雜環(huán)中的外向環(huán)氮。反過來胞苷可以使用描述的方法。不保護(hù)外向環(huán)氮直接插入寡聚體(Gryaznov，S.M.et al，J Amer Chem Soc.，1991，113，5876-5877；Gryaznov，S.M.et al，Nucl Acids Res.，1992，20，1879-1882；Kung，P.-P.et al，Tetrahedron Letts.，1992，33，5869-5872)。
5’端的適宜保護(hù)基為DMT(二甲氧基三苯甲基)，Bz(苯甲?；?，Bu(異丁?；?，苯氧乙酰基，MMT(單甲氧基三苯甲基)或FMOC和/或3’端的適宜保護(hù)基磷酸氫酯，甲基氨基磷酸酯，甲基磷酰胺，β-氰乙基氨基磷酸酯，TBS(叔丁基二甲基硅基)或TBDPS(叔丁基二苯基硅基)。
優(yōu)選的保護(hù)基為5’位的Bz(苯甲?；?，DMT(二甲氧基三苯甲基)，MMT(單甲氧基三苯甲基)或FMOC和/或3’位的TBS，磷酸氫酯，甲基氨基磷酸酯，甲基磷酰胺，β-氰乙基氨基磷酸酯。不過傾向于按照需要封鎖的位置可以反過來(例如5’位用氨基磷酸酯，3’位用MMT)。一般來說，本發(fā)明的核單聚體和寡聚體按照文獻(xiàn)已知方法可以衍生化為貼切通式中指出的“封鎖基”。共軛物本發(fā)明還提供了本發(fā)明的寡聚體的“共軛物”。常規(guī)的“共軛物”寡聚體為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。例如本發(fā)明的寡聚體可以共價鍵連接到各種殘基上，例如連接到嵌入劑和專屬性地與DNA雙螺旋的微溝相互作用的化合物上。與本發(fā)明的寡聚體共軛的其它殘基包括標(biāo)記物(例如放射性物質(zhì)，熒光性物質(zhì)，酶)或者可以促進(jìn)細(xì)胞使用間隔連接物連接的殘基等等。適宜的放射性標(biāo)記物包括32P，35S，3H，131I和14C，適宜的熒光標(biāo)記物包括熒光，試鹵靈，若丹明，BODIPY(分子探針)以及Texas紅；適宜的酶包括堿性磷酸酯酶和辣根過氧化酶。能用作共價鍵連接殘基的其它化合物包括生物素，抗體或抗體片段，亞西亞糖蛋白，鐵傳遞蛋白，HIV Tat蛋白也可以適宜地連接到本發(fā)明的寡聚體上。
這些額外的殘基可以通過任何適宜的殘基衍生化得到。例如吖啶或補骨脂靈一類的嵌入劑可以通過寡聚體端基5’位，RNA2’位的-OH基或-SH基連接到本發(fā)明的寡聚體上，或者通過-OH基，-NH2基，-COOH基或-SH插入到嘧啶的5位。例如嘧啶的5位含-CH2CH2CH2OH或-CH2CH2CH2SH的衍生化形態(tài)是適宜的。包含聚賴氨酸或賴氨酸的共軛物可以按照描述的那樣合成，而且可以進(jìn)一步增強(qiáng)寡聚體對它的靶性核酸序列的結(jié)合率。(Lemaitre，M.et al.，Proc Natl Acad Sci.USA，1987，84，648-652；Lemaiter，M.et al.，Nucleosides and Nucleotides，987，6，311-315)可以連接上廣泛的取代基，包括那些通過鏈或取代鏈連接的取代基，寡聚體中的OH基可以被磷酸酯基取代，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基保護(hù)，或通過偶聯(lián)基制備連到別的核單聚體上的另外的鏈，或能夠連接到共軛取代基上。5’端的OH基可以被磷酸酯化，2’-OH基或3’端的OH基取代基亦可以被磷酸酯化。羥基也可以被衍生化成標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基。
本發(fā)明的寡聚體可以通過共價鍵衍生化為使用隔離鏈促進(jìn)細(xì)胞締合的殘基。適宜的共軛物還包括寡聚體合成中的固相載體以便促進(jìn)核酸序列檢測。固相載體包括擔(dān)不限于硅膠，控孔玻璃，聚苯乙烯和磁玻璃珠。糖修飾通過糖上取代可以制備衍生物。本發(fā)明的寡聚體的優(yōu)選衍生物中2’-O-烯丙基或3’-烯丙基似乎可以增強(qiáng)滲透性和對核酸酶降解的穩(wěn)定性。但似乎不減小寡聚體對單鏈或雙鏈靶的親和力。尤其是在核糖-酰胺骨架寡核苷酸中可以在核糖殘基的1’，2’，3’，4’和5’位引入不同的功能基，以便改善對應(yīng)寡核苷酸的藥代動力學(xué)性質(zhì)。取代鏈除這里發(fā)明的2’-5’，3’-5’和4’-5’鏈外，本發(fā)明的寡聚體還可以含1個或多個在文獻(xiàn)中有報道的“取代鏈”。這些“取代鏈”包括磷酸硫酯，甲基磷酸酯，硫代甲基磷酸酯，磷酸二硫代酯，烷基磷酸酯，嗎啉代磺胺，硼代磷酸酯(-O-P(OCH3)(BH3)-O-)，硅氧烷(-O-Si(X4)(X4)-O-；X4為1-6C烷基或苯基)及氨基磷酸酯(甲氧乙胺(-O-P(OCH2CH2OCH3)(O)-O-等等)，這些”取代鏈“可以按照一般可以看到的文獻(xiàn)中描述的方法合成，所述文獻(xiàn)包括以下參考文獻(xiàn)(Sood，A.，et al，J.Am.Chem.Soc.，1990，112，9000-9001；WO 91/08213；WO90/15065；WO 91/15500；Stirchak，E.P.et al Nucleic Acid Res.，1989，17，6129-6141；U.S.Patent 5,034,506；U.S.Patent 5,142,047；Hewitt，J.M.et al，Nucleosides & Nucleotides，1992，11，1661-1666；Summerton，J.et al International Publication No.216 860)。可用于這里發(fā)明的寡聚體的取代鏈還包括磺酰胺(-O-SO2-NH-)，硫化物(-CH2-S-CH2)，砜(-O-SO2-CH2-)，氨基甲酸酯(-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-)，二甲基肼基(-NH-N-(CH3)-)，氨基磺酸酯(-O-S(O)(O)-N-；-N-S(O)(O)-N-)，3’-氨基(-NH-CH2-)，N-甲基羥胺(-CH2-NCH3-O-)和2’，5’鏈(例如2’，5’氨基甲酸酯(2’-N(H)-C(O)-O-5’)，5’，2’氨基甲酸酯(2’-O-C(O)-N(H)-5’)，5’，2’甲基氨基甲酸酯(2’-O-C(O)-N(CH3)-5’)和5’，2’硫代甲縮醛(2’-O-CH2-S-5’)。另外一些適宜的取代鏈包括酰胺鏈(Buchardt，D.et al，(International Publication No.WO 92/20702)和Cook.P.D.等描述的取代鏈(International Publication No.WO.92/20822)和De Mesmacker A.等描述的取代鏈(International Publication No.WO 92/20823)以及在PCT/US92/04294中描述的取代鏈。
只要不特別指明，象甲縮醛一類的取代鏈-O-CH2-O-，就是連接到左邊核單聚體的4’，3’，2’碳中的一個上并接到右邊核單聚體的5’碳上。當(dāng)核糖，去氧核糖或阿拉伯糖以外的結(jié)構(gòu)連接到相鄰的核單聚體上時，4’，3’，2’，或5’碳的標(biāo)號可被相應(yīng)地修飾。這類結(jié)構(gòu)包括木糖，己糖，嗎啉代環(huán)，碳環(huán)(例如環(huán)戊烷)等等。
已經(jīng)發(fā)表了氨基甲酸酯，碳酸酯，硫化物，亞砜，砜，N-甲基羥胺和二甲基肼基鏈在合成子或寡聚體中的應(yīng)用(Vaseur，J-J.et al，J.AmerChem Soc.，1992，114，4006-4007；WO 89/12060；Musicki，B.et al，JOrg Chem.，1990，55，4231-4233；Reynolds，R.C.etal.，J.Org.Chem.，1992，57，2983-2985；Mertes，M.P.，et al，J.Med.Chem.，1969，12，154-157；Mungall，W.S.，et al，J.Org.Chem.，1977，42，703-706；Stirchak，E.P.，et al，J.Org.Chem.，1987，52，4202-4206；Wang，H.，et al，Tetrahedron Letts.，1991，32，7385-7388；International ApplicationNo.PCT US 91/03680)。聚代鏈在寡聚體中可用于一系列目標(biāo)，例如進(jìn)一步促進(jìn)與互補靶性核酸序列的結(jié)合和/或增加寡聚體對核酸酶的穩(wěn)定性。堿基本發(fā)明的化合物中用作核苷堿基的適宜的堿基不僅包括天然的嘌呤和嘧啶堿基，還包括這些雜環(huán)堿基的類似物和它們的互變異構(gòu)體。這些類似物包括烷基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，或其它的雜環(huán)。這類“類似的嘌呤”和“類似的嘧啶”或嘌呤或嘧啶類似物是文獻(xiàn)已知的化合物，其中有些用作化療劑。一個實例清單，但不是全部例子的清單包括N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶，7-去氮黃苷，7-去氮鳥苷，8-氧代-甲基腺嘌呤，4-乙?；奏?，5-(羧羥甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-(1-丙炔基)-4-硫尿嘧啶，5-(1-丙炔基)-2-硫代尿嘧啶，5-(1-丙炔基)-2-硫代胞嘧啶，2-硫代胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。除這些堿基類似物外，嘧啶類似物包括6-氮雜胞嘧啶，6-氮雜胸苷和5-三氟甲基尿嘧啶(見于(Cook，D.P.，et al，International Publication No.WO 92/02258)，本文引作參考文獻(xiàn))也可以適宜地插入到本發(fā)明的寡聚體中。
已經(jīng)報道了將4-硫尿苷和2-硫代胸苷插入寡聚體(Nikiforov，T.T.et al，Tetrahedron Letts.，1992，33，2379-2382；Clivio，P.，et al，Tetrahedron Letts.，1992 3365-68；Nikiforov，T.T.，et al，Tetrahedron Letts.，1991 322505-2508；Xu，Y.-Z.，et al.Tetrahedron Letts.，1991 322817-2820；Clivio，P.，et al，TetrahedronLetts.，1992 3369-72；Connolly，B.A.，et al.，Nucl.Acids Res.，1989174957-4974)。優(yōu)選的堿基包括腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶，胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-(1-丙炔基)尿嘧啶，胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-(1-丙炔基)尿嘧啶，5-(1-丙炔基)胞嘧啶，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤，7-去氮雜-7-甲基鳥嘌呤，7-去氮雜-7-甲基腺嘌呤和7-去氮雜黃苷。共價鍵結(jié)合的殘基包括在本發(fā)明的寡聚體中的一些共價鍵結(jié)合的殘基是能夠在寡聚體和雙鏈間產(chǎn)生至少一根共價鍵的殘基。提供這類多重性的交聯(lián)基也可以形成多個共價鍵。雖然共價鍵最好接在靶鏈的堿基殘基上，但也可以形成在靶的其它部位，包括糖或磷酸二酯部分。影響交聯(lián)的殘基的反應(yīng)性質(zhì)決定雙鏈中的靶的性質(zhì)。優(yōu)選的交聯(lián)殘基包括?；瘎┖屯榛瘎矣绕浒切┒ㄎ挥谂c序列專屬性賦予部分有關(guān)的交聯(lián)基以便與鏈中的靶部位反應(yīng)。
很清楚，雜環(huán)不需要是嘌呤或嘧啶；連接有功能基的偽堿基確實根本不必要是雜環(huán)。只要定位正確便可以滿意于反應(yīng)功能基的任何連接途徑。寡聚體的極性在它們的最普遍的形式中，符號3’…5’表示寡聚體的一種伸展方式，在這種伸展中連接的鏈?zhǔn)冀K是在左邊的核單聚體的氨基酸殘基的5’-羥基與右邊核單聚體的氨基酸殘基3’羥基(或具有2’-5’鏈的寡聚體的2’-，或具有4’-5’鏈的4’-)之間形成(即唯一的極性區(qū)域)，從而保持右邊核單聚體的氨基酸殘基的5’-羥基游離并可用于另一個共軛。類似地，符號5’…3’表示寡聚體按相反方向的伸展，在這種伸展中，連接的鏈?zhǔn)冀K在左邊核單聚體的氨基酸殘基的3’羥基與右邊核單聚體的氨基酸殘基的5’-羥基之間形成，從而保持右邊核單聚體的3’-羥基游離并可用于另一個共軛。寡聚體的5’…4’伸展也確實是相同的情形。藥物上可以接受的鹽本發(fā)明還提供了這里發(fā)明的所有化合物的不同的鹽，包括給哺乳動物或人服用的藥物上可以接受的鹽。藥物上可以接受的鹽和生成這類鹽的物料為文獻(xiàn)已知。藥物上可以接受的鹽優(yōu)選為本發(fā)明的寡聚體的金屬鹽或銨鹽，并包括堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽；或者有利地包括來自氨或有機(jī)胺的容易結(jié)晶的銨鹽，例如單-，雙，或三-低級(烷基、環(huán)烷基、或羥烷基)-酰胺，低級的亞烷基二胺，或低級(羥烷基或芳烷基)-烷基季銨堿，例如甲胺，二乙胺，三乙胺，二環(huán)己基胺，三乙醇胺，亞乙基二胺，三-(羥甲基)-氨基乙烷或氫氧化芐基三乙胺。本發(fā)明的寡聚體可以形成酸加合的鹽，優(yōu)選為治療上可以接受的無機(jī)酸或有機(jī)酸的鹽，例如強(qiáng)礦酸的鹽，例如親水性的鹽酸或氫溴酸，硫酸，磷酸的鹽；親酯性的脂肪羧酸或芳香羧酸或磺酸鹽，例如甲酸，乙酸，丙酸，丁二酸，乙醇酸，乳酸，羥基丁二酸，酒石酸，葡糖酸，枸櫞酸，抗壞血酸，順丁烯二酸，反丁烯二酸，羥基順丁烯二酸，丙酮酸，苯乙酸，苯甲酸，4-氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸，4-羥基苯甲酸，水楊酸，4-氨基水楊酸，甲磺酸，乙磺酸，羥基乙磺酸，苯磺酸，對氨基苯磺酸，環(huán)己基氨基磺酸的鹽等等。應(yīng)用和給藥方式由于本發(fā)明的寡聚體明顯地有與單鏈或雙鏈靶核酸結(jié)合的能力，從而可與天然的多聚核苷酸及它們的結(jié)構(gòu)類似物形成雙鏈，三鏈或其它穩(wěn)定的締合，所以本發(fā)明的寡聚體可以用于使用常規(guī)寡聚體的大多數(shù)操作。這樣一來，本發(fā)明的寡聚體可以用作例如多聚核苷酸雜交探針，用作聚合酶的鏈反應(yīng)及類似的環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的引物，用作序列引物等等。本發(fā)明的寡聚體還可用于疾病的診斷和治療。本發(fā)明的寡聚體用于治療包括專屬性地抑制基因表達(dá)(或抑制由這些基因編碼的RNA序列的翻譯)，也就是通過使用反義寡聚體抑制或者與病理狀態(tài)的建立有關(guān)或者與病理狀態(tài)的維持有關(guān)的基因表達(dá)。本發(fā)明的寡聚體可用來介導(dǎo)大量基因靶的反義抑制。通過反義地使用這些寡聚體尋靶的例證性的基因或這些基因編碼的RNAS包括編碼酶，激素，血清蛋白，跨膜蛋白，粘附分子(LFA-1，GPIIb/IIIa，ELAM-1，VACM-1，ICAM-1，E-selection等等)，受體分子包括cytokine受體，cytokines(IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5等等)，致瘤物，生長因子，以及白細(xì)胞介素。靶基因或RNAS可以與任何病理狀態(tài)相關(guān)，例如與炎癥，心血管疾病，免疫反應(yīng)，癌，病毒感染，細(xì)菌感染，酵母感染，寄生蟲感染等等相關(guān)。
