專利名稱：：使用胰島素樣生長因子結合蛋白質的方法發(fā)明的所屬領域本發(fā)明涉及使用胰島素樣生長因子結合蛋白質1(IGFBP-1或BP-1)作為治療劑。發(fā)明的背景循環(huán)胰島素樣生長因子I和II(IGF-I和IGF-II)是結構上彼此相關并與胰島素相關的7kDa蛋白質。IGF-I和IGF-II是體內大多數(shù)細胞的生長和分化因子并以高濃度存在于血清中(IGF-I約為300ng/ml，IGF-II約為1000ng/ml)。IGF-I的循環(huán)水平主要是由生長激素(GH)決定，后者刺激肝臟產生IGF-I。據(jù)信生長激素的大多數(shù)生長促進作用是由IGF-I介導的。還存在有組織IGF。如用凝膠層析法測知的，組織IGF-I具有比循環(huán)IGF更大的表觀分子量(約26kDa)(Rom，W.N.etal.，J.Clin，Invest.，821685-1693(1988))。已顯示IGF-I和IGF-II在許多病癥下起作用。這些疾病包括例如乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、神經膠質瘤、肝癌、前列腺癌、橫紋肌肉瘤、血管再狹窄(restenosis)、肢端巨大癥、肥胖、腫瘤誘發(fā)的低血糖癥、肺纖維化、糖尿病性腎病和糖尿病性視網膜病。Daughaday(Endocrinol.1271-4，1990)討論了胰島素樣生長因子在人腫瘤中的作用。例如，如Cullen等人在CancerInvestigation，9443-454(1991)中所報導的，據(jù)信IGF-I和IGF-II對于包括乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、成神經細胞瘤、神經膠質瘤、Wilm氏瘤及橫紋肌肉瘤在內的多種腫瘤起到自分泌或旁分泌生長因子作用。如Yee等人在CancerRes.，486691-6696(1988)中以及Osborne等人在Mol.Endocrinol.31701-1709(1989)中所報導的，已證明多種原發(fā)性腫瘤過量表達IGF-I或IGF-II并表達這些生長因子的受體。大量體外研究顯示，由上述一些腫瘤衍生的人細胞系在對IGF-I和IGF-II反應中發(fā)生增殖。在有的情況下顯示出細胞系可產生IGF-I或IGF-II，并具有IGF-I和IGF-II的細胞表面受體。在有些例子，特別是乳腺癌中，已證明腫瘤周圍的體細胞分泌造成旁分泌生長關系的IGF-I和IGF-II。在美國，乳腺、肺和結腸癌是影響到達500,000人的三種最常見的癌癥?？娠@示IGF-I和IGF-II在這些癌癥生長中的作用的最強有力的證據(jù)是，實驗表明抗IGF-I受體的抗體可阻斷裸鼠體內由衍生于這些類型人腫瘤的大量細胞系導致的腫瘤形成。如Tricoli等人在CancerResearch，466169-6173(1986)中所報導的，對人結腸癌活體組織的分析顯示，在所分析的40％腫瘤中IGF-II過量表達10至50倍。IGF-II過量表達的水平與侵入腸壁的程度相關。Nakanishi等人(J.Clin.Invest.，82354-359，(1988))已報導。IGF-I可介導入小細胞肺癌細胞系NCI-H345和NCI-N417的自分泌增殖。卵巢癌細胞系OVCAR-3、OVCAR-7和PEO4表達IGF-ImRNA。Yee等人在CancerRes.，515107-5112(1991)中報導，原發(fā)性和轉移卵巢癌組織也表達IGF-ImRNA及I型IGF受體mRNA。Blatt等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.123373-376(1984))和Canalis(J.Clin.Invest.66709-719(1980))報導了正常和惡性骨細胞都可分泌IGF-I并對IGF-I有反應。在肝組織中，IGF-IImRNA表達在發(fā)育上受到調節(jié)。Cariani等人(J.Hepatology，13220-226(1990))報導，在北美土撥鼠、人和大鼠的肝癌組織中測到了IGF-IImRNA水平的增加。三個人前列腺癌細胞系，即PC-3DU-145和LNCaFGC均產生實質量的IGF-I并持續(xù)呈現(xiàn)自動磷酸化的IGF-I受體(Pietrzkowsky，Z.etal.，CancerResearch，531102-1106(1993))。Pietrzkowsky等人報導，所有這三個細胞系的生長均受到IGF-I受體RNA之反義寡脫氧核苷酸，或者受到與IGF-I競爭結合其受體的IGF-I肽類似物的抑制。橫紋肌肉瘤是兒童最常見的軟組織肉瘤，并且似乎從發(fā)育的橫紋肌生成細胞產生的。EI-Badry等人(CellGrowth&amp;Differentiation，1325-331(1990))曾述及在橫紋肌肉瘤組織中出現(xiàn)升高水平的IGF-IImRNA。如上文提出的，胰島素樣生長因子與某些非癌疾病如肢端巨大癥和血管再狹窄有關。肢端巨大癥起因于生長激素(GH)的過度產生。生長激素通過刺激IGF-I的產生起作用。因此，肢端巨大癥與IGF-I水平的增加有關。大約25-55％經受血管成形術手術的患者在6個月內發(fā)生血管再狹窄即動脈血管再閉塞。動脈內膜層增厚是其主要原因。內膜增厚是因平滑肌增生和細胞外基質成分分泌造成的。如Cercek等人(CirculationResearch，661755-1760(1990))報導的。已表明在血管成形手術后剝脫的動脈中IGF-I基因表達被誘導了9倍。IGF-I基因表達的時間進程和水平是與平滑肌細胞增生密切相關的。如Khorsandi等人(J.Clin.Invest.，901926-1931(1992))所報導的，雜交研究表明分裂中的平滑肌細胞顯示出增加了IGF-I基因的表達。如Khorsandi等人(Atherosclerosis，93115-122(1992))所報導的，其他研究工作表明，有低循環(huán)IGF-I水平的動物(因切除其腦垂體所致)在血管成形術后更大程度地減少了內膜增厚。與某些腫瘤有關的低血糖癥很長時間以來就被人們所知道。在從再發(fā)性低血糖癥患者體內切除的平滑肌肉瘤中，觀察到有不尋常高水平的IGF-IImRNA和IGF-II免疫反應性肽(Daughaday，W.H.，etal.，NewEnglandJournalofMedicine，Vol.319，No.221434-1440(1988))。在切除平滑肌肉瘤后，低血糖癥有所緩解。研究腫瘤誘發(fā)的低血糖癥的其他人報導，發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療前血漿IGF-II水平升高，而在腫瘤治療后則可促進IGF-II水平降低及低血糖癥恢復(Axelrod，L.andRou，D.，NewEngland.JournalofMedicine，Vol.319，No.221477-1479(1988))。體內給予IGF-I也可誘發(fā)低血糖癥(Lewitt，M.S.，etal.，Endocrinology，Vol.129，No.42254-2256(1991))。Lewitt等人還報導了體外研究顯示IGFBP-1可抑制葡萄糖摻入大鼠脂肪組織的脂肪酸中。在肺纖維化組織中，被活化的肺泡巨噬細胞數(shù)目增加并且在肺泡壁中有纖維母細胞的過多積聚。纖維母細胞分泌細胞外膠原蛋白基質。纖維母細胞和基質分泌引起肺泡壁增厚并造成肺泡-毛細血管單位的損失，已表明被激活的肺泡巨噬細胞可釋放IGF-I以作為纖維母細胞的復制信號(Rom，W.N.etal，J.Clinic.Invest.，821685-1693(1988))。已證明來自肺間質病變患者的肺泡巨噬細胞自發(fā)分泌這種IGF-I(Bitterman，P.S.etal.，J.Chin，Invest.，721801-1813(1983))。目前，肺瘤和非腫瘤性疾病的治療方法包括手術、放射治療、化學療法及激素治療。例如，可用外科手術、放療和化學治療劑治療如乳腺、肺、卵巢、結腸以及骨肉瘤等不同癌癥。用于治療這些癌癥的化學治療劑包括氟嘧啶和烷基化劑。這兩類藥物均表明有明顯的毒性，例如包括骨髓抑制、免疫抑制、中性白細胞減少、胃腸毒性、腎毒性及外周神經病變。另外，尚沒有已知治療肝癌的有效化學治療劑。外科手術是高度侵害性的并且是不可預見后果的，而放射治療則在定位點上是非特異的。激素療法具有不利的付作用如不期望的毛發(fā)生長和情緒改變。已證明抗I型IGF-I受體的抗體在體外阻斷IGF-I反應性瘤細胞系的生長。研究表明，抗IGF-I受體的抗體阻斷移植到免疫缺陷裸鼠體內的某些乳腺和肺癌細胞的生長(Arteagaetal.，J.Clin，Invest.，84l418-1423(1989))Ziaetal.，Proc.Amer.Assoc.forCancerResearch，33270，Abstract1616(1992))。如Trojan等人(ProceedingsoftheNationalAcademyofScience，894874-4878(1992))所述，已顯示IGF-I基因的反義序列阻斷移植到大鼠體內的惡性大鼠神經膠質瘤細胞系的生長。但使用反義序列進行基因治療仍處于早期發(fā)展階段。因此，需要有一種抑制IGF在上述腫瘤和病癥中所發(fā)揮的作用的藥劑。本發(fā)明提供了這樣一種稱為IGFBP-1的抑制IGF在這些疾病中的不適當作用的IGF抑制劑。發(fā)明的概要本發(fā)明涉及使用胰島素樣生長因子結合蛋白質(IGFBP)作為治療利以治療或預防IGF相關病癥的方法。在本發(fā)明的特定實施方案中，結合蛋白質是IGFBP-1，也稱為“BP-1”。本發(fā)明還涉及使用修飾形式的IGFBP作為治療劑的方法。例如，修飾形式的IGFBP-1包括連接到聚合物上的IGFBP-1或連接到聚合物上的2或多個IGFBP-1分子。該方法包括給具有IGF相關病癥的患者使用足以引起治療效果的包括例如IGFBP-1或修飾形式之IGFBP-1在內的IGFBP。就IGFBP-1來說，可望當患者的血流中循環(huán)IGFBP-1的水平在大約每毫升0.1μg至300μg時，即可達到治療效果。