專利名稱：N-(膦酰甲基)甘氨酸的酶催化制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備乙醛酸和氨甲基磷酸(AMPA)混合物及接著制備N-(膦酰甲基)甘氨酸(通常稱為草甘膦)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種酶催化方法，該方法包括在有AMPA和催化劑存在的水溶液中使羥基乙酸與氧反應，所述催化劑包括羥基乙酸氧化酶((S)-2-羥基酸氧化酶，EC1、1.3，15)和過氧化氫酶(EC1，11，1.6)，生成含乙醛酸和AMPA的混合物，然后將此混合物就地氫化，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸，該化合物是廣譜的后突發(fā)性植物生長抑制劑和除莠劑，可用于調節(jié)各種植物的生長。
羥基乙酸氧化酶通常存在于綠葉植物和哺乳動物細胞中，它能催化羥基乙酸氧化為乙醛酸，同時生成過氧化氫
N.E.Tolbert等人(J.Biol.Chem.，Vol.181，905-914(1949))首先報道了一種由煙草葉中提取出來的酶，通過形成乙醛酸中間體，這種酶催化了羥基乙酸氧化為甲酸和CO2。某些化合物如乙二胺的加入限制了中間體乙醛酸的進一步氧化。該氧化反應在pH約為8的條件下進行，常用的羥基乙酸的濃度為約3-40mM(毫摩爾)。據(jù)報道羥基乙酸氧化的最佳pH為8.9。已報道草酸(100mM)能抑制羥基乙酸氧化酶的催化作用。類似地，K.E.Richardson和N.E.Tobert(J.Biol.Chem.，Vol236，1280-1284(1961))指出含有三羥甲基氨基甲烷(TRIS)的緩沖液抑制了在羥基乙酸氧化酶(催化羥基乙酸的氧化)中草酸的形成。C.O.clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris(J.Biol.Chem.，Vol.178，977-987(1949)報道了催化氧化羥基乙酸與氧的羥基乙酸氧化酶的最佳pH為約7.8-8.6，最佳溫度為35-40℃。
I.Zelitch和s.ochoa(J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)及J.C.Robinson等人(J.Biol.Chem，Vol237，2001-2009(1962)報道了在菠菜羥基乙酸氧化酶催化的羥基乙酸的氧化中，甲酸和CO2的形成是由H2O2與乙醛酸的非酶反應產(chǎn)生的。他們觀察到，加入能催化H2O2分解的過氧化氫酶，通過抑制甲酸和CO2的生成而大大地提高了乙醛酸的產(chǎn)率。還發(fā)現(xiàn)FMN(黃素單核苷酸)的加入極大地增加了羥基乙酸氧化酶的穩(wěn)定性。
N.A.Frigero和H.A.Harbury(J.Biol.Chem.，Vol.231，135-157(1985)已報道關于由菠菜分離出的羥基乙酸氧化酶的制備和性質。發(fā)現(xiàn)純化的酶在溶液中極不穩(wěn)定;這種不穩(wěn)定性被認為是由于黃素單核苷酸較弱地結合在酶活性部位，以及這種酶的具有酶活性的四聚物和/或八聚物分解成酶惰性的單聚物和二聚物，后者不可逆地聚集并沉淀。向此酶溶液中加入FMN極大地增加了酶的穩(wěn)定性，而且高蛋白濃度或高離子強度保持該酶作為八聚物或四聚物。
關于通過羥基乙酸氧化酶催化的羥基乙酸的氧化還有許多其他的參考文獻。在下列參考文獻中描述了酶的分離(及一種分析方法)I.Zelitch，MethodsinEnzymology，Vol，1，AcademicPress，NewYork，1955，P.528-532(由菠菜和煙草葉中提取)，M.Nishimura等人，Arch.Biochem.Biophys，Vol，222，397-402(1983)(由南瓜子葉提取)，H.Asker和D.Davies，Biochim.Biophys.Acta，Vol.761，103-108(1983)(由鼠肝提取)，以及M.J.Emes和K.H.Erismann，Int.J.Biochem.Vol.16.1373-1378(1984)(由LemnaMinorL提取)。還報告了這種酶的結構E.Cederlund等人，EurJ.Biochem，Vol，173，523-530(1988)，及Y.Lindquist和C.Branden，J.Biol.Chem，Vol246，3624-3628(1989)。
由氨甲基磷酸和乙醛酸制備N-(膦酰甲基)甘氨酸有許多已知方法。Rogers等人在歐洲專利申請186，648中描述了這樣一種方法，它包括乙醛酸或其鹽與氨甲基磷酸或其鹽縮合，生成一中間產(chǎn)物，通常認為是醛亞胺(席夫堿)，不經(jīng)分離將該中間產(chǎn)物通過催化氫化還原為N-(膦酰甲基)甘氨酸。Gaertner在美國專利4，094，928中描述了另一方法，它是通過乙醛酸與氨甲基磷酸酯在無水溶劑中反應，分離同樣的中間體羰基醛亞胺甲基磷酸酯;在與水共沸蒸餾并除去溶劑之后，還原該羰基醛亞胺甲基磷酸酯，并將酯基水解生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
上述制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法其缺點在于乙醛酸是相當昂貴的起始原料，而其他較便宜的制備所需物質的方法已被實施?，F(xiàn)有的制備乙醛酸的方法，如二鹵代乙酸的水解，草酸的電解還原、乙二醛的氧化、乙烯或乙醛的催化氧化以及馬來酸、其酯或酐的臭氧分解，它們在實施中都存在一種或多種困難，例如昂貴的分離/純化步驟、低產(chǎn)率、或大量廢料流出。Gaertner所述的方法還有一個缺點是它需要額外的步驟(相應地會有產(chǎn)率損失)，而且需要不必要的中間體的分離。