本發(fā)明的寡聚體適合于體內(nèi)和體外兩種治療應(yīng)用。用于半體外治療的適應(yīng)癥包括處理白血病(慢性骨髓性白血病，急性淋巴細(xì)胞性白血病)或病毒感染時骨髓或外周血液一類的細(xì)胞。由能夠作為癌癥治療的靶的這些基因編碼的靶基因或RNAS包括致癌物，例如ras，k-ras，bc1-2，c-mgb，bcr，c-myc，c-ab1或過度表達(dá)的序列，例如mdm2，制瘤素M，IL-6(kaposi’s肉瘤)，HER-2以及移位物例如bcr-ab1。由這些基因編碼的病毒基因序列或RNAS例如聚合酶或皰疹病毒基因的逆轉(zhuǎn)錄酶，例如CMV，HSV-1，HSV-2，逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-1，HIV-1，HIV-2或其它DNA或RNA病毒，例如HBV，HPV，VZV，流感病毒，腺病毒，黃素病毒，鼻病毒等等也是適宜的靶。使用專屬性結(jié)合的寡聚體時可以和別的治療劑共軛。本發(fā)明的寡聚體的其它治療應(yīng)用包括(1)通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)，例如調(diào)節(jié)IL-1受體，IL-1，ICAM-1或在介導(dǎo)炎癥中起重要作用的E-selection調(diào)節(jié)炎癥響應(yīng)，和(2)血管成形術(shù)后的調(diào)節(jié)例如血管成形術(shù)后發(fā)生的動脈堵塞(再狹窄)中的細(xì)胞增生，這是通過調(diào)節(jié)(a)生長因子或有絲分裂因子，例如非肌肌蛋白myc，fox，PCNA，PDGF或FGF或它們的受體的表達(dá)，(b)細(xì)胞增生因子例如c-myb的表達(dá)來實現(xiàn)的。其它適宜的增生因子或信號傳導(dǎo)因子，例如TGFx，IL-6，gINF，蛋白激酶C，酪氨酸激酶(例如p210，p190)可以考慮為牛皮癬或其它疾病的靶。此外，EGF受體，TGFa或MHC等位基因可以是自動免疫疾病的靶。
本發(fā)明的寡聚體釋放到細(xì)胞內(nèi)可以被任何適宜的方法增強(qiáng)，這些方法包括磷酸鈣，DMSO，甘油或右旋糖酐的轉(zhuǎn)運，electroporation或通過(International Publications NOS.WO 90/14074，WO 91/16024，WO91/17424，U.S.Patent 4,897,355)中描述的方法使用陽離子，陰離子和/或中性類脂組合物或脂質(zhì)體。寡聚物通過與陽離子型類脂類如與DOTMA形成復(fù)合物(可以形成脂質(zhì)體也可以不形成脂質(zhì)體)，這種復(fù)合物然后與細(xì)胞接觸，這樣使可將寡聚體攜入細(xì)胞。適宜的陽離子型類脂包括但不限于N-(2，3-二(9-(Z)-十八烯酰氧基))-丙-1-基-N，N，N-三甲銨(DOTMA)及它的鹽，1-O-油酰-2-O-油酰-3-二甲基氨基丙基-β-羥乙基銨及它的鹽和2，2-雙(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)丙烷及它的鹽。
通過使用(i)病毒，例如Sendai病毒(Bartzatt，R.，Biotechnol ApplBiochem.，1989，11，133-135)或腺病毒(wagner，E.et al.，Porc Natl Acad.Sci.USA，1992，89，6099-6013)；(ii)使用化合物例如聚賴氨酸，魚精蛋白或N12-雙(乙基)精胺的聚氨或聚陽離子共軛物(wagner，E.et al.，Porc NatlAcad.Sci.USA，1991，88，4255-4259；Zenke，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990，87，3655-3659；Chank，B.K.et al.，Biochem Biophys ResCommun.，1988，157，264-270；U.S.Patent 5,138,045)；(iii)用化合物類脂精氨形成的類脂聚胺復(fù)合物(Behr，J.-P.et al.，Proc Natl Acad Sci.USA，1989，86，6982-6986；Loeffler，J.P.et al.，J.Neurochem.，1990，54，1812-1815)；(iv)用化合物包括陰離子磷酸類脂例如磷脂酰甘油，心磷脂，磷脂酸或磷脂酰乙醇胺形成的陰離子型，中性或pH敏感的類脂(Lee，K.-D.etal.，Biochem Biophys ACTA，1992，1103，185-197；Cheddar，G.et al.，ArchBiochem Biophys，1992，294，188-192；Yoshimura，T.，et al.，Biochem Int.，1990，20，697-706)；(v)與諸如鐵傳遞蛋白或生物素一類的化合物的共軛物或(vi)可以增強(qiáng)目標(biāo)寡聚體的藥物動力學(xué)性質(zhì)的與蛋白(包括單寧白蛋白或抗體)，糖蛋白或高聚物(包括聚乙二醇)形成的共軛物。這里使用的轉(zhuǎn)運是指適合于寡聚體釋放到細(xì)胞中的任何方法。能用于轉(zhuǎn)運方案的任何化學(xué)試劑例如類脂式任何生物劑例如病毒，在這里集合地稱為“滲透增強(qiáng)劑”。寡聚體可以經(jīng)由與其它核酸例如與(i)編碼蛋白或蛋白片段的可表達(dá)的DNA片段(ii)編碼蛋白或蛋白片段的可轉(zhuǎn)錄RNAs共轉(zhuǎn)運釋放到細(xì)胞中。
本發(fā)明的寡聚體可以摻到能增強(qiáng)寡聚體釋放到細(xì)胞中的任何適宜的配方中。適宜的配方也包括普遍應(yīng)用的場合的配方，在這些應(yīng)用中局部給藥將化合物釋放到細(xì)胞或組織中。在含寡聚體的局部制劑中可以使用聚乙二醇，丙二醇，azone，nonoxony1-9，油酸，DMSO，聚胺或類脂聚胺等化合物。
在希望抑制基因表達(dá)的研究或生產(chǎn)目標(biāo)中可以適宜地使用本發(fā)明的寡聚體。目前僅可以得到極少的可以通過任何機(jī)制有效地并專屬性地抑制靶基因表達(dá)的試劑。以前已經(jīng)報道的可以抑制靶基因表達(dá)的寡聚體常常具有非專屬性和/或者不能將靶基因的表達(dá)降到很低的水平(低于非抑制水平約40％)。
這樣一來，這里描述的寡聚體構(gòu)成了可以用于抑制選擇性蛋白或目標(biāo)或細(xì)胞中的蛋白的方法，其中蛋白是由DNA序列編碼而且蛋白是由RNA序列翻譯的，該方法包括以下步驟將本發(fā)明的寡聚體導(dǎo)入細(xì)胞；允許寡聚體與DNA或RNA或雙鏈形成三鏈或與DNA或RNA形成雙鏈，由此抑制蛋白表達(dá)或抑制蛋白。本發(fā)明的方法和化合物適宜調(diào)控原核性和真核性兩種細(xì)胞中例如細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)。
使用本發(fā)明的取代鏈容易設(shè)計核糖核酸酶H“感受態(tài)”或核糖核酸酶H“非感受態(tài)”寡聚體。核糖核酸酶H的感受態(tài)寡聚體可以由一個或多個核糖核酸酶H感受態(tài)的區(qū)域組成，該區(qū)域由連接的核糖核酸酶H感受態(tài)核單聚體組成。修飾的寡聚體例如2’取代(2’-O-烯丙基等等)或一些未荷電的鏈(甲基磷酸酯，氨基磷酸酯等等)作為被核糖核酸酶H識別和/或作用的取代基通常是非感受態(tài)。通過降解RNA-寡聚體雙鏈中的靶RNA核糖核酸酶H的能力可以促進(jìn)反義寡聚體的功能(Dagle，J.M.et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，4751-4757；Walder，J.A.et al.，InternationalPublication Number.WO 89/05358)。該酶切斷RNA-DNA雙鏈中的RNA。
為了保留核糖核酸酶H的感受性，一種寡聚體需要三個或更多感受態(tài)的位于其中的鄰近核單聚體的核糖核酸酶感受態(tài)區(qū)域(Quartin，R.S.，etal.，Nucl.Acids Res.，1989，17，7253-7262)。設(shè)計的抗核酸酶分解的寡聚體應(yīng)具有端鏈，糖和/或堿基修飾以便產(chǎn)生抗核酸酶作用。這樣，設(shè)計寡聚體時可以使它的5’位或3’位或同時兩個位置同時具有修飾的核單聚體殘基，同時具有一個內(nèi)部的核糖核酸酶H感受態(tài)區(qū)域。保持核糖核酸酶H感受性的例證性寡聚體一般應(yīng)具有唯一的極性并應(yīng)在5’位和使寡聚體對核酸酶降解穩(wěn)定的3’位包含大約2至大約12個核單聚體，并在核糖核酸酶H的非感受態(tài)3’和5’端之間應(yīng)含作為核糖核酸酶H的感受態(tài)區(qū)域發(fā)揮功效的大約3個至大約26個核單聚體。這類寡聚體上的變化包含(1)由1或2個核糖核酸酶感受態(tài)鏈或取代鏈組成的一個較短的核糖核酸酶H感受態(tài)區(qū)域，(2)由多達(dá)15，20或更多取代鏈或核單聚體組成的一個較長的核糖核酸酶H非感受態(tài)區(qū)域，(3)由多達(dá)30，40或更多鏈組成的一個較長核糖核酸酶H感受態(tài)區(qū)域，(4)在3’端或5’端的僅具單一核糖核酸酶H非感受態(tài)區(qū)域的寡聚體。
通過與靶核酸序列形成雙鏈或三鏈結(jié)構(gòu)含少至8個核單聚體的寡聚體可用來影響靶蛋白的表達(dá)。不過經(jīng)由形成雙鏈或三鏈的用于抑制靶蛋白表達(dá)的寡聚體優(yōu)選具有大約10至大約20個核單聚體殘基。
含本發(fā)明的取代鏈的寡聚體可以按照所述的方法適宜地環(huán)化(International Publication No.WO 92/19732；Kool，E.T.J Am Chem Soc.1991，113，6265-6266；Prakash，G.et al.，J.Am Chem Soc.，1992，114.，3523-3527)。這類寡聚體適宜于結(jié)合到單鏈或雙鏈核酸靶上。環(huán)狀寡聚體可以是各種尺寸。尺寸在大約22-50個核單聚體的這類寡聚體能夠適宜地制備。如所述(Prakash，G.ibid)的那樣，這類環(huán)狀寡聚體的分離寡聚體結(jié)合區(qū)域的環(huán)區(qū)域含有大約3個至大約6個核單聚體殘基。通過配位酶或化學(xué)途徑經(jīng)由5’-和3’-端糖和/或堿基的鏈，寡聚體可以發(fā)生酶法環(huán)化。
該寡聚體可以通過抑制負(fù)責(zé)調(diào)控轉(zhuǎn)錄(Maher，L.J.，et al.，Science，1989，245，725-730)或翻譯的核酸結(jié)合蛋白的相互作用被用于調(diào)控靶基因表達(dá)。這樣一來，該寡聚體是與核酸結(jié)合蛋白(包括核糖體，RNA聚合酶，DNA聚合酶，翻譯的啟動子，或者增加或者減少轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，蛋白-激素轉(zhuǎn)錄因子等等)競爭的適宜的序列專屬性化合物。這樣，設(shè)計適當(dāng)?shù)墓丫垠w可以用于增加靶蛋白的合成，依賴的機(jī)制是結(jié)合到或接近到轉(zhuǎn)錄因子用來表現(xiàn)表達(dá)的的調(diào)節(jié)位點，或抑制選擇的受體蛋白本身的表達(dá)。
包括可以增強(qiáng)結(jié)合率的另外的修飾的本發(fā)明的寡聚體能夠設(shè)計含二級或三級結(jié)構(gòu)，例如含偽繩結(jié)或半偽繩結(jié)(pseudo-half-knots)結(jié)構(gòu)(Ecker，D.J.et al.，Science，1992，257，958-961)。與對應(yīng)的未修飾寡聚體相比，這類結(jié)構(gòu)具有更穩(wěn)定的二級或三級結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)的穩(wěn)定性有賴于單一寡聚體中的自身互補區(qū)域或形成給定結(jié)構(gòu)的兩個或多個寡聚體之間的互補區(qū)域之間結(jié)合率的增大。這類結(jié)構(gòu)能用來仿HIV TAR的結(jié)構(gòu)以便干擾HIV Tat蛋白(一種往TAR結(jié)合的蛋白)的結(jié)合。類似的途徑能用于其它轉(zhuǎn)錄或翻譯因子，這些因子識別更高級的核酸結(jié)構(gòu)例如柄結(jié)構(gòu)，環(huán)結(jié)構(gòu)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，繩結(jié)結(jié)構(gòu)等等。另外本發(fā)明的寡聚體能夠用于(1)破壞或(2)結(jié)合到這類結(jié)構(gòu)上，作為(1)干擾或(2)增強(qiáng)蛋白往核酸結(jié)構(gòu)上結(jié)合的一種方法。
