專利名稱：：有殺蟲效力的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明與有殺蟲效力的多肽有關(guān)。特別與如下有關(guān)可從Diguetia蜘蛛毒分離到的有殺蟲效力的多肽，編碼這些有殺蟲效力多肽的DNA，生產(chǎn)上述多肽的方法和控制無脊椎害蟲的方法。近年來，公眾已經(jīng)深刻地意識到與使用人工合成殺蟲劑有關(guān)的環(huán)境危害和對哺乳動物的毒性。因此，這些殺蟲劑的使用已經(jīng)迅速地下降。然而，對有效昆蟲控制的需要并未改變。這就促使研究人員去建立新的控制昆蟲的方法。最廣泛使用的微生物殺蟲劑來自細菌Bacillusthuringiensis(以后簡稱B.t.)。這種細菌制劑用于控制多種吃葉的鱗翅目幼蟲。日本甲蟲和蚊子。Karamata等1989年1月10日發(fā)表的美國專利號4，797，279闡明了含編碼B.t.Kurstakiδ-內(nèi)毒素的基因和編碼B.t.tenebrionisδ-內(nèi)毒素的基因的雜合細菌細胞以及它們的制備方法。這些雜合子能有效抵抗對B.t.Kurstaki品系敏感的害蟲以及對B.t.tenebrionis品系敏感的害蟲。一般來說，這些雜合子在殺蟲力水平或殺蟲力的范圍或上述兩方面具有有用的殺蟲特性優(yōu)于物理混合母代品系所觀察到的結(jié)果。把含這些微生物的殺蟲混合物以雜合子的有效殺蟲量施于昆蟲或它們的生存環(huán)境中就可以抵抗昆蟲。另一B.t.菌的衍生物發(fā)表于歐洲專利申請發(fā)行編號為0325400A1，屬于Gilroy和Wilcox。這項發(fā)明與對鱗翅目昆蟲有毒性的雜合毒性基因有關(guān)。特別地，此發(fā)明含有雜合的δ-內(nèi)毒素基因。它有一部分的B.t.var.KurstakiHD-73毒素基因和一部分的B.t.var.Kurstaki品系HD-1的毒素基因。此發(fā)明闡述了這種編碼有抗鱗翅目昆蟲活性蛋白的雜合毒素基因(DNA)。歐洲專利申請發(fā)行號0340948(屬于Wilcox等)，也應(yīng)用了B.t.菌的殺蟲特性。此發(fā)明涉及雜合殺蟲毒素，它們是為了制備具抗鱗翅目昆蟲活性的雜合B.t.毒素而把昆蟲腸表皮細胞識別B.t.基因區(qū)域與鱗翅目毒素B鏈融合而產(chǎn)生的。發(fā)明指出也許能用這種雜合B.t.基因插入植物中或克隆進棒狀病毒中來產(chǎn)生可回收的毒素?；蛘?，這種含雜合B.t.基因的宿主可作為殺蟲劑，直接施于靶昆蟲的生存環(huán)境中。在尋找殺蟲復(fù)合物的過程中，蝎子毒被認為是一種可能的具殺蟲特性復(fù)合物的來源。兩種昆蟲選擇性毒素已從蝎子Leiurusquingquestriatusquinquestriatus毒液中分離出來，由zlotkin等發(fā)表在ArchBiochemandBiophysics，240877-87(1985)，題目為《蝎毒中激活性和抑制性昆蟲毒素都影響鈉傳導(dǎo)并有共同的結(jié)合位點》。有關(guān)它們的化學和藥理性質(zhì)研究表明一種毒素誘導(dǎo)蠅幼蟲快速的激動收縮麻痹，另一種毒素誘導(dǎo)慢速抑制松弛麻痹。兩者都影響鈉傳導(dǎo)。加拿大專利2，005，658，由Zlotkin等1990年6月19日發(fā)表，闡明了一種來源于蝎子LeiurusquinquestriatushebraeusButhi-nas，Buthidae的有效殺蟲蛋白。這項發(fā)明中毒液被凍干并分部分離。對幼蟲有最高毒性且對鼠有最低毒性的那部分被進一步純化，最終產(chǎn)物稱為“LqhP35”。Grishin(ShemyakinInstituteofBioorganicChemistry，USSRAcademyofSeiences，Moscow117988，GSP-1，USSR)發(fā)表的《Buthuseupeus和Lucosasingoriensis毒液中的毒素成分》揭示了四種從蝎Buthuseupeus毒液中分離到的昆蟲毒素。文章還闡述了塔蘭圖拉毒蛛Lucosasingoriensis毒液中毒素成分的分離和鑒定。原毒液對昆蟲是無毒的。相應(yīng)于有關(guān)多種殺蟲性混合物的研究和發(fā)展，研究人員致力于建立產(chǎn)生殺蟲基因并把它們引入靶害蟲的方法。美國專利編號4，879，236，由Smith和Summers于1989年11月7日發(fā)表，涉及了這樣一種方法，把一個被選擇基因與一個棒狀病毒啟動子相連引入棒狀病毒的基因組中從而產(chǎn)生了一個重組棒狀病毒的表達載體。它能在昆蟲細胞內(nèi)表達出被選擇基因。這種方法包括切割棒狀病毒DNA產(chǎn)生一段DNA含有polyhedrin基因或有polyhedrin啟動子的部分polyhedrin基因。為了構(gòu)建一個重組轉(zhuǎn)移載體，把上述DNA片段插入一個克隆載體然后將被選擇基因插入這個修飾過的克隆載體中，這樣它就在polyhedrin啟動子的控制下，這個重組轉(zhuǎn)移載體然后與野生棒狀病毒DNA混合以產(chǎn)生同源重組并把被選擇基因整合入棒狀病毒的基因組。棒狀病毒Autographacalifornia(AcMN-PV)和與之相關(guān)的polyhedrin啟動子被發(fā)現(xiàn)對形成能在真核宿主細胞中極高表達被選擇基因的病毒表達載體是有用的。發(fā)明者們建議通過選擇產(chǎn)生對某一特定昆蟲或多種昆蟲有毒性的蛋白的基因并把它克隆于AcMNPV表達載體上，這種表達載體可以用于控制昆蟲的系統(tǒng)。他們建議這種載體可以施用于要保護的植物或動物上。這種重組病毒能在昆蟲攝入后入侵腸壁并開始復(fù)制。另一種建議是把基因插入棒狀病毒的基因組使它與polyhedrin結(jié)構(gòu)順序相融合，以致當昆蟲腸中堿性環(huán)境使多角體外殼解離后，有毒物質(zhì)就被釋放出來。更一步的構(gòu)建殺蟲基因并把它們引入需保護靶生物的方法已由Cutler闡述，發(fā)表在AGBiotechNewsvol.7(5)317(1990)，題目為《電穿孔用于轉(zhuǎn)化農(nóng)作物由模式作物證實的成功》。這篇文章指出DNA可以直接用電穿孔進入在萌發(fā)的花粉中，花粉可重新放回花中形成種子，然后長成轉(zhuǎn)化植株。這種方法已成功地應(yīng)用于煙草，可能在玉米和三葉草中也會成功。此方法可能比原生質(zhì)體電穿孔簡單，因為最終目的是授粉并“讓花去做這項工作”而不是再生植株。此程序包括收集花粉，讓它在萌發(fā)液中萌發(fā)30-60分鐘，之后花粉管將開始伸出花粉粒，在含花粉的懸液中加入需要的DNA，進行電擊，在花粉管上打孔，洗去多余的DNA，把變化了的花粉放在植物的柱頭上，等待到種子形成。這可能是一種把基因引入作物的簡單方法。另一種傳遞系統(tǒng)由Barnes和Edwards闡明，于1989年8月29日發(fā)表在美國專利編號4，861，595中。此發(fā)明涉及把處理過的、實體上完整的微生物細胞作為傳遞系統(tǒng)，將蛋白復(fù)合物送入動物和人體中。這種微生物細胞先通過一個同源基因產(chǎn)生蛋白到細胞內(nèi)。再用化學或物理方法處理這種產(chǎn)生蛋白的微生物同時保持細胞結(jié)構(gòu)完整。用這種方法程序操作產(chǎn)生的被處理的微生物體不能繁殖，但胞內(nèi)復(fù)合物的活性沒有明顯降低。因為這種細胞不能復(fù)制，它的穩(wěn)定的細胞壁可以在需要的動物或人類的消化系統(tǒng)區(qū)域里分解，所以此發(fā)明物可以定時定點地釋放被包含的產(chǎn)物。經(jīng)過合適的處理，這種產(chǎn)生蛋白的微生物細胞本身可以用作傳遞系統(tǒng)而不需純化產(chǎn)生的復(fù)合物。任何用微生物方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、多肽，氨基酸或復(fù)合物(包括殺蟲劑)都可以作為發(fā)明的起始材料。Carbonell等人探討了用DNA技術(shù)引入編碼蝎毒中神經(jīng)毒素的人工合成基因的可能性，文章發(fā)表在Gene73409-18(1988)上，題目為《編碼一昆蟲專一性蝎子神經(jīng)毒素基因的合成和用棒狀病毒載體表達它的嘗試》。這篇文章探討了如下可能性用DNA技術(shù)將編碼蝎Buthuseupens毒液中神經(jīng)毒素的合成基因?qū)氚魻畈《镜幕蚪M來提高棒狀病毒殺蟲性。此文章討論了三種用以polyhe-dron啟動子為基礎(chǔ)的AcMNPV表達系統(tǒng)來影響毒素產(chǎn)生的方法。單是表達36個密碼子的基因就可產(chǎn)生少量的毒素。把一信號肽連在毒素上也取得一些成功。把polyhedron基因的N端與毒素基因融合能產(chǎn)生顯著量的蛋白。然而檢測到的polyhedron本身的量是上述產(chǎn)物量的10到20倍。這種表達的限制被認為不是在轉(zhuǎn)錄水平而是在轉(zhuǎn)錄后水平包括翻譯和蛋白穩(wěn)定性。沒有發(fā)現(xiàn)這種毒素產(chǎn)物有麻痹作用。歐洲專利申請，發(fā)行號0431829闡明了如下轉(zhuǎn)基因植物，在它們的細胞內(nèi)，有效地表達一種捕昆蟲生物體中的昆蟲專一性毒素，其表達量足夠使吞噬植物組織的選擇性昆蟲中毒。被闡明的這種特別毒素是從蝎Androctonusaustralia毒液中分離的。研究者們也已能從蜘蛛毒液中抽提到毒素。Geren在J.Toxi-col.-ToxinReviews5(2)161-170(1986)發(fā)表了《蜘蛛毒液的神經(jīng)毒素和壞死毒素》，文章評論了有關(guān)神經(jīng)毒素和壞死毒素的工作，并指出蜘蛛毒液分子可以作為特異性殺蟲劑的模式。美國專利發(fā)行編號4，925，664是Jackson和Parks在1990年5月15發(fā)表的。闡明了用從蜘蛛Agelenopsisaperta和Hololenacur-ta得到的毒素治療心臟和神經(jīng)方面疾病的方法。這些毒素也能有效地作為特異的鈣通道或激動性氨基酸受體的阻礙物從而抵抗昆蟲或相關(guān)的害蟲。歐洲專利申請發(fā)行編號0395357，闡明了從蜘蛛Agelenopsisaperta毒液分離到的多胺和多肽，多胺與激動性氨基酸神經(jīng)傳遞物相頡。這些多肽和其中一種多胺阻礙許多生物體活細胞中的鈣通道。文中提到可用上述的鈣通道阻礙物來控制無脊椎害蟲。歐洲專利申請發(fā)行號0374940闡述了從蜘蛛Hololenacurta毒液中分離到的毒素。這些多肽能用作殺蟲劑，在藥學上也有用，例如，作為鈣通道和谷氨酸的頡物。Browers等在Proc.Natl.Acad.Sci.843506-3510(1987)發(fā)表了文章《鑒定和純化蜘蛛Hololenacurta毒液中一種不可逆的突觸前膜神經(jīng)毒素》，闡明了從蜘蛛Hololenacurta毒液中分離到的一種蛋白性神經(jīng)毒素，它能抑制果蠅幼蟲的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。作者指出這種毒素阻礙果蠅運動神經(jīng)元的突觸前膜的鈣通道。Quistad等人在Toxicon29(3)329-336(1991)發(fā)表了文章《Funnel-web蜘蛛Hololenacurta中的麻痹性和殺蟲性毒素》，描述了從Hololenacurta毒液純化的一種多肽和十種毒素及其注射入鱗翅目幼蟲后的影響。Stapleton等人在J.Biol.Chem.265(4)2054-2059(1990)發(fā)表文章《毒素從funnel-web蜘蛛Hololenacurta毒液中分離到的神經(jīng)毒殺蟲多肽》，闡明了從蜘蛛Hololenacurta毒液分離到的三種多肽神經(jīng)毒素及其對蟋蟀Achetadomestica的影響。Quick和Usherwood在Pestic.Sci.20315-317(1987)上發(fā)表文章《ExtoncleolSummariesPesticidesGroupandPhysicochem-icalandBiophysicalPanelSymposiumNovelApproachesinAgrochemicalResearch》闡明了寄生蛾和一些orb-web蜘蛛毒液中存在的毒素，當注射入昆蟲體內(nèi)后能引起快速麻痹。作者指出蜘蛛毒素是控制離子選擇性膜通道的受體的阻礙物，這些通道與蝗蟲骨胳肌中由谷氨酸受體控制的開放通道相互作用。文章不僅提及在Ar-giope和Araneus蜘蛛毒液中的低分子量毒素也提到從Joro蜘蛛Nephilaclavata毒腺中分離到的一種毒素。另一項與分離的蜘蛛毒液毒素性質(zhì)有關(guān)的研究表明從funnel-web蜘蛛毒液中分離到的低分子量因子能可逆地與鈣通道結(jié)合。cherksey等1989年8月24日發(fā)表了WO89/07608，闡明了這些活性低分子量因子能與鈣通道可逆性結(jié)合，此結(jié)合有足夠的特異性和親和力使神經(jīng)元的鈣傳導(dǎo)消失，并可用來純化鈣通道結(jié)構(gòu)。這些毒液對哺乳動物有毒害。Jackson和Parks討論了蜘蛛毒素的其它應(yīng)用，文章發(fā)表在AnnuRevNeurosci12405-14(1989)，題為《蜘蛛毒素在神經(jīng)生物學上的新近應(yīng)用》。這篇文章講到不同taxa的毒素有很大的異源性。它指出實驗表明鈣通道有種特異性，蜘蛛毒液可作為鈣通道的頡物。被討論的蜘蛛毒液對脊椎動物有影響。