Kleiner在美國專利4，670，191中公開了合成N-(膦酰甲基)甘氨酸的另一方法，它包括氨甲基磷酸或其鹽與約兩摩爾當量的乙醛酸在含水介質中反應。過量的乙醛酸明顯地起還原劑的作用，將中間體乙醛酸-氨甲基磷酸反應產(chǎn)物轉化為所需的N-(膦酰甲基)甘氨酸，其本身被氧化為一種或多種副產(chǎn)物，包括CO2。類似地，F(xiàn)ields等人在美國專利4，851，159中描述了通過加熱N-酰氨基甲基磷酸與乙醛酸或其衍生物制備N-(膦酰甲基)甘氨酸。乙醛酸與N-酰氨基組份的摩爾比優(yōu)選為2∶1;而較小的比例會損失產(chǎn)率。
Kleiner和Fields等人的方法伴隨的缺點不僅是要用較昂貴的乙醛酸，而且要用它作犧牲的還原劑(生成每摩爾N-(膦酰甲基)甘氨酸需用約-摩爾乙醛酸作還原劑)以及氨基-(或N-酰氨基)甲基磷酸的縮合劑。
本發(fā)明的一個方面涉及乙醛酸(或其鹽)和氨甲基磷酸(AMPA)(或其鹽)的混合物的制備，它是通過在水溶液中并在AMPA和兩種催化劑-羥基乙酸氧化((S)-2-羥基酸氧化酶，EC1、1.3、15)和過氧化氫酶(EC1、11、1.6)的存在下，用氧來氧化羥基乙酸。因此，這第一方面代表用于制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的中間體的制備方法，該中間體包括乙醛酸組份和氨甲基磷酸組分，該方法包括在氨甲基磷酸存在下將羥基乙酸組分酶催化轉化為乙醛酸組份。
因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供用作制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的中間體混合物的制備方法，該方法包括下列步驟，通過將羥基乙酸組份和氨甲基磷酸組分混合到水溶液中就地生成乙醛酸組份，第一個催化劑適于催化羥基乙酸部分用氧來氧化為乙醛酸組分和過氧化氫，第二個催化劑適于過氧化氫的催化分解，調節(jié)溶液的pH值在6到10之間，在有效的溫度和足夠的時間內(nèi)使溶液與氧源接觸，在氨甲基磷酸組份存在下使至少部分羥基乙酸組份轉化為乙醛酸組份，在將所述中間體轉化為N-(膦酰甲基)甘氨酸之前，使該溶液停止與氧接觸。
本發(fā)明的另一方面涉及N-(膦酰甲基)甘氨酸的制備，它是通過在水溶液中并在氨甲基磷酸和兩種催化劑-羥基乙酸氧化酶((s)-2-羥基酸氧化酶，EC1、1.3、15)和過氧化氫酶(EC1、11、1.6)的存在下，用氧來氧化羥基乙酸，隨后在水溶液中就地還原所得到的乙醛酸和氨甲基磷酸混合物，生成所需的N-(膦酰甲基)甘氨酸，該化合物是后突發(fā)性植物生長抑制劑和除莠劑。
根據(jù)此第二方面，本發(fā)明提供制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法，該方法包括下列步驟(a)在水溶液中并在氨甲基磷酸和酶-羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的存在下，用氧來氧化羥基乙酸，生成乙醛酸組分和氨甲基磷酸組份的混合物;
(b)還原步驟(a)中生成的所述混合物，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
換句話說，本發(fā)明的第二方面包括使由第一方面得到的混合物經(jīng)過氫化，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
對本發(fā)明來說應當理解，在氨甲基磷酸存在下通過羥基乙酸的酶催化氧化所生成的混合物自然導致除所需的乙醛酸組份外的氧化副產(chǎn)物的分布(包括通過實施例但并不限于此的草酸酯、甲酸酯和二氧化碳)。在這種混合物中還將存在未反應的羥基乙酸以及各種添加物，如黃素單核苷酸(以下稱作FMN)等，所有這些物質可能或可能不影響所期望的后續(xù)氫化反應(再一次通過實施例但并不局限于此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甲酸酯和FMN降低了轉化的碳平衡，該平衡存在于AMPA存在下的乙醛酸的氫化過程中)。這樣本發(fā)明進一步提供由酶催化氧化所生成的溶液分離并回收酶，以及在氫化步驟之前任意除去FMN。
優(yōu)選地，催化劑是酶催化的;更優(yōu)選地，第一個酶是羥基乙酸氧化酶((s)-2-羥基酸氧化酶，EC1、1.3.15)，第二個酶是過氧化氫酶(EC1.11.1.6)。在催化劑/酶存在下溶液與O2的接觸停止之后，通過過濾或離心除去催化劑/酶，然后使該溶液經(jīng)過還原條件制備N-(膦酰甲基)甘氨酸。
因此，通過避免在單獨的步驟中制備乙醛酸的需要，本發(fā)明提供了制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的更有效且經(jīng)濟的方法。
本發(fā)明一個目的是提供制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的改進的方法，該方法是通過乙醛酸和氨甲基磷酸混合物的酶催化制備及隨后的還原來進行，它避免需要單獨制備乙醛酸。
另一個目的是提供這樣一種方法，其中在氨甲基磷酸的存在下，由易得的其前體即羥基乙酸酶催化地就地生成了乙醛酸，這樣就提供了一種制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的更有效且經(jīng)濟的方法。
羥基乙酸或其合適的鹽的催化氧化是在酶催化劑存在下通過羥基乙酸與分子氧源接觸而方便地進行，所述酶催化劑可催化羥基乙酸與O2反應生成乙醛酸。一種這樣的催化劑是羥基乙酸氧化酶(EC1.1.3.15)，也稱作羥基乙酸氧化酶。羥基乙酸氧化酶可以由本領域已知的許多來源分離得到。用于該反應的羥基乙酸氧化酶應當以有效濃度存在，通常的濃度為約0.01至約1000IU/mL，優(yōu)選約0.1至約4IU/ml。IU(國際單位)被定義為每分鐘催化一微摩爾底物轉變的酶的量。對這種酶的分析方法見于I.Zelitch和S.Ochoa.J.BiolChem.Vol.201，707-718(1953)。該方法也被用于分析回收或再循環(huán)的羥基乙酸氧化酶的活性。