其中可以使用IGFBP，特別是IGFBP-1治療或預防的病癥的例子包括乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、神經膠質瘤、肝癌、前列腺癌、橫紋肌肉瘤、血管再狹窄、肢端肥大癥、肥胖、腫瘤誘發(fā)的低血糖癥、肺纖維化、糖尿病性腎病和糖尿病性視網膜病。本發(fā)明還涉及含有IGFBP，特別是IGFBP-1或經修飾形式的IGFBP-1的藥物組合物，以及使用該藥物組合物治療或預防IGF相關病癥的方法。本發(fā)明的詳細描述IGF-I和IGF-II的不適當表達和利用是造成許多病癥的因素。預期給予IGFBP特別是IGFBP-1可以對與IGF，特別是IGF-I或IGF-II的不適當表達或利用相關的病癥發(fā)揮有用的治療作用。因此，本發(fā)明涉及使用足以引起治療效果量的IGFBP，包括IGFBP-1或經修飾形式的IGFBP-1，以治療有IGF相關病癥的患者或預防IGF相關病癥的方法。對本說明書中使用的術語限定如下術語“可接受的藥物載體”是指生理上相容的，含水或不含水溶劑。除另外指出者外，術語“IGF-I”是指含有與天然IGF-I有相同氨基酸序列的蛋白質，或含有與天然IGF-I相同的氨基酸序列同時加有N-末端甲硫氨酸的蛋白質(met-IGF-I)。術語“IGF”是指與包括例如IGF-I、IGF-II、(des1-3)IGF-I、met-IGF-I、胰島素在內的I型IGF的受體結合的任何多肽，以及與I型受體結合的任何活性片段。Blundell和Humbel(Nature，287781-787(1980))描述了該激素家族。術語“IGF相關病癥”是指由IGF、IGF結合蛋白質或IGF受體的過量表達或產生不足，IGF與結合蛋白質或受體的不適當或不充分地結合導致的或與之相關的已有或潛在的不利生理病癥，以及其中給予使用IGFBP，特別是IGFBP-1緩解或減少病癥的任何疾病。IGF相關病癥還指其中給正?；颊呤褂冒↖GFBP-1在內的IGFBP具有預期效果的病癥。IGF相關病癥的例子包括乳腺癌、結腸癌、骨肉瘤、神經膠質瘤、肺癌、橫紋肌肉瘤、卵巢癌、肝癌、肢端巨大癥、肥胖、腫瘤誘發(fā)的低血糖癥、肺纖維化、血管再狹窄、糖尿病性腎病和糖尿病性視網膜病。術語“患者”是指需要治療IGF相關病癥的包括人在內的任何動物。術語“IGFBP”是指六種已知IGF結合蛋白質中的任何一種，或這些與IGF結合的結合蛋白質的片段。在血中循環(huán)的IGF-I和IGF-II與六種特異性結合蛋白質結合是已知的。結合蛋白質結合血液中95％或更多的IGF。一種理論是當被結合蛋白質結合時，IGF-I和IGF-II即不能與介導其生物功能的某些細胞表面受體相互作用。IGF結合蛋白質-1是一種23kDaIGF結合蛋白質。IGFBP-1在生長停滯期間(如饑餓和糖尿病)在體內表達，提示IGFBP-1起到IGF-I抑制劑的作用。Oh等人(Endocrinol.1321337-1344(1993))報導，IGF-I和IGF-II對IGFBP-1有基本上相當?shù)挠H和性。羊水是IGFBP-1的天然來源并含有磷酸化和非磷酸化形式的這種結合蛋白質(Jones，J.I.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.887481-7485(1991))。磷酸化的BP-1比非磷酸化的BP-1對IGF-I的親和性更高(Jones，J.I.etal.，J.Biol.Chem.，268，21125-1131(1993))。Jone等人推測磷酸化的BP-1是細胞生長抑制劑，而非磷酸化的BP-1是細胞生長刺激劑。在細菌中表達的重組產生的BP-1是非磷酸化的，并且已顯示可增強IGF-I的效應(Iadin，D.etal.，J.CellularBiochemistry，Supplement17E127(1993))。但本文提供的數(shù)據(jù)證明，非磷酸化的IGFBP-1在體外和體內也可以抑制細胞生長。具體地說，已發(fā)現(xiàn)衍生于細菌的重組BP-1抑制伴隨某些IGF相關病癥的損傷性細胞生長。因此，用于本發(fā)明方法的IGFBP-1可以是磷酸化的或非磷酸化的。從而，可以從如羊水的天然來源中純化或者可按照本領域已知的重組方法生產用于本發(fā)明的BP-1。成熟IGFBP-1的氨基酸序列是Ala-Pro-Trp-Gln-Cys-Ala-Pro-Cys-Ser-Ala-Glu-Lys-Leu-Ala-Leu-Cys-Pro-Pro-Val-Ser-Ala-Ser-Cys-Ser-Glu-Val-Thr-Arg-Ser-Ala-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys-Pro-Met-Cys-Ala-Leu-Pro-Leu-Gly-Ala-Ala-Cys-Gly-Val-Ala-Thr-Ala-Arg-Cys-Ala-Arg-Gly-Leu-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Pro-Gly-Glu-Gln-Gln-Pro-Leu-His-Ala-Leu-Thr-Arg-Gly-Gln-Gly-Ala-Cys-Val-Gln-Glu-Ser-AspAla-Ser-Ala-Pro-His-Ala-Ala-Glu-Ala-Gly-Ser-Pro-Glu-Ser-Pro-Glu-Ser-Thr-Glu-Ile-Thr-Glu-Glu-Glu-Leu-Leu-Asp-Asn-Phe-His-Leu-Met-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-His-Ser-Ile-Leu-Trp-Asp-Ala-Ile-Ser-Thr-Tyr-Asp-Gly-Ser-Lys-Ala-Leu-His-Val-Thr-Asn-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Glu-Pro-Cys-Arg-Ile-Glu-Leu-Tyr-Arg-Val-Val-Glu-Ser-Leu-Ala-Lys-Ala-Gln-Glu-Thr-Ser-Gly-Glu-Glu-Ile-Ser-Lys-Phe-Tyr-Leu-Pro-Asn-Cys-Asn-Lys-Asn-Gly-Phe-Tyr-His-Ser-Arg-Gln-Cys-Glu-Thr-Ser-Met-Asp-Gly-Glu-Ala-Gly-Leu-Cys-Trp-Cys-Val-Tyr-Phe-Trp-Asn-Gly-Lys-Arg-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Glu-Ile-Arg-Gly-Asp-Pro-Asn-Cys-Gln-Ile-Tyr-Phe-Asn-Val-Gln-Asn(sEQIDNO.1).信號序列的氨基酸序列是Ser-Glu-Val-Pro-Val-Ala-Arg-Val-Trp-Leu-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Val-Gln-Val-Gly-Val-Thr-Ala-Gly(SEQIDNo.2).依據(jù)SEQIDNO1，本領域技術人員可以化學合成編碼IGFBP-1的DNA。另外，本領域技術人員也可以基于SEQIDNO1設計寡核苷酸探針，以分離基因組DNA或mRNA并產生cDNA?？梢杂镁幋aIGFBP-1的DNA轉化宿主以重組生產該蛋白質。例如，可以在使用T7啟動子系統(tǒng)的E.coliBL21/DE3中表達作為包涵體中之不溶性蛋白質的BP-1。Studier，F(xiàn).W.和Moffatt，B.(J.Mol.Biol.189113-30(1986))描述了BL21/DE3菌株。另外也可以使用TAC啟動子系統(tǒng)。在E.coli中，重組表達的BP-1包含在可溶性部分中。該不溶性蛋白質不適當?shù)卣郫B并且是無活性的?？梢詫⒃摰鞍踪|溶解在6M胍和還原劑中。將混合物稀釋10倍并允許BP-1重新折疊過夜，以使BP-1變性并折疊成其適當?shù)臉嬒?。IGFBP-1含有18個半胱氨酸殘基，據(jù)信所有這些半胱氨酸均參予形成二硫橋鍵。盡管BP-1中有大量的半胱氨酸殘基，但蛋白質還是重新折疊形成單一的主要形式?？梢允褂靡幌盗蠶-瓊脂糖和丁基-瓊脂糖柱純化重新折疊的蛋白質。每10升發(fā)酵液純化的BP-1的產率約1.5g。也可以在Jones，J.I.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.887481-7485(1991)和J.Biol.Chem.，268，21125-1131(1993)，兩文獻均列為本文參考文獻)列舉的哺乳動物表達系統(tǒng)中表達IGFBP-1。為了在哺乳動物系統(tǒng)中表達，可以使用編碼成熟蛋白質和信號序列的DNA。本領域技術人員可以按需要選擇任何適當?shù)妮d體和表達系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^增加包括IGFBP-1在內的IGFBP的循環(huán)半壽期來提高其治療實用性。已知例如通過將聚乙二醇(PEG)等惰性聚合物鏈共價結合到蛋白質上以增加蛋白質的分子量，即可提高蛋白質在體內的循環(huán)半壽期(如參見Davisetal.，BiomedicalPolymersPolymerieMaterialsandPharmaceuticalsforBiomedicalUse，pp.441-451(1980))。PEG與蛋白質共價結合本文稱為“PEG化”(“PEGylation”)。術語“PEG化的”(“PEGylated”)是指與聚合物結合的。PEG化的一種有用方法包括產生突變型蛋白，該突變蛋白上有用來與被巰基特異性反應基團激活的聚合物結合的半胱氨酸殘基。可以使用本領域已知的誘變技術制備突變型蛋白。例如，可以用半胱氨酸殘基取代一個或多個特定氨基酸，或在氨基酸之間或N或C末端上插入半胱氨酸殘基以產生IGFBP-1突變型蛋白?？