除它們在反義或三股螺旋治療中的應(yīng)用外，本發(fā)明的寡聚體通過直接取代核酸雙鏈中的一條鏈亦可用作治療或診斷劑。取代天然雙鏈中的一根鏈，例如取代雜色體DNA或雙鏈病毒DNA，RNA或雜交DNA/RNA中的一根鏈對具有高結(jié)合率的寡聚體是可能的，由于它們的互補序列不足以有效地取代雙鏈中的DNA或RNA的一條鏈。通過D-環(huán)發(fā)生作用的寡聚體的療效源于對互補序列的高結(jié)合率，該互補序列介導(dǎo)了與核酸靶相聯(lián)系的正常生理功能。靶核酸的類型包括但不限于(i)包括外顯子、內(nèi)含子、外顯子/內(nèi)含子正常接合，啟動/強(qiáng)化區(qū)域和5’或3’非翻譯區(qū)域的基因序列，(ii)利用二級結(jié)構(gòu)以便生效的核酸區(qū)域(例如HIV TAR柄-環(huán)元素或tRNAs)，(iii)發(fā)揮結(jié)構(gòu)或其它功能的其它核酸，例如端粒染色體，著絲點或復(fù)制區(qū)域(病毒，細(xì)菌等等)，和(iv)任何其它雙鏈區(qū)域。很明顯，寡聚體能使用離散功能區(qū)合成，該區(qū)域中一種寡聚體的一個區(qū)域通過D-環(huán)結(jié)合到靶上，而相鄰的一個區(qū)域通過所說的形成三重螺旋結(jié)合到靶分子上或作為一個隔離物結(jié)合到蛋白上。另外，D-環(huán)狀的寡聚體能夠通過伸展寡聚體與之結(jié)合的鏈而與雙鏈中的每一條結(jié)合(即寡聚體的一個區(qū)域結(jié)合到一條鏈上，另一個區(qū)域結(jié)合到互補鏈上)。支配結(jié)合模式(即三重螺旋或D0環(huán))的控制元素是寡聚體的序列和建構(gòu)到寡聚體中的固有的親和力。Watson-Crick雙鏈結(jié)合堿基識別規(guī)則不同于Hoogsteen控制的三鏈結(jié)合規(guī)則。因為這個原因，寡聚體的堿基序列可以用于支配寡聚體將使用的結(jié)合規(guī)則的類型。在自然界中D-環(huán)結(jié)構(gòu)是通過酶介導(dǎo)的過程形成的(Harris，L D.et al.，J Biol Chem.，1987，262.，9285-9292)或與DNA發(fā)生復(fù)制的區(qū)域相聯(lián)系的(Jacobs，H.T.et al.，Nucl Acids Res，1989，17，8949-8966)。出現(xiàn)在寡聚體結(jié)合中的D-環(huán)可以來自一步過程或兩步過程。靶鏈的直接取代將通過單鏈結(jié)合事件產(chǎn)生D-環(huán)。不過，D-環(huán)也能通過形成三鏈螺旋出現(xiàn)，該三鏈螺旋促進(jìn)了導(dǎo)向D-環(huán)的鏈取代事件。
可以設(shè)計含有本發(fā)明的取代鏈的核糖酶以便設(shè)計特性改變了的類別。已經(jīng)描述了斷裂單鏈RNA或DNA的核糖酶(Roberson，D.L.，et al.，Nature，1990，344，467-468)。已經(jīng)假定了核糖酶在治療中的應(yīng)用(Sarver，N.et al.，Science，1990，247，1222-1225；International Publication Number WO91/04319)。設(shè)計適宜的寡聚體序列可以影響核糖酶功能必需的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)。例如，含有本發(fā)明的取代鏈的并具有核酸酶穩(wěn)定的靶區(qū)域的核糖酶對靶序列可以具有較高的結(jié)合率同時保持堿基配對的專屬性。由于本發(fā)明的取代鏈的較高的親和力和/或核酸酶的穩(wěn)定性可以設(shè)計核糖酶中的較短的識別區(qū)域(制備上有利)，這種設(shè)計可以導(dǎo)向更有利的底物轉(zhuǎn)換(有利于核糖酶的功能)。
在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的寡聚體可以按照合適的方式通過抑制適宜的靶基因的表達(dá)用于治療各種疾病。對于這類治療來說，寡聚體可以按各種給藥模式配方，給藥模式包括系統(tǒng)給藥，局部給藥或區(qū)域性給藥。配方技術(shù)和處方一般可以從Remington’s Pharmaceutical Sciences，MerckPublishing CO.，Easton，PA，最后一版中查到。寡聚體活性成分一般與載體結(jié)合，例如與稀釋劑或賦型劑結(jié)合，賦型劑可以包括填充劑，擴(kuò)散劑，粘合劑，保濕劑，崩解劑，表面活性劑，或潤滑劑，這取決于給藥模式的性質(zhì)和劑型。典型的劑型包括片劑，粉劑，液體劑包括懸浮劑，乳化劑和溶液劑，顆粒劑，膠囊劑和栓劑，以及用于注射的液體劑，包括脂質(zhì)體制劑。
對于系統(tǒng)給藥，注射為優(yōu)選，包括肌肉注射，靜脈注射，腹膜內(nèi)注射及皮下注射。對于注射給藥，本發(fā)明的寡聚體配方到液體溶液中，優(yōu)選配方到與生理上一致的緩沖溶液中，例如配方到Hank’s溶液中或Ringer’s溶液中。此外，寡聚體可以配方成固體形并在使用前再溶解或懸浮。也包括凍干劑型。能用于系統(tǒng)給藥的劑量優(yōu)選為從大約0.01mg/kg至50mg/kg，每天1次或2次。不過可以使用不同的劑量計劃，這取決于(i)抑制它的靶DNA或RNA活性的各寡聚體的強(qiáng)度，(ii)與給定的靶基因相關(guān)的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和程度，或(iii)給定的寡聚體的藥物動力學(xué)行為。
也可以通過轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)或透皮途徑系統(tǒng)給藥，或化合物可以口服。對于轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)給藥或透皮給藥，在配方時使用對被滲透的屏障的適宜的穿透力。這類穿透力一般為文獻(xiàn)已知并包括例如用于轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)給藥的膽鹽和羧鏈孢酸衍生物。此外可使用洗滌劑以便促進(jìn)滲透。轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)給藥例如可以通過鼻噴霧使用，或使用栓劑，對于口服給藥，寡聚體配方到適宜的口服給藥劑型中，例如配方到膠囊劑，片劑和舌下劑中。
對于局部給藥，本發(fā)明的寡聚體配方到散膏劑，油膏，凝膠和霜劑中，這些都是文獻(xiàn)已知的。用于眼部疾患例如病毒感染的本發(fā)明的寡聚體的配方應(yīng)以文獻(xiàn)已知的組合物為基礎(chǔ)。
除用于治療之外，本發(fā)明的寡聚體還可以用作診斷劑以便確定它們專屬性結(jié)合的核酸序列是否存在。本發(fā)明的寡聚體的增強(qiáng)的結(jié)合率有利于它們用作引物和探針。通過或者形成雙螺旋或者形成三螺旋的雜交可以完成診斷測定，形成的螺旋然后可以通過適當(dāng)?shù)耐緩酱_定。例如，寡聚體可以用放射標(biāo)記，熒光標(biāo)記或生色標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，而且可以測定結(jié)合到固相載體上標(biāo)記物的存在。另外，雙鏈或三鏈螺旋的存在可以通過專屬性識別這些螺旋的抗體來測定。使用這類寡聚體作為探針進(jìn)行檢測的途徑一般是已知的。
使用本發(fā)明的取代鏈通過形成三重螺旋作為診斷劑具有好處，由于三重螺旋在溫和的條件下形成，適當(dāng)進(jìn)行測定時無需將樣品置于過分苛刻的條件下。診斷檢測是以測定細(xì)菌，真菌或原生物的RNA序列的同一性為基礎(chǔ)的，常常需要從樣品中或?qū)嶒炇遗囵B(yǎng)的生物分離RNA，由于RNA對普遍存在的核酸酶極端敏感，該分離過程既費工又費時。
寡聚體探針也可以引進(jìn)另外的修飾，例如引入糖和/或取代鏈的修飾使寡聚體對核酸酶特別穩(wěn)定，這樣便可在正常含有核酸酶活性的細(xì)胞或組織的萃取液存在下進(jìn)行檢測。含端基修飾的寡聚體常常在不損失專屬性的情況下保持對互補序列的結(jié)合(Uhlmann et al.，Chemical Reviews，1990，90，543-584)。正如上面說的，通過在本發(fā)明的探針中引入容許與DNA的另一條鏈專屬性結(jié)合的連接物，那么本發(fā)明的探針也可以含這樣的連接物(Froehler，B.C.et al.，Biochemistry，1992，31，1603-1609；Horne etal.，J.Am.Chem.Soc.，1990，112，2435-2437)。
往也含有共價交聯(lián)劑的探針中引入本發(fā)明的堿基類似物有能力在診斷或檢測測定中增加敏感性并降低本底。此外，使用交聯(lián)劑將允許新的檢測革新，例如(1)使用交聯(lián)增加探針的分辨能力，(2)引入變性的洗滌步驟以便降低本底和(3)在雜交熔融溫度或接近雜交的熔融溫度進(jìn)行雜交和交聯(lián)以便減少靶中的二級結(jié)構(gòu)和增加探針的專屬性。以前曾敘述雜化條件的改進(jìn)(Gamper et al.，Nucleic Acids Res.，1986，14，9943)。
本發(fā)明的寡聚體適用于這里使用方法的診斷檢測，其中被檢測的或為寡聚體或為核酸按所述通過共價鍵連接到固相載體之上(U.S.Patent No.4,775,619)。寡聚體還適用于按照描述的方法可以放大靶序列的依賴于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的診斷檢測(European Patent Publication No.0393，744)。本發(fā)明的具有3’末端可作為引物的寡聚體可以和諸如Tag或VentTMjxhem(New England Biolabs)一類的聚合酶鏈反應(yīng)方法中使用的聚合酶兼容。這樣，本發(fā)明的寡聚體可以用作PCR操作中的引物。
本發(fā)明的寡聚體在不連續(xù)序列或隨機(jī)序列中可用作引物。隨機(jī)序列的引物一般有大約6，7或8個核寡聚體的長度。這種引物可用于各種核酸擴(kuò)增操作(PCR，連結(jié)酶鏈反應(yīng)等等)或用于克隆操作。本發(fā)明的取代鏈一般不干擾寡聚物作為引物發(fā)揮功能的能力。在3’端位殘基以外的位置具有2’位修飾的寡聚體，由于其它的修飾成為核糖核酸酶非感染態(tài)或不然的話對核酸酶穩(wěn)定，因而可以有利地用作細(xì)胞萃取液或含核酸酶的其它溶液中的RNA或DNA序列的探針或引物。因而寡聚體可用于樣品中的核酸擴(kuò)增操作，即將寡聚體與含靶核酸的樣品混合，接著將寡聚體與靶核酸雜交，并使用PCR，LCR或其它方法擴(kuò)增靶核酸。
衍化到螯合劑例如EDTA，DTPA或1，2-二氨基環(huán)己基乙酸上的寡聚體可以用于所述的各種體外診斷測定(U.S.Patent Nos，4,772,548，4,707,440和4,707,352)。另外，本發(fā)明的寡聚體能使用5-(3-碘代乙酰胺基丙-1-基)-2’-去氧尿苷或5-(3-(4-溴丁酰胺基)丙-1-基)-2’-去氧尿苷一類的交聯(lián)劑衍生化并用于所述的各種檢測方法和試劑盒(InternationalPublication No.WO 90/14353)。
除上面的應(yīng)用外，本發(fā)明的寡聚體抑制基因表達(dá)的能力可以通過使用合適的方法測定細(xì)胞或重組體系中的表達(dá)水平而進(jìn)行體外核實(Graessmann，M.et al.，Nucleic Acids Res.，1991，19，53-59)。
上面描述的本發(fā)明通過現(xiàn)用下述實施例更好地進(jìn)行解釋。這些實施例僅用來解釋本發(fā)明而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。
實施例合成核單聚體合成子和寡聚體的綜述寡聚體本發(fā)明的寡聚體可以使用文獻(xiàn)中合成寡核苷酸衍生物的已知反應(yīng)進(jìn)行合成。例如見于Flandor，J.懊惱Yam，S.Y.，Tetrahedron Letts.，1990，31，597-600；Mattson，R.J.et al.，J Org Chem.，1990，55，2552-2554；Chung，C.K.et al.，J Org Chem.，1989，54，2767-2769。
如同從表1中列出的各種特殊的取代鏈中可以看出的那樣，本發(fā)明的取代鏈可以變化以便在它們的結(jié)構(gòu)中含1個或多個氮，硫和/或氧原子。取代鏈中的這些原子的位置可以從5’位變至“中”位，變至2’位或3’位和4’位。本部分?jǐn)⑹隽艘幌盗斜硎龊铣煞磻?yīng)圖，這些合成反應(yīng)圖提供了其中含不同部位和不同組合的氮和氧原子的取代鏈的合成路線。
圖1-25描述的合成可以按寡核苷酸化學(xué)領(lǐng)域里已知的實踐進(jìn)行修改。例如雖然合成圖中并未總是指出堿基的保護(hù)，但這類保護(hù)可以是期待的，并能夠使用文獻(xiàn)中已知的試劑和技術(shù)完成保護(hù)，(例如見于Protective Groups in Organic Synthesis，Theodora W.Greene，John Wileyand Sons，1981)。類似地雖然在一些場合表明使用了保護(hù)基，但為了合成例證性的本發(fā)明寡聚物，并非總需要封鎖反應(yīng)物。
實施例1圖1中的頭5步反應(yīng)是關(guān)于制備異丁?；Ｗo(hù)的氨基酸醇，絲氨醇。圖1中的第6步和后面的反應(yīng)是合成絲氨醇取代的胸腺嘧啶氨基磷酸酯建筑塊。
在圖1的第1步中，絲氨酸的氨基通過1與酸式碳酸二叔丁酯反應(yīng)生成化合物2進(jìn)行保護(hù)。也可使用其它等價的保護(hù)基。下一步，化合物2的β-羥基用二氫吡喃封鎖，得到完全保護(hù)的氨基酸3。氨基酸3然后與二硼烷-二甲硫醚復(fù)合物反應(yīng)，得到醇4，4與異丁酰氯反應(yīng)生成5。這步還原反應(yīng)也可以用氯甲酸異丁酯和硼氫化鈉進(jìn)行(見K.Ramasamy，R.K.Olsen and T.Emery，Synthesis，1982，427。5與三氟乙酸反應(yīng)3。分鐘，然后用NaHCO3洗滌，得到6。
胸腺嘧啶乙酸7按照文獻(xiàn)制備(見L.Kosynkina，W.Wang and T.C.Liang，Tetrahedron Letts，1994，35，5173)。在混合酸酐條件下7和6偶聯(lián)，得到8。8用DMTCl進(jìn)行二甲氧基三苯甲基化得到9，9在堿中水解得到10。10在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行Phophysitylation得到絲氨醇偶聯(lián)的胸腺嘧啶建筑塊11。該合成子然后可以通過常規(guī)的化學(xué)方法加到生長的寡聚體中。任何DNA合成化學(xué)，例如氨基磷酸酯化學(xué)或磷酸酯化學(xué)均可用于按類似于前面闡明的方式連接單聚體或二聚體。
實施例2在反應(yīng)圖2中，通過胸腺嘧啶與溴乙醛二甲縮醛反應(yīng)，生成的12用TFA水溶液水解制得胸腺嘧啶乙醛13。按照與圖1中使用的類似的步驟將醛13和胺及6偶聯(lián)，生成的對應(yīng)中間體然后轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨ソㄖK17。
實施例3在反應(yīng)圖3中，起始原料為β-取代的氨基酸18。按照圖1和圖2中使用的步驟，該取代氨基酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨ソㄖK27。
實施例4在圖4中，原料氨基醇21用CrO3/吡啶混合物氧化，得到醛28。在堿存在下該醛與鹵代烷反應(yīng)，生成化合物29。然后氨基醇29按照圖1和圖2使用的類似步驟轉(zhuǎn)化為建筑塊35。