此文章也把蜘蛛毒液當作農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面昆蟲特異性毒素的可能來源。Adams等發(fā)表文章《funnelweb蜘蛛AgelenopsisAperta毒液中突觸毒素的分離及其生物活性》(《InsectNeurochemistryandNeurophysiology1986》BorkovecandGelmaneds.，HumanaPress，NewJersy，1986)。文章講述了從蜘蛛Agelenopsisaperta分離到多種對昆蟲突觸傳導(dǎo)有頡作用的多肽毒素。美國專利編號4，855，405由Yoshioka等1989年8月8日發(fā)表，闡明了從Joro蜘蛛毒腺得到受體抑制物及其操作方法。由液體或固體運載的這種復(fù)合物被昆蟲接觸后即發(fā)生殺蟲效力。美國專利編號4，918，107在1990年4月17日由Nakajima等人發(fā)表，它與如下有關(guān)一種具有谷氨酸受體抑制活性的復(fù)合物。制備這種復(fù)合物的程序以及含有這種復(fù)合物的一種殺蟲混合物。這種復(fù)合物用液體或固體載體裝載并加入分散劑，直接施于要保護的植物或動物。很低的用量即可有效殺蟲，它對哺乳動物和魚類毒性很低，對環(huán)境的不良影響也極小。用棒狀病毒作為生物殺蟲劑也已被探討。野生棒狀病毒作為生物殺蟲劑的主要缺陷在于它們作用慢。吞噬野生棒狀病毒的幼蟲一般在5到7天之內(nèi)死亡。被侵染的幼蟲在其間很長一段時間繼續(xù)進食，破壞大量農(nóng)作物。由于與某些合成殺蟲劑相關(guān)的多種問題，包括毒性、環(huán)境危害、由抗性而引起的效力減低，所以持繼地需要發(fā)展新的無脊椎動物控制方法，包括建立遺傳工程重組棒狀病毒產(chǎn)生比棒狀病毒侵染本身更快地致殘宿主的蛋白毒素。這項發(fā)明提供了一種新的有效殺蟲多肽，(它是基本純化的可從Diguetia蜘蛛毒液分離到)和農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的多肽的鹽。此殺蟲多肽被認為對無脊椎動物特別是昆蟲有很高的特異性。而且，已證明此殺蟲多肽對農(nóng)業(yè)上重要害蟲有極有效的殺蟲力因而被認為是對無脊椎害蟲控制領(lǐng)域極重要的貢獻。此外，本發(fā)明提供了一種新的DNA順序，它編碼了一種Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽。本發(fā)明還提供了一種新的重組表達載體，它包含了一段編碼Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽的DNA順序，并且該載體能夠在轉(zhuǎn)化細胞中有效地表達所述編碼順序。本發(fā)明還提供了一種新的重組宿主細胞，用編碼Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽的DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染得到的重組子細胞能表達此多肽。本發(fā)明還提供了一種新的重組桿狀病毒表達載體，它能夠在寄主或寄主昆蟲細胞中表達編碼Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽的DNA順序。本發(fā)明還提供了一種的方法來生產(chǎn)Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽，以及生產(chǎn)的多肽。此方法包含以下幾步培養(yǎng)重組宿主細胞，此重組細胞中轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了一種DNA順序編碼Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽，所述載體能在轉(zhuǎn)化細胞中有效地表達上述順序;以及從培養(yǎng)的重組宿主細胞中分離上述殺蟲多肽。本發(fā)明還提供了一種新的轉(zhuǎn)基因植物，在該植物的種系中或者在該植物的先代中導(dǎo)入了一段DNA順序編碼Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽，通過有性或無性繁殖得到的該轉(zhuǎn)基因植物的后代仍保留有表達此種DNA順序的性狀。本發(fā)明還提供了一種新的方法來控制無脊椎害蟲，用有效劑量的Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽及其在農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的鹽來接觸所述害蟲。本發(fā)明還提供了一種新的方法來控制無脊椎害蟲，即用一種重組的桿狀病毒接觸害蟲，該病毒能表達Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽及其在農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的鹽。本發(fā)明還提供了一種新的殺蟲劑組成，即在一種農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的媒介體中帶有的有效殺蟲劑量的Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽及其在農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的鹽。本發(fā)明還提供了一種新的抗體能與Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽及其農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的鹽發(fā)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種新的方法用上述抗體在檢測Diguetia蜘蛛毒液中殺蟲多肽的存在獲得蜘蛛毒液;將毒液與帶有檢測標記的抗體接觸;檢測所述多肽上的抗體標記。本發(fā)明還提供了一種新方法，用上述抗體來純化Diguetia蜘蛛毒液的殺蟲多肽。此方法包含下述步驟將抗體與固體支持物偶聯(lián);將含有所述多肽的溶液與固體支持物上的抗體接觸，使所述多肽吸附到抗體上;將所述多肽從偶聯(lián)在固體支持物的抗體上洗脫下來;收集純化的多肽。本發(fā)明還提供了一種新的來源于編碼Diguetia蜘蛛毒液中殺蟲多肽的核酸順序的DNA探針。本發(fā)明還提供了一種新的方法來檢測編碼Diguetia蜘蛛毒液中殺蟲多肽的核酸順序的存在，包含下述幾步獲得蜘蛛的核酸;將此核酸與上述DNA探針接觸能與DNA結(jié)合的探針。圖1是Diguetiacanities毒液的RPHPLC圖譜，使用0.1%TFA對乙?；鶃喯跛崽荻?，表明在毒液中檢測到的三組成份，第二部分代表TBW活性組分。圖2顯示了在大鼠海馬切片中，檢測DK9.2在1μm濃度下在Schaffer側(cè)-CA1金字塔細胞突觸上的突觸傳遞(誘發(fā)群體峰)。圖中數(shù)據(jù)代表了平均時間的群體峰記錄(a)是DK9.2加入前5分鐘(b)是DK9.2加入后的15-20分鐘間隙。這些記錄是相同的，這表明在這一濃度下，本測試檢測不到DK9.2在大鼠CNS中的活性。圖3是pWR9圖譜，一種桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體帶有編碼DK9.2前體的基因。圖4是對新生的煙草budworm的連續(xù)病毒喂養(yǎng)實驗結(jié)果(1000，000PIB/gm喂食量)。圖5表明了TTX的阻止或逆轉(zhuǎn)DK9.2誘導(dǎo)爆發(fā)的能力。A.定義.文中所述的“Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽”包括具有殺蟲效力的多肽，以及該多肽具有殺蟲效力的片斷，不管來源如何，而只要它能從Diguetia中以任何已知技術(shù)分離得到。例如，來源可以是重組產(chǎn)生的殺蟲多肽。本文中所述的“表達載體”包括能表達所包含的DNA順序的載體，這樣的順序可以操作連接到其它順序上以利其表達。盡管沒有一直明確指出，它也隱含著這些表達載體能夠在寄主生物中以染色體外或整合在染色體上的DNA的形式進行復(fù)制。很明顯，缺失復(fù)制能力將使得它們無法操作?？偨Y(jié)起來，“表達載體”是一個功能上的定義，任何DNA序列，只要它能有效地表達所帶上的特定DNA片斷都包含在這一定義中。一般說來，在重組DNA技術(shù)中常用的載體是“質(zhì)?！保粗腑h(huán)狀雙鏈DNA并且不在染色體上。因為質(zhì)粒是最常用的載體，所以“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用。盡管如此，本發(fā)明也應(yīng)包括其它逐漸被知的、具有同等功能的表達載體?！爸亟M宿主細胞”是指用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化所得的細胞”Diguetia科的蜘蛛現(xiàn)在只包括一個屬Diguetia。Diguetia的種主要發(fā)現(xiàn)于美國西南部(包括加利福尼亞)和墨西哥。這些小蜘蛛的很多植物和灌木，包括仙人掌上織出擴展的不規(guī)則的網(wǎng)。各種Diguetia蜘蛛的種，象大多數(shù)蜘蛛一樣，主要是捕食者，很容易食用它們捕獵到的大多數(shù)種類的昆蟲。雖然本發(fā)明并不想被限制在任何理論推理上，但在給昆蟲注射殺蟲多肽后觀察到的不尋常的癥狀學非常類似于veratridine，一種堿性Na+通道促進劑，或者是從Buthidae科和Buthus屬中分離到的蝎子毒素-已知的突觸前Na+通道促進劑注入昆蟲體內(nèi)。一般認為上述多肽可能引進肌肉或神經(jīng)膜的部分去極化，可能影響了Na+或K+通道。更專一地講，上述殺蟲多肽誘導(dǎo)了對tetradotoxin阻礙敏感的神經(jīng)重復(fù)釋放脈沖。這樣，很可能神經(jīng)膜的對電壓敏感的Na+通道就是這些肽的作用位點。B.從Diguetia毒液中分離多肽可以用任何已知方法從Diguetia蜘蛛頭胸腺體中抽提毒液。但是，為避免毒液及抽提毒液的污染，最好用電刺激蜘蛛排出毒液，然后抽吸收集毒液，防止因回流或血淋巴造成的污染。(參見U.S.4，925，664)用電“擠奶”方法取得毒液后，通過高壓液相層析(HPLC)，或凝膠過濾層析，或任何其它有效的分離手段將其分離成不同的肽組份(毒素)。當然，最后一步分離用HPLC是最理想的。這樣，用電擠奶技術(shù)，以及后面的凝膠過濾、HPLC，或其它有關(guān)的分離手段，例如疏水相關(guān)層板，就可能獲得純化的蜘蛛毒素。當然，在本發(fā)明中使用其它技術(shù)分離毒素也是可以的。這樣分離得到的毒素即可用常規(guī)技術(shù)作氨基酸順序分析或測定殺蟲活力。C.殺蟲多肽本發(fā)明從其一個方面講，就是提供了一種殺蟲多肽，及其有殺蟲活力的片斷，并實質(zhì)上從Diguetia蜘蛛毒液中分離到，制成農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的鹽。按前述方法分離并純化的殺蟲多肽，可以用任何已知方法作氨基酸順序分析，例如N-端氨基酸順序分析自動氨基酸順序分析儀。正象本文所闡述的，本發(fā)明的范圍也包含其它可能的殺蟲多肽，也就是說，包含除了本文所詳述的三種外其它從Diguetia分離到的殺蟲多肽。下面介紹從Diguetia中分離到的殺蟲多肽的一些特性1)大小大小范圍在6200到7200道爾頓之間，長度為55-65個氨基酸。2)保守的氨基端SEQIDNOS1，前5個氨基酸的3到5個是一樣的。3)SEQIDNOS1，3，5有40%以上的順序同源性。4)SEQIDNOS1，3，5有大約7或8個半胱氨酸殘基。5)基因簇一個以上的毒素基因在基因組DNA上成簇存在，這表明這些基因有可能來源于一個共祖先。更專一地講，現(xiàn)已鑒定并分離了三種殺蟲多肽。第一個，DK9.2已經(jīng)被分離，根據(jù)cNDA翻譯得到的氨基酸順序表明就是SEQIDNO1。質(zhì)譜的數(shù)據(jù)表明兩種同功酶在26位上有一個保守的替代，一個同功酶26位是蘇氨酸另一個26位是谷氨酰胺。谷氨酰胺同功酶比蘇氨酸同功酶大約27個原子量單位。因DK9.2可以指兩個同功酶或其中的任一個。DK9.2分子量用質(zhì)譜測定為約6371-6391dalton，在相反相HPLC上為單一的峰。第二個，DK11分子量為6700dalton，或用質(zhì)譜測定的6740dalton，在相反相HPLC為單一的峰。更確切說，這一HPLC組分根據(jù)cDNA翻譯得到的氨基酸順序如SEQIDNO3所示。最后一個被分離的，OK12，分子量大小為7100dalton，或為根據(jù)質(zhì)譜所確定的7080dalton，在相反相HPLC上為單一的峰。并且，這一組分的氨基酸順序可能就是SEQIDNO5。相對應(yīng)于SEQIDNOS1，3和5的三種肽殺蟲活性幾乎相近。可能其它肽有55到65個氨基酸，與SEQIDNO1，3和5有大于40%的順序同源性，并有大約7到8個半胱氨酸殘基，并表現(xiàn)出相同的殺蟲活力。這種肽可能天然存在或通過重組DNA技術(shù)來合成。不管是天然或重組合成的肽，都包含在本發(fā)明范疇中。D.本發(fā)明中的殺蟲多肽編碼順序的確定。