盡管羥基乙酸與氧的酶催化反應已為公知的，但對乙醛酸的高選擇性以前尚未知曉，而且以前沒有關于在氨甲基磷酸(AMPA)存在下進行羥基乙酸的酶催化氧化反應的報道。一個應用先例即國際公開號WO為91/05868(1991年5月2日)標題為“通過羥基乙酸的酶催化氧化制備乙醛酸”，該文描述了在氧、胺緩沖液和溶解的酶-羥基乙酸氧化酶或過氧化氫酶的存在下將羥基乙酸酶催化轉化為乙醛的方法。
該方法表明了使用過氧化氫酶(以破壞副產(chǎn)物過氧化氫)和能夠與生成的乙醛酸形成化學加合物的胺緩沖液(限制了乙醛酸的進一步氧化)具有意想不到的協(xié)合效應。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單獨加入過氧化氫酶或胺緩沖液都不會產(chǎn)生兩者均存在時所見測到的高選擇性，所得到的乙醛酸的幾乎定量的產(chǎn)率要大于單獨使用過氧化氫酶或胺緩沖液所預期的簡單的加合效果。
通過形成乙醛酸與胺緩沖液的抗氧化配合物(通過N-取代的半胺和/或亞胺的形成)所產(chǎn)生的乙醛酸產(chǎn)率的提高取決于質子化的胺緩沖液的pKa。在胺緩沖液(0.33M，pH8.3)、氫基乙酸氧化酶(0.2IU/mL)、過氧化氫酶(1，400IU/mL)和FMN(0.01mM)存在下，于30℃、1atm氧壓下氧化羥基乙酸水溶液(0.25M)24h，其結果列于下表，以及用兩種預期不與乙醛酸配合的緩沖液(磷酸鹽和N-二(羥乙基)甘氨酸)進行反應，結果也見下表
緩沖液(pKa)%草酸%乙醛酸%羥基乙酸%甲酸乙二胺(6.85,9.93)6.885.50.82.4TRIS(8.08)1.181.02.812.0甲胺(10.62)1.053.939.85.1乙醇胺(9.50)1.869.64.8124.5氯化銨(9.24)1.139.937.718.9異丙醇胺(9.43)2.060.04.837.4N-二(羥乙基)甘氨酸(8.30)1.024.925.643.8磷酸鹽(2.15,7.10,12.3)0.724.552.421.2在試驗的胺緩沖液中，pKa約等于或低于反應混合物的pH值的胺(即乙二胺和TRIS)生成的乙醛酸產(chǎn)率(低的甲酸和草酸產(chǎn)率)高于胺的pKa大于進行反應的pH值時乙醛酸的產(chǎn)率。這些結果與所預期的相一致，即未質子化的胺與乙醛酸必然形成抗氧化的N-取代半胺和/或亞胺配合物;在反應混合物中其Pka大于反應混合物pH值的胺緩沖液主要以質子比的銨離子存在，因此不可能與乙醛酸生成這樣的配合物。
氨甲基磷酸(AMPA)的質子化的胺的pKa是10.8(Lange’sHandbookofChemistry，J.A.Dean，Ed，McGraw-Hill，NewYork，1979，12th，Edition)，因此，在7至9的pH范圍內(nèi)向羥基乙酸的酶催化氧化反應中加入AMPA。意想不到地會產(chǎn)生高產(chǎn)率的乙醛酸。附帶的實施例說明用這種胺已得到高達92%的乙醛酸產(chǎn)率。除了得到意想不到的高產(chǎn)率的乙醛酸，與不加AMPA所進行的反應(實施例13)相比，使用AMPA還能導致在羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的回收方面的改進。在使用酶催化劑的方法中通常需要回收再循環(huán)催化劑，其中催化劑的消耗對整個生產(chǎn)消耗起著重大作用。
在用羥基乙酸作催化劑將羥基乙酸氧化轉化為乙醛酸的過程中，通過向反應溶液中加入能分解過氧化氫的催化劑便得到最佳結果。能有效地與羥基乙酸氧化酶結合的一種這樣的破壞過氧化物的催化劑是過氧化氫酶(E.C.1、11、1.6)。過氧化氫酶能催化過氧化氫分解為水和氧，而且認為在羥基乙酸氧化酶催化的羥基乙酸與O2的反應中，過氧化氫酶加快了與乙醛酸一起生成的過氧化氫的分解，從而提高了本發(fā)明方法中乙醛酸的產(chǎn)率，過氧化氫酶的濃度應當為50，000IU/mL，優(yōu)選500至15，000IU/ml。最好將過氧化氫酶和羥基乙酸氧化酶的濃度調節(jié)在上述范圍內(nèi)，以使過氧化氫酶與羥基乙酸氧化酶的比例(每種酶按IU測定)為至少約250∶1。
在反應溶液中另一任選的但常常是有益的組分是黃素單核苷酸(FMN)，通常所用濃度為0.0至約2.0mM，優(yōu)選約0.01至約0.2mM。FMN增加了羥基乙酸氧化酶的效率，這就是說每單位的酶轉化羥基乙酸為乙醛酸的量增加了。應當理解加入的FMN的濃度是除了與酶共存的任何FMN，因為在制備酶的過程中也常常向酶中加入FMN。關于FMN的結構及其分析方法見于K.Yagai，MethodsofBiochemicalAnalysis，Vol.x，Inter-sciencePublishers，NewYork，1962，P.319-355，該文獻在此引入作為參考。
羥基乙酸(2-羥基乙酸)是市場上可買到的，在本發(fā)明反應中其初始濃度在0.10M至2.0M的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.25M至1.0M之間。它可以酸形式使用，或以其相容的鹽形式使用，也就是說這種鹽水是水溶的，其陽離子不影響所需的羥基乙酸轉化為乙醛酸或后續(xù)反應，即乙醛酸產(chǎn)物與氨基甲基磷酸反應生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。合適的并且相容的成鹽陽離子可通過試驗容易地測定。這些鹽具有代表性的例子是堿金屬、堿土金屬、銨、取代的銨、磷鎓及取代的磷鎓鹽。