實施例5注意圖5，頭4步基本與圖1的步驟相同，在這里天門冬氨酸代替絲氨酸用作原料。由天門冬氨酸甲酯36制得完全保護(hù)的醇40，40用乙酸選擇性脫保護(hù)得到41。41用CrO3/吡啶氧化，得到對應(yīng)的醛42，醛42在三乙酰氧基硼氫化鈉存在下用O-芐基羥胺進(jìn)行還原性氨化，得到43(見T.Kolasa and M.J.Miller，J.Org.Chem.，1990，55，1711)。采用基本與上面敘述的相同反應(yīng)條件，但使用烯丙基保護(hù)基保護(hù)39的羥基，使醇39轉(zhuǎn)變?yōu)槿?6。在三乙酰氧基硼氫化鈉的存在下醛46和羥胺43偶聯(lián)，接著脫去氨基的保護(hù)基得到雙胺48。按照圖1的步驟，該雙胺48可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w53。
實施例6圖6中，在Mitsunobu反應(yīng)條件下(見O.Mitsunobu，Synthesis，1981，1)醇54與O-芐基羥胺55偶聯(lián)得到化合物56。該中間體56氫化之后再乙?；?，得到57。57用TFA去除”TBDMSi”保護(hù)基得到58。58與7偶聯(lián)之后二甲氧基三苯甲基化得到60。60用堿水解后再亞磷酸酯化，得到終建筑塊62。
實施例7在圖7中，絲氨醇4轉(zhuǎn)變?yōu)辂u化物59并用胸腺嘧啶烷基化，得到63。脫去63中的保護(hù)基，與DMT-保護(hù)的羥基乙酸偶聯(lián)并亞磷酸酯化得到66。
實施例8在圖8中，醇64與N-羥基氨基丙酸69偶聯(lián)得到70。胸腺嘧啶用鹵化物73烷基化得到74，74脫保護(hù)并與76偶聯(lián)后水解得到78。78與70縮合，然后亞磷酸酯化得到異羥肟酸酯二聚體80。
實施例9在圖9中，用N-羥氨基丙酸醛81與醇64偶聯(lián)。按照圖8中的類似步驟從83和86制備二聚體88。
實施例10在圖10中，α-溴代-β-氨基丙酸甲酯89用胸腺嘧啶烷基化(見T.Kolasa and M.J.Miller，J.Org.Chem.，1990，55，4246)得到90。中間體90用氫氧化鈉水解得到酸91，再與6偶聯(lián)得到92。用圖1中描述的步驟，然后可將化合物92轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨ソㄖK95。
實施例11在圖11中，胸腺嘧啶用鹵代烷基胺烷基化(見R.K.Olsen，K.Ramasamyand T.Emery，J.Org.Chem.，1984，49，3527和Islam et al.，J.Med.Chem.，1994，37，293-304制備氨基鹵代烷)得到97。97與TFA反應(yīng)，然后烷基化得到100。100進(jìn)行二甲氧基三苯甲基化，水解，然后亞磷酸酯化得到建筑塊103。
實施例12圖12是由N-羥胺43和由天門冬氨酸制備的醛107制備異羥肟酸酯骨架二聚體111的另一條路線。
實施例13在圖13中按照圖2中描述的相同的反應(yīng)步驟由中間體108和13制備二聚體115。
實施例14在圖14中，制備N-羥基胸腺嘧啶(見Kim，CU.，et al.，TetrahedronLetts.，1992，33，25-28)并與N-羥基鄰苯二甲酰亞胺偶聯(lián)，得到117后在乙醇中與肼反應(yīng)得到118。118與DMT-保護(hù)的甘氨醇環(huán)氧化物119反應(yīng)得到120。采用標(biāo)準(zhǔn)的方法將中間體120轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨?21。在第二個合成中，化合物118與氨基酸醛122在還原性胺化條件下偶聯(lián)，得到123。用FMOCCl保護(hù)的第二氨基水解后得到125。
實施例15在圖15中，1，2-二羥基丙酸126與N-羥胺胸腺嘧啶118偶聯(lián)得到127，在標(biāo)準(zhǔn)條件下將127轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨ズ铣勺?29?；衔?18還與己二酸偶聯(lián)并轉(zhuǎn)變?yōu)楹怂峤ㄖK133。
實施例16在圖16中，首先按照圖1中描述的類似方法由118和134合成建筑塊136。139與118偶聯(lián)得到140。137與118反應(yīng)得到138，138與140縮合，得到二聚體141。
實施例17在圖17中，醛142與甘氨酸芐酯偶聯(lián)得143。143與7反應(yīng)得到145，145與乙酸反應(yīng)得到148。148用Boc-NH-O-乙酰羥胺進(jìn)行Mitsunobu烷基化得到147，147氫化得到建筑塊150。143與13進(jìn)行類似的偶聯(lián)，然后進(jìn)行與上面相同的反應(yīng)，得合成子149。
實施例18在圖18中，醛142和Boc-NH-O-芐基羥胺進(jìn)行還原胺化，得到151。151氫化得到152，然后用乙醇酸153?；?B.C.Borer andD.C.Balogh，Tetrahedron Letts.，1991，32，1039)得到154。154與TFA反應(yīng)除去Boc保護(hù)基并偶聯(lián)后得到155。155的羥基保護(hù)基用乙酸選擇性脫保護(hù)得到156。采用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件化合物156轉(zhuǎn)變?yōu)榻ㄖK157。類似地，按照制備157的步驟154與13偶聯(lián)可以制得建筑塊158。
實施例19在圖19中，胸腺嘧啶-N-羥胺160用醇162烷基化得163。按照圖1中的反應(yīng)步驟，化合物163轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨ソㄖK166。
實施例20在圖20中，首先使用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件由谷氨酸合成中間體169。胸腺嘧啶用169烷基化得到170，170與TFA反應(yīng)得到171。中間體171與Boc-甘氨酸偶聯(lián)得到173，水解后得到單聚體合成子174。類似地，118與Boc-氨基乙酸醛偶聯(lián)然后水解得到的芐酯得到172。
實施例21在圖21中，使用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件由Boc-NH-O-芐基羥胺和175制備中間體177。177氫化之后與N-羥基胸腺嘧啶116偶聯(lián)，得到178。脫去THP保護(hù)基，然后經(jīng)二甲氧基三苯甲基化和亞磷酸酯化之后，得到建筑塊合成子181。類似地，按照上述反應(yīng)，用THP-羥基乙酸醛代替THP-羥基乙酸可制得182。
實施例22在圖22中，使用已知原料183按照圖22底部指明的反應(yīng)條件制備建筑塊191。
實施例23在圖23中，使用原料183，按照圖23底部指明的反應(yīng)條件制備建筑塊199。
實施例24在圖24中，按照圖24底部指明的反應(yīng)條件，將原料200轉(zhuǎn)變?yōu)榻ㄖK207。
實施例25本實施例中使用的和生成的化合物見圖1。
胸腺嘧啶乙酸(1)胸腺嘧啶(37.8g，300mmol)溶于氫氧化鉀(64.5g，1150mmol)與200ml水的溶液中。當(dāng)該溶液于40℃水浴上溫?zé)釙r，加入溴乙酸(62.5g，450mmol)與100ml水的溶液，歷時1小時。在該溫度下反應(yīng)混合物再攪拌1小時。冷卻至室溫，用濃鹽酸調(diào)pH至5.5。然后溶液在冰箱中冷卻2小時。過濾除去生成的任何沉淀(未反應(yīng)的胸腺嘧啶)。濾液用濃鹽酸調(diào)pH至2，冰凍2小時。過濾收集白色沉淀，40℃真空干燥6小時。產(chǎn)量為44g(88％)。
N-Boc-L-絲氨酸甲酯(2)室溫下將L-絲氨酸甲酯(15.6g，100mmol)懸浮于THF/DMF(各100ml)混合物中。攪拌下往該混合物中加三乙胺(11.13g，110mmol)，接著加酸式碳酸二異丁酯(24.0g，110mmol)，繼續(xù)于室溫下攪拌30分鐘。加水(20ml)，溶液室溫攪拌8小時。溶液蒸發(fā)至干。殘留物懸浮于乙酸乙酯(250ml)并用硫酸氫鉀(0.25N溶液，100ml)處理。產(chǎn)物立即用乙酸乙酯溶液萃取。有機(jī)萃取液用水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(100ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到油狀殘留物26g(90％)。
N-Boc-L-絲氨酸(OTHP)甲酯(3)化合物2(15g，68.49mmol)溶于無水CH2Cl2(100ml)中，并與3，4-二氫-2H-吡喃(8.4g，100mmol)和催化量對甲苯磺酸(100mg)室溫反應(yīng)。反應(yīng)混合物室溫攪拌12小時并蒸發(fā)至干。殘留物溶于乙酸乙酯(200ml)，用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(50ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干。殘留物的純度足以用于下步反應(yīng)。產(chǎn)量15g(72％)。
N-Boc-L-絲氨醇(OTHP)(4)在氬氣保護(hù)下，絲氨酸(OTHP)甲酯(10g，33mmol)溶于無水THF(100ml)并用冰浴冷至0℃。0℃攪拌下往該冰凍溶液中加硼烷-甲硫醚絡(luò)合物(2M THF溶液，100ml，200mmol)，歷時1小時。加完硼烷后，反應(yīng)混合物升溫至室溫并于40℃加熱6小時。反應(yīng)混合物冷至0℃，用水和乙酸中和至pH6-7，用乙醚(3×100ml)萃取。乙醚萃取液用水(2×100ml)洗滌，飽和食鹽水(100ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干得到油狀粗產(chǎn)品。該油狀物用閃式硅膠層析純化，用己烷→丙酮洗脫，得到8g(88％)純產(chǎn)物。
N-Boc-L-絲氨酸(OTHP)O異丁酸酯(5)化合物4(8g，29.09mmol)與無水CH2Cl2(100ml)的溶液攪拌并于0℃加TEA(3.54g，35mmol)，然后加異丁酰氯(3.71g，35mmol)，歷時30分鐘。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌4小時并蒸發(fā)至干。殘留物溶于乙酸乙酯(200ml)，用5％NaHCO3溶液(50ml)洗滌，水(50ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干得到油狀粗產(chǎn)品。該油狀物用閃式硅膠層析純化，用己烷→丙酮洗脫，得到7.9g(79％)純產(chǎn)物。
L-絲氨醇(O異丁酸酯)(6)化合物5(10g，28.98mmol)溶于CH2Cl2(100ml)中，室溫下與TFA(50ml)攪拌1小時，蒸發(fā)至干。殘留物溶于甲醇(50ml)中并再蒸發(fā)。殘留物溶于CH2Cl2(200ml)中，用飽和NaHCO3溶液(2×100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到4.5g(96％)油狀產(chǎn)物。
N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-絲氨醇(O異丁酸酯)(8)胸腺嘧啶乙酸7(7.3g，40mmol)和N-甲基嗎啉(4.4ml，40mmol)溶于100ml DMF中。在氬氣保護(hù)下將溶液冷至-20℃。攪拌下往該冰冷溶液中一次加氯代甲酸異丁酯(5.2ml，40mmol)。15分鐘后加入化合物6(6.44g，40mmol)與30ml DMF(冷至相同溫度)的溶液。反應(yīng)混合物于-20℃攪拌30分鐘，升溫至室溫，繼續(xù)攪拌1小時，反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，殘留物溶于CH2Cl2(200ml)中，有機(jī)溶液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到泡泡糖狀粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，得到12g(92％)純產(chǎn)物。
4，4-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙?；?-L-絲氨醇(O異丁酸酯)(9)化合物8(10g，30.58mmol)與無水吡啶(3×50mmol)共蒸，然后溶于無水吡啶(100ml)中。在室溫和氬氣保護(hù)下往該溶液中加TEA(3.54g，35mmol)，接著加DMTCl(11.83g，35mmol)。反應(yīng)混合物攪拌12小時，用甲醇(20ml)淬火并攪拌30分鐘。溶液蒸發(fā)至干并溶于CH2Cl2(200ml)。有機(jī)萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。CH2Cl2層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到泡泡糖狀粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，得到17g(88％)純產(chǎn)物。
1-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-L-丙基-1，3-二醇(10)化合物9(10g，15.89mmol)溶于甲醇(20ml)中。0℃下往該溶液中加1N NaOH溶液(20ml，20mmol)。反應(yīng)混合物攪拌1小時后用乙酸淬火至pH7。溶液用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。有機(jī)萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到泡泡糖狀粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷-丙酮洗脫，得到8.2g(92％)純產(chǎn)物。
1’-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙?；?〕-L-丙-3’-O-(N，N-二異丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(11)化合物10(8.00g，14.31mmol)與無水吡啶(3×50ml)共蒸發(fā)，然后在氫氧化鈉固體上真空干燥過夜。該干物料溶于無水CH2Cl2(100ml)并在氬氣保護(hù)下冷至0℃。在氬氣保護(hù)下往該冰冷溶液中加N，N-二異丙基乙胺(5.23g，25mmol)，然后加2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代氨基磷酸酯(4.72g，20.00mmol)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌1小時，再在室溫攪拌1小時。反應(yīng)混合物用CH2Cl2(100ml)稀釋。該CH2Cl2溶液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。該CH2Cl2層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到泡泡糖狀粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的丙酮洗脫，得到10g(x％)純產(chǎn)物。該泡泡糖狀物在NaOH固體上真空干燥過夜。該泡泡糖狀產(chǎn)品溶于CH2Cl2(15ml)中并在氬氣保護(hù)下于1小時內(nèi)滴入攪拌的無水己烷(2000ml)中。加完CH2Cl2溶液后生成的沉淀再攪拌1小時并過濾，用無水己烷(200ml)洗滌，在固體NaOH上干燥過夜。產(chǎn)量9.5g(87％)。
