專利名稱：仙茅素b、編碼仙茅素b的dna以及生產(chǎn)仙茅素b的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及仙茅素B(curculin B)、編碼仙茅素D的DNA以及生產(chǎn)仙茅素B的方法。
寬葉仙茅(Curculigo latifolia)是一種屬于仙茅科(Hypoxidaceae)〔按照另一不同的分類方法則屬于石蒜科(Amaryllidaceae)〕的植物，它在自然界中生長于馬來西亞西部、泰國南部等地區(qū)。本發(fā)明的發(fā)明人在過去就已發(fā)現(xiàn)寬葉仙茅中所含有的一種蛋白質(zhì)即仙茅素(Curculin)同系物(以下稱為仙茅素)可用作調(diào)味劑。而且，本發(fā)明人在日本專利申請公開號2-104263中描述了得自寬葉仙茅的仙茅素，在日本專利申請公開號2-84157中公開了穩(wěn)定仙茅素的方法，并在日本專利申請公開號2-84160和2-84161中公開了加工仙茅素的方法。另外，在日本專利申請公開號2-190899中公開了仙茅素同系物之一(以下稱為仙茅素A)的完整氨基酸序列。
但是，在上面的日本專利申請公開號2-104263、2-84157、2-84160、2-84161和3-190899中所述的技術中，仙茅素是從寬葉仙茅中提取的，因此難以大量生產(chǎn)。而且，還存在寬葉仙茅植物難以處理、通過提取方法所獲得的仙茅素的活性較低等問題。
為了提供一種大量生產(chǎn)仙茅素的方法，本發(fā)明人根據(jù)已闡明的仙茅素A的氨基酸序列制備出寡核苷酸，并利用該寡核苷酸作為探針成功地克隆了編碼仙茅素同系物中另一種仙茅素(以下稱作仙茅素B)的cDNA。而且還證實由含有上述克隆DNA的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的微生物產(chǎn)生了仙茅素B，從而使本發(fā)明得以完成。
因此，本發(fā)明涉及基本上純的仙茅素B。在本說明書中，“基本上純的仙茅素B”具體是指基本上無來源于寬葉仙茅之其它蛋白質(zhì)的仙茅素B，并可按照本發(fā)明的方法由重組宿主細胞或微生物產(chǎn)生之。
本發(fā)明也涉及包括編碼仙茅素B之堿基序列的DNA。
另外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)仙茅素B的方法，該方法包括培養(yǎng)含有重組DNA的轉(zhuǎn)化細胞或微生物，其中所說的重組DNA中含有編碼仙茅素B的堿基序列，從而使得被轉(zhuǎn)化的細胞或微生物能夠產(chǎn)生仙茅素B;并從被轉(zhuǎn)化細胞或微生物中分離仙茅素B。
再者，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)包括編碼仙茅素B之堿基序列的DNA的方法，該方法包括從寬葉仙茅中分離出含有仙茅素B mRNA的部分，利用逆轉(zhuǎn)錄酶由mRNA制備單鏈DNA，由單鏈DNA制備雙鏈DNA、將雙鏈DNA插入載體、用該載體轉(zhuǎn)化宿主以產(chǎn)生cDNA庫，并且利用含有編碼部分氨基酸序列的堿基的一個或多個合成DNA作為探針，從該庫中分離出編碼仙茅素B的cDNA，其中所說的部分氨基酸序列是根據(jù)自寬葉仙茅純化的仙茅素A推斷的。


圖1顯示了EcoRI接頭的結(jié)構(gòu)。
圖2是編碼仙茅素B之克隆DNA的限制性酶切圖。
圖3顯示了質(zhì)粒pQ9的結(jié)構(gòu)。
圖4顯示了表達質(zhì)粒的制備方法及其結(jié)構(gòu)。
圖5顯示了電泳和Western分析的結(jié)果。
圖6顯示了通過對寬葉仙茅進行沖洗、提取和脫鹽步驟后所獲得的調(diào)味劑的CM-瓊脂糖離子交換層析的洗脫曲線。
圖7顯示了對圖6的峰(B)陰影部分進行Sephadix G-100分子篩層析的洗脫曲線。
圖8顯示了由高純度仙茅素A組成的調(diào)味劑的活性。
設想植物細胞中的仙茅素是以包括前肽或前肽原的未成熟蛋白質(zhì)形成產(chǎn)生的，且成熟蛋白質(zhì)是通過分離處在加工過程中的前肽或前肽原而形成的。根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，成熟的仙茅素B由114個氨基酸組成，具有下列式(Ⅰ)的氨基酸序列Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His SerLeu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys AsnLeu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn ThrAsp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp GlyAsn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly SerAla Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln LysAsp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu GlyPro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly (Ⅰ).
而且，未成熟的仙茅素B由158個氨基酸組成，其氨基酸序列如式(Ⅱ)所示
Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala AlaVal Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly GlnThr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr LeuThr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly ArgGln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys ArgLeu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His AsnAsn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly LysTyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr GlyPro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val AsnGly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro Gln His GluAsp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn (Ⅱ).