羥基乙酸向乙醛酸的轉化方便地且優(yōu)選在含水介質中進行。加入氨甲基磷酸(AMPA)或其合適的鹽。形成AMPA/羥基乙酸(起始量)的摩爾比范圍為0.01/1.0至3.0/1.0，優(yōu)選0.25/1.0至1.05/1.0。將AMPA和羥基乙酸在水溶液中混合之后，調節(jié)所得混合物的pH在6到10之間，優(yōu)選7.0到9.0之間。在此pH范圍內(nèi)，通過加入任何相容的無干擾的堿包括堿金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽，可以調節(jié)準確的值以達到所需pH值。隨著反應的進行反應混合物的pH略有降低，因此通常易于在接近最大酶活性的pH范圍的高值端開始反應，約9.0-8.5，反應過程中使pH下降。通過單獨加入無干擾的無機或有機緩沖液能夠任意地保持pH值，因為酶活性隨pH而變化。
當然羥基乙酸和乙醛酸極易溶解于水，當pH在6到10之間時，它們即使不是幾乎全部也是大部分以羥基乙酸和乙醛酸離子存在。本領域技術人員還應理解乙醛酸(及其共軛堿，乙醛酸陰離子)也可以水合物存在，如(HO)2CHCOOH和/或半縮醛存在，HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH，它們的組成和其陰離子配對物等價于乙醛酸和其陰離子，后者是本發(fā)明用于N-(膦酰甲基)甘氨酸制備的合適的反應物。
氧(O2)是用于將氧基乙酸轉化為乙醛酸的氧化劑，它可以氣體形式通在過在氣-液介面液體的攪動或通過透氧膜加到反應體系中。在大多數(shù)情況下，反應速度至少部分地受到氧溶于含水介質的速度的控制。因此，盡管氧能讓空氣形式加入反應體系，但最好使用較純的氧，甚至使用高壓。盡管氧壓上限尚屬未知，可以使用高達50大氣壓的氧，優(yōu)選15大氣壓的上限。為保持高的氧溶解(這里是反應)速度，攪動是很重要的，可用任何方便的攪動形式，如攪拌。另一方面，正如酶領域技術人員所熟知的，高壓速剪切攪動或產(chǎn)生泡沫的攪動會降低酶的活性，應當避免。
反應溫度是很重要的變量，因為它影響反應速度和酶的穩(wěn)定性?？梢允褂?℃至40℃的反應溫度，但優(yōu)選的反應溫度范圍為5℃至15℃。在優(yōu)選的溫度范圍內(nèi)進行反應便能在反應末尾使回收的酶活性達到最大值。溫度不應太低以致使水溶液開始結冰。溫度可以通過一般方法加以調節(jié)，如(但不局限于此)通過使用套層反應器并使具有適當溫度的液體通過夾套。反應器可以由對反應組份呈惰性的任何材料構成。
反應完成后，可以通過過濾或離心分出酶并再使用。用另一種方法，可以通過加熱如至70℃5分鐘使酶變性并沉淀，和/或使酶留在反應混合物中，如果在后續(xù)步驟中它們的存在并非有害，即將乙醛酸-氨甲基磷酸混合物轉化為N-(膦酰甲基)甘氨酸，以及從反應混合物分離N-(膦酰甲基)甘氨酸的步驟。
使反應溶液與O2停止接觸之后，且優(yōu)選在除掉存在的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶之后，可以通過使溶液與活性碳接觸任意地除去黃素單核苷酸(FMN)。還原含有乙醛酸和氨甲基磷酸(它們與相應的亞胺處于平衡中)的溶液，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
催化氫化是由乙醛酸和氨甲基磷酸混合物制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的優(yōu)選方法。適用于本發(fā)明的催化劑包括(但并不限于)各種鉑系金屬，如銥、鋨、銠、釕、鉑和鈀;還有各種其他過渡金屬，如鈷、銅、鎳和鋅。催化劑可以沒有載體，例如阮內(nèi)鎳或氧化鉑;或可以使催化劑載于載體上，例如載于碳上的鉑、載于氧化鋁上的鈀、或載于硅藻土上的鎳。優(yōu)選是載于碳上的鈀、載于硅藻土上的鎳和阮內(nèi)鎳。
氫化反應可以在4至11的pH，優(yōu)選5至10的pH下進行。在此pH范圍內(nèi)，通過加入任意的相容且無干擾的堿或酸可以調節(jié)準確的值以得到所需的pH值。合適的堿包括(但并不限于)堿金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽，而合適的酸包括(但并不限于)鹽酸、硫酸或磷酸。
氫化溫度和壓力可以極大地變化。溫度一般為0℃至150℃，優(yōu)選20℃至90℃，而H2壓力一般為約大氣壓至約100個大氣壓，優(yōu)選1至10個大氣壓。氫化催化劑以最小濃度被使用，在所選擇的反應條件下該濃度是以使氫化反應達到所需的反應速度和起始原料的總轉化率;此濃度易于通過試驗測定。用于該反應的乙醛酸和AMPA的每100份合并重量可以使用0.001至20或更多份重量的催化劑。
用作后突發(fā)性除莠劑的N-(膦酰甲基)甘氨酸可以從還原溶液中回收，無論采用什么還原方法，可以還原溶液中回收，無論采用什么還原方法，可以通過本領域已知的任何回收方法，包括在美國專利4，851，159和4，670，191及歐洲專利申請186648和413672中公開的方法。
在下列用于進一步說明本發(fā)明的實施例中，乙醛酸、甲酸、草酸的產(chǎn)率及羥基乙酸的回收率都是基于反應開始時羥基乙酸的總量而計算的百分比。反應混合物的分析是用高壓液相色譜進行的。有機酸的分析是用Bio-RadHPX-87H柱進行的，AM-PA和N-(膦酰甲基)甘氨酸是用Bio-RadAminex草甘膦分析柱分析的。所報告的N-(膦酰甲基)甘氨酸的產(chǎn)率是基于羥基乙酸或AMPA計算的。這取決于該反應中哪一個是限制反應劑。