實施例26(見圖23)N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨酸(2)室溫下將O-芐基-L-絲氨酸1(10g，51.28mmol)懸浮在THF/H2O(8∶2，100ml)混合物中。往該攪拌的混合物中加三乙胺(6.06g，60mmol)，然后加酸式碳酸二叔丁酯(13.08g，60mmol)，反應(yīng)混合物繼續(xù)在室溫攪拌過夜。均相溶液蒸發(fā)至干，殘留物溶于乙酸乙酯(300ml)中。有機(jī)萃取液用0.5N KHSO4溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到14g(93％)油狀殘留物。
N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨醇(3)N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨酸2(6.0g，20.34mmol)溶于無水THF中，然后在氬氣保護(hù)下冷至-20℃。攪拌下往該冷溶液中加TEA(2.32g，23mmol)及氯代甲酸異丁酯(3.13g，23mmol)。在氬氣保護(hù)下和-20℃下繼續(xù)攪拌30分鐘，反應(yīng)混合物在氬氣保護(hù)下立即過濾，沉淀用無水THF(50ml)洗滌。合并的濾液緩慢地加到冷的(0℃)NaBH4(7.4g，200mmol)與THF/水(80∶20，200ml)的溶液中，歷時10分鐘。加完后，反應(yīng)混合物在0℃攪拌2小時，并用乙酸調(diào)pH至7，溶液蒸發(fā)至干。在乙酸乙酯/水(300∶150ml)間分配，并萃入乙酸乙酯中。有機(jī)萃取液用飽和食鹽水(100ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，純餾分傾到一起，蒸發(fā)至干，得到4.7g(82％)純油狀產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)δ1.41(s，9H，Boc)，3.60-3.70(m，4H)，3.82(d，2H)，4.53(s，2H，OCH2Ph)，5.20(bs，1H，NH) and7.30-7.40(m，5H，Ph).
N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨醇-O-異丁酸酯(4)室溫下往N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨醇3(4.3g，14.3mmol)于無水吡啶(50ml)的無水溶液中加TEA(2.02g，20mmol)。攪拌下往該溶液中加異丁酸酐(3.16g，20mmol)，并在氬氣保護(hù)下繼續(xù)攪拌過夜。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，在乙酸乙酯(100ml)和NaHCO3(5％溶液，100ml)之間分配，并萃入乙酸乙酯中。有機(jī)萃取液用水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，干燥后的溶液蒸發(fā)至干，得到粗殘留物。該殘留物用閃式硅膠色譜純化，用己烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)至干，得到4.5g(84％)純油狀產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)δ1.04(d，6H，IbCH3)，
1.39(s，9H，Boc)，2.46(m，1H，IbCH)，3.40(m，2H)，3.92(m，2H)，4.12(m，1H)，4.46(s，2H，OCH2Ph)，6.84(d，1H，NH)and7.24-7.40(m，5H，Ph).
N-(胸腺嘧啶乙酰基)-O-芐基-L-絲氨醇-O-異丁酸酯(6)N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-L-絲氨醇-O-異丁酸酯4(4.3g，12mmol)，三氟乙酸(20ml)和CH2Cl2(20ml)在室溫下攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物蒸干，殘留物溶于CH3OH(10ml)，再蒸發(fā)至干。殘留物在固體KOH上真空干燥12小時。該干殘留物不經(jīng)鑒定，直接用于后面的反應(yīng)。
胸腺嘧啶乙酸5(2.76g，15mmol)溶于無水DMF(75ml)并在氬氣保護(hù)下冷至-20℃。攪拌下往該冷卻的溶液中加N-甲基嗎啉(1.72g，17mmol)后再加氯代甲酸異丁酯(2.31g，17mmol)。攪拌15分鐘后，上面的TFA鹽與無水DMF(50ml)的溶液用N-甲基嗎啉(1.72g，17mmol)中和并立即加到攪拌著的冷的胸腺嘧啶乙酸中。反應(yīng)混合物在-20℃攪拌1小時后升溫至室溫并繼續(xù)攪拌過夜。反應(yīng)溶液蒸發(fā)至干，殘留物溶在CH2Cl2(250ml)和水(100ml)中并萃入CH2Cl2中。有機(jī)萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。CH2Cl2萃取液干燥，蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，收集必需的餾分，蒸發(fā)，得到4.8g(94％)純產(chǎn)物。該純產(chǎn)物用CH2Cl2/己烷重結(jié)晶。mp122-124℃1HNMR(CDCl3)δ1.04(d，6H，IbCH3)，1.72(s，3H，CH3)，2.44(m，1H，IbCH)，3.42(m，2H)，4.06(m，2H)，4.18(m，1H)，4.30(s，2H)，4.46(s，2H，OCH2Ph)，7.24-7.40(m，6H，C6H and Ph)，8.22(d，1H，NH)and 11.22(s，1H，NH).
N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-絲氨醇-O-異丁酸酯(7)將N-(胸腺嘧啶乙?；?-O-芐基-L-絲氨醇-O-異丁酸酯6(2.08g，5mmol)溶于乙醇(50ml)中。室溫下往該溶液中加Pd(OH)2(0.6g)和環(huán)己烯(5ml)。反應(yīng)混合物在70℃加熱12小時。濾去催化劑，并用甲醇(20ml)洗滌。濾液蒸發(fā)至干，得到白色固體。該白色固體溶于少量甲醇中并冷至室溫。結(jié)晶性的產(chǎn)物為細(xì)粉。mp196-198℃。收率1.48g(91％)1HNMR(Me2SO-d5)δ1.04(d，
6H，IbCH3)，1.72(s，3H，CH3)，2.42(m，1H，IbCH)，3.40(m，2H)，3.94(m，2H)，4.06(m，1H)，4.23(s，2H)，4.90(t，1H，OH)，7.20(s，1H，C6H)，8.12(d，1H，NH)and 11.22(s，1H，NH).
4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙?；?-L-絲氨醇-O-異丁酸酯(8)在氬氣保護(hù)下將N-(胸腺嘧啶乙?；?-L-絲氨醇-O-異丁酸酯7(1.48g，4.5mmol)溶于無水吡啶(50ml)。攪拌下往該溶液中加TEA(0.51g，5mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(0.10g)。10分鐘后加氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(1.69g，5mmol)，并繼續(xù)在氬氣保護(hù)下于室溫攪拌過夜。反應(yīng)混合物用甲醇(10ml)淬火，攪拌10分鐘，蒸發(fā)至干。殘留物溶于乙酸乙酯(200ml)，用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到2.5g(88％)泡泡糖狀純產(chǎn)物。
1HNMR(CDClδ1.4(d，6H，IbCH3)，1.72(s，3H，CH3)，2.40(m，1H，IbCH)，3.38(m，2H)，3.72(s，6H，2.OCH3)，4.12(m，2H)，4.20(m，1H)，4.32(d，2H)，6.84(m，4H，Ph)，7.20-7.40(m，12H，C6H and Ph)，8.30(d，1H，NH)and 11.28(s，1H，NH).
1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙?；?〕-L-丙基-1，3-二醇(9)4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙?；?-L-絲氨醇-O-異丁酸酯8(3.4g，5.41mmol)溶在甲醇(30ml)中，并用冰浴冷至0℃。攪拌下往該冷溶液中加2N NaOH溶液(10ml，20mmol)，再于0℃攪拌30分鐘。用乙酸調(diào)溶液的pH至7并蒸發(fā)至干。殘留物在水(50ml)和CH2Cl2(150ml)之間分配，并萃入CH2Cl2中，水層再用CH2Cl2萃取(50ml)萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和食鹽水(50ml)洗滌。干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，得到3.0g(99％)產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)1.72(s，3H，CH3)，3.0(m，2H)，3.42(m，2H)，3.72(s，6H，2.OCH3)，3.94(m，1H)，4.32(d，2H)，4.68(m，1H，OH)，6.84(m，4H，Ph)，7.20-7.40(m，12H，C6H and Ph)，8.06(d，1H，NH) and 11.28(bs，1H，NH).
1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙?；?〕-L-丙基-3-O-(N，N-二異丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(10)將1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙?；?〕-L-丙-1，3-二醇9(3.1g，5.55mmol)在固體NaOH上真空干燥過夜并溶入無水CH2Cl2(100ml)。溶液在氬氣保護(hù)下冷至0℃。攪拌下往該冷卻的溶液中加N，N-二異丙基乙胺(1.29g，10mmol)，然后加2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代氨基磷酸酯(1.96g，8.3mmol)。反應(yīng)混合物0℃攪拌1小時，室溫攪拌2小時。反應(yīng)混合物用CH2Cl2(100ml)稀釋，有機(jī)層用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。CH2Cl2萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得油狀殘留物。該殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到泡泡糖狀物。該泡泡糖狀物在固體NaOH上干燥過夜。在氬氣保護(hù)下將干泡泡糖狀物溶入無水CH2Cl2(20ml)并滴加到攪拌的無水己烷(2000ml)中，歷時1小時。加完后生成的沉淀再攪拌1小時，過濾，用無水己烷(100ml)洗滌，收集到的固體在固體NaOH上真空干燥4小時。產(chǎn)量3.5g(83％)。
實施例27(見圖24)N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-D-絲氨酸(12)室溫下將O-芐基-D-絲氨酸11(5g，25.64mmol)懸浮在THF/H2O(8∶2，70ml)混合物中。往該攪拌的混合物中加三乙胺(4.04g，40mmol)，然后加酸式碳酸二叔丁酯(6.54g，30mmol)，反應(yīng)混合物繼續(xù)在室溫攪拌過夜。均相溶液蒸發(fā)至干，殘留物溶于乙酸乙酯(150ml)中。有機(jī)萃取液用0.5N KHSO4溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。乙酸乙酯萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到7.56克(100％)油狀殘留物。
N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-D-絲氨醇(13)N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-D-絲氨酸10(7.56g，25.63mmol)溶于無水THF中，然后在氬氣保護(hù)下冷至-20℃。攪拌下往該冷溶液中加TEA(3.03g，30mmol)及氯代甲酸異丁酯(4.08g，30mmol)。在氬氣保護(hù)下于-20℃再攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物立即在氬氣罩下過濾，沉淀用無水THF(50ml)洗滌。合并的濾液緩慢地加到冷的(0℃)NaBH4(7.4g，200mmol)與THF/水(80∶20，200ml)的溶液中，歷時10分鐘。加完后，反應(yīng)混合物在0℃攪拌2小時，并用乙酸調(diào)pH至7。，溶液蒸發(fā)至干。在乙酸乙酯/水(300∶150ml)間分配，并萃入乙酸乙酯中。有機(jī)萃取液用飽和食鹽水(100ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，純餾分傾倒一起，蒸發(fā)至干，得到6.68g(92％)純油狀產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)δ1.41(s，9H，Boc)，3.60-3.70(m，4H)，3.82(d，2H)，4.53(s，2H，OCH2Ph)，5.20(bs，1H，NH)and7.30-7.40(m，5H，Ph).