因此，本發(fā)明也涉及包括了編碼具有式(Ⅰ)或(Ⅱ)之氨基酸序列的堿基序列的DNA;還涉及包括了所說的堿基序列以及與之結(jié)合的ATG(編碼起始的甲硫氨酸)的DNA，其中將所說的堿基序列與ATG結(jié)合是為了由微生物或培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生成熟或未成熟的仙茅素B。
通過自然突變或人工誘變，有可能在不改變主要活性的情況下改變DNA結(jié)構(gòu)或相應肽結(jié)構(gòu)之一部分或多個部分。因此，上述本發(fā)明的DNA甚至包括編碼具有對應于所有上述多肽的同源突變體的結(jié)構(gòu)的多肽的堿基序列。
可按以下方法得到編碼仙茅素B的DNA(A)提取mRNA研磨能夠以極高濃度產(chǎn)生仙茅素的寬葉仙茅的果實，并從粉末樣品中提取RNA?？墒褂昧蚯杷犭曳?Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Laboratory，New York(1982))或是苯酚-SDS法(Brawerman等，Biochemistry，11，637-641(1972))提取RNA。
硫氰酸胍法包括向樣品中加入硫氰酸胍溶液然后制備勻漿。然后將勻漿置于晶形塑料離心管中，離心后得到RNA殘余物。精提該RNA殘余物后得到mRNA。
苯酚-SDS法包括將含有苯酚、EDTA和SDS以及二硫蘇糖醇的Tris-鹽酸緩沖液加到粉末樣品中，得到一水相。所產(chǎn)生的水相中除RNA外還含有其它物質(zhì)(如多糖)，因此，須利用氯化鋰等進行脫鹽處理以得到RNA殘余物。然后，將RNA殘余物重新溶于合適的溶劑中，并經(jīng)用Oligo(dT)柱純化而提取mRNA(Aviv et al.，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，1408-1418(1972))。在本發(fā)明中，因為寬葉仙茅植物具有堅硬的細胞壁，故最好使用苯酚-SDS法。
(B)合成cDNA并將cDNA插入載體中為了合成cDNA，可以使用Okayama-Berg的方法(Okayama et al.，;Mol.Cell Biol.2，161(1982))、Gubler-Hoffman的方法(Gubler et al.，Gene 25，263(1983))以及其它方法。
下面解釋Okayama-Berg法。
〔1〕用限制酶KpnⅠ切割PBR322-SV40載體質(zhì)粒，然后加入Oligo dT，并與限制酶HpaⅠ反應。利用OligodT纖維素(Pharmacia LKB Biotechnology Co.)柱分離出無額外dT或具有Oligo dT短鏈的產(chǎn)物，從而制得載體引物。
〔2〕用限制酶pstⅠ切割另一個pBR322-SV40融合質(zhì)粒DNA并純化之。然后接上Oligo dG鏈以制備出具有可被限制酶HindⅢ切割之堿基序列的接頭DNA。
〔3〕將純化的mRNA和上面〔1〕中制備的載體引物混合，并利用轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。
〔4〕將Oligo dG鏈連接到與合成之cDNA融合的引物上，然后用HindⅢ消化，并除去在cDNA融合之末端的相反側(cè)連接了Oligo dG鏈的部分。
〔5〕利用T4連接酶或另一種DNA連接酶連接HindⅢ片段，使上面〔2〕中制得的帶有Oligo dG鏈的接頭DNA與上面〔4〕中制得的載體引物DNA-mRNA雜合體連接成環(huán)，然后用核糖核酸酶H部分消化RNA。再利用此RNA片段作引物，并依靠DNA聚合酶用DNA鏈取代RNA鏈。利用T4連接酶連接DNA后制備雙鏈DNA。
〔6〕制備感受態(tài)細胞，進行轉(zhuǎn)化后將細胞培養(yǎng)于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中(例如X-培養(yǎng)液，LB-培養(yǎng)液，或YT-培養(yǎng)液)，從而得到含有所需DNA的菌落。
下面介紹Gubler-Hoffman法。在該方法中，有可能利用λgt10、λgt11、λZAP等作為載體。
〔1〕利用退火至純化之mRNA的poly A部分上的Oligo dT作為引物，并利用逆轉(zhuǎn)錄酶，合成第一條cDNA鏈(或sscDNA)。
〔2〕將核糖核酸酶H或另一種內(nèi)切型RNA酶加到上面〔1〕中制備的cDNA-mRNA雜合體中以消化mRNA，然后加入dATP、dTTP、dGTP和dCTP，用DNA聚合酶Ⅰ或Klenow片段引發(fā)反應，以合成第二條cDNA鏈(或dsc DNA)。
〔3〕通過T4 DNA聚合酶反應處理上面〔2〕中制備的dscDNA以使其兩端均勻，并利用EcoRI甲基化酶使EcoRI位點甲基化，然后將EcoRI接頭連接至兩末端，并進行EcoRI消化。
〔4〕用T4連接酶連接上面〔3〕中制備的EcoRI消化的cDNA和EcoRI消化的λgt載體，然后包裝以制備cDNA文庫。
可按照上述方式合成cDNA并將其插入載體中。但是在本發(fā)明的方法中，如后面的實施例所示，最好使用Gubler-Hoffman法，并且最好用λgt10作為載體。
(C)制備探針本發(fā)明人已從寬葉仙茅植物中純化仙茅素A，測定出該蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列，并公開在日本專利申請公開號3-190899中。可選擇該氨基酸序列中的合適部分來制備探針?？衫靡阎椒?例如利用自動DNA合成儀的磷酰亞胺法，The Japanese Biochemical Society ed.，Henetic Research Mechods I，1-27(1986)或Matteucci et al.，Tetrahedron Lett.，21，719(1980))來合成用作探針的DNA。
(D)篩選可利用上面(C)中制備的探針從上面(B)中制備的cDNA文庫中篩選出含有所需基因的噬斑。將該噬斑在尼龍膜、硝酸纖維素或其它濾膜上烘烤。然后按照上面提到的Manitis等人的方法，用放射性核素(如〔32P〕)標記上面(C)中獲得的探針。將在上述濾膜上烘烤過的噬斑與用32P等標記的探針雜交，以篩選出含有所需基因的噬斑。
另外，也可利用Glover，DNA Cloning，1，51-52，IRL Press中所述的方法從cDNA文庫中篩選含有所需基因的噬斑。該篩選方法包括利用該蛋白質(zhì)的特異性抗體檢測與所需cDNA的表達相對應的蛋白質(zhì)活性或檢測與所需cDNA的表達相對應的蛋白質(zhì)，并鑒定cDNA。但是，在本發(fā)明中所使用的是噬斑雜交(或菌落雜交)法。
(E)亞克隆可用于亞克隆的載體的例子有puc系的質(zhì)粒(如pUC7、pUC8、pUC9、pUC18或pUC19)或pBR系的質(zhì)粒(如pBR322、pBR325或pBR327)。最好是使用pUC18。從通過上述篩選方法所選擇的噬斑或菌落中提取并純化噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA，并在用合適的限制酶消化后插入到亞克隆載體中。