赏@樣的非固有半胱氨酸殘基將是“游離的”，即未參予形成分子內二硫鍵。非固有半胱氨酸殘基可以被取代或插入IGFBP-1分子的暴露于蛋白質表面上的區(qū)域中，并且未參予受體結合或與IGF結合。半胱氨酸的一個插入或取代位點可出現(xiàn)在BP-1蛋白質分子的中間部分。據(jù)信半胱氨酸可以被取代或插入基于SEQIDNO1之殘基數(shù)碼的氨基酸60至180之間。特別有用的突變型蛋白包括在98和101位上的半胱氨酸殘基取代這些位置上天然存在之絲氨酸的蛋白質。將惰性聚合物鏈分子結合到一個或多個IGFBP-1分子上產生進一步修飾的IGFBP-1形式，即也稱為“PEG化的IGFBP-1”的IGFBP-1-聚合物結合體。PCT申請公開No.WO92/16221中討論了將巰基特異性反應基團與聚合物偶聯(lián)的問題(該文獻列為本文參考文獻)。如果半胱氨酸突變型蛋白質通過巰基特異性反應基因被偶聯(lián)到聚合物上，則可望所形成的結合物是在非固有半胱氨酸處結合到蛋白質上。但在突變型蛋白的再折疊期間，非固有半胱氨酸可能會參予形成二硫鍵，從而游離出一個用來PEG化的固有半胱氨酸。在這種情況下，聚合物即在該固有半胱氨酸殘基處結合?？梢允褂秒膱D譜法確定特定的PEG化位點。還期望有含有2個IGFBP-1分子的，即在聚合物分子的每一末端各有一個的“啞鈴狀”分子。使用常規(guī)方法，和PCT申請公開No.WO92/16221中描述的技術(該文獻列為本文參考文獻)，以及本文提供的技術，本領域技術人員可以很容易地確定用于制備這些包括IGFBP-1在內的經修飾IGFBP的適當pH、蛋白質濃度，及蛋白質對聚合物的比例。本發(fā)明進一步提供在藥用可接受的載體上含有包括IGFBP-1在內的IGFBP的藥物組合物。一種載體是生理鹽溶液，但也可以使用其他可接受的藥用載體。在一個實施方案中，期望由載體和IGFBP-1卡成生理上可相容的，緩慢釋放的配制品。這樣一種載體中的基本溶劑在性質上可以是含水的或不含水的。另外，載體可含有用來改變或維持配制品的pH、滲透性、粘度、澄清度、顏色、無菌性、穩(wěn)定性、溶解速度或氣味的其他醫(yī)藥學上可接受的輔助劑。同樣，載體還可含有用于改變或維持IGFBP-1的穩(wěn)定性、溶解速度、釋放，或吸收的其他醫(yī)藥學上可接受的輔助劑。這些輔助劑是那些通?；虺Ｒ?guī)用于配制以單位劑量或多劑量形式給藥之制劑的物質。一旦配制了治療組合物，即可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體制劑、或脫水或凍干粉來儲存于無菌容器中。這樣的配制品可以以直接使用的形式或需要在給藥前重新溶解的形式儲存。這種配制品的優(yōu)選儲存條件是至少低至4℃并更好是在-70℃的溫度下。另外，也可在或接近生理pH的條件下儲存并施用這種含有IGFBP-1的配制品。目前相信在高pH(即大于9)或低pH(即低于4)條件下儲存和施用此配制品是不理想的?？梢越涭o脈內、非腸道的、肌肉內、皮下、關節(jié)內注射途徑，或以灌注液、吸入噴霧劑、口服活性配制品或栓劑形式使用本發(fā)明的藥物組合物。為了達到并維持所期望的IGFBP-1劑量，可以重復給藥。這種方法想使IGFBP-1在患者血流中保持預定的濃度范圍。據(jù)信使血流中IGFBP-1的循環(huán)濃度保持在每毫升0.1μg至300μg即可有效地治療IGF相關病癥。給藥頻率將取決于所使用的配制品中IGFBP-1的藥物動力學參數(shù)。本發(fā)明的方法部分基于下列實施例中所述的實驗結果。簡單地說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IGFBP-1可體外阻斷IGF-I和IGF-II對乳腺癌、結腸癌和骨肉瘤細胞的促有絲分裂作用。雌激素通過使細胞分泌IGF-I或IGF-II而至少部分地刺激乳腺癌生長。抑制結腸癌生長所需的BP-1濃度為1-10μg/ml。一種結腸癌細胞系可生長于無血清培養(yǎng)基中、推測是因它產生了其自身的生長因子。用高濃度的BP-1至少使該細胞系在無血清培養(yǎng)基中的生長受到50％的抑制。本發(fā)明人已證明，IGFBP-1抑制IGF-I對骨肉癌細胞的促有絲分裂作用。大約12倍摩爾過量的IGFBP-1.使50ng/mlIGF-I對大鼠骨肉瘸細胞的促有絲分裂作用抑制達50％。還表明IGFBP-1抑制平滑肌細胞對IGF-I的增殖反應。在大鼠血管成形術后給予IGFBP-1明顯地抑制了因平滑肌增生和細胞外基質沉淀所致的內膜增厚。這些結果表明IGFBP-1在治療或預防血管再狹窄中是有用的。在切除垂體的大鼠體內，IGFBP-1抑制了IGF-I和生長激素的生長促進作用。另外，IGFBP-1、其突變型蛋白以及PEG化的IGFBP-1抑制了IGF-I對小鼠3T3成纖維細胞生長的刺激作用。下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1A.IGFBP-1的純化和再折疊以40ml/10g細胞膏的濃度將表達IGFBP-I的E.coli細胞懸浮在緩沖液A(50mMTris、pH7.5，20mMNaCl和/或1mMDTT)中，并使France細胞破碎器以1800psi的壓力破碎細胞。以20,000xg離心細胞懸液30分鐘，并以SDS-PAGE法分析細胞沉淀和上清的等分樣品。沉淀中存在相當于IGFBP-1的主帶，而上清中則沒有。將沉淀懸浮于緩沖液A(40ml/10g細胞膏)中，再次以20,000xg離心30分鐘。此洗滌過程重復2次。使用毛玻璃勻漿器將含有IGFBP-1的最終沉淀懸浮于6M胍、50mMTris，pH7.5，6mMDTT(25ml/10g細胞)中。將懸液于室溫下保溫15分鐘。以20,000xg離心30分鐘以除去未溶解的蛋白質。IGFBP-I的終濃度為1.0mg/ml。對沉淀和上清液的SDS-PAGE分析顯示，IGFBP-1只存在于上清中。對變性并還原的IGFBP-1進行三步驟再折疊處理。a)向上清液中加入氧化態(tài)谷胱甘肽，即混合的二硫化物生成劑(GSSG)至終濃度為25mM，并于室溫下保溫15分鐘。b)然后用50mMTris、pH9.7將溶液逐步稀釋10倍并加入苯甲基磺酰氟至終濃度為1mM。蛋白質的終濃度為100μg/ml。c)將再折疊混合物于4℃保溫過夜，然后以20,000xg離心15分鐘。對沉淀和上清液的SDS-PAGE分析顯示上清液含有相對均質的IGFBP-1。用緩沖液C(0.05％TFA)將上清液的等分樣品(50μl)稀釋至200μl，注射至反相柱(RP-4，1×250mm，Synchrom)上，并使用流速為0.1ml/分鐘的線性梯度(增加1％緩沖液D/分鐘)，用80％乙腈、0.042％TFA(緩沖液D)洗脫。于68分鐘時洗脫代表再折疊之IGFBP-1的單一主峰。在5M胍、50mMTrispH7.5、100mMDTT中完全還原并變性后，再折疊之IGFBP-1的保留時間變?yōu)?1.0分鐘。這些結果表明，在所述條件下IGFBP-1再折疊成單一的優(yōu)勢蛋白質。對在68.0分鐘洗脫的IGFBP-1的N末端序列分析給出序列MetAlaProTrpGlnCysAlaPro…(SEQIDNO3).該序列與人IGFBP-1的N末端氨基酸序列(SEQIDNO1)相匹配，不同的只是重組蛋白質的N末端上多一個甲硫氨酸殘基。B.再折疊之IGFBP-1的分離將從含有正確再折疊之IGFBP-1的590gE.coli膏制備的再折疊混合物(15000ml)濃縮到1800ml，對20mM磷酸鈉(pH6.0)透析，以10,000xg離心30分鐘以除去沉淀的E.coli蛋白質，并加于預先用同樣緩沖液平衡過的Q-Sepharose(Pharmacia/LKB，Piscataway，NJ)柱(5.0×60cm)上。以20ml/分鐘的流速用5000ml達到0.5MNaCl的線性梯度洗脫結合的蛋白質。每份收集25ml。在0.3-0.4MNaCl時洗脫出單一主峰；用反相層析柱(RP-4，1×250mmSynchrom)分別分析每部分的100μl等分樣品。收集合并含有優(yōu)勢正確再折疊之IGFBP-1(根據(jù)RP-4分析結果確定的)的部分(900ml)，將pH調到7.5，將導電率調至1mMNaCl(95毫歐姆)，并加于預先用20mMHEPES(pH7.5)、1.0MNaCl以30ml/分鐘的流速平衡過的Toyopearlbutyl-650S疏水作用柱(5×5cm)(Supelco，Bellefonte，PA)上。以40ml/分鐘的流速用1500ml達到20mMHEPES，pH7.5的線性梯度洗脫蛋白質。在5-15％乙醇處洗脫出單一寬峰。用RP-4反相層析法和SDS-PAGE法分析各峰部分的等分樣品(10μl)。合并含有純的(95％)正確再折疊之IGFBP-1的各部分，濃縮至6-8mg/ml并檢測其生物活性。在下列所有使用IGFBP-1的實驗中，均使用重組體E.coli表達的IGFBP-1。實施例2IGFBP-1抑制IGF-I和生長激素在大鼠體內的生長促進作用從動物體切除垂體以去掉生長激素的來源并致使其生長停止?？砂碨choenle等人(Nature，296252-253(1982))所述方法經注射外源生長激素或IGF-I，以刺激切除垂體的動物生長。在該模型中試驗皮下給予IGFBP-1對IGF-I和生長激素刺激生長的影響。經檢測體重增加和脛骨骺寬度估計動物生長情況。A.IGF-I實驗由商業(yè)來源(CharlesRiver，Wilmington，MA)得到體重為120-130g的手術切除了腦垂體的雄性SpragueDawley大鼠。在實驗開始前2至3周監(jiān)測大鼠的體重，以證實腦垂體已完全切除。研究中排除每周體重增加2g以上的大鼠。用0.2ml載體溶液(40mMHEPES、100mMNaCl)、單一IGF-I(80μg)、單一IGFBP-1或以不同摩爾比例與BP-1合并的IGF-I(80μg)，在大鼠頸背部每天兩次皮下注射，連續(xù)注射8天。試驗的IGFBP-1IGF-I的摩爾比例為0.04∶1至5∶1。每天測體重。在接受最后一次注射后12小時殺死動物。切掉動物的右和左脛骨，用福爾馬林固定，在矢狀面上斷裂其遠端并按Greenspan(Endocrinology，45455-463(1949))所述用硝酸銀染色。