本發(fā)明的另一方面，提供了編碼Diguetia蜘蛛毒液中殺蟲多肽的DNA順序。使用前述的部分氨基酸順序數(shù)據(jù)，即可分離并確定這些基因。有許多方法來獲得基因，例如Fuqua，S.等的“一個簡單的PCR方法檢測并克隆低豐度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物”，Biotechnique，Vol.9，No.2(Aug1990);Frohman，M.A.的“競賽cDNA末端的快速擴增”，PCRprotocds，Innis等編，AcademicPress，SamDiego，CA，(1990)和美國專利No.4，703，008“編碼Erythroprotein的DNA順序”。簡單地說，可以合成一段決定氨基酸順序的DNA鏈或其互補鏈。這種合成的DNA分子可以用作探針來從基因組或從cDNA克隆與其有同源性的DNA。一般說來，十五個或更多的核苷酸可以唯一地確定一同源DNA，也就是說在至少包含五個氨基酸順序。編碼確定的氨基酸分子的DNA越多越好，因為每個氨基酸都有多至六種密碼子。因此，單獨地使用每個DNA探針是不合適的，而是幾種探針同時使用，也就是該領(lǐng)域中常用的簡并探針。雖然在探針混合物中只有一個DNA分子與所欲得到的基因有準確的同源性，但其它的探針也可能唯一地識別該基因，因為只需要較高程度的同源性。所以不需要合成所有的可能的探針便可以克隆到基因。一般來說，在探針庫中無需包含生物中不常用密碼子。事實上，可以只合成一種探針，該探針中對每個氨基酸都使用最常用氨基酸，當然，這種方法不是總能成功。確定基因順序的一種方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。參見美國專利4，683，195和4，683，202。實質(zhì)上，只要已知一段DNA的兩端順序，便可以用PCR方法來合成這一DNA。相對于兩端順序的引物或寡聚核苷酸探針合成以后，便可用PCR來合成中間的DNA。在一個用PCR來獲得蜘蛛毒素基因的方法中，先從蜘蛛中抽提RNA并進行純化。用一個脫氧胸苷酸尾的寡聚核苷酸作引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后制備前面所述的編碼毒液蛋白氨基端順序的簡并探針。將此種探針與前述脫氧胸苷酸尾的寡聚核苷酸一起進行PCR反應(yīng)。因為合成的DNA探針對所需的mRNA有專一性，所以只有所需的cDNA可以有效地擴增，其產(chǎn)物可以連接到一些已知的載體上。盡管如此，應(yīng)該意識到在蜘蛛毒液中可能存在具有類似氨基酸順序的一族肽，在這種情況下，可能會使一種或更多種編碼相應(yīng)肽的cDNA在PCR反應(yīng)中擴增。因為相關(guān)的肽也有殺蟲活性，所以編碼這些肽的基因也在本發(fā)明的范疇中。最后，可以用傳統(tǒng)方法將合成的cDNA順序克隆到合適的載體上，確定堿基的順序，編碼殺蟲多肽的順序，如同在SEQIDNO2和4中給出的。將PCR產(chǎn)物翻譯成蛋白質(zhì)表明它們代表了成熟蛋白的全順序。除了DK9.2成熟蛋白編碼區(qū)的cDNA，其上游的cDNA也已經(jīng)克隆并測序。(SEQIDNO7)。將完整的mRNA進行翻譯表明，DK9.2的前體包括一信號肽，一前體肽和成熟毒素肽。信號肽的作用被認為是引導(dǎo)肽的分泌，信號順序?qū)π律牡亩ㄎ黄痍P(guān)鍵作用。一般地，它們提供了拓撲信號(Blobel，G.Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.77，1496-1500(1980)，從而將所引導(dǎo)蛋白定位于細胞內(nèi)或細胞外。這對于靶位點為細胞外的分泌蛋白尤其重要。這對于重組蛋白的生產(chǎn)也很有幫助，因為可以從細胞外的培養(yǎng)基中很容易就純化表達蛋白，而不需要破細胞從總的細胞抽提液中純化。DK9.2前體蛋白的信號肽由17個氨基酸組成Met-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-Leu-Cys-Leu-Ser-Leu-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala除了信號肽，DK9.2上游的mRNA還有一前體肽。它的功能還不清楚，有21個氨基酸-Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Iys-Asp-Ala-Asp-Ile-Met-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-Arg-這些前體肽或前體肽前的順序可能對DK9.2的穩(wěn)定性，表達和折疊很有用。這些順序或其中一部分對于其它分子的表達例如一個構(gòu)造的基因可能也很重要。作為本發(fā)明的一部分，我們也將提供數(shù)據(jù)來證明其它的信號肽和前體肽也可以用于重組DK9.2的表達中。E.重組表達本發(fā)明還提供了一個重組表達載體，它包含了一段DNA順序編碼Diguetia蜘蛛毒液中的殺蟲多肽。載體可以使編碼順序在轉(zhuǎn)化細胞中表達。本發(fā)明也提供了用殺蟲DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后得到的重組宿主細胞，使宿主細胞可以表達此多肽。有了編碼所需蛋白的適當?shù)腄NA，便可以用現(xiàn)代的重組技術(shù)來生產(chǎn)該蛋白。編碼順序可以通過cDNA或基因組DNA獲得，也可以根據(jù)基因的核苷酸順序來合成獲得。如果用合成方法制備DNA，可以利用宿主的密碼子偏好性。表達系統(tǒng)必須包含調(diào)控順序，例如啟動子，最好有增強子和末端調(diào)控，這些在該領(lǐng)域中是較常規(guī)的。參見Sambrook等的Molecu-larCloningaLaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress(1989)。如此，可以在真核或原核系統(tǒng)中制備所需蛋白，在很多情況下，會產(chǎn)生不同階段的形式。最常用的原核系統(tǒng)依然是E.Coli，雖然其它的系統(tǒng)，例如B.Subtilis和Pseudomonas也很有用。原核系統(tǒng)中合適的調(diào)控順序包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子，例如lac啟動子，trp啟動子，雜合啟動子tac，入噬菌體PI啟動子。一般地，外源蛋白可以在宿主中以融合蛋白或成熟蛋白形成產(chǎn)生。當以成熟蛋白形式表達所需順序時，順序常有一個甲硫氨酸，并且不能有效地去除。同樣，本文中所述蛋白或肽若用細菌來生產(chǎn)在N端也有一個Met。而且還應(yīng)在編碼序列前構(gòu)造一個可以操作的信號肽以利其分泌，分泌時信號肽即被切除?，F(xiàn)在，已有許多種真核宿主可用來表達重組外源蛋白。正如細菌宿主，真核宿主也可以被轉(zhuǎn)化表達所需蛋白，但常常需要有信號肽以利其分泌。真核表達系統(tǒng)還有一個優(yōu)點就是可以剪切內(nèi)含子，這是高等生物的基因組的編碼順序中常有的。真核系統(tǒng)也提供了其它的處理機制，例如糖基化，氧化或衍生出某些氨基酸殘基，構(gòu)象控制等等。常用的真核系統(tǒng)包括酵母，昆蟲細胞，哺乳類細胞，鳥類細胞和高等植物細胞。這還沒有列全。每個宿主類型都有適當?shù)膯幼?，以及中止順序和增強子，例如桿狀病毒多角體啟動子。同上，啟動子也分為組成和誘導(dǎo)型。例如在哺乳類系統(tǒng)中，MITT啟動子可以通過加重金屬離子來誘導(dǎo)。構(gòu)建表達系統(tǒng)的細節(jié)是該領(lǐng)域中常規(guī)的。要重組表達一個蛋白，先將編碼DNA連接到所選的表達系統(tǒng)上，該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到適當?shù)乃拗鞑⒃谝欢l件下進行培養(yǎng)，使外源基因得以表達，然后從培養(yǎng)物中回收本文中所述的殺蟲蛋白，可以通過裂解細胞或其它適當方法。對于蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基作一些小修飾，可能會導(dǎo)致活性增強。這些修飾可以是定向的，例如通過定點突變，也可能是偶然的例如通過普通的誘變。改變蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的突變(普通或特指的蛋白)是由于編碼它的核苷酸順序發(fā)生了改變。這些突變特異地包括等位突變。一級結(jié)構(gòu)的改變可以是缺失、增加或替換?！叭笔А笔侵付嚯牡囊粋€或多個氨基酸殘基的缺失，“增加”是指多肽鏈中比野生型多了一個或多個殘基?！疤鎿Q”是指一個或多個氨基酸殘基被其它殘基所替換。蛋白片段是指一個多肽其肽順序與相關(guān)多肽的一部分相同。有用“替換”是指那些保守的，也說是說一個殘基被另一個同一大類的殘基替換。眾知，自然界的氨基酸可以分為酸性、堿性、中性極性或者中性非極性，以及芳香氨基酸。一般希望替換的密碼子與原密碼編碼同一類氨基酸。這樣，一般地，堿性氨基酸Lys、Arg和His可以相互替換;酸性氨基酸Asp和Glu可以相互替換;中性極性氨基酸Ser，Thr，Cys，Gln，Asn可以相互替換;非極性脂肪族氨基酸Gly，Ala，Val，Ile和Keu相互之間是保守的(但因為大小不同，Gly和Ala更近一些，而Val，Ile和Leu更近一些。);芳香氨基酸Phe，Trp和Tyr可相互替換。雖然Pro是一個非極性氨基酸，但它有些麻煩，因為它對構(gòu)象的作用，替換成Pro或Pro被替換一般都不可行，除非造成相似的構(gòu)象變化。極性氨基酸，包括Ser，Thr，Gln，Asn會產(chǎn)生保守的變化，Met也在較低程度上這樣。而且，雖然Ala、Gly和Ser屬于不同大類，也似乎可以相互替換，Cys也屬于這一類，或者可以劃入中性極性氨基酸。有一些不同類的氨基酸替換也可能是很有用的。因為本發(fā)明中的蛋白的重組材料可以提供，這些蛋白可以用重組技術(shù)或用自動氨基酸合成儀來獲得。因為不同宿主會有不同的翻譯后修飾，可以獲得天然蛋白的不同修飾型。由于翻譯后修飾，包括糖基化，酰胺化或脂化，或者是蛋白質(zhì)一級、二級或三級結(jié)構(gòu)的變化，會使修飾后的蛋白與未修飾蛋白不同，這也包含于本發(fā)明范疇中。還應(yīng)該注意到，這里所講的蛋白質(zhì)，例如SEQIDNO1用人工合成，可替換一些非編碼的氨基酸。特異的殘基包括，例如ω氨基酸，公式為H2N(CH2)nCOOH，n為2-6。它們是中性非極性氨基酸，例如肌氨酸(Sar)，t-丁基丙氨酸(t-BuAla)，t-丁基甘氨酸(t-BuGly)，N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)和正亮氨酸(Nleu)。例如，苯甘氨酸可替代Trp，Tyr或Phe。瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亞砜(Mso)是中性極性的，環(huán)己基丙氨酸(Cha)是中性非極性的，磺基丙氨酸(Cya)是酸性的，鳥氨酸(Orn)是堿性的。Pro的構(gòu)象可以替換羥脯氨酸(Hyp)來實現(xiàn)。F.轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明進一步提供的是轉(zhuǎn)基因植物，把編碼可大量從Diguetia蜘蛛毒液中分離到的有效殺蟲多肽的DNA順序引入植物種素，DNA順序的表達性狀通過有性生殖或無性生殖而被后代遺傳。根據(jù)本發(fā)明，編碼有效殺蟲多肽的基因可以通過遺傳工程方法引入植物，當植物細胞產(chǎn)生多肽時可作為控制昆蟲害蟲的有效手段。因此，有可能產(chǎn)生比自然界的變種有更強抵抗昆蟲能力的植株。用來轉(zhuǎn)化植物的殺蟲多肽的編碼區(qū)可以是基因的全長或有活性的部分。然而，編碼多肽的這段遺傳順序所表達并產(chǎn)生的必須是在產(chǎn)生的植物細胞內(nèi)有功能的多肽。據(jù)認為從基因組和cDNA來的DNA以及編碼殺蟲多肽的合成DNA都可用來轉(zhuǎn)化。而且，構(gòu)建基因可部分用cDNA克隆，部分用基因組克隆，部分用合成基因以及它們的各種組合。另外，編碼多肽基因的DNA可含有不同種的部分而不僅能來源于分離的多肽。另外，據(jù)認為此殺蟲多肽可與另外的一種或多種復(fù)合物結(jié)合，在表達這些復(fù)合物嵌合基因的轉(zhuǎn)化植株中產(chǎn)生意想不到的殺蟲特性。這些其它復(fù)合物可以包括例如對昆蟲有口服毒性的蛋白酶抑制劑或從Bacillusthuringiensis來的多肽。B.thuringiensis蛋白引起昆蟲腸細胞膜鉀離子透性的改變，并推測能在膜上產(chǎn)生小孔。其它能形成小孔的蛋白也可與殺蟲多肽同時使用。例如magainin、ce-cropin、attacin、meiittin、gramicidins、鈉通道蛋白和合成片段、Staphylococcusaureus的α-毒素，apolipoprotein及其片段，alame-thicin和多種合成的兩性多肽。凝集素與細胞膜結(jié)合增強內(nèi)吞作用，是另一類能與此發(fā)明的殺蟲多肽共同使用的蛋白，可使遺傳上改變植物的抗蟲性。多肽基因的啟動子可用作表達嵌合基因順序，然而，其它啟動子也是有用的?？