按照例如Hanahan等人所述的方法(Mol.Biol.166 557-580(1983))。將由此獲得的重組載體引入到感受態(tài)細胞中。所使用的宿主細胞可以是得自大腸桿菌K12菌株的細胞，如HB101或MM294、MC1061、C600、DH1以及JM109?？衫蒙厦鍹aniatis等人的文章中所述的方法，例如使用異丙基吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)的方法檢測由此獲得的轉(zhuǎn)化株。
(F)制備質(zhì)粒DNA按照例如上面Maniatis等人的文獻中所述的堿性SDS法或者煮沸法，有可能從通過亞克隆所獲得的克隆中純化質(zhì)粒DNA。如果需要，也可使用氯化銫超離心法。
(G)cDNA的結(jié)構(gòu)分析用各種類型的限制酶切割上面(F)中制得的質(zhì)粒DNA以制備限制性酶切圖。另外，用雙脫氧法(Sanger et al.，J.Mol.Biol.143，161-178(1980))測定核苷酸序列。
(H)表達可利用上面(F)中所獲得的質(zhì)粒DNA以及利用例如上面Maniatis等人的文獻中所述的方法來轉(zhuǎn)化大腸桿菌YA21菌株的感受態(tài)細胞并表達仙茅素B。除了上述大腸桿菌YA21菌株外，用于表達的宿主細胞還可以是大腸桿菌MM294、DH1、DH5JM109、HB101、GC508或CES201等。
另外，用于本發(fā)明的載體可以是ColE1質(zhì)粒載體，如pUC系(例如pUC7、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19等)、pBR系(例如pBR322、pBR325和pBR327等)及其衍生物pTV118、pUC118、pUC119等。可提到的噬菌體載體包括得自λ-噬菌體的載體，如λgt10、λgt11、Charon 4A、λgt WES-λB、EMBL3、EMBL4等。
再者，適于在酵母中表達的載體可以是例如pYES2.0、pAH9、pMAC561、pLG669、pMA91、pMM82、pMC2010、pOP、pTE432和pSD922。適于在枯草芽孢桿菌中表達的載體可以是例如pPL608、pKTH50、pKTH51、pKTH53、pKTH38、pHY300pLH等。適于在動物細胞(如COS-7細胞、Bowes黑素瘤細胞、CHO細胞)中表達的載體可以是例如pMT、pSV、pCD pMDSG、pBPV等。
在合適的已知培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化株，直至達到足夠的細胞濃度。然后通過例如超聲波處理等手段破碎細胞，并用已知方法處理所得的液體以純化仙茅素B。所獲得的仙茅素B可用作調(diào)味劑、食品、藥物等。
下述實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實施例1提取RNA
用干冰冷凍約6g寬葉仙茅果實(從開花后不久至完全成熟的各個不同時期，即從0周至大約8周不同生長階段之果實的混合物;由于使用的是整個果實，所以所有的果實成分如果皮、種子、果肉等均包括在內(nèi))，并在防止融化的情況下用干冰冷凍并粉碎之，得到5g粉狀物。
向5g所產(chǎn)生的粉末中加入15ml苯酚、15ml0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.5，5mM EDTA，1%SDS)和600μl 1M二硫蘇糖醇?；旌虾罅⒖虅×覔u動該混合物。離心分離出水相，然后用苯酚提取三次。所產(chǎn)生的水相中包含有除RNA之外的物質(zhì)如多糖。因此，加入1.05體積的5M氯化鋰，并將混合物于4℃放置2小時，然后離心得到RNA沉淀物。接著，用乙醇處理該沉淀物，得到768μg RNA。
實施例2提取mRNA對得自實施例1的768μg RNA進行熱變性處理(65℃10分鐘)，并制備含有熱變性之RNA的0.5M氯化鈉溶液，然后使該溶液通過Oligo(dT)柱(mRNA純化柱;Pharmacia LKB Biotechnology Co.)。用0.5M氯化鈉溶液除去未吸附的部分，并用不含氯化鈉的洗脫液洗柱，得到8μg高濃度的RNA。
實施例3合成cDNA利用市售的cDNA合成試劑盒(cDNA合成試劑盒;Pharmacia LKB Biotechnology Co.)由mRNA合成sscDNA，然后再合成dscDNA。用Klenow片段修成平頭，并與EcoRI接頭一起退火。
即，向包括Oligod(T)12-18引物、Maloney氏小鼠白血病病毒(MMLV)之逆轉(zhuǎn)錄酶、dATP、dCTP、dGTP和dTTP的緩沖液(第一鏈反應混合物)中加入含有4μg熱變性mRNA的20μl無核糖核酸酶的水。使反應混合物于37℃反應1小時。然后將上述反應混合物加至含有核糖核酸酶H、DNA聚合酶Ⅰ、dATP、dCTP、dGTP和dTTP的緩沖液(第二鏈反應混合物)中，使總體積達到100μl。整個混合物于12℃反應1小時，然后于22℃反應1小時。反應完成后，加入1μl Klenow片段，使反應混合物再于37℃反應30分鐘。加入100μl苯酚/氯仿后，將混合物離心1分鐘，用層析柱純化上層水相。向100μl洗脫液中加入4μl EcoRI接頭(其結(jié)構(gòu)示于圖1)溶液、1μl ATP溶液和3μl T4 DNA連接酶。將混合物溫和攪拌并作短時間離心后，于12℃反應過夜。將反應溶液于65℃加熱10分鐘使DNA連接酶變性并用冰冷卻，然后加入10μl ATP溶液和1μl T4多核苷酸激酶。溫和攪拌后于37℃反應30分鐘。向反應溶液中加入100μl苯酚/氯仿，然后離心1分鐘，上層水相通過層析柱純化，從而得到與EcoRI接頭連接的dscDNA。
實施例4將cDNA插入載體中用EcoRI切割λgt10的EcoRI位點，經(jīng)堿性磷酸酶處理并脫去磷酸后，使之與實施例3中得到的連接了EcoRI接頭的dscDNA相連接。
為找到最好的混合比例，進行試驗連接。即，將2μl λgt10、3μl 3M乙酸鈉和60μl冷乙醇加到實例3中得到的30μl洗脫液(用洗柱緩沖液稀釋成含有5.0ng、15.0ng或40.0ng dscDNA的溶液)。將整個混合物混合后于-70℃冷卻15分鐘，離心10分鐘以得到沉淀物。干燥所得沉淀物。將干燥過的cDNA重新懸浮于9μl洗柱緩沖液中，然后加入1μl ATP溶液和1μl T4DNA連接酶。攪拌后離心該混合物，并于12℃反應16小時。然后按照Maniatis等人的文獻中所述的方法進行體內(nèi)包裝(Giga pack golol)并用重組噬菌體感染大腸桿菌c600hf1，由此發(fā)現(xiàn)當0.3μg λgt與40ng EcoRI接頭連接的dscDNA混合時可得到最佳結(jié)果。然后，按照上述摩爾比放大連接和包裝，以制得約含300，000個單獨的噬斑的文庫。
實施例5篩選根據(jù)日本專利申請公開號3-190899中所述的仙茅素A的氨基酸序列，制備出以下三種類型的探針。在下面的堿基序列中，N代表脫氧核糖核苷酸殘基A、C、G和T，H代表A、C和T，D代表A、G和T，R代表A和G，K代表G和T，Y代表C和T。所使用的合成方法可以是上面提到的Japanese Biochemical Society(Genetic Research Methods I)文獻中所述的方法。