鈣化的組織染成深褐色，并且軟骨的增殖帶呈現(xiàn)為有清晰界限的白色帶狀。用裝有精細測微鏡片的立體顯微鏡測量軟骨骺板。得出約10個通過各骨骺的讀數(shù)。計算每只大鼠的右和左脛骨之聯(lián)合讀數(shù)的平均值。幾次實驗的結果總結于表1中。注射載體的大鼠在試驗的8天期間沒有增加體重，而注IGF-I的大鼠在該期間里每只大鼠平均體重增加了大約6克。以5∶1的IGFBP-1IGF-I處理的大鼠沒有顯示明顯的體重增加，表明在該模型中過量IGFBP-1阻斷了IGF-I的生長促進作用。以相對于IGF-I以1∶1和0.2∶1的摩爾比例注射IGFBP-1對IGF-I刺激的生長產生了50-75％的抑制作用。在所有接受IGFBP-1的各組中沒有檢測到單用IGF-I刺激的生長增進。另外，單蟲給予IGFBP-1也沒有明顯的生長促進作用。給用相對于IGF-I的摩爾比例為5∶1和1∶1的IGFBP-1，可見對IGF-I刺激的脛骨骨骺寬度加大具有統(tǒng)計學上顯著的抑制作用(表1)。這些數(shù)據(jù)表明IGF8P-1抑制由IGF-I刺激的骨和軟骨生長。表1皮下注射IGFBP-1對IGF-I刺激的體重和脛骨骺寬度增加的影響*大鼠每天接受兩次注射。**數(shù)值是每組8至15只大鼠的平均數(shù)±平均數(shù)的標準差。B.生長激素實驗本實驗的設計與IGF-I實驗相同，不同的只是大鼠接受生長激素而不是IGF-I注射。在不同的注射部位皮下注射生長激素和IGFBP-1。以每次注射10mg/kg的量每天注射兩次IGFBP-1，這個劑量等于上述實驗中以5∶1過量摩爾比例的給藥量。以每次注射15毫單位的量每天注射兩次人腦垂體產生的生長激素(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)。這一生長激素劑量比前述實驗中所用的IGF-I在大鼠體內激發(fā)了更強的生長反應。在6天給藥期間平均每只用生長激素處理的大鼠體重增加12克(表2)。用IGFBP-1處理的大鼠體重增加約受到75％的抑制。相對于用載體處理動物，生長激素刺激的脛骨骨骺寬度約增加兩倍(表2)。合用IGF3P-1則使生長激素刺激的脛骨骨骺寬度增加受到約75％的抑制(表2)表2皮下注射IGFBP-1對生長激素刺激的體重和脛骨骨骺寬度的影響*大鼠每天接受兩次注射。**數(shù)值為每組5只大鼠的平均值±平均值的標準差。上述實驗表明，IGFBP-1在大鼠體內能夠抑制IGF-I和生長激素的生長促進作用。實施例3IGFBP-1在體外抑制人乳腺癌細胞的生長針對人乳腺癌細胞系檢測IGF-I、IGF-II和IGFBP-1的生物學作用。人乳腺癌細胞系MCF7得自位于Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(登記號HTB22)。細胞維持于含有10％小牛血清、10μg/ml胰島素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素、10μg/ml鏈霉素和非必需氨基酸(IrvineScientific)的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基(得自Mediatech，Merndon，VA)中。為了進行細胞增殖試驗，經用胰蛋白酶和EDTA簡單處理從平皿中離散出MCF7細胞。以加在無血清培養(yǎng)基(含有1mg/ml牛血清白蛋白、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和非必需氨基酸的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基)中每孔2×104個細胞的量，將細胞鋪敷于96孔組織培養(yǎng)板(CostarCorporation，Cambridge，MA)中。以200μl的終體積向各孔中加入不同稀釋度的IGF-I、IGF-II或IGFBP-1。37℃保溫4天后，向各孔中加入20μl濃度為5mg/ml的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物；可得自SigmaChemicalCompany，編目號N5655)。將細胞繼續(xù)于37℃保溫6小時。加入50μl含50％二甲基甲酰胺、20％十二烷基硫酸鈉(pH4.7)的溶液，以溶解細胞和水解的MTT。37℃保溫過夜后，用VMAX動力學微量平板讀數(shù)器(MolecularDevicesCorporation，PaloAlto，CA)在570nm處測定液體的光密度并減去650nm光密度本底，以定量水解的MTT。如根據(jù)細胞培養(yǎng)物的光密度增加所證實的，IGF-I和IGF-II均引起了MCF7細胞的增殖(表3)。IGF-I刺激MCF7細胞增殖的能力約比IGF-II強5倍。在IGF-I濃度約為1-120ng/ml，IGF-II濃度約為10-1200ng/ml時出現(xiàn)MCF7細胞增殖。IGFBP-1以一種劑量依賴方式抑制IGF-I和IGF-II刺激的MCF7細胞增殖(表4和5)。這是在漸增量的IGFBP-1存在下，將MCF7細胞與60ng/ml的IGF-I或300ng/ml的IGF-II一起保溫后測知的。除不含血清或胰島素外，所使用的組織培養(yǎng)基與用來維持細胞生長的培養(yǎng)基相同。對于IGF-I，試驗的IGFBP-1濃度范圍為6至13,600ng/ml。在IGFBP-1濃度約為180ng/ml，即相當于IGF-I∶IGFBP-1為大約1∶1摩爾比時出現(xiàn)大約50％的生長抑制作用(表4)。當IGFBP-1濃度超過4000ng/ml，即相當于使用約20倍摩爾過量的IGFBP-1時，達到基本上完全的生長抑制。對于IGF-II，所試驗的IGFBP-1濃度范圍約為30ng/ml至23,000ng/ml。在IGFBP-1濃度約為840ng/ml即稍大于IGF-I∶IGFBP-1約為1∶1的摩爾濃度比時，使IGF-II生長反應受到約50％的抑制(表5)。當IGFBP-1濃度超過22,000ng/ml，即相當于稍大于20倍摩爾過量的IGFBP-1時，出現(xiàn)基本上完全的生長抑制作用。表3IGF-I和IGF-II對MCF-7乳腺癌細胞生長的刺激作用*IGF-I和IGF-II濃度值四舍五入取最接近的整數(shù)。**570nm處光密度減去650nm處光密度。為一式三孔的平均值。標準偏差小于平均值的11％。表4IGFBP-1對IGF-I刺激的MCF-7乳腺癌細胞生長的抑制作用*IGFBP-1濃度值四舍五入取最接近的整數(shù)。**570nm處光密度減去650nm處光密度。為一式三孔的平均值。標準偏差小于平均值的8％。表5IGFBP-1對IGF-I刺激的MCF-7乳腺癌細胞生長的抑制作用570nm處光密度減去650nm處光密度。為一式三孔的平均值。標準偏差小于平均值的11％。實施例4IGFBP-1在體外抑制人結腸癌細胞系的生長試驗IGF-I和IGFBP-1對多株人結腸癌細胞系的生物學作用。6株人結腸癌細胞系得自位于Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心。這些細胞系是SK-CO-1(HTB39)、LS174T(CL188)、DLD-1(CC1221)、HT-29(HTB38)、COLO-205(CCL222)和Caco-2(HTB37)，括號內的號是指ATCC登記號。之所以選擇這些細胞系是因為按照ATCC目錄中提供的說明，它們都能在裸鼠體內生成腫瘤。將細胞維持在含有10％小牛血清、2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基(Mediatech，Herndon，VA)中。按下述方法檢測IGF-I對這6株結腸癌細胞系的作用。當細胞達到90-100％匯合時，經用胰蛋白酶/EDTA溶液作簡單處理可從平皿上溶散細胞。將細胞洗幾次，計數(shù)并以1×105個/ml的濃度重新懸浮于無血清培養(yǎng)基(含有2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基)中。在96孔組織培養(yǎng)平板(CorningGlassWorks，Rochester，NY)的每個孔中加入100μl細胞懸浮液，在各孔中加入100μl含有不同量IGF-I的無血清培養(yǎng)基，并用吸移法輕輕混合各培養(yǎng)物。將平板于37℃保溫3天。此時，使用結晶紫染料檢測法定量細胞數(shù)。抽掉培養(yǎng)基并在每孔內加入150μl結晶紫染料[2g結晶紫(AldrichChemicalCompany，Inc.，Milwaukee，WI)溶解于含270ml37％甲醛和20ml磷酸鉀pH7.0的溶液中]。20分鐘后抽出液體并用磷酸鹽緩沖鹽水將細胞洗3次。在每孔內加入200μl抽提緩沖液(50％乙醇、0.1M檸檬酸鈉pH4.2)并在室溫下將平板放置過夜。第二天使用微量平板讀數(shù)器(MolecularDevices，PaloAlto，CA)測出小孔的570nm光密度。如根據(jù)細胞培養(yǎng)物的光密度增加所證實的，所有6株細胞系均在對IGF-I反應中增殖(表6和7)。Caco-2細胞系在無血清培養(yǎng)基中生長良好，提示它可產生一種或多種內源性生長因子。IGF-I可增加Caco-2細胞系在無血清培養(yǎng)基中的生長(表6)。在所試驗的條件下，檢測的其他結腸癌細胞系在無血清培養(yǎng)基中沒有表現(xiàn)明顯的細胞增殖。但正如由培養(yǎng)物的光密度增加所證實的，它們都在對IGF-1的反應中發(fā)生增殖(表6和7)。表6IGF-I對人結腸癌細胞系生長的刺激作用*IGF-I濃度值四舍五入取最接近的整數(shù)。**570nm處光密度一式三孔的平均值。表7IGF-I對人HT一29結腸癌細胞生長的刺激作用*IGF-I濃度值四舍五入取最接近的整數(shù)。**570nm處光密度一式三孔的平均值。然后檢測IGFBP-1對這些細胞系生長的作用。與其測定IGFBP-1對IGF-I刺激的細胞生長的作用，不如測定IGFBP-1是否能在血清存在下抑制細胞的生長，這樣更能代表體內狀態(tài)。