赡苡杏玫挠行е参飭幼邮沁^量表達的啟動子。在可操作系中與多肽遺傳順序相連的啟動子必須能啟動此肽的表達以使轉(zhuǎn)化的植物增強對害蟲的抗性。已經(jīng)知道了可對本發(fā)明有用的過量表達的植物啟動子。含人工連接在啟動子上的殺蟲多肽基因的嵌合遺傳順序可以與合適的克隆載體相連并轉(zhuǎn)化所需植物。一般用質(zhì)?；虿《?噬菌體)載體，含有從與宿主細胞相容的種來的復(fù)制和調(diào)控順序?？寺≥d體一般含復(fù)制起始點以及特殊基因，在轉(zhuǎn)化的宿主細胞內(nèi)能作為表形選擇標記一般是抗生素抗性。轉(zhuǎn)化宿主細胞后，可通過表型標記選擇轉(zhuǎn)化載體。有用的宿主細胞可以是原核生物，包括細菌宿主象E.coli，Salmonellaryphimurium和serratiamarcescens，或是真核宿主如酵母或線狀真菌。克隆載體及其轉(zhuǎn)休的宿主細胞一般用來增加載體的拷貝數(shù)。由于拷貝數(shù)增加，含此多肽基因的載體可以被分離，并且，舉個例子，可把這里敘述的遺傳順序引入植物或其它宿主細胞。已經(jīng)有方法產(chǎn)生表達外源基因的植物。例如，可以用A.tumefaciens直接感染或與植株、植物組織或細胞共培養(yǎng)來轉(zhuǎn)化植物組織;用外源基因直接轉(zhuǎn)移入原生質(zhì)體;用PEG融合;微注射和微彈轟擊。用電穿孔法(見AgBiotechnologyNews，Vol.7P.3and17(Sepet/oct1990))轉(zhuǎn)化煙草已被證實。此方法中，在有含殺蟲多肽基因結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒環(huán)境下電穿孔植物原生質(zhì)體。高電場強度的電脈沖可逆地使生物膜滲透引起質(zhì)粒進入。電穿孔過的植物原生質(zhì)體再生出細胞壁。分裂，形成愈傷組織。篩選表達殺蟲多肽的轉(zhuǎn)化植物細胞可以用上述的表型標記來完成。外源DNA可以任何形式加入原生質(zhì)體，例如裸露的線狀、環(huán)狀或超螺旋DNA，包在脂質(zhì)體中的DNA，與鹽復(fù)合的DNA以及如此等等。所用可用Agrobacferium轉(zhuǎn)化的植物細胞及從此轉(zhuǎn)化細胞再生的整個植株也可以根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化以獲得含轉(zhuǎn)移的殺蟲多肽基因的整個轉(zhuǎn)化植株。D.M.Raineri等人證實了可轉(zhuǎn)化水稻，文章發(fā)表在Biotechnologyvol.8，pp33-38(Jan1990)上，題為《水稻(oryzasatival.)的膿桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化》。另一種把有效殺蟲多肽基因引入植物的方法是用被殺蟲多肽基因轉(zhuǎn)化的A.tumefaciens感染植物細胞。在合適的常規(guī)條件下，被轉(zhuǎn)化的植物細胞生長形成莖葉、根并進一步長成轉(zhuǎn)化植株。殺蟲多肽基因順序可以導(dǎo)入合適的植物細胞中，例如通過A.tumefaciens的Ti質(zhì)粒。通過A.tumefaciens感染，Ti質(zhì)粒被傳入植物細胞并整合進植物基因組。Ti質(zhì)粒有兩段區(qū)域?qū)Ξa(chǎn)生轉(zhuǎn)化細胞非常重要。其中一個叫轉(zhuǎn)移DNA(TDNA)，引起腫瘤形成。另一個，叫作毒區(qū)域，對形成腫瘤而不是保持腫瘤十分重要。要轉(zhuǎn)入植物基因組的TDNA區(qū)域可以通過插入酶的基因順序來增加它的長度而不影響它的轉(zhuǎn)移能力。去除腫瘤誘導(dǎo)基因使它們不再影響則此被修飾的Ti質(zhì)?？勺鳛檗D(zhuǎn)移本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的載體而引入合適的植物細胞中。遺傳物質(zhì)也可用聚乙二醇(PEG)轉(zhuǎn)移進植物細胞，PEG與遺傳物質(zhì)形成沉淀復(fù)合物被細胞吸收。轉(zhuǎn)移DNA進入植物也可以通過注射原生質(zhì)體培養(yǎng)細胞和組織，注射苗與植株的分生組織來完成。可通過常規(guī)方法獲得轉(zhuǎn)基因植株及其后代。另一種把外源DNA順序引入植物細胞的方法包括把DNA附著在顆粒上，用射擊設(shè)備稱為“基因槍”把它打入植物細胞。任何植物組織或器官都可作為此程序的靶子。包括(但不限于)胚、頂端或其它分生組織、芽、體內(nèi)或體外的體細胞和生殖細胞組織。轉(zhuǎn)基因細胞和愈傷組織根據(jù)規(guī)定的程序進行選擇。根據(jù)常規(guī)程序誘導(dǎo)靶組織，形成體胚或再生苗形成轉(zhuǎn)基因植株?？筛鶕?jù)使用的植物種選擇合適的程序。用高壓微彈將DNA轉(zhuǎn)入胚性細胞已經(jīng)得到轉(zhuǎn)基因玉米。文章報道見Biotechnology，Vol.8，pp833-838(Sept1990)，題為《轉(zhuǎn)基因玉米植物子代的遺傳性及嵌合基因的表達》。再生植株對于整合的外源DNA是嵌合的。如果含外源DNA的細胞發(fā)育成小或大孢子，整合的DNA將被傳入有性后代。如果含外源DNA的細胞是植物體細胞，可以通過無性生殖的常規(guī)方法得到非嵌合轉(zhuǎn)基因植株，可在體內(nèi)通過芽或莖的切割或體外通過常規(guī)的方法?？筛鶕?jù)使用的植物種選擇某些程序。轉(zhuǎn)化植物細胞或植物后，那些表達出多肽轉(zhuǎn)化植物細胞或植物可通過合適的表型標記來選擇。這些標記包括但不限于抗生素抗性。其它表型標記都很常規(guī)也可用于此發(fā)明。因為有多種不同的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，原則上所有植物類型都可被轉(zhuǎn)化因而表達出本發(fā)明的殺蟲多肽。越來越多的證據(jù)表明，實際上所有的植物都可從培養(yǎng)細胞或組織再生，包括(但不限于)所有主要谷物作品種，甘蔗、甜菜、棉花、水果及其它樹木、豆類和蔬菜?，F(xiàn)在，知識局限于是否所有植物都可用Agrobacterium轉(zhuǎn)化。Agrobacterium的天然植物宿主物種可在體外轉(zhuǎn)化。單子葉植物，尤其是谷物和草，不是Agrobacterium的天然宿主。嘗試用Agrobacterium轉(zhuǎn)化到現(xiàn)在為止還未成功。正有增多的證據(jù)表明某些單子葉植物可被Agrobacterium轉(zhuǎn)化。應(yīng)用現(xiàn)在成為可能的新實驗方法，谷物是能被轉(zhuǎn)化的。其它可被Agrobacterium轉(zhuǎn)化的植物屬包括Ipomoea，Passi-flora，Cyclamen，Malus，Prunus，Rosa，Rubus，Populus，San-talion，Allium，Lilium，Nacissus，Ananas，Arachis，Phaseolus和Pisum。種與種間植物的再生是不同的，但一般來說先是提供含多拷貝殺蟲多肽基因的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體懸浮液。可如自然胚一樣誘導(dǎo)原生質(zhì)體懸浮液細胞到成熟和萌發(fā)階段而形成胚。培養(yǎng)液一般含各種氨基酸和激素。一般同時形成莖葉和根。成功的再生依賴于培養(yǎng)液、基因型和培養(yǎng)的歷史。如果這三個變量是可控制的，則再生是完全可重復(fù)的。從轉(zhuǎn)化的植物細胞形成的成熟植株可以自交產(chǎn)生自交植物。這種自交植物產(chǎn)生的種子含有殺蟲多肽基因。這些種子可長成表達殺蟲多肽的植物。自殺植物能夠，例如，形成耐蟲的雜合植物。即耐蟲的自交植物與另一自交系產(chǎn)生雜交植物。對雙倍體植物，通常一個母本用殺蟲多肽(毒素)轉(zhuǎn)化，另一母本為野生型。雜交后，子一代(F1)產(chǎn)生1/2毒素/野生型1/2毒素/野生型的分離。子一代雜合子(F1)自交產(chǎn)生子二代(F2)。F2的基因分離是1/4toxin/toxin1/2toxinwildtype1/4wildtype/wildtype。F2代中的基因組成為toxin/toxin被選作昆蟲耐受植物。如這里所采用的，在變種仍能表達本發(fā)明的殺蟲多肽的前提下，變種指穩(wěn)定和可遺傳的表型變化，包括有性生殖傳給后代的可遺傳變異。另外如這里所采用的，突變指因環(huán)境條件如輻射而引起的變異，或是一種性狀根據(jù)遺傳規(guī)律經(jīng)減數(shù)分裂傳遞的遺傳變異。不管怎樣，此突變植株必須仍表達本發(fā)明的多肽。一般來說，選來在轉(zhuǎn)化植株中表達的理想殺蟲蛋白必須對非靶昆蟲和脊椎動物是安全的。要選擇使表達水平有足夠殺蟲效力的表達系統(tǒng)，因此，獲得這樣的轉(zhuǎn)基因的重要農(nóng)業(yè)作物的技術(shù)可行性，將在整個控制害蟲系統(tǒng)中給農(nóng)民增添新的武器，從而減少害蟲對作物的危害同時不影響環(huán)境。G.多肽作為殺蟲劑的應(yīng)用據(jù)認為本發(fā)明的殺蟲多肽能以多肽的有效量接觸昆蟲而用于控制無脊椎害蟲如鱗翅目。方便起見，昆蟲是偏指的害蟲。用多肽接觸無脊椎害蟲來控制所說的害蟲，其方法已可知，例子有人工包埋蛋白讓害蟲口服。表達本發(fā)明蛋白的重組宿主，如Pseudomonasflubrescens可以被加熱殺死，然后讓害蟲口服來進行控制。當然，用本發(fā)明蛋白控制無脊椎害蟲的方法也可與其它控制昆蟲的方法一起使用。例如，根據(jù)要控制的昆蟲類型及其它存在的變量來操作轉(zhuǎn)基因植物和上面提到的E.coli，以表達其它無脊椎毒素。本發(fā)明因而還提供了含本發(fā)明多肽的殺蟲混合物多肽含量有殺蟲效力或以及它的鹽，是用農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的載體裝載的，在農(nóng)業(yè)上或園藝上可接受。H.有效殺蟲多肽的抗體本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的有效殺蟲多肽的抗體。在下面的敘述中，將參考各種常規(guī)可掌握的免疫學方法，來檢測和純化能與這里所說的抗體反應(yīng)的多肽。如果抗體能特異與一分子反應(yīng)因而此分子結(jié)合在抗體上，就說此抗體能與此分子結(jié)合。決定其“epitope”指多肽抗原中能被抗體識別并結(jié)合的那部分。一個抗原可以有一個或多個決定基?？乖烧T導(dǎo)動物產(chǎn)生能與此抗原的一個決定基結(jié)合的抗體。以上所述的特異應(yīng)是指抗原將以高度的選擇性與相應(yīng)的抗體進行免疫反應(yīng)，而不與多種可能由其它抗原引起的其它抗體反應(yīng)。這里的“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(Mab)不僅包括完整的分子也包括它的能與抗原結(jié)合的片段(舉例來說，如Fab和F(ba')2片段)。Fab和F(ab')2片段缺少完整抗體的Fc片段，能較快地從循環(huán)中消除掉，與昆蟲抗體的非特異組織結(jié)合較少。本發(fā)明的抗體可通過多種方法的任一種制備。制備這種抗體的方法知道得很清楚，在文獻中有詳細描述。可見例如Sambrook等的《MolecularClonigalaboratorymanul》Seconded.coldSpringHarborPress，Vol，3ch18(1989)。例如把表達殺蟲多肽或其片段的細胞引入動物，誘導(dǎo)產(chǎn)生含能與多肽結(jié)合的多克隆抗體的血漿。一般用制備和純化使其不含天然雜質(zhì)來得到殺蟲多肽片段或者用常規(guī)方法合成殺蟲多肽片段。為了產(chǎn)生更高活性的多克隆抗血清，可以將純化的片段或合成的片段或純化的天然片段和/或合成片段的混合物引入動物。單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)來制備。一般地，這一程序包括用殺蟲多肽抗原免疫動物，抽提免疫動物的脾細胞并與適當?shù)墓撬枇黾毎诤稀Ｈ魏芜m當?shù)墓撬枇黾毎刀伎捎糜诒景l(fā)明中。融合后，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上保持雜交瘤細胞，并通過限制稀釋克隆。最后通過檢測分泌抗體能否與殺蟲肽抗原結(jié)合來確定所需克隆。如果肽源不純，只有部分雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體能與肽結(jié)合(其它的雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體能與肽雜質(zhì)結(jié)合)。這樣，就有必要從雜交瘤細胞中篩選所需克隆。篩選的過程中，將毒液樣品與雜交瘤細胞分泌的抗體保溫后，觀察殺蟲活力是否被中和或減弱。一旦確定了所需克隆株，便可用適當方法將其擴增以生產(chǎn)肽專一的單克隆抗體。為了純化天然或重組的殺蟲毒素，有必要使用殺蟲肽專一性抗體。一般地，這種抗體是單克隆抗體。在獲得了肽專一性單克隆抗體后，可將其偶聯(lián)到固體支持物上，然后用免疫親和層析的方法從天然毒液中分離肽。