(1)基于Ile-Gln-Asn-Asn-Cys-Asn(從成熟仙茅素A的氨基末端的第25位至第30位氨基酸)的有意義鏈DNA探針(17mer;48種類型)5'-ATH-CAR-AAK-AAK-TGY-AA-3'(2)基于Tyr-Gln-Asn-Gly-Arg-Gln-Ile-Trp-Ala(第34至第42位氨基酸)的反義鏈DNA探針(26mer;1536種類型)5'-GC-CCA-DAT-YTG-NCK-NCC-RTT-YTG-RTA-3'(3)基于Phe-Val-Ile-Tyr-Gly-Pro-Val(第94至第100位氨基酸)的反義鏈DNA探針(20mer;768種類型)5'-AC-NGG-NCC-RTA-DAT-NAC-RAA-3'利用T4多核苷酸激酶，用〔γ-32P〕dATP標記這些探針的5′末端，并在下面的實施例6中使用之。
實施例6噬斑雜交將實施例4所得文庫中的噬斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并固定該DNA。然后用實施例5制備的探針(1)至(3)依次進行雜交。用探針(1)進行雜交時的溫度為33-34℃，探針(2)為55℃，探針(3)為45-46℃。對探針(1)至(3)的洗滌條件均為6X SSC(1X SSC為0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉)，且洗滌溫度與雜交時的相應溫度相同。結(jié)果從大約300，000個噬斑中得到16組與所有探針雜交的噬斑。
實施例7分離單個噬斑對實施例6所獲得的16組噬斑中的每一組進行第二次篩選。即每一組噬斑均分離成單獨的噬斑，按照與實施例6相同的方式使它們依次與探針(1)-(3)雜交。分別從16組噬斑中的每一組中得到與所有探針(1)至(3)雜交的噬斑。所得的噬斑分別命名為噬菌體λQ1至λQ16。從噬菌體λQ1至λQ16中提取出噬菌體DNA，用EcoRI消化，并通過電泳比較插入子的分子量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含于噬菌體λQ9中的插入子最長(約1.2kbp)。
實施例8亞克隆利用pUC18再克隆包含于噬菌體λQ9中的插入子。即，按照例如Japanese Biochemical Society ed.，Cont.Biochemical Experiment Lectures I，Genetic Research Methods 2，100(1986)中所述的方法從噬菌體λQ9中純化30μg DNA，并用100單位EcoRI消化，從而得到400ng編碼仙茅素的EcoRI片段。另一方面，用EcoRI切割pUC18(50ng)，用堿性磷酸酶處理并脫磷酸。然后向其中加入含有100ng上述EcoRI片段和1.0μl T4連接酶的20μl連接緩沖液(66mM Tris-HCl緩沖液，含有0.01mM ATP、6.6mM氯化鎂和10mM二硫蘇糖醇，PH7.6)，將該混合物于12℃保溫16小時以進行連接。
然后，按照上面提到的Hanahan等人的文獻中所述的方法進行轉(zhuǎn)化。即，將含有100ng cDNA-質(zhì)粒DNA的5μl上述緩沖液加到為轉(zhuǎn)化而制備的210μl大腸桿菌MM294的感受態(tài)細胞中。將混合物于0℃放置30分鐘，42℃放置80秒鐘后用冰冰卻。加入800μl SOC培養(yǎng)基，并將混合物于37℃振蕩1小時。將混合物在含有50μg/ml氨芐青霉素的X-液體瓊脂培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)，每板約得到100個轉(zhuǎn)化體。
實施例9菌落雜交按常規(guī)方法對實施例8中獲得的多個平板進行變性和烘烤處理以固定DNA。于55°用上述實施例5制備的探針(2)進行雜交，并在同一溫度下用6X SSC洗滌。得到75個陽性克隆。
實施例10質(zhì)粒DNA將實施例9中認定為陽性的一個轉(zhuǎn)化株重新植入含有50μl/ml氨芐青霉素的30ml X-培養(yǎng)基中。將該混合物于37℃過夜振蕩培養(yǎng)，然后于4℃離心(2000×g，7分鐘)以得到大約200μg細胞。將該細胞(約200μg)溶于800μl含溶菌酶(10mg/ml的25mM Tris-HCl緩沖溶液(含有50mM葡萄糖和10mM EDTA，pH8.0)中，按照上面提到的Maniatis等人的文獻中所述的方法獲得約20μg質(zhì)粒(以下稱作質(zhì)粒PQ9)DNA。質(zhì)粒PQ9的結(jié)構(gòu)示于圖3中(在圖3的插入部分中，箭頭指示編碼仙茅素B的DNA的插入方向)。
實施例11制備限制酶切圖并測定堿基序列用各種限制酶切割質(zhì)粒PQ9，制備出圖2所示的限制性酶切圖。另外，利用雙脫氧法(見上述Sanger等人的文獻)測定各種DNA片段的核苷酸序列，其結(jié)果示于下面的表1中。表1中也顯示了根據(jù)堿基序列推導出的氨基酸序列。圖2中的陰影部分顯示編碼部分，箭頭表示堿基序列的測定方向。表1中所示的5′和3′非翻譯區(qū)的各堿基序列分別是一個例子。即，當利用λQ1至λQ16中除λQ9之外的噬菌體作同樣處理以測定堿基序列時，發(fā)現(xiàn)了與表1所示的5′和3′非翻譯區(qū)的堿基序列存在部分差異的序列。
表ⅠCGCAAAGACA ATG GCG GCC AAG TTT CTT CTC ACC ATT CTT GTC ACCMet Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr-20 -15TTT GCG GCC GTC GCT AGC CTT GGC ATG GCC GAC AAT GTC CTG CTCPhe Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu-10 -5 1 5TCC GGG CAA ACT CTG CAT GCC GAC CAC TCT CTC CAG GCG GGC GCCSer Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala10 15 20TAT ACC TTA ACC ATA CAA AAC AAG TGC AAC CTG GTG AAA TAC CAGTyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln25 30 35AAC GGG AGG CAG ATC TGG GCT AGC AAC ACT GAC AGG CGG GGC TCCAsn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser40 45 50GGC TGC CGC CTC ACA TTG CTG AGT GAC GGG AAC CTC GTT ATC TACGly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr55 60 65GAC CAC AAC AAC AAC GAC GTG TGG GGG AGC GCC TGC TGG GGG GACAsp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp70 75 