經用胰蛋白酶/EDTA簡單處理，從培養(yǎng)板中離散出細胞，洗細胞，以1×105個細胞/ml的濃摩將細胞再懸浮于含4％小牛血清、2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基中，并在96孔組織培養(yǎng)板的每孔中加入100μl細胞懸液。用含有2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的無血清Eagle氏極限必需培養(yǎng)基將IGFBP-I稀釋成不同的濃度并在96孔培養(yǎng)板的每孔中加入100μl該混合物。經輕輕抽吸混合細胞培養(yǎng)物并于37℃保溫3天。最終血清濃度為2％。此時使用如上文所述的結晶紫染料檢驗法定量細胞數(shù)目，于2％血清存在下，IGFBP-1致使其中4株細胞系(Caco-2、COLO-205、HT-29和SK-CO-1)的生長反應受到明顯抑制(表8和9)。當IGFBP-1水平達到每毫升幾百毫微克之前可看到小的生長抑制作用。觀察到的最大生長抑制率在30％至100％之間(IGFBP-1水平為10-20μg/ml)。IGFBP-1對LS174T和DLD-1細胞系的血清刺激生長影響較小(IGFBP-1水平在10-20μg/ml時，最大抑制率分別為9和22％)。未檢測血清中游離IGF-I和IGF-II的濃度。表8IGFBP-1對血清刺激的人結腸癌細胞系生長的抑制作用*IGFBP-1濃度值四舍五入后取最接近的整數(shù)。**570nm的處光密度。一式三孔的平均值。表9IGFBP-1對血清刺激的人SK-CO-1結腸癌細胞系生長的抑制作用<*IGFBP-1濃度值四舍五入后取最接近的整數(shù)。**570nm的處光密度。一式三孔的平均值。實施例5IGFBP-1體外抑制人骨肉瘤細胞系的生長使用大鼠骨肉瘸細胞系UMR-106(CRL1661)檢測BP-1抑制IGF-I刺激的骨肉瘤生長的能力。UMR-106(CRL1661)細胞系得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)。細胞被維持于含有7％小牛血清、100單位/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和2mM谷氨酰胺的Ham氏F12培養(yǎng)基(可得自Mediatech，Herndon，VA)中。細胞在對IGF-I反應中發(fā)生增殖。將細胞加于48孔組織培養(yǎng)板(CostarCorporation，Cambridge，MA)的各小孔中。當細胞逐漸匯合時(37℃保溫約3天后)，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細胞洗2次并在沒有小牛血清的上述培養(yǎng)基中預保溫24小時。預保溫后，除去培養(yǎng)基并換成0.5ml含有IGF-I之系列稀釋液(1-1,000ng/ml)的無血清Ham氏F12培養(yǎng)基中。將平板于37℃繼續(xù)保溫20-24小時。然后于37℃用0.5μCi的3H-胸苷(NENresearchproducts，DupontCo.，Boston，NA)脈沖處理4小時，并用冷PBS洗細胞3次。向細胞中加入冷的7％三氯乙酸(J.T.BakerInc.，Phillipsburg，NJ)從沉淀DNA。用95％乙醇淋洗細胞后，加入0.3MNaOH溶解細胞。收集等分樣品，用閃爍計數(shù)器計數(shù)以測定摻入DNA中的3H-胸苷的量。所有檢測均以一或3孔進行。如表10中所示，IGF-I引起摻入DNA中的3H-胸苷呈劑量依賴性增加。最大反應為不加IGF-I時所看到之反應水平的約6倍以上。在不同的實驗中IGF-I的ED50值范圍為4-20ng/ml。表10IGF-I對大鼠骨肉瘤UMR-106細胞生長的刺激作用*IGF-I濃度值四舍五入取最接近的整數(shù)。**每分鐘計數(shù)，一式三孔的平均值。使用作了如下改變的上述檢測法檢測IGFP-1對IGF-I刺激的UMR-106細胞生長的作用。保溫步驟后將細胞加在含50ng/mlIGF-I和不同濃度之BP-I(200至16000ng/ml)的Ham氏F12培養(yǎng)基中保溫。培養(yǎng)基還含有2mM胍、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。37℃保溫20-24小時后，用0.5μCi3H-胸苷脈沖處理細胞達4小時，用冷PBS洗3次，并用冷7％三氯乙醇沉淀DNA。用95％乙醇淋洗細胞、溶解于0.3MNaOH中并在閃爍計數(shù)器中計數(shù)等分樣晶。其中一個實驗的結果示于表11中。數(shù)據(jù)表明，IGFBP-1抑制IGF-I對骨肉瘤細胞的促有絲分裂作用。約20倍摩爾過量的IGFBP-1(2,000ng/ml)使50ng/mlIGF-I的促有絲分裂作用受到50％的抑制。如用50-100倍摩爾過量的OGFBP-1(8,000-16,000ng/ml)貝可見50ng/mlIGF-I的促有絲分裂作用基本上完成被抑制。在這些實驗中為抑制IGF-I的作用所需的IGFBP-I的量大于在其他實驗中用其他細胞系觀察到的IGFBP-1使用量。這種情況可能是由于在該實驗中50ng/mlIGF-I產生了最大促有絲分裂反應。表11IGFBP-1對IGF-I刺激的大鼠骨肉瘤UMR-106細胞生長的抑制作用*每分鐘計數(shù)，一式三孔的平均值。實施例6IGFBP-1抑制平滑肌細胞的生長試驗IGFBP-1以確定其能否抑制平滑肌細胞對IGF-I的增殖反應。大鼠平滑肌細胞樣細胞系A10得自位于Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(目錄編號CRL1476)。B.W.Kimes和B.L.Brandt(ExperimentalCellResearch，98349-366(1976))已鑒定了A10細胞系的特征。細胞維持在含有10％小牛血清、2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco氏改動的Eagle氏培養(yǎng)基，得自Mediatech，Inc.Herndcn，VA)中。為進行增殖試驗、經用胰蛋白酶/FDTA溶液簡單處理從培養(yǎng)板中離散出細胞，用含血清培養(yǎng)基洗一次，用無血清培養(yǎng)基洗兩次后，使用血細胞計數(shù)器計數(shù)。以2×105細胞/ml的濃度將細胞再懸浮于含有2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的無血清DMEM培養(yǎng)基中。在96孔組織培養(yǎng)板(CorningGlassWorks，Rochester，NY)的每個孔內等分加入100μl細胞懸液。向適當?shù)目變燃尤?00μl含有漸增量之IGF-I(0、2、20、200或2000ng/ml)的無血清培養(yǎng)基，并將平板子37℃保溫3天。此時即使用實施例3中所述的結晶紫染料檢測法定量細胞數(shù)。如根據(jù)孔內容物之光密度的增加所測知的，IGF-I引起了細胞數(shù)目的劑量依賴性增加(表12)。當IGF-I濃度為100ng/ml時出現(xiàn)最大增殖反應。表12IGF對大鼠的A-10平滑肌細胞生長的刺激作用>*570nm處光密度，6孔的平均值。使用上述細胞增殖檢測法檢測重組IGFBP-1對IGF-I刺激的A-10細胞生長的作用。使用相同方式進行檢測，但其中試驗孔內含有100ng/mlIGF-I。有些孔還含有濃度范圍為1-10,000ng/ml的IGFBP-1。如由細胞培養(yǎng)物的光密度增加所證實的，IGFBP-1引起了細胞數(shù)目的劑量依賴性增加(表13)。當IGF3P-1濃度為1000ng/ml時、其降低細胞數(shù)目達到如沒有加任何外源IGF-I的水平(稱為基線增殖)。當濃度為10μg/ml時，IGFBP-1降低細胞數(shù)目低于如細胞在無血清培養(yǎng)基中生長的水平，此提示大鼠A-10細胞產生內源IGF-I或IGF-II。這些數(shù)據(jù)表明，IGFBP-1抑制平滑肌細胞對IGF-I的增殖反應。表13IGFBP-1對IGF-I刺激的大鼠A-10平滑肌細胞生長的抑制作用<570nm處光密度，三孔的平均值。實施例7IGFBP-1突變型蛋白的制備A.IGFBP-1突變型蛋白的構建對包含于質粒pJU1021(ATCC登記號No.67730)中的IGFBP-1DNA序列進行誘變、以構建兩個IGFBP-1突變型蛋白，即C98和C101。在C98突變型蛋白中，成熟蛋白質序列98位上的絲氨酸已改變成半胱氨酸殘基。在C101突變型蛋白中，成熟蛋白質101位上的絲氨酸已改變成半胱氨酸殘基。殘基編號是基于SEQIDNO1。使用聚合酶鏈式反應(PCR)技術進行誘變。使用質粒T88IQIGFBP-1DNA作為起始模板DNA制備C98突變型蛋白。質粒pT88IGFBP-1含有質粒pT88IQ的野生型IGFBP-1編碼序列。表達載體pT88IQ是表達載體pT3XI-2的衍生物。按下述方法構建載體pT3XI-2。用于該構建的起始質粒是購自Pharmacia的質粒pKK223-3。質粒pKK223-3攜帶有四環(huán)素抗性的部分基因。用質粒pBR322攜帶的完整四環(huán)素抗性基因取代該非功能性基因。用SphI完全消化并用BamHI部分消化質粒pKK223-3。凝膠純化4.4千堿基對片段并與合成的銜接頭(SEQIDNO4)5’GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT3’3’__ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC5’BglIIClaI和來自pBR322(PLBiochemicals，27-4891-01)四環(huán)素抗性基因之ClaI、SphI消化產物的539堿基對DNA片段連接。所得質粒被命名為pCJ1。