N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-D-絲氨醇-O-異丁酸酯(14)室溫下往N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-D-絲氨醇13(6.6g，23.5mmol)與無水吡啶(50ml)的無水溶液中加TEA(3.03g，30mmol)。攪拌下往該溶液中加異丁酸酐(4.74g，30mmol)，并在氬氣保護(hù)下繼續(xù)攪拌過夜。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，在乙酸乙酯(200ml)和NaHCO3(5％溶液，100ml)之間分配，并萃入乙酸乙酯中。有機(jī)萃取液用水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，干燥后的溶液蒸發(fā)至干，得到粗殘留物。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠色譜純化，用己烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)至干，得到8.0g(97％)純油狀產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)δ1.04(d，6H，IbCH3)，1.39(s，9H，Boc)，2.46(m，1H，IbCH)，3.40(m，2H)，3.92(m，2H)，4.12(m，1H)，4.46(s，2H，OCH2Ph)，6.84(d，1H，NH)and 7.24-7.40(m，5H，Ph).
N-(胸腺嘧啶乙酰基)-O-芐基-D-絲氨醇-O-異丁酸酯(15)N-(叔丁氧羰基)-O-芐基-D-絲氨醇-O-異丁酸酯14(5.0g，14.25mmol)，三氟乙酸(20ml)和CH2Cl2(20ml)在室溫下攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物蒸干，殘留物溶于無水CH3OH(10ml)，再蒸發(fā)至干。殘留物溶解到CH2Cl2(150ml)中，用5％NaHCO3水溶液調(diào)pH至7，并萃入CH2Cl2中。有機(jī)層用水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(50ml)洗滌。CH2Cl2萃取液干燥并蒸發(fā)至干。得到的殘留物在固體KOH上真空干燥12小時。該干殘留物不經(jīng)鑒定，直接用于后面的反應(yīng)。
胸腺嘧啶乙酸5(2.57g，14mmol)溶于無水DMF(50ml)并在氬氣保護(hù)下冷至-20℃。攪拌下往該冷卻的溶液中加N-甲基嗎啉(1.52g，15mmol)后再加氯代甲酸異丁酯(2.04g，15mmol)。攪拌15分鐘后，上面的胺與無水DMF(50ml)的溶液立即加到攪拌著的胸腺嘧啶乙酸中。反應(yīng)混合物于-20℃攪拌1小時，升溫至室溫，繼續(xù)攪拌過夜，溶液蒸發(fā)至干，殘留物溶入CH2Cl2(250ml)和水(100ml)中并萃入CH2Cl2。有機(jī)萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。CH2Cl2萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，收集必需的餾分，蒸發(fā)，得到2.8g(54％)純產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)δ1.04(d，6H，IbCH3)，1.72(s，3H，CH3)，2.44(m，1H，IbCH)，3.42(m，2H)，4.06(m，2H)，4.18(m，1H)，4.30(s，2H)，4.46(s，2H，OCH2Ph)，7.24-7.40(m，6H，C3H and Ph)，8.22(d，1H，NH)and 11.22(s，1H，NH).
標(biāo)題化合物亦可按照制備“L-”異構(gòu)體的方法制備。使用的試劑為胸腺嘧啶乙酸(2.2g，12mmol)；氯代甲酸異丁酯(1.77g，13mmol)；N-甲基嗎啉(1.52克，15mmol)；TFA鹽(3.65g，10mmol)，N-甲基嗎啉(1.5g，15mmol)和無水DMF(100ml)。產(chǎn)量3.5g(84％)。
N-(胸腺嘧啶乙酰基)-D-絲氨醇-O-異丁酸酯(16)將N-(胸腺嘧啶乙?；?-O-芐基-D-絲氨醇-O-異丁酸酯15(3.5g，8.39mmol)溶于乙醇(50ml)中。室溫下往該溶液中加Pd(OH)2(1.00g)和環(huán)己烯(10ml)。反應(yīng)混合物在70℃加熱12小時。濾去催化劑，并用甲醇(20ml)洗滌。濾液蒸發(fā)至干得到白色固體。產(chǎn)量2.7g(98％)。
1HNMR(Me2SO-d6)δ1.04(d，6H，IbCH3)，1.72(s，3H，CH3)，2.42(m，1H，IbCH)，3.40(m，2H)，3.94(m，2H)，4.06(m，1H)，4.28(s，2H)，4.90(t，1H，OH)，7.20(s，1H，C6H)，8.12(d，1H，NH)and 11.22(s，1H，NH).
4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙?；?-D-絲氨醇-O-異丁酸酯(17)在氬氣保護(hù)下將N-(胸腺嘧啶乙酰基)-D-絲氨醇-O-異丁酸酯16(2.7g，8.26mmol)溶于無水吡啶(50ml)。攪拌下往該溶液中加TEA(1.01g，10mmol)，再加氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(3.38g，10mmol)，并繼續(xù)在氬氣保護(hù)下室溫攪拌過夜。反應(yīng)混合物用甲醇(10ml)淬火，攪拌10分鐘，蒸發(fā)至干。殘留物溶于乙酸乙酯(250ml)，用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)品。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到5.0g(96％)泡泡糖狀純產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)δ1.04(d，6H，IbCH3)，1.72(s，3H，CH3)，2.40(m，1H，IbCH)，3.38(m，2H)，3.72(s，6H，2.OCH3)，4.12(m，2H)，4.20(m，1H)，4.32(d，2H)，6.84(m，4H，Ph)，7.20-7.40(m，12H，C6H and Ph)，8.30(d，1H，NH)and 11.28(s，1H，NH).
1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-D-丙-1，3-二醇(18)將4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙?；?-D-絲氨醇-O-異丁酸酯17(5.0g，7.95mmol)溶在甲醇(30ml)中，并用冰浴冷至0℃。攪拌下往該冷溶液中加2N NaOH溶液(10ml，20mmol)，再于0℃攪拌30分鐘。用乙酸調(diào)溶液的pH至7并蒸發(fā)至干。殘留物在水(50ml)和CH2Cl2(250ml)之間分配，并萃入CH2Cl2中，水層再用CH2Cl2(50ml)萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和食鹽水(50ml)洗滌。干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，得到4.0g(90％)。
1HNMR(CDCl3)1.72(s，3H，CH3)，3.0(m，2H)，3.42(m，2H)，3.72(s，6H，2.OCH3)，3.94(m，1H)，4.32(d，2H)，4.68(m，1H，OH)，6.84(m，4H，Ph)，7.20-7.40(m，12H，C6H and Ph)，8.06(d，IH，NH)and 11.28(bs，1H，NH).
1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙?；?〕-D-丙基-3-O-(N，N-二異丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(19)將1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-D-丙-1，3-二醇18(2.79g，5.0mmol)在固體NaOH上真空干燥過夜并溶入無水CH2Cl2(100ml)。溶液在氬氣保護(hù)下冷至0℃。攪拌下往該冷卻的溶液中加N，N-二異丙基乙胺(1.29g，10mmol)，然后加2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代氨基磷酸酯(1.96g，8.3mmol)。反應(yīng)混合物0℃攪拌1小時，室溫攪拌2小時。反應(yīng)混合物用CH2Cl2(100ml)稀釋，有機(jī)層用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。CH2Cl2萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得油狀殘留物。該殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到泡泡糖狀物。該泡泡糖狀物在固體NaOH上干燥過夜。干泡泡糖狀物溶入無水CH2Cl2(20ml)中，在攪拌和氬氣保護(hù)下滴入攪拌的無水己烷(2000ml)中，歷時1小時。加完后生成的沉淀再攪拌1小時，過濾，用無水己烷(100ml)洗滌，收集到的固體在固體NaOH上真空干燥4小時。產(chǎn)量3.3g(87％)。
實施例28(圖25)1-O-芐基-2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙醇(21)氬氣保護(hù)、室溫和攪拌下往N3-苯甲?；叵汆奏?0(5.75g，25mmol)與無水THF(200ml)的溶液中加三苯基膦(10.48g，40mmol)和Nα-叔丁氧羰基-β-苯甲酰氧-L-絲氨醇3(5.3g，18.86mmol)。15分鐘后緩慢加入二乙基偶氮二羧酸酯(6.96g，40mmol)，歷時30分鐘。該反應(yīng)混合物用鋁鉑蓋上并在氬氣保護(hù)下室溫攪拌24小時。蒸去溶劑使干，殘留物溶解到乙酸乙酯(300ml)中。有機(jī)萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到桔紅色油狀物。該粗產(chǎn)品用閃式硅膠層析純化，用己烷→乙酸乙酯洗脫，合并含所需的產(chǎn)品的純餾分，蒸發(fā)，得到淺粉色油狀物。產(chǎn)量8.0g(86％)。1HNMR (CDCl3)1.41(s，9H，Boc)，1.72(s，3H，CH3)，3.56(m，2H)，4.20(m，2H)，4.32(m，1H)，4.52(d，2H，OCH2Ph)，5.20(d，1H，NH)，7.06(s，1H，C6H)and 7.20-7.60(m，10H，Ph).
2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙-1-醇(22)1-O-芐基-2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙醇21(4.93g，10mmol)溶解在甲醇(100ml)中并用Pd/C(10％，1g)處理。反應(yīng)混合物在50磅/英寸2氫氣壓下氫化12小時。濾去催化劑，用甲醇(50ml)洗滌，濾液蒸發(fā)至干。殘留物用丙酮/己烷結(jié)晶，得3.70g(92％)純產(chǎn)品。1HNMR(CDCl3)1.42(s，9H，Boc)，1.94(s，3H，CH3)，3.64(m，4H)，3.84(m，H)，4.14
(m，1H)，5.22(d，1H，NH)，7.18(s，1H，C6H)，7.48(t，2H，Ph)，7.62(t，lH，Ph)and 7.98(d，2H，Ph).
1-O-異丁?；?2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇(23)將2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙-1-醇22(1.6g，3.97mmol)溶解到無水吡啶(30ml)中，然后在氬氣保護(hù)下室溫攪拌。攪拌下往溶液中加TEA(0.51g，5mmol)和異丁酸酐(0.79g，5mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌12小時后蒸發(fā)至干。將殘留物溶解到乙酸乙酯(150ml)中，用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到1.6g(85％)泡泡糖狀的產(chǎn)物。該純產(chǎn)物用丙酮/己烷結(jié)晶。 mp165-167℃.1HNMR(CDCl3)1.16(d，6H，IbCH3)，1.42(s，9H，Boc)，1.94(s，3H，CH3)，2.52(m，lH)，3.64(m，4H)，3.84(m，1H)，4.14(m，1H)，5.22(d，1H，NH)，7.18(s，1H，C6H)，7.48(t，2H，Ph)，7.62(t，1H，Ph)and 7.98(d，2H，Ph).
1-O-異丁酰基-2-〔(β-羥乙?；?氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙醇(24)1-O-異丁酰基-2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙醇23(1.6g，3.38mmol)在TEA(5ml)和CH2Cl2(10ml)的混合物中室溫攪拌30分鐘，然后蒸發(fā)至干。殘留物溶解在無水甲醇(10ml)中，再蒸發(fā)至干。得到的殘留物在固體NaOH上真空干燥過夜。該干物料直接用于下面的反應(yīng)。
攪拌下往乙醇酸(0.53g，7mmol)與無水DMF(50ml)的溶液中加1-羥基苯并三唑(0.67g，5mmol)和l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)(1.91g，10mmol)。攪拌15分鐘后于室溫下加入TEA(1.01g，10mmol)和上面制得的TFA鹽的DMF(20ml)溶液。反應(yīng)混合物攪拌12小時并蒸發(fā)至干。殘留物在CH2Cl2(150ml)和水(100ml)之間分配并萃取到CH2Cl2中。有機(jī)萃取液用飽和食鹽水(50ml)洗滌。干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，合并含所需產(chǎn)物的純餾分，蒸發(fā)，得到l.35g(92％)泡泡糖狀的產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)1.16(d，6H，IbCH3)，1.94(s，3H，CH3)，2.52(m，1H)，3.20(bs，1H)，3.80-4.30(m，6H)，4.56(m，1H)，7.14(d，2H，C6H and NH)，7.50(t，2H，Ph)，7.64(t，1H，Ph)and 7.94(d，2H，Ph).
1-O-異丁?；?2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙?；?氨基〕-3-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇(25)1-O-異丁?；?2-〔(β-羥乙酰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙醇24(1.2g，2.78mmol)溶解在無水吡啶(50ml)中，并在氬氣保護(hù)下室溫攪拌。攪拌下往該溶液中加TEA(0.35g，3.5mmol)和氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(1.18g，3.5mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌12小時后用甲醇(10ml)淬火，然后蒸發(fā)至干。殘留物溶于乙酸乙酯(150ml)，用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到1.7g(83％)純產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)1.16(d，6H，IbCH3)，1.94(s，3H，CH3)，2.52(m，1H)，3.74(s，6H，2.OCH3)，3.80-4.30(m，6H)，4.56(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，7.14(d，2H，C6H and NH)and7.26-8.00(m，14H，Ph).
2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙?；?氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙醇(26)1-O-異丁?；?2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲?；?胸腺嘧啶基)-L-丙醇25(1.55g，2.05mmol)溶于甲醇(20ml)中，用冰浴冷至0℃。攪拌下往該冰冷溶液中加2N NaOH(5ml，10mmol)，0℃繼續(xù)攪拌30分鐘。用乙酸調(diào)pH至7，蒸發(fā)至干。殘留物在水(50ml)和CH2Cl2(50ml)之間分配，并萃入CH2Cl2中，水層再用CH2Cl2(50ml)萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和食鹽水(50ml)洗滌。干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，得到1.0g(99％)。
1HNMR(CDCl3)1.94(s，3H，CH3)，3.74(s，6H，2.OCH3)，3.80-4.30(m，6H)，4.56(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，7.14(d，2H，C6H and NH)and 7.26-8.00(m，14H，Ph).