80AAC GGC AAG TAT GCT CTT GTT CTT CAG AAG GAT GGC AGA TTT GTCAsn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val85 90 95ATC TAT GGC CCG GTT TTG TGG TCC CTT GGC CCT AAT GGG TGC CGCIle Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg100 105 110CGT GTT AAT GGT GGA ATC ACA GTT GCT AAG GAT TCT ACT GAA CCAArg Val Asn Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro115 120 125CAA CAT GAG GAT ATT AAG ATG GTG ATT AAT AATGln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn130 135TAATCAAGTG AGAGGATTGT TATGAGAATA ATGAGTGGAA TGGAAGACCAATCTCATGTC GGTGTGGCCT ATCTCCACCT GTTTGCAGTG CCTTTGTTAAAATAACACAT TGGGGAATAA TAAAGTGAAA CTATATAGAT TGGTTCAGCAAATTTTCTGT TCAGTTTTCC TCTCACATGT CAATGTCGAT TTTTTGCCGCGGATCATACA TGTGCTTGGT ATTCTAATCG ATAGAATTAT GGCTCAAATGGAGGCAGGGA TTATGAGAGT TTATTCGCAT CTCCGGGTCT TCCAACTTACGAATTATAAC AAGATTCAAG GATGCATCTG AGAGCCAACT TAACGTCTTACATCAAAGGA GCTAGCCGAA GTTTATTCCC AGAGCTAGAG GAAGTTCGCTGCCATGGTTG ATAGTACAAG TAGAACGACG CATGTATTGC TTCCAGGAATCACTTCCAGC TTCTCGACAC CTCCAGTGGC CTTTTCACCA CCGAAAGCACCACCAATTTC AGCACCATTG GTAGGTATAT TTACATTAAC AATACCACAGTCACTGCCAT GGGGTCCAAT CCACTTGAAA ATAACTTCAG GTCTACGAGTGAAAATAGAA CTGCTTAAAC TTGCGGTACA GAGTTATTTA TTTCAATTGCTTCTTTCAGA GTCTGGAATT TCATTACGTA AA (III)
實施例12表達按照Hanahan等人所述的方法(文獻同上)制備表達載體。即用EcorⅠ消化質(zhì)粒pQ9(10μg)，并利用klenow片段(1.0μl5.0單位)。充填其末端，從而得到編碼仙茅素B的DNA片段(約1.2kb)。然后，將100ng該DNA片段插入被HincⅡ消化的puc18(50ng)中，制備一重組質(zhì)粒(見圖4)。另一方面，利用氯化鈣處理法使大腸桿菌YA21菌株成為感受態(tài)細胞，并用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化之。將轉(zhuǎn)化體接種在含有50μg/ml氨芐青霉素的0.2mlx-液體培養(yǎng)基中，并于37℃保溫18小時。然后離心(3000xg，10分鐘)細菌懸浮液，將約5μg所得沉淀物懸浮于1.0mlM9培養(yǎng)基中，并進行預保留。然后以1mM的濃度加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)保溫2小時。
實施例13制備抗血清將含有1mg/4ml在對比實施例4(見下)中制備并在對比實施例5(見下)中鑒定的仙茅素A的0.1M pBS磷酸鹽生理緩沖液(pH7.6)用作抗原溶液(用于一次免疫)。將4ml抗原溶液與等量的弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA混合所獲得的油包水型乳液分別用作FCA抗原溶液和FIA抗原溶液，將2ml上述FUA抗原溶液通過肌肉注射到兔(兩只體重約1.5kg的雌兔)的左、右大腿部位以對其進行免疫(初次免疫)。初次免疫一周后，按同樣方式再次免疫(加強免疫)，不同的是這次使用的是FIA抗原溶液。加強免疫一周后，按30ml/兔抽取血樣。將所得血液于室溫放置2小時，然后以3500rpm離心5分鐘。所得上清液以10，000rpm的速度繼續(xù)離心20分鐘，從上清中制取含有抗仙茅素A抗體的抗血清。通過柱層析(1.0×4.0cm柱，自然降落)用不溶性蛋白質(zhì)A處理該抗血清以制備出純化的抗血清。
實施例14Western分析將實施例12中制及的細胞懸浮在100μl含有1mM pMSF(苯甲磺酰氟)的10mM Tris-1mM EDTA緩沖液(pH7.5)中，并通過超聲波處理將其破碎，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離到3μl所得液體。其結(jié)果示于圖5的第3泳道。圖5的第4泳道是對照樣品，它是通過破碎未經(jīng)實施例12所述之一重組步驟的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌YA21菌株并按同樣方式通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所產(chǎn)生的液體而得到的如第三泳道左邊的箭頭所示，蛋白質(zhì)成分見于約17kd處。所使用的標記物(未示出)是預染色的SDS-PAGE標準品(含有磷酰酶B(PhospholyraseB)(110kd)，牛血清白蛋白(84kd)，卵白蛋白(47kd)，碳酸酐酶(33kd)，大豆胰蛋白酶抑制劑(24kd)和溶菌酶(16kd);Biorad Laboratories)。
然后，將分離的成分轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，于室溫下用10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4;含有0.14M氯化鈉和0.05%(v/v)吐溫20，以下稱作TPBS)洗滌濾膜，然后加入20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4;含有3%白蛋白和0.5M氯化鈉)作為封阻滲液。將混合物于37℃放置60分鐘，進行封阻。向上述濾膜中加入10ml1500倍稀釋的實施例13所獲得的純化抗血清于4℃放置1天。用TPBS洗滌三次后加入第二抗體。再將濾膜于室溫放置2小時。既使用的第二抗體是5ml1000倍稀釋的堿性磷酸酶接合的抗兔IgG(Sigma co)。