這種方法可以獲得高度純化的肽沒有天然的雜質(zhì)。在本文中，“無天然雜質(zhì)”是指沒有天然狀態(tài)下結(jié)合的雜質(zhì)化合物(也就是說，其它的蛋白質(zhì)，脂，碳水化合物等)。在純化了肽以后，可用來免疫動物(例如小鼠或兔子，以誘導(dǎo)產(chǎn)生肽專一性多克隆抗體。適當大小的DNA探針，一般為10到50個核苷酸，可以來源于Diguetia毒液中殺蟲多肽的編碼序列。這種探針可用來檢測編碼Diguetia毒液殺蟲多肽的DNA序列的存在，將探針與毒液接觸并檢測可與探針結(jié)合的DNA。I.從遺傳上經(jīng)改造的殺蟲微生物有效殺蟲多肽單獨使用或與別的昆蟲毒素配合使用可以從強度和程度上增強諸如棒狀病毒(baculoviuses)和重組細菌等微生物的毒性。包括那些感染HeliothisVirescens(棉螟蛉)，Orgyiapseudot-sugata(道格拉斯冷杉暗色蛾)，Lymantiadispar(舞毒蛾)，Auto-graphaCalifornica(苜蓿尺蠖)，Neodiprionsertifer(歐洲松木蠅)以及Lanspcyresiapomonella(青蘋蛾)在內(nèi)的幾種棒狀病毒已在一些國家鑒定并用作殺蟲劑了。把至少一種對昆蟲具選擇性的毒素基因引入其基因組中可顯著增強這類殺蟲的效力。一種非常適用于本發(fā)明的重組表達載體是如美國專利4，879，236中所描述的那種類型的棒狀病毒表達載體，該專利已詳細闡明了其特征。又見Carbonell等“編碼一種昆蟲專一性蝎子神經(jīng)毒素的基因之合成及通過棒狀病毒載體表達該基因的嘗試”，Gene，73409-418(1988)。這種載體預(yù)計在一表達系統(tǒng)中是有用的，該系統(tǒng)中將把自Diguetia蜘蛛毒液中可大量分離提取的一種有效殺蟲多肽的DNA編碼序列克隆到一種AutographaCalifornica棒狀病毒(AcMNPV)表達載體中，此棒狀病毒載體已在美國專利4，879，236和Miller等，Science，219，715-721，(1983)，中描述過。該重組表達載體病毒可應(yīng)用于被昆蟲所有害侵染的動物或植物。當病毒被有害昆蟲攝入時，重組病毒便侵入昆蟲的腸壁細胞開始復(fù)制，有效殺蟲多肽基因便會在復(fù)制過程中表達，從而在比昆蟲攝入野生型AcMNPV病毒后更短的時間內(nèi)導(dǎo)致昆蟲傷殘或死亡。一種同樣被預(yù)計有用的重組病毒闡明于歐洲專利申請0，340，948中。表達本發(fā)明的DNA的該種雜交病毒可以變成改變了昆蟲宿主范圍的病毒。如，由本發(fā)明中的DNA與一種專一性昆蟲腸細胞識別蛋白基因構(gòu)成的重組基因可表達一單鏈融合蛋白產(chǎn)物，此融合蛋白產(chǎn)物可在識別蛋白基因產(chǎn)物的指導(dǎo)下使有效殺蟲多肽到達宿主昆蟲靶位。按歐洲專利申請0，325，400中所述方法，多種原核和真核微生物可被一種重組毒素基因轉(zhuǎn)化并表達其編碼的有效殺蟲多肽。含載有本發(fā)明蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒的重組細菌預(yù)計適用于本發(fā)明中的方法。昆蟲將通過應(yīng)用此重組細菌于該昆蟲而受到控制。參見實例，美國專利4，797，279，該專利中已詳細闡明了其特征。運用適于本發(fā)明的棒狀病毒的其他實例見于Tomalski等，“由棒狀病毒介導(dǎo)一種螨神經(jīng)毒素基因的表達引起的昆蟲麻痹癥”，Na-ture，35282-85(1991)以及Steuart等，“一種改進的帶有昆蟲專一性毒素基因的棒狀病毒殺蟲劑的構(gòu)建，”Nature35285-88(1991);McCutchen等，“一種表達昆蟲選擇性神經(jīng)毒素的重組棒狀病毒之獲得害蟲防治的可能性”，Biotechnology，9848-851(1991).J.雜交DNA序列作為有關(guān)分子的探針適當大于的DNA探針可以從本發(fā)明的DNA序列推測出。這類探針可用來與其他來源的核酸雜交以檢測其中是否存在有編碼本發(fā)明中之有效殺蟲多肽的DNA。用其信號序列或其cDNA片段甚至其完整的cDNA作為寡核酸探針在非嚴謹條件下篩選，將可得到與本文所述的毒素分子族功能同源的其他活性多肽DNA?？膳c本發(fā)現(xiàn)DNA序列的寡核苷酸探針雜交的好的合適核酸來源應(yīng)包括，但不限于，同屬不同種的蜘蛛，相關(guān)屬的蜘蛛，以及同一屬但不同產(chǎn)地的蜘蛛。K.一啟動子序列的鑒定本發(fā)明另一方面提供了在蜘蛛中調(diào)控DK9.2合成的啟動子序列。用成熟毒素cDNA作探針篩選染色體DNA庫以分析DK9.2基因的結(jié)構(gòu)。對染色體DNA轉(zhuǎn)錄錄起點上游的分析，表明存在一個推測的啟動子。此啟動子區(qū)的421bp的一般DNA序列示于SEQIDNO8。這個推測的啟動子包含通常存在于緊接轉(zhuǎn)錄起始位點的上游區(qū)域內(nèi)的許多必需調(diào)控信號。(啟動子調(diào)控信號的綜述見Meknight等，1982。真核蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄控制信號。Science217316)。一個典型的TATA框位于推測的轉(zhuǎn)錄啟始位點以外-30處，并且看來該框?qū)φ{(diào)控RNA合成的啟動是重要的。在更上游處有兩個相距較遠的回文順序，其中一個包含據(jù)認為對RNA多聚酶的結(jié)合重要的同感CAAT框。據(jù)推測，這個啟動子或啟動子區(qū)域?qū)υ谥参铩游锘蚣毦胁煌虻霓D(zhuǎn)錄和表達有使用價值，例如在一個重組構(gòu)造的基因中。實施例以下實施例用以闡明本發(fā)明范圍內(nèi)具體的產(chǎn)物和方法，但它們并不限定本發(fā)明的應(yīng)用范圍。材料和方法蜘蛛由Spiderpharm，IncofBlackCanyoncity，AZ，并由該公司進行種的鑒定。Diguetiacanities蜘蛛毒液是用電法擠出的，同時采用保護措施確保其中無唾液和血細胞的污染。毒素純化-將原始毒液(貯存于-80℃)融化，在層析前將其徹底混勻并溶于0.1%的三氟乙酸(TFA)中。原始毒液使用BeckmanSystemGold126溶劑和168光電二極管束檢測器以逆向液相層析(RPLC)法分部。乙酸基亞硝酸或異丙醇加入TFA作為陽離子偶聯(lián)劑。純化中使用下列含同樣基質(zhì)的柱子Dynamax300ARPC18柱(25cm×4.6mmi.d.，顆粒大小12μm)，Vydac300AC18分析柱(25cm×4.6mmi.d.，顆粒大小5μm)，以及Vydac300AC18半制備性柱(25cm×10mmi.d.，顆粒大小5μm)。在220nm光波處監(jiān)測尋找峰值，并用GILSON208微量部分收集器進行分部收集。所有收集部都經(jīng)冰凍干燥后，貯于-80℃?？焖僭愚Z擊質(zhì)譜分析(FAB-MS)-在標準FAB條件下，在Univ.ofILLinois的VG儀器ZAB-SE質(zhì)譜儀上測量質(zhì)譜(氙氣，分辨力1000，加速電壓8KV，內(nèi)部溫度40℃)。樣品(約1ug)溶于4ml含25%水溶TFA(1%)的硫代甘油中分析。實施例1將用前述方法自Diguetiacanities中獲得的25μl冷凍干燥原始毒液溶于0.1%三氟乙酸(TFA)中，在半制備性VydacRPC18柱上用逆向液相層析法分級，以每分鐘3.5ml的流速洗脫，使用線性梯度洗脫液，其成分為水溶0.1%TFA和50%亞硝酸溶解的0.1%TFA，開始洗脫時二者的比例為85∶15，在180分鐘以后50∶50的比例結(jié)束洗脫。收集部滯留時間(大約分鐘數(shù))13.2429.6648.2857.1962.81066.41168.71271.41377.116126.117131.4每一收集部均經(jīng)冰凍干燥陸續(xù)除去洗脫劑和水，樣品貯存于-80℃，殺蟲鑒定時每個收集部樣品都溶于25μl生理緩沖鹽液中。一些收集部的殺蟲活力通過對tobaccobudworm(HeliothisVirescens)“TBW”的作用的試驗得到證實(表Ⅰ)TBW幼蟲用裝了33gauge針頭和PB600連續(xù)加樣的50μlHamilton針筒注射3μl測試溶液，每個收集部用五只幼蟲作試驗。注射方法是，把針頭插入到腹部側(cè)中線處(靠近任一前腿處)，以小角度注射以免破壞內(nèi)臟。注射后每只昆蟲都放入一含有人工合成食物的容器中。定時觀察;注射后24小時開始測量麻痹癥狀。在計算劑量時用0.3gm作為TBW的平均體重。一組對照幼蟲只注射生理緩沖鹽液。麻痹癥狀逐漸發(fā)展，而此之前有一明顯的肌肉痙攣階段。嚴重情況下，痙攣在注射后的15-30分鐘之間產(chǎn)生，并逐漸增強直至幼蟲完全失去活動力，有時顫抖持續(xù)48小時以上。這種現(xiàn)象有時也可發(fā)生于只注射了亞致死劑量而幼蟲最終復(fù)活的情況。顫抖的嚴重程度是毒性最可靠的指標。若被作用至完全麻痹和/或身體收縮，幼蟲便不能復(fù)活。表ⅠDiguetiacanities原始毒液RPLC收集部對TBW的毒性(7.5WVE/每克昆蟲)＊麻痹百分數(shù)麻痹百分數(shù)收集部初時24hr10040060081001009100100101001001110010012100100130016001700對照00麻痹被定義為昆蟲在被側(cè)轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)不能恢復(fù)自身常態(tài)的癥狀。＊＊WVE，原始毒液等價量是指正常存在于1μl擠出的原始毒液的任何毒素的量;自25μl分離液得到5WVE相當于回收樣品的20%。實施例2Diguetiacanities收集部9的純化TBW活性收集部9的主要成分通過再次層析化得到單一組分(每分組分在SDS-DAGE電泳中均為一可見帶，分子量約在6，500Dalton)，層析在VydacRPC18(25cm×10mmi.d)柱上進行，以3.5ml/min的速度在異丙醇/0.1%三氟乙醇的線性溶劑梯度(1.0%/min)下洗脫，在220nm波長下監(jiān)測。峰的探測和分部收集如例1中所示收集兩個部分。第一個在21.81分鐘洗脫出(收集部9.1)，第二個峰在22.39分鐘洗脫出(收集部9.2)。收集部9.1和9.2分別通過冰凍干燥先后除去洗脫劑和水，濃縮留下樣品9.1和9.2。冷凍干燥后收集部產(chǎn)物的純度估計至少達99%。從25μl原始毒液中估計可得到大約含6μg純蛋白的樣品9.2。把樣品9.2注射入如例1所示的tobaccobadworm以試驗其殺蟲活力，方法是五只實驗昆蟲中每只都注射溶于緩沖鹽液的6.3μg樣品9.2，另用五只幼蟲只注射緩沖鹽液作為對照組。24小時及48小時后檢驗昆蟲。在24小時時所有的那些處理昆蟲都被麻痹并隨之死去而對照昆蟲卻顯示正常。48小時時無任何變化。通過快原子轟擊質(zhì)譜分析該多肽表明其分子量為6371±2。對樣品9.2的N-末端氨基酸順序分析得其部分氨基酸順序?qū)嶋H上與SEQIDNo1氨基酸1-33所示的一致。在H.Virescens(TBW)中Diguetia毒素9.2的半死劑量LD50大約為1.0nmol/gm.其產(chǎn)生癥狀與實施例1中使用原始毒液所產(chǎn)生的相似。實施例3DiguetiaCanities收集部11的純化用類似例2中所述方式，例1中DiguetiaCanities原始毒液中分離到的收集部11，再經(jīng)逆向液相層析純化得到一個組分。該組分經(jīng)冰凍干燥先后除去洗脫劑和水而得到一種的遺留物稱為樣品11。該樣品通過例2所述的方法用5.0WVE/g的劑量檢測其對tobac-cobudworm活力。24小時后，經(jīng)樣品處理的昆蟲80%呈現(xiàn)麻痹癥狀，48小時后60%呈現(xiàn)麻痹癥狀。對照組昆蟲則表現(xiàn)正常。經(jīng)快原子轟擊質(zhì)譜分析顯示該多肽分子量為6740±2，用末端氨基酸順序分析法測得樣品11的部分氨基酸順序，見SEQIDNO3氨基酸1-29。實施例4DiguetiaCanities收集部12的純化用類似例2中的方式，例1中DiguetiaCanities原始毒液中分離到的收集部12經(jīng)逆向液相層析純化，得到一個組分。該組分經(jīng)冷凍干燥先后除去洗脫劑和水得到濃縮的樣品，稱樣品12。該樣品通過例2所述的方法檢測其對tobaccobudworm的殺蟲活力。24小時后經(jīng)樣品12處理的昆蟲100%呈現(xiàn)麻痹癥狀，48小時后80%呈現(xiàn)麻痹狀態(tài)。對照組昆蟲則表現(xiàn)正常。經(jīng)快原子轟擊質(zhì)譜分析該多肽測得其分子量為7080±2。N-末端氨基酸分析表明其部分氨基酸順序，見SEQIDNO5。有限的材料供應(yīng)不允許精確標定毒性;因此樣品9.2在比樣品11、12分別高39%和67%的劑量(nmol/mg)水平上檢測毒性。選擇的劑量是為了覆蓋最小致死劑量到無效應(yīng)劑量水平，但并非每次都達到目的。盡管如此，結(jié)果表明這些多肽具有非常相似的毒性。樣品9.2可能比另二個樣品具有稍強的毒性，但差異可能小于3倍。這些多肽(樣品9.2，11，12)的最小100%致死劑量在3.0到5.0nmol/gm之間，這與商業(yè)性殺蟲劑相比更具優(yōu)越性;如teflubenzuron，其半致死劑量(SAW)為1.0nmol/gm。實施例5分離自DiguetiaCanities毒液中分離到的樣品9.2，11的編碼基因。