實施例1向3OZ.Fischer-Porter玻璃氣溶膠反應器中放入磁攪棒和10mlpH為8.5的水溶液，該溶液含有羥基乙酸(0.25M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丙酸(HPLC內(nèi)標，0.125M)、羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IV/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取，1，400IU/ml)。將反應器密封并使反應混合物冷卻至15℃，然后通過加壓至70psig用氧沖洗反應器并向大氣壓放氣五次，同時攪拌。然后給反應器加70psig的氧壓在15℃下攪拌混合物。用注射器通過取樣口(反應器內(nèi)無壓力損失)定期移出等分試樣(0.10ml)，通過HPLC分析以監(jiān)測反應進程。5小時后，，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別是70.4%、19.6%和2.2%，剩下5.3%羥基乙酸。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別是它們的初始值的27%和100%。
實施例2(比較例)用0.33MK2HPO4代替0.265M AMPA，重復實施例1的反應。5小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別是34.1%、11.1%和0.2%，剩下58.7%的羥基乙酸。23小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別是39.4%、44.7%和15.34%，無剩余的羥基乙酸。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別是它們初始值的85%和87%。
實施例3(比較例)用0.263MN-二(羥乙基)甘氨酸代替0.265MAMPA，重復實施例1的反應。5小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別是42.5%、49.6%和10.1%，羥基乙酸剩余0.2%。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別是它們初始值的47%和100%。
實施例4用5，600IU/ml過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取)重復實施例1的反應。6小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為85.5%、7.6%和3.3%，羥基乙酸剩余2.5%。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別是它們初始值的36%和100%。
實施例5用14，000IU/ml過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取)重復實施例1的反應。6小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為88.0%、3.3%和3.0%，羥基乙酸剩余3.4%。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為它們初始值的28%和96%。
實施例6用56，000IU/ml過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取)重復實施例1的反應。6小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別是84.0%、0.4%和2.5%，羥基乙酸剩余8.4%。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶和剩余活性分別為其初始值的16%和76%。
實施例7向30Z.Fischer-Porter玻璃氣溶膠反應器中放入磁攪棒和10mlpH為8.5的水溶液，該溶液含有羥基乙酸(0.25M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.20M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC內(nèi)標，0.10M)羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)。將反應器密封并使反應混合物冷卻至5℃，然后通過加壓至70psig用氧沖洗反應器并向大氣壓放氣五次，同時攪拌。之后給反應器加70psig氧壓，在5℃下攪拌混合物。用注射器通過取樣口(反應器內(nèi)無壓力損失)定期移出等分試樣(0.10ml)，通過HPLC分析以監(jiān)測反應進程。6小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為92.3%、4.36%和5.5%，羥基乙酸無剩余。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的87%和88%。反應混合物的最終pH為6.7。
得到的乙醛酸(0.23M)和AMPA(0.20M)的混合物用Ami-conCentriprep10濃縮器(10，000分子量斷流)過濾，除去可溶的酶，然后將濾液放在裝有磁攪棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向該瓶中加入0.100g10%Pd/c并將瓶密封，用氮氣沖洗，然后用氫氣加壓至50psi并在25℃下攪拌。17小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度為0.13M(通過HPLC測定，按AMPA計算產(chǎn)率為66%)。