2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙?；?氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙基-1-O-(N，N-二異丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(27)2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙?；?氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙醇26(1.00g，2.09mmol)在固體NaOH上真空干燥過夜并溶于無水CH2Cl2(50ml)中。在氬氣保護(hù)下將該溶液冷至0℃。攪拌下往該冰冷溶液中加N，N-二異丙基乙胺(0.54g，4.2mmol)，再加2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代氨基磷酸酯(0.73g，3.1mmol)。反應(yīng)混合物0℃攪拌1小時，室溫攪拌2小時。反應(yīng)混合物用CH2Cl2(100ml)稀釋，CH2Cl2萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得油狀殘留物。該殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到泡泡糖狀產(chǎn)物。該泡泡糖狀產(chǎn)物在固體NaOH上真空干燥。干泡泡糖樣產(chǎn)物溶解在無水CH2Cl2(10ml)中，在氬氣保護(hù)和攪拌下滴加到無水己烷(800ml)中，歷時30分鐘。加完后，生成的沉淀再攪拌30分鐘，過濾，用無水己烷(100ml)洗滌，固體在固體NaOH上真空干燥4小時。產(chǎn)量1.3g(82％)。
實施例29(圖26)Nα-叔丁氧羰基-O-芐基羥胺(28)將O-芐基羥胺鹽酸鹽(15.9g，100mmol)懸浮在THF(150ml)和水(50ml)的混合物中。攪拌下往該溶混合物中加TEA(15.15g，150mmol)，然后加酸式碳酸二叔丁酯(23.98g，110mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌12小時，蒸發(fā)至干。殘留物在乙酸乙酯(250ml)和水(200ml)之間分配，并使萃入乙酸乙酯中。乙酸乙酯萃取液用硫酸氫鉀溶液(100ml)及飽和食鹽水(100ml)洗滌，干燥，蒸發(fā)至干，得15g(91％)清亮的油。
1-氯-2-(四氫吡喃基)氧-乙烷(29)1-氯乙醇(8.06g，100mmol)溶解在無水CH2Cl2(100ml)中，在氬氣保護(hù)下用冰浴冷至0℃。攪拌下往該溶液中加二氫吡喃(12.6g，150mmol)接著加對甲苯磺酸吡啶鹽(1.25g，5mmol)并繼續(xù)攪拌過夜。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并溶于乙酸乙酯(200ml)中。乙酸乙酯萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(100ml)洗滌。有機(jī)層干燥，蒸發(fā)至干，粗產(chǎn)物用閃式硅膠層析純化，用己烷→二氯甲烷洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到11g(67％)純產(chǎn)物。
N-叔丁氧羰基-N-〔(四氫吡喃)氧〕乙基-O-芐基羥胺(30)0℃和氬氣保護(hù)及攪拌下往N-叔丁氧羰基-O-芐基羥胺28(5.79g，25.96mmol)與無水DMF(50ml)的溶液中緩慢加NaH(60％，1.2g，30mmol)，歷時15分鐘。反應(yīng)混合物0℃攪拌30分鐘，室溫攪拌1小時。加1-氯-2-(四氫吡喃基)氧-乙烷29(4.95g，30mmol)，反應(yīng)混合物于80℃加熱12小時。反應(yīng)混合物冷卻后蒸發(fā)至干。殘留物懸浮于水(50ml)中，調(diào)pH至7，萃入乙酸乙酯(150ml)中。乙酸乙酯萃取液用水洗滌，飽和食鹽水洗滌，干燥并蒸發(fā)至干。殘留物用閃式硅膠層析純化，用己烷→二氯甲烷洗脫，收集所需的餾分，蒸發(fā)，得到6.0g(66％)油狀產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，9H，Boc)，1.49-1.84(m，6H，3.CH2)，3.48-3.70(m，4H，2.CH2)，3.86(m，2H，CH2)，4.60(t，1H，CH)，4.84(s，2H，CH2Ph)and 7.32-7.42(m，5H，Ph).
N-叔丁氧羰基-N-[(2-羥)乙基]-O-芐基羥胺(31)將N-叔丁氧羰基-N-〔(四氫吡喃)氧〕乙基-O-芐基羥胺30(3.51g，10mmol)與THF∶水∶乙酸(1∶1∶1，100ml)混合物的溶液在70℃攪拌加熱3小時。反應(yīng)混合物冷至0℃后用固體NaHCO3調(diào)pH至7。反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(2×75ml)萃取。合并有機(jī)萃取液，用水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(100ml)洗滌，干燥，蒸發(fā)至干。殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到2.5g(94％)泡泡糖樣產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，9H，Boc)，3.60(t，2H，CH2)，3.74(m，2H，CH2)，4.84(s，2H，CH2Ph)and 7.32-7.42 (m，5H，Ph).
N-叔丁氧羰基-N-〔〔(2-異丁?；?氧〕乙基〕-O-芐基羥胺(32)室溫，氬氣保護(hù)和攪拌下往N-叔丁氧羰基-N-〔(2-羥)乙基〕-O-芐基羥胺31(4.2g，16.6mmol)與無水吡啶(50ml)的溶液中加TEA(2.02g，20mmol)，接著加異丁酸酐(3.16g，20mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌12小時，蒸發(fā)至干。殘留物溶于乙酸乙酯(200ml)中，用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)萃取液干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷洗脫，收集純餾分，蒸發(fā)，得到4.5g(80％)純產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)δ1.04(d，6H，IbCH3)，1.48(s，9H，Boc)，2.44(m，1H，IbCH)，3.60(t，2H，CH2)，3.74(m，2H，CH2)，4.84(s，2H，CH2Ph)and 7.32-7.4 2(m，5H，Ph).
N-(胸腺嘧啶乙?；?-N-〔〔(2-異丁酰基)氧〕乙基〕-O-芐基羥胺(33)N-叔丁氧羰基-N-〔〔(2-異丁?；?氧〕乙基〕-O-芐基羥胺32(5.0g，14.84mmol)溶解在CH2Cl2(10ml)中，在TFA(12ml)中攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并溶于無水甲醇(10ml)。在蒸發(fā)至干，在固體NaOH上真空干燥過夜。該干物料不經(jīng)鑒定直接用于后面的反應(yīng)。
將胸腺嘧啶乙酸5(3.13g，17mmol)溶解到無水DMF中，在氬氣保護(hù)下冷至-20℃。攪拌下往該冰冷溶液中加N-甲基嗎啉(2.02g，20mmol)，接著加氯代甲酸異丁酯(2.72g，20mmol)。攪拌15分鐘后，上面的TFA鹽與無水DMF(50ml)的溶液用N-甲基嗎啉(2.02g，20mmol)中和并立即加到冷卻的攪拌的胸腺嘧啶乙酸中。反應(yīng)混合物于-20℃攪拌1小時，升溫至室溫并繼續(xù)攪拌過夜。該溶液蒸發(fā)至干，殘留物溶解到CH2Cl2(25ml)和水(100ml)中，并萃入CH2Cl2。有機(jī)萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(50ml)洗滌，CH2Cl2萃取液干燥，蒸發(fā)至干，得粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→丙酮洗脫，合并必需的餾分，蒸發(fā)，得到4.0g(70％)純產(chǎn)物。該純產(chǎn)物用CH2Cl2/己烷結(jié)晶。
mp185-188℃)1HNMR(Me2SO-d6)δ1.00(d，6H，IbCH3)，1.74(s，3H，CH3)，2.44(m，1H，IbCH)，3.92(m，2H)，4.18(t，2H)，4.68(bs，2H)，4.98(s，2H)，7.34(s，1H，C6H)，7.40-7.50(m，5H，Ph)and 11.32(bs，1H，NH).
實施例30(見圖27)(2R，4R)-2-羧甲氧基-4-羥基吡咯烷(35)250ml園底燒瓶裝有電磁攪拌和回流冷凝器，加無水甲醇(40ml)，然后在氬氣保護(hù)下用冰浴冷卻。攪拌下往該溶液中加乙酰氯(4.32g，55mmol)，接著加順式-4-羥基-D-脯氨酸34(5.00g，38.17mmol)。得到的溶液加熱回流7至8小時，然后冷至室溫。該溶液用乙醚稀釋，抽濾收集生成的白色固體，用乙醚洗，在固體NaOH上真空干燥。產(chǎn)量6.9g(100％)。
1HNMR(CDCl3)2.09(2 dd，1H)，2.34(m，1H)，3.49-3.73(m，3H)，3.79(s，3H，CH3)，4.34(m，2H).
(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羧甲氧基-4-羥基吡咯烷(36)室溫和攪拌下往(2R，4R)-2-羧甲氧基-4-羥基吡咯烷35(6.9g，38.12mmol)與THF/水(8∶2，150ml)的溶液中加TEA(10.1g，100mmol)，再加酸式碳酸二叔丁酯(10.9g，50mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌6小時，蒸發(fā)至干。殘留物溶于乙酸乙酯(200ml)中，用0.5％硫酸氫鉀溶液(50ml)洗滌，水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(50ml)洗滌，有機(jī)萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，得到7.8g(84％)油狀產(chǎn)物。該油狀產(chǎn)物干燥后變?yōu)闊o色固體。mp75-77℃.1HNMR(CDCl3)1.45(s，9H，Boc)，2.09(2 dd，1H)，2.34(m，1H)，3.49-3.73(m，3H)，3.79(s，3H，CH3)，4.34(m，2H).
(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羥甲基-4-羥基吡咯烷(37)(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羧甲氧基-4-羥基吡咯烷36(7.0g，28.6mmol)溶于無水THF(100ml)并在氬氣保護(hù)下用冰浴冷卻。往該冰冷溶于中分批加入硼氫化鋰(1.88g，85.8mmol)，歷時15分鐘。加完硼氫化鋰后，反應(yīng)混合物在氬氣保護(hù)下0℃攪拌1小時，室溫攪拌15小時。該溶液冷至0℃，用水(50ml)稀釋，用乙酸調(diào)pH至6。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，溶入乙酸乙酯(200ml)中，用水(100ml)洗，飽和食鹽水(100ml)洗滌，乙酸乙酯萃取液干燥并蒸發(fā)至干。殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，收集純餾分，蒸發(fā)至干，得到5.00g(81％)無色油狀物。該油狀產(chǎn)物放置后變?yōu)闊o色固體。
mp95-97C.1HNMR(CDCl3)1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H).
(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-羥基吡咯烷(38)(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羥甲基-4-羥基吡咯烷37(4.4g，20.28mmol)溶解于無水吡啶(50ml)并使在氬氣保護(hù)下攪拌。攪拌下往該溶于中加TEA(2.53g，25mmol)，再加氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(7.45g，22mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌12小時后用甲醇(10ml)淬火。得到的溶液蒸發(fā)至干并溶入乙酸乙酯(200ml)。乙酸乙酯層用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌和飽和食鹽水(100ml)洗滌，有機(jī)萃取液用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，殘留物用閃式硅膠層析純化，用己烷→乙酸乙酯洗脫，合并需要的餾分，蒸發(fā)，得到8.09g(100％)桔紅色泡泡糖樣產(chǎn)物。
1HNMR(CDCl3)1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，3.74(s，6H，2.OCH3)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，and 7.26-8.00(m，9H，Ph).
(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-〔(對甲苯磺?；?氧〕吡咯烷39-(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-羥基吡咯烷38(8.09g，20.27mmol)溶于無水吡啶/CH2Cl2(2∶1，200ml)中并在氬氣保護(hù)下用冰浴冷卻。往該冰冷的溶于中加TEA(3.03g，30mmol)，再加對甲苯磺酰氯(5.7g，30mmol)。反應(yīng)混合物0℃攪拌3小時，30℃以下攪拌8小時。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干后在乙酸乙酯(200ml)和5％NaHCO3溶液(100ml)之間分配，并使萃入乙酸乙酯中。乙酸乙酯萃取液用水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(100ml)洗滌，干燥，蒸發(fā)至干，粗產(chǎn)物用閃式硅膠層析純化，用己烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到12.2g(89％)桔黃色油狀物。1HNMR(CDCl3)1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，2.40(s，3H，CH3)，3.40-3.62(m，3H)，3.74(s，6H，2.OCH3)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，and 7.26-8.00(m，13H，Ph).
(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-疊氮基-吡咯烷(40)將(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-〔(對甲苯磺?；?氧〕吡咯烷39(5.1g，7.58mmol)溶于二甲基甲酰胺(50ml)并用水(5ml)稀釋。攪拌下往該溶液中加疊氮化鈉(0.65g，10mmol)并于80℃加熱8小時。放冷，蒸發(fā)至干。殘留物在CH2Cl2(200ml)和水(100ml)之間分配，并萃入CH2Cl2。有機(jī)萃取液用飽和食鹽水(50ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，粗產(chǎn)物用閃式硅膠層析純化，用己烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到3.8g(92％)清亮的油狀物。
1HNMR(CDCl3)1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，3.74(s，6H，2.OCH3)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，and 7.26-7.80(m，9H，Ph).
(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羥甲基-4-氨基吡咯烷(41)(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-疊氮基-吡咯烷40(2.72g，5mmol)在甲醇(75ml)中在10％鈀炭(0.3g)存在下于室溫及5個大氣壓下氫化。12小時后，濾去催化劑，用甲醇(20ml)洗，減壓蒸去溶劑。得1.0g(93％)產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)and 4.44(m，1H).
(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羥甲基-4-鄰苯二甲酰亞胺基吡咯烷(42)(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羥甲基-4-氨基吡咯烷41(1.00g，4.63mmol)溶解在無水甲醇(20ml)中，然后在室溫下用N-乙氧羰基鄰苯二甲酰亞胺(1.09g，5mmol)處理。反應(yīng)混合物攪拌6小時后蒸發(fā)至干。殘留物用閃式硅膠層析純化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脫，合并純餾分，蒸發(fā)，得到1.5g(94％)純泡泡糖樣產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)and 7.3-7.6(m，4H，Ph).