接著，加入約10ml堿性磷酸酶緩沖液，并將濾膜于室溫下放置10分鐘。然后，加入含66μlNBT(四唑氮藍)溶液、33μlBCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)溶液和9.9ml堿性磷酸酶緩沖液的底物溶液，使濾膜在室溫下顯色5分鐘。加入3%三氯乙酸溶液終止反應，并用蒸餾水漂洗濾膜。其中NBT溶液是將50mg NBT溶于1ml70%二甲基甲酰胺而制得的，BCIP溶液是將50mg BCIP溶于1ml100%甲酰胺而制得的。
所得結(jié)果示于圖5的第1和第2泳道。第1泳道是第3泳道的轉(zhuǎn)移，而第2泳道是第4泳道(對照)的轉(zhuǎn)移。第2泳道不含有與抗仙茅素A抗體反應的任何成分，而第1泳道則如左邊的箭頭所示，含有與在第3泳道的約17kd處出現(xiàn)的蛋白質(zhì)相應之位置的抗仙茅素A抗體反應的成分。
參考實施例1漂洗和用氯化鈉溶液提取。
稱取約30g寬葉仙茅果肉，向其中加入40ml水。將該混合物制成勻漿并離心(12，500rpm，60分鐘)。上清液呈現(xiàn)棕色且不具有調(diào)味活性。向所得殘渣中加入40ml水，將混合物制成勻漿并離心(12，500rpm，20分鐘)。上清為無色液體且不具有調(diào)味活性。
然后，將0.5M氯化鈉水溶液加至所得殘渣中。將混合物制成勻漿并離心(30，000rpm，60分鐘)。所得上清為無色液體且顯示出調(diào)味活性。使用40ml 0.5M氯化鈉水溶液重復提取步驟三次。合并三份上清液后得到含有仙茅素的粗提物。
參考實施例2用硫酸銨鹽析向參考實施例1中制得的粗提物中加入硫酸銨至80%飽和度以沉淀活性物質(zhì)。離心(32，000rpm，60分鐘)所得液體以得到沉淀物，將其溶于100ml 0.01M磷酸鹽緩沖液(PH6.8)中。
參考實施例3CM-Sepharose離子交換層析將參考實施例2中得到的溶液通過CM-Sepharose CL-6B柱(直徑＝2.2cm×18cm;柱床體積＝68ml;Pharmacia LKB Biotechnology Co.)以進行吸附。然后，用0.01M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)除去未吸附的部分再用0-1.0M線性梯度的氯化鈉溶液(流速＝5ml/小時，每管5ml;總洗脫物＝500ml)洗脫仙茅素。根據(jù)280nm處的吸收值監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)。所得結(jié)果顯示于圖6中。圖6所示的峰(B)是包含調(diào)味仙茅素的部分。
參考實施例4分子篩層析向參考實施例3所獲得的部分(如圖6的峰(B)之陰影部分所示)中加入硫酸銨至80%飽和以沉淀活性物質(zhì)。離心(32，000rpm，60分鐘)所得液體，得到沉淀物，然后將其溶解于1.5ml 0.01M磷酸鹽緩沖液(PH6.8)中。用Sephadex(Pharmacia LKB Biotechology Co.)G-100柱(直徑＝1.6cm×58cm;柱床體積＝160ml)及含有0.5M NaCl的0.01M磷酸鹽緩沖液(PH6.8)(流速＝8.4ml/hr;每管收集2.8ml;總洗脫物＝182ml)分離所得到的濃縮溶液。根據(jù)280nm處的吸收值監(jiān)測蛋白質(zhì)。圖7所示的峰(A)是包含調(diào)味仙茅素的部分。
參考實施例5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳利用含8M尿素的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，以電泳法測定參考實施例4所得的圖7峰(A)陰影部分所示之部分的物質(zhì)純度及其分子量。結(jié)果可見在分子量12，000道爾頓處顯示出單一帶，從而證實圖7峰(A)陰影部分所示之部分的調(diào)味仙茅素是純的。因此，將所得到的純化的仙茅素稱為“仙茅素A”。
表2列出了從30g寬葉仙茅果肉中制得的仙茅素成分的蛋白質(zhì)含量、活性物質(zhì)的產(chǎn)率以及純化程度。其中蛋白質(zhì)含量是采用Lowry等人的方法測定的。
另外，按如下方法測定其活性將樣品在口中放3分鐘，用水漱口后通過品嘗含有各種濃度之蔗糖溶液的0.02M檸檬酸溶液來進行甜度比較，從而確定達到相同甜度的蔗糖濃度。所得結(jié)果示于圖8。從圖8可以看出，高純度仙茅素A的活性相當于0.3M蔗糖的甜度。
參考實施例6等電點電泳以使用Phast Gel IEF5-8的Phast System(商標)(Pharmacia LKB Biotechnology Co.)裝置對高純度的仙茅素A進行等電點電泳。由此測得的等電點為7.1。
按照本發(fā)明，可采用比現(xiàn)有技術更簡便的方法制備出基本上純的和穩(wěn)定的仙茅素B，并具有可能對其進行大規(guī)模生產(chǎn)。
盡管參照具體的實施方案對本發(fā)明進行了敘述，對本發(fā)明所作的對于本領域技術人員來說顯而易見的各種改動和改進均視為包括在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思之內(nèi)。
序列目錄序列號1序列長度114序列類型氨基酸分子類型蛋白質(zhì)原始來源寬葉仙茅序列描述:
Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser1 5 10 15Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn20 25 30Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr35 40 45Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly50 55 60Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser65 70 75Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys80 85 90Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly95 100 105Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly110序列號2序列長度158序列類型氨基酸分子類型蛋白質(zhì)原始來源寬葉仙茅序列描述Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala Ala-20 -15 -10Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln-5 1 5Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu10 15 20Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg25 30 35Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg40 45 50Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn55 60 65Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys70 75 80Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly85 90 95Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn100 105 110Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro Gln His Glu115 120 125Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn (II).