實施例8向3OZ.Fischer-Porter玻璃氣溶膠反應器中放入磁攪棒和10mlpH為8.5的水溶液，該溶液含有羥基乙酸(0.50M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.40M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC內(nèi)標，0.10M)、羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)。將反應器密封并使反應混合物冷卻至5℃(代替前面實施例中所的15℃)，然后通過加壓至70psig用氧沖洗反應器并向大氣壓放氣五次，同時攪拌。之后給反應器加70psig氧壓，在5℃下攪拌混合物。用注射器通過取樣口(反應器內(nèi)無壓力損失)定期移上等分試樣(0.10ml)，通過HPLC分析以監(jiān)測反應進程。17.5小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為91.0%、2.9%和2.9%，羥基乙酸剩余4.1%。反應混合物的最終pH為6.7。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的63%和91%。
得到的乙醛酸(0.46M)和AMPA(0.40M)的混合物用Ami-conCentriprep10濃縮器(10，000分子量斷流)過濾，除去可溶的酶，然后將濾液放在裝有磁攪棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向該瓶中加入0.100g10%pd/c并將瓶密封，用氮氣沖洗，然后用氫氣加壓至50psi并于25℃攪拌。17小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.29M(按AMPA計算產(chǎn)率為72%)。
實施例9用10ml含有羥基乙酸(0.75M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.60M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC內(nèi)標，0.10M)，羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，2.0IU/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml的水溶液，pH為8.5，重復實施例8的羥基乙酸的酶催化氧化。40小時后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPCL產(chǎn)率分別為83.2%、2.3%和7.5%，羥基乙酸無剩余。反應混合物的最終pH為6.8。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的65%和86%。
得到的乙醛酸(0.62M)和AMPA(0.60M)的混合物用Ami-conCentriprep10濃縮器(10，000分子量斷流)過濾，除去可溶的酶，然后將濾液放在裝有磁攪棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向該瓶中加入0.100g10%pd/c并將瓶密封，用氮氣沖洗，然后用氫氣加壓至50psi并于25℃攪拌。24小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.42M(按AMPA計算產(chǎn)率為70%)。
實施例10用10ml含有羥基乙酸(1.0M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.80M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC內(nèi)標，0.10M)、羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，2.0IU/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger，14，000IU/ml)的水溶液，pH為8.5，重復實施例8的羥基乙酸的酶催化氧化。66小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為78.9%、2.2%和12.1%，羥基乙酸剩余2.0%。反應混合物的最終pH為6.9。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的64%和87%。
得到的乙醛酸(0.79M)和AMPA(0.80M)的混合物用Ami-conCentriprep10濃縮器(10，000分子量斷流)過濾，除去可溶的酶，然后將濾液放在裝有磁攪棒3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向該瓶中加入0.100g10%pd/c并將瓶密封，用氮氣沖洗，然后用氫氣加壓至50psi并于25℃攪拌。23小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.51M(按乙醛酸計算產(chǎn)率為65%)。
實施例11在pH為8.0時重復實施例8的反應。17.5小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為87.0%、2.2%和1.9%，羥基乙酸剩余8.5%。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的44%和97%。
實施例12在pH為7時重復實施例8的反應。17.5小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為88.0%、1.4%和1.9%，羥基乙酸剩余8.2%。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的44%和93%。