第一步RNA的分離自野外收集DiguetiaCanities蜘蛛?；钪┲朐谝旱卤鶅霾⑷〕鲱^胸。按Chomczynski和Sacchi，AnalyticalBiochemisfry，162，156(1987)的方法自頭胸中抽提RNA。多聚腺苷酸化信使RAN(mRNA)經(jīng)寡d(T)纖維素層析(PharmaciaLKB，Sweden)而純化。第二步cDNA的合成信使RNA在鼠白細胞病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(BethesdaResearchLab-oratories，MD)的作用下，按生產(chǎn)商提供的操作程度逆轉(zhuǎn)錄合成cD-NA。在20μl的反應(yīng)混合物中含有由cDNA合成工具盒(BorbringerMamnbeim，1N)提供的酶緩沖液，50μgmRNA，2單位RNaseH，30ngd(T)NotI引物(promega，Madison，WI)，四種脫氧核苷三磷酸各1mM，以及100μg逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)混合物在37℃溫育1小時，然后在42℃繼續(xù)溫育10分鐘。再加乙醇沉淀，最后溶于20μl水中。第三步引物的合成一簡并的引物DNA順序混合物使用Drosophila傾向使用的密碼子設(shè)計一段按SEQIDNO1可編碼第1到第8個氨基酸的簡并引物DNA順序混合物。該引物由猶他大學HowardHughesMedicalInstitute合同設(shè)備合成。第四步擴增使用熱穩(wěn)定DNA多聚酶進行由引物指導(dǎo)的DNA擴增，此方法最先由Saikki等發(fā)表于Science，239，487(1988)。在實際應(yīng)用中，我們在含有GeneAmpTmDNA擴增工具盒(PerkinElmerCetus，CA)提供的多聚酶鏈式反應(yīng)物中加入5μlDiguetia頭胸cDNA作為模板。擴增反應(yīng)體系中含有意義及反義引物各2μM，四種脫氧核苷三磷酸各100μM及4單位熱穩(wěn)定重組TaqI多聚酶。反應(yīng)在PerkinElmerCetus公司生產(chǎn)的DNA熱循環(huán)儀上進行。從具有相似N-末端氨基酸順序的相關(guān)毒素基因家族中通過使用嚴緊退火溫度(58℃)選擇性擴增編碼樣品9.2之基因。在這樣的條件下擴增產(chǎn)生了單一的一段DNA，瓊脂糖凝膠電泳表明其大小為275bp.在較不嚴緊的條件下，則瓊酯糖凝膠電泳檢測出五個以上的擴增產(chǎn)物，其大小自200bp到360bp不等。這些在較不嚴緊條件下得到的不同PCR產(chǎn)物可能編碼一些氨基酸順序上，分子量大小上及殺蟲活力上與樣品9.2相近的多肽。這些相關(guān)的多肽中預(yù)計有樣品11和12，因為其N-末端氨基酸順序如SEQIDNO81，3和5所示彼此間及其與樣品9.2非常相似。第五步PCR產(chǎn)物的克隆由高度嚴緊條件及較不嚴緊條件得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過Centri-con-100(Amicon)分子大小分離系統(tǒng)除去未參入的引物而得到純化。所得產(chǎn)物再用限制性內(nèi)切酶NotI(MBR，Milwawkee，WI)酶解，該酶可在引物的下游(3'末端)切開產(chǎn)生一粘性末端。載體PKC(Sfratagene，LaJolla，CA)經(jīng)EcoRV(USBiochemical)和NotI雙酶切產(chǎn)生單向克隆位點。載體和插入片段連接后轉(zhuǎn)化compexDH5αF'。轉(zhuǎn)化子用32P標記的中間片段探針篩選，選出的克隆應(yīng)用中間片段探針作引物測量小量DNA順序(USBiochemical'sSequeraseVer-sion2.0)作進一步的鑒定。兩個克隆的cDNA插入片段的完整DNA順序如SEQIDNO2和4所示。僅前者是來自嚴緊PCR反應(yīng)所得的克隆，而兩種cD-NA插入片段在由較不嚴緊PCR反應(yīng)條件得到的克隆中均可發(fā)現(xiàn)。SEQIDNO2編碼的多肽氨基酸順序見SEQIDNO1，該多肽具有與樣品9.2一致的N-末端順序。該多肽的分子量據(jù)估計為6377.9Daltons，假定在天然形式下該多肽所有(半胱氨酸)都以分子內(nèi)二硫鍵(烷氨基)的形式存在，則分子量為6369.7D。因此，該多肽看來與樣品9.2為同一分子。后者經(jīng)質(zhì)譜分析確定其分子量為6371±2。由SEQIDNO4編碼的多肽氨基酸順序見SEQIDNO3。該多肽具有一與樣品11相同的N-末端順序。因此，此多肽看來與樣品11是同一多肽。實施例6對哺乳動物的毒性如前所述的方法自D.Canities獲得的5μl原始毒液，若分三次向小鼠腹膜內(nèi)注射(IP)，將致小鼠死亡。處理過的小鼠起初與只注射鹽液的對照小鼠無區(qū)別。但注射后10到15分鐘，處理小鼠就變得比較多動，表現(xiàn)出獨特的跳躍姿態(tài);接著出現(xiàn)短時間的動作不協(xié)調(diào)，呼吸困難及痙攣，自產(chǎn)生癥狀到死亡約2分鐘。分別以約4.2，0.9，1.2mg/kg的劑量向小鼠腹膜內(nèi)注射樣品9.2，11，12，24小時內(nèi)均無效應(yīng)產(chǎn)生。以每只小鼠約30μg的劑量(約1mg/kg)向小鼠(約28gm)腦內(nèi)室注射樣品9.2。直到注射后48小時均未發(fā)現(xiàn)任何效應(yīng)。另有一小鼠腹膜內(nèi)注射約125μg(4.2mg/kg)的樣品9.2，亦無效應(yīng)可見。為了鑒定本毒液對脊椎動物的毒性。原始毒液經(jīng)逆向液相層析后合并的收集部在小鼠中進行毒性試驗，收集部2含有對tobaccobudworm(TBW)有活力的成分。相當于25μl原始毒液的劑量向小鼠腹膜內(nèi)注射收集1和2無任何效應(yīng)。而收集部3則產(chǎn)生與注射原始毒液所觀察到的一樣，這些結(jié)果表明DiguetiaCanities毒液的成分中殺蟲有效成分和脊椎動物有害成分是明顯不同的。實施例7電生理數(shù)據(jù)DK9.2以1μM的濃度在大鼠海馬切片的Schaffercollateral-CA1錐狀細胞突觸上研究突觸轉(zhuǎn)導(dǎo)(激動群體鉤連)。示于圖2中數(shù)據(jù)代表以時間平均的群體鉤連記錄(a)DK9.2加入前5分鐘的記錄，(b)DK9.2加入后15-20分鐘期間的記錄。這些記錄可以是重疊的表明，在該濃度下，DK9.2對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)不具有此分析法可檢測到的活力。用此分析法可檢測到不同哺乳動物離子通道及神經(jīng)遞質(zhì)受體的多種多樣的效應(yīng)。(T.V.Dunwiddie，TheUseofInVitroBrainSlicesinNeuropharmacology，InEletophysiologicalTechniquesinPharmacology，editedbyH.M.Geller，AlanR.Liss，Inc.，NewYork，1986)。例如，阻止鈉通道失活的分子，如某些蝎毒素，可導(dǎo)致群體鉤連響應(yīng)最后相的明顯擴展。(KanedaM，MyamaY，IkemotoYandAkaikeN.，Scorpionfoxinprolongsanlnacfiva-tionphaseofthevoltage-dependentSodiumcurrentinratiso-lafedsinglehippocampalpleurons，BrainRes，487192-195，1989;AlanL.Mueller，NaturalprochuctsSciences，Inc.，Unpublishedobseruations)，相對而言，DK9.2在低100倍的濃度下對昆蟲試驗品(家蠅)有活性。它以一種推測是阻止昆蟲鈉通道失活的方式發(fā)揮作用。實施例8編碼DK9.2前體的cDNA上游順序為了得到編碼DK9.2的cDNA上游順序，合成了一段相應(yīng)于SEQIDNO2DNA順序的反義鏈上第159-178核苷酸殘基的中間片段寡核苷酸，在此引物的5'末端有一個EcoRI切點。10μl的單鏈毒液素cDNA用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(BethesdaResearchLaboratories)在其3'末端加上若干脫氧鳥核苷酸殘基。20μl的反應(yīng)液中含14單位的酶和500μMdGTP，在37℃溫育15分鐘。樣品經(jīng)乙醇沉淀后溶于20μl水中。通過一個與擴增下游/或熟毒素cDNA順序方法相似的錨定PCR技術(shù)，由特異引物引導(dǎo)擴增了基因上游DNA序列。擴增反應(yīng)液中含有有義引物(dcc結(jié)尾的引物)和無義引物各2μM，脫氧核苷三磷酸各100μM，以及4單位的熱穩(wěn)定重組Tag多聚酶。溫度變化如下94℃2分鐘，37℃2分鐘，37℃1分鐘，該循環(huán)重復(fù)兩次，在后面的循環(huán)中將第二步退火溫度提高到54℃。此循環(huán)共重復(fù)32次。在EB存在的4%瓊指糖凝膠電泳顯示，錨定PCR產(chǎn)生一條380bp的片段。該片段用E.coliDNA多聚酶Ⅰ大片段(Klenow片段)(MolecularBiologyResources，MadisonWI)，然后用乙醇沉淀，溶解沉淀后用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切。酶切片段在1mMATP存在下由T4蛋白酶磷酸化，然后連接到由EcoRI和EcoRV雙酶切的PBluescriptsKS載體上。亞克隆用測序酶(Sequenase)2.0(USB)分析雙鏈DNA順序。含有成熟多肽毒素基因上游區(qū)域的cDNA翻譯表明DK9.2是以前體蛋白質(zhì)形式合成的。上游cDNA順序見SEQIDNO6。編碼前體蛋白的基因上有一段信號序列和前多肽基因片段(SEQIDNO7)，除去這一區(qū)段就可產(chǎn)生自蜘蛛毒液分得的成熟多肽毒素。據(jù)推測信號序列及前多肽中序列對于蜘蛛產(chǎn)生和分泌DK9.2是必需的。實施例9重組棒狀病毒的構(gòu)建一段鱗翅目昆蟲的信號順序(Jonesetal.，MolecularCloningRegulationandCompleteSequenceofaHemocyanin-RelatedJuvenileHormore-SupressibleProteimFromInsectHemolymqhs，J.Biol.Chem，2658596(1990))，應(yīng)用Rossi，etal(J.Biol.Chem，2579226(1982))的方法由兩段合成的寡核苷酸構(gòu)建而成。經(jīng)由離子交換層析純化得到兩段48個核苷酸組成的單鏈片段，它們在3'末端有十一個可互補的堿基。當這兩個片段在有四種脫氧核苷三磷酸和DNA多聚酶IKlenow片段存在下退火時，可合成一個雙鏈產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng)羥基磷灰石層析純化，再用AatⅡ酶解，產(chǎn)生的片段可插入到克隆于PKS-DK9C的DK9.2cDNA的上游區(qū)。篩選得到插有信號序列的亞克隆并測其DNA順序。DNA測序證實有一個此二cDNA順序的融合產(chǎn)物不改變閱讀框。切下該完整的合成基因，經(jīng)適當改造后克隆到一種棒狀病毒轉(zhuǎn)移載體PBlueBac(Vialard，J.，etal.，J，Vinrology643-50(1990))的NheI切點中。對亞克隆順序的測定證明了重組基因的正確插入。對質(zhì)粒WR9的DNA順序的測定證實該合成“Caterspider”基因(preDK9.2)插入到了棒狀病毒轉(zhuǎn)移載體PBlueBac(圖3)中。PBlueBac載體的應(yīng)用加快了篩選進程，因為插入到棒狀病毒基因組中的重組基因可與β-半乳糖苷酶基因共表達，故在指示培養(yǎng)基上生長時可通過顏色是否變化來識別。應(yīng)用Summers和Smith建立的方法，編碼前9.2的重組棒狀病毒可用1μgAcMNPV病毒DNA和2μg質(zhì)粒DNA混合共轉(zhuǎn)染Spodopterafrugiperda菌株Sfq獲得。轉(zhuǎn)染4天后，將細胞上清的稀釋液涂布于接有5×106Sf9細胞的100mm平板上，上覆一層含Bluo-gal底物(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)的瓊脂糖凝膠。5到6天內(nèi)，重組子因其呈淺蘭色可被識別。重組噬菌斑用Pasteurpipet微量加樣器挑出，用1ml培養(yǎng)液洗脫，該洗脫液再感染生長于T-25燒瓶中的Sf9細胞，三天后從感染了六個不同噬菌斑的細菌培液中收集小體積上請用以制備病毒DNA。應(yīng)用病毒的外殼蛋白(Polyhedrin)基因周圍區(qū)域的特異性引物進行PCR擴增，證實這6個病毒噬菌斑中有5個含有合適大小的插入片段且無任何野生型污染。接著制備經(jīng)滴定成斑數(shù)的重組病毒貯存液用于體內(nèi)和體外試驗。實施例10重組DK9.2的生物學活性自含血清組織培養(yǎng)液中分離得到的重組樣品9.2(DK9.2)的生物學活性檢測是在齡蟲TBW幼蟲中進行的。