(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶-1-基)〕甲基-4-鄰苯二甲酰亞胺基吡咯烷(43)氬氣保護(hù)、室溫及攪拌下往N3-苯甲酰基胸腺嘧啶20(1.15g，5mmol)與無水THF(70ml)的溶液中加三苯基膦(2.62g，10mmol)和(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羥甲基-4-鄰苯二甲酰亞胺基吡咯烷(1.4g，4.05mmol)。15分鐘后緩慢加偶氮二羧酸二乙酯(1.74g，10mmol)，歷時10分鐘。該反應(yīng)混合物用鋁鉑蓋住并在氬氣保護(hù)下室溫攪拌24小時。蒸去溶劑至干，殘留物溶入乙酸乙酯(150ml)。有機(jī)萃取液用5％NaHCO3溶液(100ml)洗滌，水(100ml)洗滌，飽和食鹽水(50ml)洗滌，有機(jī)萃取液用無水硫酸鈉干燥，干燥后的乙酸乙酯萃取液蒸發(fā)至干，得桔紅色油狀產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物用閃式硅膠層析純化，用己烷→乙酸乙酯洗脫，合并含所需產(chǎn)物的餾分，蒸發(fā)，得到2g(89％)淺粉色的油狀物。
1HNMR(CDCl3)1.41(s，9H，Boc)，1.72(s，3H，CH3)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)，7.06(s，1H，C6H)and 7.20-7.60(m，9H，Ph).
實施例31寡核苷酸的合成用DNA自動合成儀(Applied Biosystems model 394)和標(biāo)準(zhǔn)的氨基磷酸酯化學(xué)法合成含修飾的氨基酸核酸骨架的寡核苷酸。β-氰乙基氨基磷酸酯，合成試劑和CPG聚苯乙烯柱均購自AppliedBiosystems(Foster City，CA)。合成硫代磷酸酯寡核苷酸時，用二硫代四乙基二烴氨基硫羰/乙腈代替標(biāo)準(zhǔn)氧化瓶，在磷酸酯鏈的硫化步驟使用標(biāo)準(zhǔn)的ABI硫代磷酸酯程序。從控孔的玻璃柱裂解下來之后，使寡核苷酸與濃氫氧化銨于55℃反應(yīng)8小時，除去保護(hù)基。得到的寡核苷酸(DMT-on)用HPLC純化，用seriprep C3反相柱(ABI)，用0.1M乙酸三乙銨的5％乙腈(緩沖液A)和乙腈(緩沖液B)線型梯度洗脫。用80％乙酸脫DMT保護(hù)基，產(chǎn)品用乙醇沉淀。產(chǎn)物純度用HPLC檢查，用分析型C18柱(Beckman)。在DNA序列的3’端、5’端和中間序列插入該氨基酸核酸單聚體的偶聯(lián)效率為100％。制備含16個氨基酸修飾的胸腺嘧啶的同型高聚體亦無任何問題。
實施例32雜交分析本發(fā)明的氨基酸修飾的寡核苷酸往它們的互補性RNA和DNA序列雜交的能力通過熱熔分析測定?；パaRNA用Genset corporation(La Jolla，CA)合成，用變性尿素PAGE純化。將計量濃度的天然反義寡核苷酸或特定位置含功能基的寡核苷酸或加到RNA或加到DNA互補序列上形成雜交雙鏈。增色性吸收(260nm)取決于當(dāng)雙鏈向隨機(jī)盤繞躍遷時的溫度，用Varian Cary IE UV-可見分光光度計監(jiān)測。在10nm磷酸鈉，pH 7.4，0.1mM EDTA，和NaCl的緩沖溶液中測定，緩沖溶液的離子強(qiáng)度或為0.1M或為1.0M。用1/Tm對ln[Ct]作圖表示分析數(shù)據(jù)，其中[Ct]為總寡核苷酸濃度。從該分析確定熱動力學(xué)參數(shù)。根據(jù)從雙鏈或形成的雜雙鏈的穩(wěn)定性得到的信息，估價修飾的嘧啶放入寡核苷酸中對螺旋穩(wěn)定性的影響。劇烈地改變雜交穩(wěn)定性的修飾顯示為自由能(4G)的降低或增高以及決定它們在反義寡核苷酸中的用途。
用3’端和5’端含氨基酸核酸骨架的寡核苷酸進(jìn)行雜交研究。初步的研究表明，修飾的寡核苷酸與它們的互補性RNA及DNA序列形成雙鏈與未修飾的寡核苷酸相似。
實施例33抗核苷酶的作用天然的，磷酸硫代酯和本發(fā)明的修飾寡核苷酸在含各種濃度的胎牛血清或成年人血清的介質(zhì)中孵育評價它們的抗血清核酸酶作用。標(biāo)記的寡核苷酸孵育不同的時間，用蛋白酶K處理，然后在20％聚丙烯酰胺-尿素變性凝膠上進(jìn)行凝膠電泳分析，然后進(jìn)行自動放射照相或磷成相。激光光密度法對放射照相進(jìn)行定量。根據(jù)修飾的位置和寡核苷酸的已知長度，有可能確定特定的修飾對核酸酶降解的影響。測定抗胞漿核酸酶作用時使用HL60細(xì)胞株。通過微分離心制備線粒體后上清液，標(biāo)記的寡核苷酸在該上清液中孵育不同的時間。孵育后象上面指出的那樣評價血清核酸酶對寡核苷酸的降解。自動放射照相的結(jié)果定量以便比較未修飾的寡核苷酸即磷酸硫代酯和修飾的寡核苷酸。
對氨基酸修飾的寡核苷酸的初步研究表明，它們有抗蛇毒磷酸二酯酶降解作用。
編入的參考文獻(xiàn)所有的專利，專利申請書和引用的出版物這里都編入作為參考文獻(xiàn)。
等量物前面寫的說明書被認(rèn)為足以使專業(yè)人員實施本發(fā)明。前面敘述的各種修飾確實使進(jìn)行本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.選自下述一組通式表示的化合物
其中“Base”為核苷堿基，其中R為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph，其中X為選自(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基其中Z為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7，和R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)和-(CH2)xF的基；其中x為1-7；和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基。
2.選自下述一組通式表示的化合物
其中“Base”為核苷堿基，其中R為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F；其中x為1-7，和F選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph；其中R1選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F；其中x為1-7，和F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph；其中R2為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，和F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中R3為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，和F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中R4為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，和F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中A為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5和Se的基；其中x為1-7；其中B為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5和Se的基；其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中X為選自(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)， 甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中Y為選自(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，Ch3和Ph的基；其中Z為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，Ch3和Ph的基；
3.選自下述通式表示的化合物
其中“Base”為核苷堿基，其中R為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7；和F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中R1為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2和Ph的基；其中X為選自(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，和Ph的基；其中Z為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；
4.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求1的化合物，而且其中所述的化合物通過4’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
5.權(quán)利要求4的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
6.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求2的化合物，而且其中所述的化合物通過4’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
7.權(quán)利要求6的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
8.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求3的化合物，而且其中所述的化合物通過4’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
9.權(quán)利要求8的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
10.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求1的化合物，而且其中所述的化合物通過3’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
11.權(quán)利要求10的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
12.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求2的化合物，而且其中所述的化合物通過3’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
13.權(quán)利要求12的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
14.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求3的化合物，而且其中所述的化合物通過3’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
15.權(quán)利要求14的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
16.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求1的化合物，而且其中所述的化合物通過2’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
17.權(quán)利要求16的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
18.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求2的化合物，而且其中所述的化合物通過2’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
19.權(quán)利要求18的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
20.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求3的化合物，而且其中所述的化合物通過2’位與核苷酸間鏈相連之后再通過該核苷酸間鏈與第二個單聚體的5’位相連。
21.權(quán)利要求20的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，羥胺和氨基磷酸酯。
22.選自下述通式表示的化合物
其中n為1-200，其中“Base”為核苷堿基，其中R為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x是1-7；其中其中F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中R1為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，和F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中R2為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，其中F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中R3為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，其中F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中R4為選自H，OH，SH，CN，CH3，OCH3，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，Ph和-(CH2)x-F的基；其中x為1-7，其中F為選自NH2，SH，OH，COOH，OCH3，SCH3，SPh，NOH，NOH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中A為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5和Se的基；其中x為1-7；其中B為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3，NR5和Se的基；其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，和Ph的基；其中X為選自(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3，和Ph的基；其中Y為選自(CH2)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中x為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中Z為選自(CH2)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH3和NR5的基，其中X為1-7；其中R5為選自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH3，ONH2，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，雜烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH2)xF的基；其中x為1-7，和F為選自H，OH，SH，OCH3，CN，SCH3，ONH2，ONH(CH3)，SNH2，S(O)NH2，S(O)(O)NH2，CH3和Ph的基；其中V為核苷酸間鏈
23.權(quán)利要求22的化合物，其中V為表1的核苷酸間鏈。
24.選自下述通式表示的化合物
其中X為選自(CH2)n，其中n＝1-3，CO(CH2)n，其中n＝0-2和(CH2)nSO2，其中n＝1-2的基，Y為選自CH2，CO，COOH，CS和SO2的基；Y’為選自CH2，CO，COOH，CS和SO2的基；Z為選自O(shè)，S，NH和CH2的基；R為選自CH2OH，CH2NH2，CH2NHCHO，CONH2和COOH的基，B為核苷堿基。
25.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求1的化合物。
26.選自下述通式表示的化合物
其中n為1-2O0，X為選自(CH2)n，其中n＝1-3，CO(CH2)n，其中n＝0-2和(CH2)nSO2，其中n＝1-2的基，Y為選自CH2，CO，COOH，CS和SO2的基；Y’為選自CH2，CO，COOH，CS和SO2的基；Z為選自O(shè)，S，NH和CH2的基；R為選自CH2OH，CH2NH2，CH2NHCHO，CONH2和COOH的基，B為核苷堿基。
27.選自下述通式表示的化合物
其中“Base”為核苷堿基，其中R為選自H，CH3，-(CH2)p-NR1R2，Ph，CH2Ph，-(CH2)p-Im，NR1R2的基，其中p為1-10，其中R1和R2各自獨立為H和CH3，和其中Im為咪唑基。
28.由許多單聚體組成的寡聚體，其中至少有一個單聚體為權(quán)利要求27的化合物，而且其中所述的單聚體中至少有一個單聚體是通過核苷酸間鏈與第二個單聚體相連。
29.權(quán)利要求28的寡聚體，其中核苷酸間鏈選自磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，酰胺，異羥肟酸酯，胺，羥胺和氨基磷酸酯。
30.選自下述通式表示的化合物，
其中n為1-200，其中“Base”為核苷堿基；其中A，B，C和X各自獨立地選自NH，NR，O，S，-C(O)，-(CH2)p；其中R為選自H，CH3，-(CH2)p-NR1R2，Ph，CH2Ph，-(CH2)p-Im，NR1R2，OH，OCH3，-O(CH2)p-NR5R6，OPh，OCH2Ph，-O(CH2)p-Im，NR5R6，-C(O)-OH，-C(O)-CH3，-C(O)-(CH2)p-CH3，-C(O)-(CH2)p-Ph，-C(O)-(CH2)p-NR5R6，-C(O)-Ph，-C(O)CH2Ph，-C(O)-(CH2)p-Im，-C(O)-NR5R6的基；p為1-10，R1和R2各自獨立為H和CH3；和Im為咪唑基。
31.選自下述通式表示的化合物，
其中n為1-200，其中“Base”為核苷堿基；其中A，B，C各自獨立地選自磷酸二酯鏈和硫代磷酸酯鏈，和其中X為選自NH，NR，O，S，-C(O)，-(CH2)p的基；其中R為選自H，CH3，-(CH2)p-NR1R2，Ph，CH2Ph，-(CH2)p-Im，NR1R2，OH，OCH3，-O(CH2)p-NR5R6，OPh，OCH2Ph，-O(CH2)p-Im，NR5R6，-C(O)-OH，-C(O)-CH3，-C(O)-(CH2)p-CH3，-C(O)-(CH2)p-Ph，-C(O)-(CH2)p-NR5R6，-C(O)-Ph，-C(O)CH2Ph，-C(O)-(CH2)p-Im，-C(O)-NR5R6的基；p為1-10，R1和R2各自獨立為H和CH3；和Im為咪唑基。
全文摘要
本發(fā)明提供了各種新的寡核苷酸類似物,這些類似物具有的一種或多種性能造成在寡核苷酸應(yīng)用的操作中使用標(biāo)題化合物比使用常規(guī)寡核苷酸優(yōu)越。本發(fā)明的化合物是寡核苷酸類似物,其中天然核酸中的呋喃糖環(huán)被一個氨基酸或修飾的氨基醇?xì)埢〈?。本發(fā)明的新化合物的一些具體實例中特別有用基因表達(dá)的反義控制。本發(fā)明的化合物還可用作核酸雜交探針或引物。本發(fā)明的另一個方面是提供本發(fā)明的寡核苷酸類似物的單聚前體。這些單聚前體可用于合成標(biāo)題的多聚核苷酸類似物。本發(fā)明的另一個方面是提供標(biāo)題的多聚核苷酸類似物的配方,這些配方是設(shè)計用于治療或預(yù)防疾病的。本發(fā)明還有一個方面是提供治療或預(yù)防疾病的方法,尤其是提供治療病毒感染和細(xì)胞生長失調(diào)的方法。標(biāo)題疾病的治療方法包括服用有效量的作為反義抑制劑的標(biāo)題多聚核苷酸類似物的步驟。
文檔編號C07D473/18GK1171112SQ95196989
公開日1998年1月21日 申請日期1995年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月2日
發(fā)明者K·拉馬沙米, 王廣義, W·塞弗特 申請人:Icn藥品公司