實施例13向3OZ.Fischer-Porter玻璃氣溶膠反應器中放入磁攪棒和10mlpH為8.5的水溶液，該溶液含有羥基乙酸(0.50M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)標，0.10M)、羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger，14，000IU/ml)。將反應器密封并使反應混合物冷卻至5℃，然后通過加壓至70psig用氧沖洗反應器并向大氣壓放氣五次，同時攪拌。之后給反應器加70psig氧壓，在5℃下攪拌混合物。用注射器通過取樣口(反應器內(nèi)無壓力損失)定期移出等分試樣(0.10ml)，通過HPLC分析以監(jiān)測反應進程。21小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為81.7%、1.2%和2.2%，羥基乙酸剩余7.5%。羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的19%和77%。然后用0.50M羥基乙酸和0.25M、0.375M、0.40M、0.50M或0.625M氨甲基磷酸(AMPA)重復該反應，將這些反應的反應產(chǎn)物的產(chǎn)率及酶回收率列在下面[AMPA]乙醛酸甲酸草酸羥基乙酸羥基乙酸過氧化氫酶氧化酶(M)(%)(%)(%)(%)(%)(%)0.0081.71.22.27.519770.2579.42.13.32.548790.37578.32.33.61.757950.4091.02.92.94.163910.5085.21.53.35.549930.62579.61.71.814.04294
實施例14用10ml含有羥基乙酸(0.25M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC內(nèi)標，0.25M)、羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)的水溶液，在pH7.0和15℃下重復實施例8的羥基乙酸的酶催化氧化。8小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為82.8%、0.9%和2.1%，羥基乙酸剩余13.9%。反應混合物的最終pH為6.6。
這種乙醛酸(0.21M)和AMPA(0.263M)的混合物用Ami-conCentriprep10濃縮器(10，000分子量斷流)過濾，除去可溶的酶，然后將濾液和50mg10%pd/c放在裝有玻璃襯里的不銹鋼壓力反應器中。將反應器密封，用氮氣沖洗，然后用氫氣加壓至1000psi并在25℃搖動。在反應的前0.5小時內(nèi)反應器壓力降到一穩(wěn)定值。然后加壓至1000psi。4小時后，將反應器壓力放空，用氮氣清洗反應器。N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.16M(按乙醛酸計算產(chǎn)率為76%)。
實施例15在pH8時重復實施例14的羥基乙酸的酶催化氧化。8小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為86.7%、1.8%和4.1%，羥基乙酸剩余13.2%。反應混合物的最終pH為6.7。
用實施例5所述的相同方法，將這種乙醛酸(0.22M)和AMPA(0.263M)混合物在1000psi下氫化。4小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.14M(按乙醛酸計算產(chǎn)率為64%)。
實施例16在pH9時重復實施例14的羥基乙酸的酶催化氧化。7小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為70.0%、5.6%和11.1%，羥基乙酸無剩余。反應混合物的最終pH為6.8。
用實施例5所述的相同方法，將這種乙醛酸(0.18M)和AMPA(0.263M)的混合物在1000psi下氫化。4小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.094M(按AMPA計算產(chǎn)率為52%)。
實施例17用羥基乙酸和AMPA的起始濃度分別為0.50M和0.40M，在pH8.5下重復實施例14的羥基乙酸的酶催化氧化。16.5小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為85.4%、3.5%和6.3%，羥基乙酸剩余1.4%。反應混合物的最終pH為7.0。
用實施例5所述的相同方法，將這種乙醛酸(0.43M)和AMPA(0.40M)的混合物在1000psi下氫化。4小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.30M(按AMPA計算產(chǎn)率為75%)。
實施例18用10ml含有羥基乙酸(0.50M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.375M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC內(nèi)標，0.10M)、羥基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和過氧化氫酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)的水溶液，在pH8.5下重復實施例8的羥基乙酸的酶催化氧化。17小時后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為87.1%、1.9%和2.1%，羥基乙酸剩余8.9%。反應混合物的最終pH為6.7。
得到的乙醛酸(0.435M)和AMPA(0.375M)混合物用Ami-conCentriprep10濃縮器(10，000分子量斷流)過濾，除去可溶的酶，然后將濾液與50mg脫色碳混合(除去FMN)再過濾。將得到的濾液放在裝有磁攪棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向該瓶中加入0.100g10%pd/c，將瓶密封，用氮氣沖洗，然后用氫氣加壓至50psi并于25℃攪拌。17小時后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的濃度(通過HPLC測定)為0.372M(按AMPA計產(chǎn)算產(chǎn)率為99%)。