劑量在被測溶液的A280吸收值基礎(chǔ)上計算。采用16μg/g的劑量，重組產(chǎn)物在注射后2小時內(nèi)可導(dǎo)致明確的肌肉痙攣，48小時后有一半幼蟲(6只中的3只)被麻痹并嚴重收縮，而其他3只幼蟲仍表現(xiàn)輕度到中度的肌肉痙攣。8μg/g的劑量也使只幼蟲中的3只麻痹，而5.2μg/g的劑量則只使兩只麻痹。結(jié)果證明重組DK9.2有生物活性。實施例11重組棒狀病毒的體內(nèi)測試A.DK9.2重組核型多角體病病毒(vAcDK9.20的生物學活性1)病毒制備物的滴定病毒貯存液用噬菌斑分析法滴定(Luriaetal.，“GeneralVirol-ogy”，1978，pp.21-32;John，WilleyandSons，NewYork)。滴度用每單位體積貯液可形成噬等斑的數(shù)目(pfu)表示，劑量則用pfu/幼蟲表示。若各病毒顆粒都可成功地感染一個不同的宿主細胞，一個pfa就相當于一個成熟病毒顆粒(Luriaetal.，ibid)。例如，103個宿主細胞可被1ml含量為106PFU/ml的病毒制備物感染(i.e.，130PFU/μl)。2)生物分析實驗DK9.2重組核型多角體病病毒(rNPV)，vAcDK9.2的生物學活力可經(jīng)一系列劑量反應(yīng)分析實驗檢測。該實驗中，TBW幼蟲(平均質(zhì)量約250mg)被注射含不同劑量vAcDK9.2的組織培養(yǎng)液或單純的組織培養(yǎng)液(n＝10，即10只)。如例1所示毒素注射實驗，處理過的幼蟲分別培養(yǎng)于放有食物的容器中，定時觀察。這兩個病毒感染分析實驗的綜合結(jié)果見表Ⅱ。采用5000pfu/幼蟲和更大的劑量，DK9.2毒性的典型癥狀(肌肉顫抖和痙攣)在注射后幼24小時開始出現(xiàn)。48小時內(nèi)至少一半試驗昆蟲失去了活動力(i.e.麻痹或半麻痹)。最低測試劑量50pfu/幼蟲在48小時內(nèi)誘導(dǎo)顫抖和痙攣，在96到120小時內(nèi)至少70%的幼蟲失去活動力。B.vAcDK9.2和野生型NPV的生物學活動力比較進一步研究比較了vAcDK9.2與其親本野生型病毒Auto-graphaCarforicaNPV(Wt-AcMNPV)的效力。這些分析實驗的目的是為了確定受vAcDK9.2感染的幼蟲與受等劑量Wt-AcM-NPV感染的幼蟲相比，是否在更短時間內(nèi)失去活動力。1)注射分析實驗vAcDK9.2和wt-AcMNPV的生物學活力在一系列注射實驗中進行比較。向末齡的tobacobudworm(Heliothisvirescens)幼蟲，CabbageLooper(Trichoplusiani)幼蟲以及beetarmyworm(Spodopteexigua)幼蟲注射5×10pfu/幼蟲的vAcDK9.2或wt-AcMNPV;對照幼蟲只注射組織培養(yǎng)液。結(jié)果表明，在所有三個物種上，vAcDK9.2確定比wt-AcMNPV具有更強的效力，結(jié)果總結(jié)于表Ⅲ。2)喂養(yǎng)分析實驗為了檢測vAcDK9.2經(jīng)攝食后的活力必需制備一種可口腔感染的多角素陰性(pol-)重組子。此目的可根據(jù)其他研究者發(fā)表的建成具口腔感染力的pol-重組NPV8的方法，經(jīng)vAcDK9.2和wt-AcMNPV的其潴留來達到。(如Kurodaetal.，1989，J.Virology63(4);1677-1685，和Priceetal.，1989.ProcNatlAcad，Sci861453-1456)。SF-9細胞同時被vAcDK9.2和wt-AcMNPV感染的多重感染系數(shù)(MOI)分別為10和2。同時，另一組SF-9細胞只被wt-AcMNPV(MOI＝2)感染。感染5天后，破碎細胞后差別離心，收集內(nèi)含體(e.g.，Wood，1980，Vivology104392-399)。內(nèi)含體在血細胞計數(shù)器上計數(shù)。那些共感染vAcDK9.2和wt-AcM-NPV的細胞比只感染wt-AcMNPV的細胞，產(chǎn)生的內(nèi)含體較少同時較小，由前者得到的多角內(nèi)含體(PIB)產(chǎn)量為4.6PIB/細胞，而后者內(nèi)含體產(chǎn)量為33.3PIB/細胞。為了比較wt-AcMNPV和vAcDK9.2的生物學活力，實驗中運用了一種食物摻入分析方法?；旌系幕蚍匆吧偷腜IB以105PIB/gm的濃度摻入到一種不含瓊脂的昆蟲食物中，該食物分配到小容器中，將所生的TBW幼蟲放入容器(每個容器一只，共20只)。對照幼蟲給予等量未經(jīng)處理的食物。允許幼蟲隨意進食，定時觀察其病狀的發(fā)展。結(jié)果見表Ⅱ。開始48小時內(nèi)無任何效應(yīng)，但72小時后50%以上喂以混合PIB的幼蟲被麻痹;野生型病毒此時未引起任何效應(yīng)。96小時后，90%以上喂以混合PIB幼蟲被麻痹，而喂以野生型PIB的幼蟲只有10%死亡或垂死。120小時后，前一組幼蟲100%死亡或垂死，而后一組幼蟲僅75%死亡或垂死。因此，正如注射分析實驗的結(jié)果，在喂養(yǎng)分析實驗中，vAcDK9.2處理的幼蟲比wt-AcMNPV處理幼蟲在顯著縮短的時間喪失活動力。表ⅡvAcDK9.2在TBW中的劑量響應(yīng)分析實驗%麻痹百分數(shù)</tables>表ⅢvAcDK9.2和wt-AcMNPV注射TBW.CL和BAW幼蟲效應(yīng)比較</tables>1.每只幼蟲注射病毒5×105pfu;對照組只注射等量體積的組織培養(yǎng)基2.n＝8;每只幼蟲的平均體重為300mg3.8只幼蟲中的2只因注射時產(chǎn)生的傷殘而死亡，因此不作進一步的分析4.第9天wt-AcMNPV處理的幼蟲死亡率為100%5.n＝10;每只幼蟲平均體重為165mg6.對cAcDK9.2，n＝20;對wt-AcMNPV，n＝10及對照;每只幼蟲平均體重為200mg實施例12DK9.2基因的啟動子為得到DK9.2基因的調(diào)節(jié)組分，構(gòu)建了一個染色體基因文庫。采用HerrmarnandFrischanf的方案(見MethodsinEnzymslogy，Vol，V52，AcaclemicPress，Ine1987，99，180-183)制備蜘蛛DNA，用Sau3A部分酶切，然后用TLS-55轉(zhuǎn)頭(BeckmanCo.，Ltd)在10%-38%蔗糖密度梯度系統(tǒng)中以25，000rpm轉(zhuǎn)速離心16小時，再分部收集。合并35-45Kb的DNA收集部，用部分填充法將DNA片段插入粉粒載體的一個XhoI位點中。連接產(chǎn)物中的1/4用GigakgoldTM(Stratagene，LaJolla，CA)包裝到噬菌體顆粒中，經(jīng)轉(zhuǎn)染得到相當于超過3×109bp的蜘蛛DNA。該基因庫鋪于25個150mm平板上，再印至尼龍濾膜上，用編碼DK9.2的放射性標記的cDNA、編碼其N末端的末端標記寡核苷酸、編碼其C末端的末端標記寡核苷酸放射性標記的中間片段等4種探針來篩選目的菌落。有一個編碼cDNA的粘粒與以上所有探針均雜交，其EcoRI酶切片段的DNA轉(zhuǎn)移雜交結(jié)果表明其中一個3.0kb的片段可與中間體片段以及C末端探針雜交。用前述的三個引物測定粘粒cDK2雙鏈序列證實分離到了DK9.2的基因，并提示了該毒素家族的另一個或一些基因位于同樣的鄰近DNA片段上的可能性，因為此基因N末端寡核苷酸(它和所有Dignetia殺蟲有效多肽有高度同源性)在粘粒DNA的多個位點插入。為獲得DK9.2基因的啟動子序列，先得到一段與有義鏈上前信號序列一致的合成寡核苷酸。在這個引物和另外的本發(fā)明基因特異性的引物之間的PCR擴增產(chǎn)物將信號序列定位于N末端外顯示上游大于3，000bp處。反義鏈上的引物用于測定緊接編碼信號肽的cDNA5'端上游區(qū)域的DNA順序。該信號序列到上游的DNA順序表明，起始甲硫氨酸密碼以外-11bp處有另一個內(nèi)含子。合成了與DK9.2前體的cDNA5'區(qū)域一致的一段寡核苷酸引物，用于引發(fā)一個PCR反應(yīng)以確定在轉(zhuǎn)錄起始位點與翻譯起始位點之間間隔序列的大小。一個1，000bp的擴增產(chǎn)物證實了該內(nèi)含子的存在并表明了其大小。轉(zhuǎn)錄起始位點上游DNA順序確證其中包含一個啟動子，該啟動子區(qū)的DNA序列見SEQListingNO8，它包含多個普遍存在于其他真核啟動子中的位于緊接轉(zhuǎn)錄起始位點上游區(qū)域的必需調(diào)控信號。該啟動子或其中部分片段可用于在細菌、病毒、植物或動物中轉(zhuǎn)錄或翻譯其他真核基因。例13關(guān)于DK9.2作用方式的神經(jīng)生理學研究神經(jīng)生理學研究是為了闡明DK9.2的作用方式、蛆神經(jīng)肌肉接合的周圍神經(jīng)的記錄表明DK9.2誘發(fā)易于被河豚毒素阻斷的神經(jīng)反復(fù)(陣發(fā))放電，因此，此毒素作用位點可能是電壓敏感的神經(jīng)膜鈉離子通道。進一步的研究表明DK9.2在達到10nM閥值濃度時可持續(xù)激動周圍神經(jīng)。另外，它的效力至少是蝎4號哺乳動物毒素的50倍。本研究中所用的實驗動物是家蠅第三期齡蟲。幼蟲用昆蟲釘固定住，用醫(yī)用外科解科刀切開腹部，展平幼蟲射體，并用釘固定，除去內(nèi)臟露出體壁肌肉組織。在周圍神經(jīng)與腦交接外將其切割出來，除去腦，然后浸入昆蟲鹽液中，成份是(mM)NaCl(140)，KCl(5)，CaCl2(0.75)，MgCl2(4)，NaHCO3(5)和HEPES(5)，pH7.2。一刺激接受電極附著于任一合適的神經(jīng)干上用以記錄神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。緩慢加大剌激閥值直至觀察到肌肉6或7的一根纖維收縮為止。然后在這根纖維中插入一個胞內(nèi)記錄微電極，該電極連接一個用于檢測應(yīng)答神經(jīng)剌激的激動后突觸電勢(EPSP)的胞內(nèi)予放大器。為記錄周圍神經(jīng)纖維上升的電活性，記錄電極附在一個交流予放大器上，信號被放大100倍，在0.3和1Hz下輸出，有記錄都在MacLab裝備計算機的儀器系統(tǒng)中數(shù)字化，并顯示、分析。有關(guān)DK9.2作用的最初實驗中使用了神經(jīng)肌肉連結(jié)制備物。若給予周圍神經(jīng)單次剌激則導(dǎo)致體壁肌肉出現(xiàn)一次單個EPSP。有DK9.2存在時，單個刺激導(dǎo)EPSP高效率的放電。除了刺激引發(fā)的放電以外，還出現(xiàn)自發(fā)陣發(fā)放電并延續(xù)數(shù)分鐘。一陣發(fā)過程常持續(xù)1秒以上，此時的EPSP頻率大于30Hz，陣發(fā)放電的出現(xiàn)引發(fā)體壁肌細胞強烈收縮，這使得保持胞內(nèi)記錄非常困難。因為陣發(fā)動電引起的收縮將電極排出肌肉。因此絕大多數(shù)實驗是在含高濃度蔗糖(300mM)的鹽溶液中進行的，蔗糖可抑制收縮而不影響電活性。用通常的或高濃度蔗糖的鹽液獲得的結(jié)果是類似的。DP9.2處理后觀察到的陣發(fā)放電與蝎α毒素存在時觀察到的現(xiàn)象類似，已知蝎毒素α作用于神經(jīng)細胞膜的電壓敏感離子通道。電此可見，陣發(fā)放電可以被專一性鈉離子通道阻抑劑河豚毒素(TTX)所阻抑。TTX阻止或逆轉(zhuǎn)DK9.2誘發(fā)的陣發(fā)放電能力示于圖5中。在圖5A中，EPSP被1μMTTX迅速阻抑，使得制備物對隨后的100nMDK9.2的處理不敏感。類似的實驗見于圖5B中，該實驗中先由DK9.2誘發(fā)陣發(fā)放電，然后被隨后加入的TTX逆轉(zhuǎn)。在該實驗中，陣發(fā)放電的產(chǎn)生使電極被逐出肌肉，使得當試圖重新進行記錄時引入一刺入假象記錄。一旦找到一合適記錄位點，則檢測陣發(fā)放電2分鐘左右，這時該制備物顯示在TTX處理后的數(shù)秒內(nèi)其活動停止。為了避免因肌肉收縮而導(dǎo)致細胞內(nèi)記錄的困難，上述實驗在蛆周圍神經(jīng)上進行細胞外記錄重復(fù)實驗。結(jié)果是，伴隨運動纖維的逆向活化，感受神經(jīng)活性有所上升。當DK9.2的濃度在70nM時可導(dǎo)致神經(jīng)放電的增強，而且不受隨后鹽液處理的影響，但0.4μMTTX可迅速抑制此反應(yīng)。另外，在DK9.2之前加入TTX可阻止陣發(fā)放電的出現(xiàn)。著手進一步研究的目的是為了確定昆蟲神經(jīng)對DK9.2的敏感性，并與標準蝎毒素比較其效力。DK9.2在外圍神經(jīng)制備物上測試其作用，開始用1nM，以后大約每5分鐘增加濃度直至觀察到其活力的上升。在該制備物中，1nM到5nMDK9.2是無作用的，但達10nM時，在一短暫的延遲時間后就能在該制備物上誘發(fā)活力。五個神經(jīng)制備物用以確定DK9.2在昆蟲神經(jīng)上的有效閥濃度，其結(jié)果總結(jié)于表五中。表Ⅳ濃度處理次數(shù)產(chǎn)生響應(yīng)昆蟲所占的比例%響應(yīng)1nM2002nM1005nM313310nM33100用相似的方法，在最后一組實驗中確定蝎子Leiurusquingues-triatus毒素4(LqT×4)對昆蟲神經(jīng)的敏感性。制備物(4個)在受到濃度達到500nM的LqT×4時無效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)與以前的研究結(jié)果相等，即發(fā)現(xiàn)LqT×4是特異作用哺乳動物鈉通道的。