130 135序列號3序列長度1166序列類型核苷酸分子類型cDNA或mRNA原始來源寬葉仙茅序列描述
CGCAAAGACA ATG GCG GCC AAG TTT CTT CTC ACC ATT CTT GTC ACCMet Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr-20 -15TTT GCG GCC GTC GCT AGC CTT GGC ATG GCC GAC AAT GTC CTG CTCPhe Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu-10 -5 1 5TCC GGG CAA ACT CTG CAT GCC GAC CAC TCT CTC CAG GCG GGC GCCSer Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala10 15 20TAT ACC TTA ACC ATA CAA AAC AAG TGC AAC CTG GTG AAA TAC CAGTyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln25 30 35AAC GGG AGG CAG ATC TGG GCT AGC AAC ACT GAC AGG CGG GGC TCCAsn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser40 45 50GGC TGC CGC CTC ACA TTG CTG AGT GAC GGG AAC CTC GTT ATC TACGly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr55 60 65GAC CAC AAC AAC AAC GAC GTG TGG GGG AGC GCC TGC TGG GGG GACAsp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp70 75 80AAC GGC AAG TAT GCT CTT GTT CTT CAG AAG GAT GGC AGA TTT GTCAsn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val85 90 95ATC TAT GGC CCG GTT TTG TGG TCC CTT GGC CCT AAT GGG TGC CGCIle Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg100 105 110CGT GTT AAT GGT GGA ATC ACA GTT GCT AAG GAT TCT ACT GAA CCAArg Val Asn Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro115 120 125CAA CAT GAG GAT ATT AAG ATG GTG ATT AAT AATGln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn130 135TAATCAAGTG AGAGGATTGT TATGAGAATA ATGAGTGGAA TGGAAGACCAATCTCATGTC GGTGTGGCCT ATCTCCACCT GTTTGCAGTG CCTTTGTTAAAATAACACAT TGGGGAATAA TAAAGTGAAA CTATATAGAT TGGTTCAGCAAATTTTCTGT TCAGTTTTCC TCTCACATGT CAATGTCGAT TTTTTGCCGCGGATCATACA TGTGCTTGGT ATTCTAATCG ATAGAATTAT GGCTCAAATGGAGGCAGGGA TTATGAGAGT TTATTCGCAT CTCCGGGTCT TCCAACTTACGAATTATAAC AAGATTCAAG GATGCATCTG AGAGCCAACT TAACGTCTTACATCAAAGGA GCTAGCCGAA GTTTATTCCC AGAGCTAGAG GAAGTTCGCTGCCATGGTTG ATAGTACAAG TAGAACGACG CATGTATTGC TTCCAGGAATCACTTCCAGC TTCTCGACAC CTCCAGTGGC CTTTTCACCA CCGAAAGCACCACCAATTTC AGCACCATTG GTAGGTATAT TTACATTAAC AATACCACAGTCACTGCCAT GGGGTCCAAT CCACTTGAAA ATAACTTCAG GTCTACGAGTGAAAATAGAA CTGCTTAAAC TTGCGGTACA GAGTTATTTA TTTCAATTGCTTCTTTCAGA GTCTGGAATT TCATTACGTA AA
權利要求
1.利用重組宿主細胞或微生物生產(chǎn)基本上純的仙茅素B的方法。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，它用于生產(chǎn)基本上沒有來源于寬葉仙茅之其它蛋白質(zhì)的仙茅素B。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，它用于生產(chǎn)包括式(Ⅰ)氨基酸序列的肽Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His SerLeu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys AsnLeu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn ThrAsp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp GlyAsn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly SerAla Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln LysAsp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu GlyPro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly (Ⅰ).