然后將購自NewEnglandBiolabs(Beverly，Massachusetts)的XhoI接頭插入質粒pCJI的PvuII位點以形成質粒pCJX-1。這一插入破壞了控制質?？截悢?shù)的rop基因。然后從質粒pMC9(Calosetal.，1983)中純化含有l(wèi)acI基因的EcoRI片段，并插入帶有XhoI至EcoRI銜接頭的XhoI位點。然后經用EcoRI和PstI切割用含有附加位點的多接頭(SEQIDNO5)5’AATTCCCGGGTACCAGATCTGACTCACTAGTCTGCA3’3’GGGCCCATGGTCTAGACTCGAGTGATCAG5’置換質粒pKK223-3中的多接頭區(qū)。如此得到的質粒載體被稱為pCJXI-1。最后，用具有與被亞硫酸氫鹽誘變破壞之限制性酶HindIII、BamHI和SalI識別位點相似的基因取代四環(huán)素抗性基因。使用下述方法突變pBR322的四環(huán)素抗性基因。用HindIII切割質粒pBR322，然后用亞硫酸氫鈉誘變(ShortleandBotstein，1983)。連接被誘變的DNA以形成環(huán)形DNA，然后用HindIII切割以使任何逃脫誘變的質粒線性化。用此消化混合物轉化E.coliJM109(Yanisch-Perronetal.，1985)。分離四環(huán)素抗性菌落并檢查質粒的四環(huán)素抗性基因中HindIII位點的丟失情況。將此被成功地突變的質粒稱為pT1。按相似方法誘變pT1中的BamHI位點，得到質粒pT2。反復誘變質粒pT2以除去SalI位點，形成質粒pT2。分離攜帶了已突變之四環(huán)素抗性基因的pT3中的ClaI-StyI片段，并用至取代pCJXI-1的同源片段以形成pT2XI-2。已突變的四環(huán)素抗性基因仍編碼功能性蛋白質。按下述方法在tac啟動子區(qū)域的下游導入一個多接頭，除其他位點外該多接頭中還含有適用于在E.coli中表達克隆基因的BamHI和KpnI限制性位點。如在pT3XI-2中一樣，被克隆的含有pT88IQ載體之基因的表達是由tac啟動子驅動的。轉譯在獨特的NdeI識別序列CATATG的ATG(消除了下游NdeI位點，從而使該起始位點NdeI序列成為獨特的)處開始。在NdeI位點的下游有一個多接頭，利于插入所需的基因。另外，用截短的片段(其除去了lacZ啟動子及作為lac阻遏物結合位點的操縱基因區(qū)域)取代含有LacI區(qū)域的XhoI片段。置換中的lacI區(qū)域還攜帶IacIq突變-導致lac阻遏物產生增加的單堿基置換(Muller-Hilletal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)591259-1264(1968))。pT3XI-2和pT88IQ間的特異性差別如下1.克隆位點區(qū)。在多接頭的EcoRI位點上游和多接頭之下游末端處的HindIII位點間，下列135mer序列(SEQIDNO6)被取代5’＞CACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTFGTTTFAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCCGGGTACCGTCGACGAGCTCTTCGAACTAGTCCGCGGT＞3’該序列在表達起始密碼子處含有NdeI位點(劃下線處)和含有BamHI、XmaI、KpnI、SalI、SacI、BstBI、SpeI和SacII之識別位點的多接頭。2.下游NdeI位點。在pT3XI-2克隆區(qū)域的大約2.4kb下游有一個NdeI位點。除去該位點從而使得如上所述的起始密碼子處的NdeI位點成為pT88IQ中唯一的Nde位點。該位點從5′＞CATATG＞3′至5′＞CATATATG＞3′，從而除掉NdeI識別序列。3.IacIq區(qū)域pT3XI-2中含有l(wèi)acI區(qū)域的兩個XhoI位點間的區(qū)域被下面1230堿基序列所取代pT88IQ的lacIq序列(1230bp)(SEQIDNO7)CCATGGCTGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTFGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTFCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCGGAATTAATTCAGCCATGG該被取代的區(qū)域除掉lacZ啟動子和作為lac阻遏物之結合位點的操縱基因區(qū)域。其還含有致使lac阻遏物合成增加的lacIq突變(Muller-Hilletal，文獻出處同上)。經用限制性酶XbaI和HindIII消化，從質粒pJU1021中分離IGFBP-1DNA序列，并使用NA-45濾膜按制造前提供的說明書以瓊脂糖凝膠電泳法純化之(SchleicherandSchuell，Keene，NH)。將分離出的IGFBP-1DNA片段克隆到已用)XbaI和HindIII消化并按上述方法經凝膠電泳純化的質粒pT88IQ中。將此正確地再構建的質粒定名為pT88IQIGFBP-1。在PCR誘變反應中使用的5′寡核苷酸引物(IGFBP-1-5′)具有序列5′CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTACTTTAAGAAGGA3’(SEQIDNO.8).3′寡核苷酸引物(IGFBP-1-C98)具有序列5′CAGGAGCTCCTCCTCAGTTATCTCCGTGCTCTCTGGGCATTCAGGGCTCCCTGCCTCTGCAGCATGGGG3’(SEQIDNO.9).在含有10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，25mMMgCl2，0.001％明膠，各500μMdATP、dCTP、DGTP和TTP，各30pmoleIGFBP-l-5′和IGFBP-1-C98引物，1-10ngpT88IQIGFBP-1質粒DNA及5單位“AmpliTaq”TaqDNA聚合酶(Perkin-ElmerCetus，由RocheMolecularSystems，Inc.Branchburg，NJ出售)的50μl反應混合物中進行PCR反應。PCR反應條件是開始在96℃保溫3分鐘，35次循環(huán)(96℃反應1分鐘，66℃反應1分鐘，72℃反應1.5分鐘)，最后于72℃保溫10分鐘。使用經瓊脂糖凝膠純化的含有作為起始模板DNA之野生型IGFBP-1編碼序列的DNA片段制備C101突變型蛋白。經用NdeI和HindIII消化質粒pJU1020得到IGFBP-1編碼序列，并用瓊脂糖凝膠電泳法純化約0.8kb的IGFBP-1編碼DNA片段。PCR誘變反應中使用的5′寡核苷酸引物與用于構建S98C突變蛋白的引物(IGFBP-1-5′)相同。3′寡核苷酸引物(IGFBP-1-C101)具有序列5′CCCGAGCTCCTCCTCAGTTATCTCCGTGCACTCTGGGCTTTCAGGGCTCCCTGC3’(SEQIDNO.10)。在含有10mMTris-HClpH8.3，50mMKCl，1.5mMMgCl2，0.001％明膠，各200μMdATP、dCTP、DGTP和TTP，20pmoleIGFBP-1-5′和IGFBP-1-C101引物以及2.5單位“AmpliTaq”TaqDNA聚合酶的100μl反應混合物中進行PCR反應。PCR反應條件是95℃反應1分鐘，50℃反應1分鐘，72℃反應1分鐘-計30次循環(huán)，然后72℃保溫10分鐘。PCR后，使反應混合物通過ChromaSpin100柱(ClonTech，PaloAlto，CA，目錄編號K1332-2)，以除去核苷酸和未被摻入的DNA引物。用XbaI和SacI消化DNA片段并按上述程序經瓊脂糖凝膠電泳純化正確大小的片段(約0.43kb)。將純化的DNA片段與XbaI＋SacI消化的pT88IQIGFBP-1質粒DNA連接。用連接混合物轉化E.coli菌株DH5α(可得自ClonTeehLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)并鋪敷在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。從各次轉化得到的幾個菌落中制備質粒DNA并測定跨越被插入區(qū)的兩股核苷酸的序列。選擇各突變蛋白的有正確序列的質粒。將其定名為克隆C101-3(C101突變蛋白)和C98-12(C98突變蛋白)。然后將突變的IGFBP-1基因再轉回質粒pT5T中(EisenbergS.P.etal.，Nature，343341-346(1990))。為此，用NdeI和HindIII消化得自克隆C101-3和C98-12的質粒DNA，凝膠純化含有突變體IGFBP-1基因的約800bp帶，并將它連接到已用同樣的限制性酶消化的pT5T質粒DNA上。用連接混合物轉化E.coli菌株BL21/DE3并鋪敷在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。從各次轉化得到的幾個菌落中制取質粒DNA。將具有正確序列的克隆定名為pT5TIGFBP-1-C98(C98突變蛋白)和pT5TIGFBP-1-C101(C101突變蛋白)。B.洗過的包涵體的制備在10升發(fā)酵罐中培養(yǎng)表達C98或C101突變型蛋白的E.coli細胞。將從發(fā)酵罐中得到的細胞以6ml緩沖液/克細胞的比例重新懸浮于破胞緩沖液(50mMTris，25mMNaCl，1mM二硫蘇糖醇(“DTT”)，pH7.5)中。使用French細胞擠壓器以10,000psi的壓力破碎細胞。將懸浮液以17,700xg離心30分鐘。將含有包涵體的沉淀再懸浮于破胞緩中液中以清洗之，然后再次以17,700xg離心?？衫鋬霰４嫦催^并再次離心的沉淀以待進一步處理。沉淀中所含蛋白質的約80％是突變型蛋白。C.突變型蛋白再折疊首先使用細胞勻漿器將沉淀溶解于6M鹽酸胍、50mMTris，6mMDTT，pH7.5中(每10ml緩沖液溶解1g沉淀)以使各突變型蛋白變性。