權利要求
1.一種用于制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的中間體的制備方法，該中間體包括乙醛酸組份和氨甲基磷酸組份，該方法包括在氨甲基磷酸存在下酶催化轉化羥基乙酸組份為乙醛酸組份。
2.一種制備乙醛酸和氨甲基磷酸混合物的方法，該方法包括在水溶液中在氨甲基磷酸和羥基乙酸氧化酶及過氧化氫酶的存在下，用氧氧化羥基乙酸的步驟。
3.一種用作制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的中間體混合物的制備方法，該方法包括下面的步驟，將羥基乙酸組份和氨甲基磷酸組份混入水溶液中就地生成乙醛酸組份，第一個催化劑適于催化羥基乙酸組份用氧來氧化為乙醛酸組份和過氧化氫，第二個催化劑適于催化過氧化氫的分解，調節(jié)溶液pH值在6到10之間，在有效的溫度和足夠的時間內(nèi)使該溶液與氧源接觸，在氨甲基磷酸組份存在下使至少部分羥基乙酸組份轉化為乙醛酸組份，在將所述中間體轉化為N-(膦酰甲基)甘氨酸之前，使該溶液停止與氧接觸。
4.一種制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法，該方法包括下列步驟(a)在水溶液中，在氨甲基磷酸和羥基乙酸氧化酶及過氧化氫酶的存在下，通過用氧氧化羥基乙酸制備乙醛酸組份和氨甲基磷酸組份的混合物;(b)還原在步驟(a)中制備的所述混合物，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
5.一種制備N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法，該方法包括下列步驟(ⅰ)通過將羥基乙酸組份和氨甲基磷酸組份混入水溶液中，在水溶液中就地酶催化制備乙醛酸組份和氨甲基磷酸組份的混合物，第一個催化劑適于催化羥基乙酸與氧的氧化，生成乙醛酸和過氧化氫，第二個催化劑適于催化過氧化氫的分解，調節(jié)溶液的pH值在6到10之間。(ⅱ)在有效的溫度和足夠的時間內(nèi)使溶液與氧源接觸，在氨甲基磷酸組份存在下，使至少部分羥基乙酸組份轉化為乙醛酸組份;(ⅲ)使溶液停止與氧接觸，(ⅳ)然后使所述混合物氫化，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
6.根據(jù)權利要求1、3或5的方法，其中轉化是通過羥基乙酸氧化酶催化的。
7.根據(jù)權利要求1、3或5的方法，在過氧化氫酶存在下進行。
8.根據(jù)前面任一權利要求的方法，在黃素單核苷酸存在下進行。
9.根據(jù)前面任一權利要求的方法，在pH約6.0至約10.0之間進行。
10.根據(jù)前面任一權利要求的方法，在0℃至約40℃的溫度下進行。
11.根據(jù)前面任一權利要求的方法，其中在羥基乙酸氧化酶以0.01至約1000IU/ml濃度存在時進行。
12.根據(jù)前面任一權利要求的方法，其中在過氧化氫酶以50至50，000IU/ml濃度存在時進行。
13.根據(jù)權利要求4的方法，進一步包括在所述步驟(b)之還原之前，從由步驟(a)中制備的所述溶液分離并回收所述酶。
14.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述步驟(a)的乙醛酸混合物的制備是在黃素單核苷酸存在，并且進一步包括在所述步驟(b)之還原之前，從由步驟(a)中制備的所述溶液分出所述黃素單核苷酸。
15.根據(jù)權利要求5的方法，其中第一個催化劑是羥基乙酸氧化酶，第二個催化劑是過氧化氫酶。
16.根據(jù)權利要求5的方法，其中氫化反應是在催化劑存在下進行的。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中氫化催化劑選自載在碳上的鈀，載在硅藻土上的鎳和阮內(nèi)鎳。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中氫化催化劑存在的量為每100份所用的乙醛酸和氨甲基磷酸的合并重量的0.001至20份重量的催化劑。
19.根據(jù)權利要求17的方法，其中氫化反應是在4至11的pH、0℃至150℃的溫度范圍內(nèi)和1至約100大氣壓的氫氣壓力下進行的。
20.根據(jù)權利要求1、2或3的方法，包括還原中間體生成N-膦酰甲基甘氨酸的另一步驟。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中中間體是通過催化氫化還原的。
22.根據(jù)權利要求21的方法，其中中間體反應混合物被就地制備并氫化。
23.權利要求1、2或3的任一方法在制備N-膦酰甲基甘氨酸中的應用。
24.權利要求1、2或3的任一方法的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備乙醛酸和氨甲基磷酸的混合物并接著制備N-(膦酰甲基)甘氨酸(也稱作草甘膦)的方法。該方法包括在水溶液中在氨甲基磷酸和催化劑——羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的存在下，通過羥基乙酸和氧的酶催化反應就地制備乙醛酸和氨甲基磷酸的混合物，然后將所得混合物氫化制備N-(膦酰甲基)甘氨酸，它是一種后突發(fā)性植物生長抑制劑和除莠劑。
文檔編號C07C59/153GK1073481SQ9211438
公開日1993年6月23日 申請日期1992年11月6日 優(yōu)先權日1991年11月6日
發(fā)明者D·L·安頓, R·迪科西莫, E·W·波塔 申請人:納幕爾杜邦公司