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，它用于生產(chǎn)包括式(Ⅱ)氨基酸序列的肽Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala AlaVal Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly GlnThr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr LeuThr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly ArgGln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys ArgLeu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His AsnAsn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly LysTyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr GlyPro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val AsnGly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro Gln His GluAsp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn (Ⅱ).
5.生產(chǎn)仙茅素B的方法，它包括培養(yǎng)含有重組DNA的轉(zhuǎn)化細胞或微生物，其中所說的重組DNA含有編碼仙茅素B的堿基序列，從而使得該轉(zhuǎn)化細胞或微生物產(chǎn)生仙茅素B，并從所說的被轉(zhuǎn)化細胞或微生物中分離仙茅素B。
6.利用含有編碼自寬葉仙茅(Curc u ligo latifolia)純化的仙茅素A推導出的部分氨基酸序列之堿基序列的一個或多個合成的DNA作為探針，由分離自寬葉仙茅的mRNA生產(chǎn)包括編碼仙茅素B的堿基序列之DNA的方法。
7.利用含有編碼自寬葉仙茅純化的仙茅素A推導出之部分氨基酸序列的堿基序列的一個或多個合成的DNA作為探針，由分離自寬葉仙茅的mRNA生產(chǎn)包括編碼未成熟仙茅素B之堿基序列的DNA的方法。
8.生產(chǎn)包括編碼仙茅B之堿基序列的DNA的方法，該方法包括從寬葉仙茅中分離含有仙茅素mRNA的部分;利用逆轉(zhuǎn)錄酶從所說的mRNA制備單鏈DNA;從所說的單鏈DNA制備雙鏈DNA;將所說的雙鏈DNA插入載體中，用所說的載體轉(zhuǎn)化宿主以產(chǎn)生cDNA文庫，以及利用一個或多個合成的DNA體為探針從所說的cDNA文庫中分離編碼仙茅素B的cDNA，其中所說的合成的DNA含有編碼部分氨基酸序列的堿基序列，所說的堿基序列是根據(jù)自寬葉仙茅純化的仙茅素A推導出的。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中使用至少一種選自包括下列堿基序列式之DNA的DNA作為探針5'-ATH-CAR-AAK-AAK-TGY-AA-3',5'-GC-CCA-DAT-YTG-NCK-NCC-RTT-YTG-RTA-3'和5'-AC-NGG-NCC-RTA-DAT-NAC-RAA-3'其中N代表脫氧核糖核苷酸殘基A、C、G或T，H代表脫氧核糖核苷酸殘基A、C或T，D代表脫氧核糖核苷酸殘基A、G或T，R代表脫氧核糖核苷酸殘基A或G，K代表脫氧核糖核苷酸殘基G或T，Y代表脫氧核糖核苷酸殘基C或T。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中使用包括了下式堿基序列的DNA5'-ATH-CAR-AAK-AAK-TGY-AA-3'或包括了下式堿基序列的一個或兩個DNA作為探針5'-GC-CCA-DAT-YTG-NCK-NCC-RTT-YTG-RTA-3'或5'-AC-NGG-NCC-RTA-DAT-NAC-RAA-3',其中N代表脫氧核糖核苷酸殘基A、C、G或T，H代表脫氧核糖核苷酸殘基A、C或T，D代表脫氧核糖核苷酸殘基A、G或T，R代表脫氧核糖核苷酸殘基A或G，K代表脫氧核糖核苷酸殘基G或T，Y代表脫氧核糖核酸殘基C或T。
全文摘要
本發(fā)明涉及基本上純的仙茅素B、生產(chǎn)仙茅素B的方法以及編碼成熟或未成熟仙茅素B的DNA。
文檔編號C07K14/245GK1064704SQ9210136
公開日1992年9月23日 申請日期1992年3月4日 優(yōu)先權日1991年3月4日
發(fā)明者栗原良枝, 荒井綜一, 阿部啟子, 山下治之 申請人:栗原良枝, 荒井綜一, 旭電化工業(yè)株式會社