向溶解的沉淀中加入氧化態(tài)谷胱甘肽(“GSSG”)至其終濃度為23mM，以開始再折疊。將溶液于室溫保溫15分鐘，之后逐步用50mMTris(pH9.7)稀釋至蛋白質終濃度為100μg/ml，且谷胱甘肽終濃度為0.6M。用考馬斯蘭蛋白質檢測法檢測蛋白質濃度(Pierce，Rockford，IL)。然后加入半胱氨酸和苯甲基磺酰氟使其終濃度分別為5.6mM和1mM。將再折疊溶液于4℃保溫過夜。在C4反相層析柱(RP-4，1×250mM，Synchrom，Lafayette，IN)上分析100μl再折疊溶液的等分樣品以監(jiān)測再折疊情況。用2％乙腈(CH3CN)，0.05％三氟乙酸(“TFA”)平衡C4柱。將100μl再折疊溶液的等分樣品注射到平衡過的柱上，并使用達到60％CH3CN，0.05％TFA、以2％/分鐘改變緩沖液B的線性梯度，以0.25ml/分鐘的流速進行洗脫。對于每種突變型蛋白，重新折疊的蛋白質均比還原并變性的但未重新折疊的蛋白質早大約2分鐘作為尖峰被洗脫。D.重新折疊的突變型蛋白的純化用具有3kDa截留分子量的AmicoS10Y3超濾膜(AmicondiVisionofWRGraceandCo.，BeverlyMassachusetts)將再折疊溶液濃縮約10倍，并對20mM磷酸鈉(pH6.0)透析。將透析的溶液以17,700xg離心30分鐘并通過0.2μ濾膜過濾上清液。將過濾后的蛋白質以20ml/分鐘的速度加于預先用20mM磷酸鈉(pH6.0)平衡過的Q-Separose陰離子交換柱(5×30cm，PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上。以20ml/分鐘的流速用達到20mM磷酸鈉、0.5MNaClpH6.0的線性梯度(5倍柱體積)洗脫結合的蛋白質。以每管25ml收集洗脫物。各突變型蛋白均在大約0.2-0.25MNaCl處被洗脫。使用與上述監(jiān)測再折疊的相同條件在C4反相柱(RP-4，1×250mm，Synchrom，Lafayette，IN)上分析，或用SDS-PAGE法分析各管內容物。合并含有重新折疊之突變型蛋自的各管(即在0.2-0.25MNaCl時洗脫的各管)，并透析到20mMTris-HCl，1MNaCl，pH7.5中。以25ml/分鐘將經過透析的材料上樣于預先用20mMTris-HCl，1MNaCl(pH7.5)平衡過的ButylSepharose(Supelco，Bellefonte，PA)疏水作用柱(5×8cm，PamaciaBiotech，Piscataway，NJ)上。以20ml/分鐘的流速，用達到20mMTris，0NaCl，25％乙醇(pH7.5)的線性梯度(10-15倍柱體積)洗脫結合的蛋白質。在大約15-20％乙醇濃度處洗脫作為不對稱峰的各突變型蛋白。使用上述監(jiān)測重新折疊所用的同樣條件在C4反相層析柱(RP-4，1×250mm，Synchrom，Lafayette，IN)上，或使用SDS-PAGE法分析含蛋白質各管(在15-20％乙醇處洗脫的)的100μl等分樣品。合并含有純化之突變型蛋白的各管，濃縮到大約0.8mg/ml并透析到20mMTris，250mMNaCl(pH7.4)中。按實施例9中所述方法檢測純化之再折疊突變型蛋白的生物活性。實施例8IGFBP-I突變型蛋白的PEG化使用平均分子量為20kDa，具有結合(CH3O-(CH2CH2O)n-NHCOCH2CH2-N)之巰基特異性順丁烯二酰亞胺反應性基團的單個氧基PEG(其中n是單體單位的數(shù)目)對C98和C101突變型蛋白進行PEG化處理。PCT申請公開No，WO92/16221(列為本文參考文獻)中討論了其他適用PEG順丁烯二酰亞胺試劑的制備和使用。在重新折疊期間，被取代的半胱氨酸殘基(分別為C98和C101中的CYS98或CYS101)可與谷胱甘肽形成混合的二硫化物以成為Cys-S-S-GSH，或與半胱氨酸形成二硫化物以成為Cys-S-S-Cys。相應地，在與PEG試劑反應時沒有可用的游離巰基，因此，在與PEG試劑反應之前純化的突變型蛋白被部分還原。室溫下，在20mMTris，(pH7.4)，250mMNaCl中以DTT對蛋白質摩爾比為5.625∶1的比例，使純化的突變型蛋白(0.45mg/ml)與DFT反應2小時，以完成部分還原反應。經酸化至pH5.5而終止還原作用。對10mM乙酸鈉(pH5.5)透析后除去DTT。室溫下，在15mM乙酸鈉，26mM磷酸鈉(pH7.0)，120mMNaCl中，以PEG對蛋白質的摩爾比為4∶1的比例(蛋白質終濃度為0.33mg/ml)，使部分還原的突變型蛋白分別與PEG試劑反應。對反應混合物的SDS-PAGE分析顯示大約50％部分還原的突變型蛋白被轉化成具有近似表觀分子量為大約67kDa的單PEG化的蛋白質(C98-PEG，C101-PEG)。呈現(xiàn)大的表觀分子量的部分原因是PEG與凝膠相互作用所致。將反應混合物調到含20mM磷酸鈉(pH6.5)。以20ml/分鐘的加樣速度將反應混合物加樣于用20mM磷酸鈉(pH6.5)平衡過的Q-AQSepharose陰離子交換柱(5×10cmPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上。以20ml/分鐘的流速，用達到20mM磷酸鈉、1MNaCl(pH6.5)的線性梯度(10倍柱體積)洗脫結合的蛋白質。在大約0.2MNaCl處洗脫C98和C101PEG化的突變型蛋白。每管收集25ml，并用SDS-PAGE分析等分樣品，收集在非還原SDS-PAGE上產生相當于PEG化突變型蛋白之單一優(yōu)勢帶的含PEG化C98或C101的各管，并按實施例9中所述方法進行生物學活性檢測。實施例9IGFBP-1和其突變型蛋白抑制IGF-I刺激的3T3細胞的生長使用結晶紫染料檢測法檢測細胞增殖情況。在96孔明膠包被的培養(yǎng)板上進行檢測。以25,000細胞/孔的量將Balb/c3T3成纖維細胞鋪敷在200μl含0-850ng/mlIGF-I的無血清DMEM(Dulbecco氏改善的Eagle氏培養(yǎng)基，Mediatech，Herndon，VA)中。在此期間，用150μl含0.2％結晶紫、10％甲醛、10mM磷酸鉀(pH7.0)的溶液替換培養(yǎng)基。室溫保溫20分鐘后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將小孔洗3次，并經與每孔200μl的50％乙醇/0.1M檸檬酸鈉(pH4.2)一起保溫而釋放出與細胞結合的染料。第二天讀出570nm處吸光率。表13中所示的結果表明，重組體IGF-I以劑量依賴方式刺激3T3成纖維細胞的增殖。在IGF-I濃度約為20-60ng/ml時呈現(xiàn)最大增殖。ED50約為5-20ng/ml。將細胞與一組不同量的IGF-I和漸增量的結合蛋白質共保溫，檢測IGFBP-1、C98和C101突變型蛋白，及PEG化的突變型蛋白對IGF-1刺激的3T3成纖維細胞增殖的影響。以25,000細胞/孔的量將Balb/c3T3成纖維細胞鋪敷在含有21ng/mlIGF-I和不同量IGFBP-l及不同的突變型蛋白(0ng/ml-11.520ng/ml)的200μl無血清DMEM中。將細胞繼續(xù)保溫72小時并按上述方法處理。所示結果表明，未PEG化的和PEG化的C98和C101突變型蛋白的生物活性與野生型重組體IGFBP-1的活性差不多(表14-18)。在所述條件下抑制50％的21ng/mlIGF-I活性所需的IGFBP-1濃度(IC50)，對于野生型IGFBP-1、IGFBP-1突變型蛋白和PEG化的IGFBP-1大約為200-300ng/ml。實施例8將由實施例1制成的小丸填充入硬明膠膠囊中。實施例9和10囊芯二氧化硅(0.1-0.3mm)1000g純化水1900g速尿靈(90％＜25μm)1000g聚乙烯吡咯烷酮，K-90100g聚合物層實施例9乙基纖維素分散體，30％(Aquacoat)128g枸櫞酸乙酰三丁酯10g表15C98突變型蛋白對3T3成纖維細胞生長的劑量依賴性抑制作用*吸光率數(shù)值是一式三份樣品的平均值。**S.E.代表平均值的標準差。表16C101突變型蛋白對3T3成纖維細胞生長的劑量依賴性抑制作用<>吸光率數(shù)值是一式三份樣品的平均值。S.E.代表平均值的標準差。表17C98PEG化突變型蛋白對3T3成纖維細胞生長的劑量依賴性抑制作用吸光率數(shù)值是一式三份樣品的平均值。S.E.代表平均值的標準差。表18C101PEG化突變型蛋白對3T3成纖維細胞生長的劑量依賴性抑制作用吸光率數(shù)值是一式三份樣品的平均值。S.E.代表平均值的標準差。表19野生型IGFBP-1對3T3成纖維細胞生長的劑量依賴性抑制作用</tables>實施例10IGFBP-1和PEG化的IGFBP-1的藥物動力學使用四只雄性SpragueDawley大鼠檢測藥物動力學參數(shù)。給兩只大鼠靜脈注射1mg/kg重組人IGFBP-1團塊，兩只大鼠靜脈注射1mg/kgPEG化的IGFBP-1C101突變型蛋白團塊。按實施例7和8中所述方法制備C101突變型蛋白并使之PEG化注射后0.016、0.083、0.033、0.075、1.5、2、3、5、6、8、10、12、24和48小時抽取尾靜脈血液樣品。將血樣收集到EDTA包被的試管中并離心收集血漿部分。使用MedixBiochemica(Kaumiaihen，F(xiàn)inland)IGFbp-1試驗藥盒(目錄登記號N0.10831ETNB)以ELISA法檢測血漿樣品中的IGFBP-1濃度。計算各試驗組中兩只大鼠的血漿濃度平均值并使用RstripII(MicromathSoftware，SaltLakeCity，Utah)調準兩或三條曲線。從配合好曲線中得到數(shù)據(jù)示于表20中。在注射野生型IGFBP-1和PEG化C101突變型蛋白后ELISA可檢測的血漿IGFBP-1分別按照三指數(shù)律和雙指數(shù)律消失。使用配合好的曲線，按Pharmacokinetics(Gibaldi，M.，andPerrier，D.，Swarbricked.，1975)中所示計算出標準藥物動力學參數(shù)。表21中顯示了這些參數(shù)。結果表明PEG化可因降低了血漿清除率從而增加了循環(huán)時間，致使IGFBP-1的藥物動力學效能得到改善。表20*未測出表21*每組兩只大鼠的平均值。實施例11IGFBP-1抑制大鼠的血管再狹窄在氣體血管成形術后，檢測大鼠頸動脈中IGFBP-1改變增殖反應的能力。給19只體重約375g的未經受手術的SpragueDawley大鼠右頸靜脈內植入頸靜脈導管。一周后檢測導管開放性并開始通過系留灌注系統(tǒng)連續(xù)進行鹽水灌注。Francis，P.C.，etal.，“ContinuousIntravenousInfusioninFisher344ratsforSixMonthsAFeasibilityStutly”，ToxicologyMethods，Vol.2，pp.1-13(1992)中介紹了系留灌注系統(tǒng)(該文獻列為本文參考文獻)。3天后，按Edelman，E.R.andKarnovsky，M.J.，CiFculation，Vol.89，No.2，pp.770-776(1994)(該文列為本文參考文獻)所述在左頸內動脈中通過動脈切開對所有動物進行氣體血管成形術。將2FFogarty氣球導管(AmericanEdwardsLaboratories，SantaAha，Calif.)推向主動脈弓并拉回，同時用足夠的空氣將氣球吹大以產生抵抗力并剝脫內皮。將此過程重復6次，以確保對動脈造成在血管壁上引起增殖反應所需要的足夠損傷。然后連接頸內動脈。將動物分成兩組并在血管成形術后立即開始處理并持續(xù)14天。組1(N＝9)由靜脈內灌流等滲鹽(0.25ml/小時)的對照動物組成。組2(N＝10)動物用IGFBP-1處理，以179μg/kg/hr的劑量連續(xù)靜脈內輸注。血管成形術后3、9和14天從尾靜脈采血從檢測血漿內IGFBP-I水平，使用MedixBiochemica(Kauniainen，F(xiàn)inland)IGFbp-1試驗藥盒(商品目錄編號No.10831ETMB)以ELISA法檢測血漿樣品中的IGFBP-I濃度。在采血時中斷輸注(約15至30分鐘)。在第14天實驗結束時，用Francis等人所述的Brevital試驗證明導管仍開放。聯(lián)合使用AcaPromazineRompun和Ketamine麻醉動物，并通過動脈穿刺給動物輸注10％中性緩沖的福爾馬林。切除頸動脈并在福爾馬林中再放2天，然后進行石臘包埋加工。包埋得自每只動物的包括幾乎全長損傷的三個頸動脈段，以保證對所有的組織區(qū)域作出估計。收集所有動物的其他組織(肺、心、肝、腎、脾和腎上腺)進行組織學檢查，以確定連續(xù)輸注IGFBP-1的全身作用(如果有的話)。頸動脈切片用蘇木精和曙紅、Masson’strichrome和甲苯胺蘭染色。其他組織只用蘇木精和曙紅染色。實驗結束時IGFBP-1的平均血漿水平為3.69±0.64μg/ml。根據(jù)大體評分，以測量新內膜(μm和象素)、新內膜加中膜(象素)和中膜(象素)來確定用IGFBP-I處理動物所產生的作用。還計算出新內膜(象素)對中膜(象素)的比例。評分和檢測結果示于表22。對所有6項反應檢測進行WilcoxonRank-Sum(Mann-WhitneyU)試驗并使用Natrella，M.G.，ExperimentalStatistics，NationalBwreauofStandardsHandbook91，p.T-80(1967)中所列的表測定p值。從WilcoxonRank-Sum(Mann-WhitneyU)試驗得到的p值報告如下。數(shù)據(jù)顯示IGFBP-1顯著地減低大鼠的血管再狹窄程度。對損傷的頸動脈未觀察增厚的視為0，嚴重增厚的視為4，以標記如0、1、2、3和4的評分來粗略估計處理相應的效果。得自處理組和對照組的平均(±標準差)評分分別為1.5±0.27和2.67±0.24。發(fā)現(xiàn)這些數(shù)值是統(tǒng)計學上有意義的(p＜0.05)。在此粗略估計中，IGFBP-1處理之動物中對血管增厚的抑制率為44％。也檢測新內膜。在相對和彼此垂直的4個點上測定從新內膜的中膜側到新內膜的內腔側的距離并確定3個切片的平均值。經處理的和對照組的動物以μm為單位新內膜平均數(shù)±S.E.分別為78.50±10.68和139.33±8.91(p＜0.01)。該測量也表明IGFBP-I處理的動物血管內膜增厚受到44％的抑制。使用ImageJ系統(tǒng)(可得自S&amp;MMicroscopy，ColoradoSprings，CO)進行影象分析，以確定處理組和對照組動物的新生內膜加中膜，單獨的新內膜和單獨的中膜的面積(3個切片/動物)處理組和對照組動物的以象素為單位的新內膜加中膜面積(平均值±S.E.)分別為25，160.30±1817.42和35，271.1.1±1，403.16(p＜0.01)。該分析表明，用IGFBP-1處理使新內膜增厚減少29％。被處理的動物單獨的新內膜的面積(象素)為14,015.40±1,834.24，對照組動物為23,119.11±1,200.39，IGFBP-1處理的動物內膜增厚抑制率為39％(p＜0.01)。最后，計算新內膜對中膜的比例。這一參數(shù)也證明了用IGFBP-1處理的有益效果。被處理動物中該比例為1.25±0.17，對照組動物為1.91±0.13。利用這一比例，證明對血管再狹窄的抑制率為35％(p＜0.05)。新內膜對中膜的比例一般是該大鼠模型中用于估計處理相應效果的最可接受的方法(EdelmanandKarnovsky，Circulation，Vol.89，No.2(1994))。表22<p>雖然就特定實施方案描述了本發(fā)明，但它無意限制本發(fā)明，并且本領域技術人員所作改動被認為是落入本發(fā)明精神和范圍之內的。權利要求1.治療患有IGF相關病癥之患者的方法，包括給患者使用治療有效量的IGFBP-1或其被修飾形式的產物。2.根據(jù)權利要求1的方法，包括給所說的患者使用IGFBP-1。3.根據(jù)權利要求2的方法，其中給患者使用的IGFBP-1的量足以使患者血流中IGFBP-1的濃度達到約每毫升0.1μg至300μg。4.根據(jù)權利要求1的方法，包括給所說的患者使用被修飾形式的IGFBP-1。5.根據(jù)權利要求4的方法，其中被修飾形式的IGFBP-1是結合到聚合物上的IGFBP-1。6.根據(jù)權利要求5的方法，其中所說的聚合物是聚乙二醇。7.根據(jù)權利要求4的方法，其中被修飾形式的IGFBP-1包括2個IGFBP-1分子，其中所說的第一個IGFBP-1被結合到聚合物的一個末端上并且所說的第二個IGFBP-1被結合到聚合物的相反末端上。8.根據(jù)權利要求1的方法，其中IGF相關病癥選自乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、神經膠質瘤、肝癌、橫紋肌肉瘤、血管再狹窄、肢端巨大癥、肥胖、糖尿病性腎病和糖尿病性視網膜病。9.根據(jù)權利要求8的方法，其中IGF相關病癥是乳腺癌。10.根據(jù)權利要求8的方法，其中IGF相關病癥是結腸癌。11.根據(jù)權利要求8的方法，其中IGF相關病癥是骨肉瘤。12.根據(jù)權利要求8的方法，其中IGF相關病癥是肢端巨大癥。13.根據(jù)權利要求8的方法，其中IGF相關病癥是血管再狹窄。14.一種藥物組合物，含有加在可接受的藥物載體中的IGFBP-1或被修飾形式的IGFBP-1。15.根據(jù)權利要求14的藥物組合物，其包含加在可接受的藥物載體中的IGFBP-1。16.根據(jù)權利要求14的藥物組合物，其包含加在可接受的藥物載體中的被修飾形式的IGFBP-1。17.根據(jù)權利要求16的藥物組合物，其中被修飾形式的IGFBP-1是結合到惰性聚合物鏈上的IGFBP-1。18.根據(jù)權利要求17的藥物組合物，其中惰性聚合物鏈是聚乙二醇。19.根據(jù)權利要求16的藥物組合物，其中被修飾形式的IGFBP-1是結合到惰性聚合物鏈之相反末端上的IGFBP-1。20.治療或預防血管再狹窄的方法，其包括給需要醫(yī)治的患者使用治療有效量的能夠結合IGF的蛋白質。21.根據(jù)權利要求20的方法，其中所說的蛋白質是IGFBP-1。22.根據(jù)權利要求21的方法，其中所說的蛋白質是被修飾形式的IGFBP-1。23.根據(jù)權利要求22的方法，其中所說的蛋白質是結合到聚合物上的IGFBP-1。24.根據(jù)權利要求23的方法，其中聚合物是聚乙二醇。25.根據(jù)權利要求23的方法，其中被修飾形式的IGFBP-1包含2個IGFBP-1分子，其中所說的第一個IGFBP-1被結合到聚合物的一個末端上并且所說的第二個IGFBP-1被結合到聚合物的相反末端上。26.根據(jù)權利要求1的方法，其中IGFBP-1是未磷酸化的。27.根據(jù)權利要求21的方法，其中IGFBP-1是未磷酸化的。28.根據(jù)權利要求26的方法，其中IGFBP-1是在E.coli中重組產生的。29.根據(jù)權利要求27的方法，其中IGFBP-1是在E.coli中重組產生的。30.未被磷酸化的并且能夠抑制IGF的活性的胰島素樣生長因子結合蛋白質(IGFBP)。31.根據(jù)權利要求30的IGFBP，其中IGFBP是在E.coli中重組產生的。32.根據(jù)權利要求30的IGFBP，其中所說的IGFBP是IGFBP-1或其被修飾的形式。全文摘要本發(fā)明涉及使用包括IGFBP-1或IGFBP-1的修飾形式在內的胰島素樣生長因子結合蛋白質(“IGFBP”)作為治療劑的方法。修飾形式包括接合到聚合物的IGFBP-1和兩個接合到聚合物之相對兩端上的IGFBP-1分子。該方法包括給具有IGF相關病癥的患者使用足以產生治療效果的IGFBP，它包括IGFBP-1或修飾形式的IGFBP-1。本發(fā)明還涉及可用于該方法的非磷酸化的IGFBP。文檔編號C07K14/435GK1134111SQ94192136公開日1996年10月23日申請日期1994年4月6日優(yōu)先權日1993年4月7日發(fā)明者G·N·科斯,D·A·盧塞爾申請人:賽納根公司