這些制備物在后繼的DK9.2處理時，DK9.2濃度需達到10-30nM才產(chǎn)生反應(yīng)。DK9.2的有效閾值濃度的略微上升可能是失活的CqT×4的弱抑制作用所致。這些實驗證明DK9.2對昆蟲神經(jīng)的作用比LqT×4至少強50倍。表Ⅴ</tables>序列單(1)一般情況(ⅰ)申請人KarenJ.Krapcho;BradfordCarrVanWagenen;J.R.HunterJackson(ⅱ)發(fā)明標題有效殺蟲多肽(ⅲ)序列數(shù)目8(ⅳ)通訊地址(A)ADDRESSEEWoodcock，Washburn，Kurtz，Mack-iewicz&amp;Norris(B)STREETOneLibertyPlace-46thFloor(C)CITYPhiladelphia(D)STATEPennsylvania(E)COUNTRYU.S.A.(F)ZIP19103(ⅴ)計算機形式(A)媒介型號DISKETTE，3.5INCH，1.44MbSTORAGE(B)計算機IBMPS/2(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件WORDPERFECT5.0(ⅵ)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)登記時間(C)分類(ⅶ)以前申請資料(A)申請?zhí)?62，373(B)登記時間March1，1991(ⅷ)律師/代理人情況(A)姓名JohnW.Caldwell，Esp.(B)登記號28，937(C)工作代號FMC-0054(ⅸ)通訊情況(A)電話(215)568-3100(B)傳真(215)568-3439(2)SEQIDNO1情況(ⅰ)序列特征(A)長度56個氨基酸(B)類別氨基酸(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO1AlaLysAspGlyAsPValGluGlyProAlaGlyCysLysLysTyr51015AspValGluCysAspSerGlyGluCysCysXaaLysGinTyrLeu202530TrpTyrLysTrpArgProLeuAspCysArgCysLeuLysSerGly354045PhePheSerSerLysCysValCysArgAspVal5555(2)SEQIDNO2情況(ⅰ)序列特征(A)長度275個堿基對(B)類別核酸(C)鏈型雙鏈(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO2GCCAAGGACGGCGACGTCGAGGGGCCTGCG30AlaLysAspGlyAspValGluGlyProAla1510GGCTGCAAGAAATACGACGTAGAGTGCGAC60GlyCysLysLysTyrAspValGluCysAsp1520AGTGGAGAGTGCTGCMMSAAGCAGTACCTG90SerGlyGluCysCysXaaLysGluTyrLeu2530TGGTACAAGTGGCGACCCCTGGATTGCCGA120TrpTyrLysTrpArgProLeuAspCysArg3540TGCCTAAAGAGCGGTTTCTTCAGCAGCAAG150CysLeuLysSerGlyPhePheSerSerLys4550TGCGTTTGCAGAGACGTGTAGATTTGAAATGAAATTCG188CysValCysArgAspVal55TGTTCTTTTTTGGTTGTAGATGACCTAATGAAACAACTGA228CATGAATAAAACAAAATTGAATGAATTGAAAAAAAAAAAA268AAAAAGC275(2)SEQIDNO3情況(ⅰ)序列特征(A)長度58個氨基酸(B)類別氨基酸(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO3AlaLysAspGlyAspValLysGlyProAlaGlyCysMetLysTyr51015LysSerGlyAspCysArgGlyLysThrCysCysAspGlnGlnTyr202530LeuTrpTyrLysTrpArgAsnLeuAlaCysArgCysPheThrVal354045GluValPheLysLysAspCysTrpCysAsnAspIleSer5055(2)SEQIDNO4情況(ⅰ)序列特征(A)長度204個堿基對(B)類別核酸(C)鏈型雙鏈(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO4(2)SEQIDNO5情況(ⅰ)序列特征(A)長度62個氨基酸(B)類別氨基酸(C)鏈型(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO5AlaLysAspGlyAspPheGluGlyProProGlyXaaLeuLysMet51015GlyGluLeuXaaLysGlyGlyThrXaaXaaThrLysValTyrLys202530TyrTrpLysTrpArgLysLeuGluCysLeuGlyLysAsnAspGly354045TrpPheLysLysLysPheIleCysAspGluArgXaaAsnProXaa505560XaaXaa(2)SEQIDNO6情況(ⅰ)序列特征(A)長度359個堿基對(B)類別核酸(C)鏈型雙鏈(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO6(2)SEQIDNO7情況(ⅰ)序列特征(A)長度38個氨基酸(B)類別氨基酸(C)鏈型(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO7MetLysValPheValValLeuLeuCysLeuSerLeuAlaAla-35-30-25ValTyrAlaLeuGluGluArgLeuAspLysAspAlaAspIle-20-15MetLeuAspSerProAlaAspMetGluArg-10-5-1(2)SEQIDNO8情況(ⅰ)序列特征(A)長度421個堿基對(B)類別核酸(C)鏈型雙鏈(D)空間構(gòu)型未知(ⅹⅰ)序列內(nèi)容SEQIDNO8權(quán)利要求1.一種自Diguetia蜘蛛毒液分大量分離的具有有效殺蟲活力的多肽或因此在農(nóng)業(yè)上或園藝上可接受的鹽。2.按權(quán)利要求1的多肽，其特征在于，該蜘蛛毒液分離自Diguetiacanities。3.按權(quán)利要求1的有效殺蟲多肽，其特征是，由質(zhì)譜分析確定的分子量約為6371-6397D，在逆向高效液相層析時作為單一峰運動，以及因此在農(nóng)業(yè)上或園藝上可接受的鹽類。4.按權(quán)利要求1的有效殺蟲多肽其特征是，具有一段實際上與SEQIDNO1相同的順序。5.按權(quán)利要求1的有效殺蟲多肽，其特征是，質(zhì)譜分析確定的分子量約為6740D;在逆向高效液相層析中以單一峰運動，以及因此在農(nóng)業(yè)上或園藝上可接受的鹽類。6.按權(quán)利要求1的有效殺蟲多肽，其特征是，具有一段實際上與SEQIDNO3相同的氨基酸順序。7.按權(quán)利要求1的有效殺蟲多肽，其特征是，質(zhì)譜分析確定的分子量約為7080D;在逆向高效液相層析中以單一峰運動，以及因此在農(nóng)業(yè)上或園藝上可接受的鹽類。8.按權(quán)利要求1的有效殺蟲多肽，其特征是，具有一段實際上與SEQIDNO3相同的氨基酸順序。9.一段具有應(yīng)用價值的分離的DNA順序，其特征是，一段DNA順序編碼一種可自Diguetia蜘蛛毒液中大量分離的有效殺蟲多肽。10.如權(quán)利要求9所述的DNA，其特征是，蜘蛛毒液是來自Diguetiacanities。11.如權(quán)利要求9所述具有應(yīng)用價值的DNA順序，其特征是，其順序已示于SEQIDNO6。12.如權(quán)利要求9所述具有應(yīng)用價值的DNA順序，其特征是，其順序已示于SEQIDNO4。13.如權(quán)利要求9所述具有應(yīng)用價值的DNA順序，其特征是，其DNA順序已示于SEQIDNO2。14.一重組的表達載體，其特征是，具一段可編碼一種自Diguetia蜘蛛毒液中大量分離的有效殺蟲多肽的DNA順序，其特征還在于此載體在轉(zhuǎn)化的細胞中能實現(xiàn)所說的編碼順序的表達。15.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，蜘蛛毒液來自于Diguetiacanities。16.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，DNA順序編碼一有效殺蟲多肽;該多肽的特征是，質(zhì)譜分析確定其分子量為6371-6397D，在逆向高效液相層析上以單一峰運動。17.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，所指DNA順序?qū)嶋H上編碼SEQIDNO1所表示的多肽。18.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，DNA順序編碼一有效殺多肽;該多肽的特征是質(zhì)譜分析確定其分子量為6740D，在逆向高效液相層析中以單一峰移動。19.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，所指DNA順序?qū)嵸|(zhì)上編碼SEQIDNO3所示的多肽。20.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，DNA順序編碼一有效殺蟲多肽;該多肽的特征是，質(zhì)譜分析表明其分子量為7080D，在逆向高效液相層析中以單一峰移動。21.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，所指DNA順序?qū)嵸|(zhì)上編碼SEQIDNO5所示的多肽。22.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，所指DNA順序?qū)嶋H上已明確示于SEQIDNO2。23.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，所指DNA順序?qū)嶋H上示于SEQIDNO4。24.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，所指DNA順序?qū)嶋H上示于SEQIDNO6。25.如權(quán)利要求14所述的重組表達載體，其特征是，所指的轉(zhuǎn)化細胞是易于受到昆蟲侵擾的植物細胞。26.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征是，編碼自Diguetia蜘蛛毒液中可大量分離的高效殺蟲多肽的一段DNA順序已轉(zhuǎn)入所指植物種質(zhì)細胞或所指植物的祖先中，因此所指DNA序列表達的性狀可經(jīng)所說植物經(jīng)有性傳播或無性傳播而遺傳給下一代。27.一種重組棒狀病毒表達載體，在宿主或昆蟲宿主中可表達一段DNA序列，該DNA序列編碼一種可自Diguetia蜘蛛毒液中大量分離的高效殺蟲多肽。28.如權(quán)利要求27所述的重組棒狀病毒表達載體，其特征是，所指的表達載體是棒狀病毒基因組，所指DNA順序插在多角蛋白基因中并受棒狀病毒多角蛋白起動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。29.DNA順序轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的重組宿主細胞，其特征是，編碼自Diguetia蜘蛛毒液中可大量分離的有效殺蟲多肽的DNA順序以一種在宿主細胞內(nèi)表達所指多肽的方式存在。30.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，蜘蛛毒液是得自Diguetiacanities。31.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA順序編碼一種高效殺蟲多肽;該多肽的特征是，質(zhì)譜分析表明其分子量為6371-6397D，在逆向高效液相層析時以單一峰移動。32.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA序列實際上編碼示于SEQIDNO1中的多肽。33.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA順序編碼一種有效殺蟲多肽;該多肽的特征是，質(zhì)譜分析表明其分子量為6740D，在逆向高效液相層析時以單一峰移動。34.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA序列實際上編碼示于SEQIDNO3中的多肽。35.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA序列編碼一種有效殺蟲多肽;該多肽的特征是，質(zhì)譜分析表明其分子量為7080D，在逆向高效液相層析時以單一峰移動。36.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA序列實際上編碼示于SEQIDNO5中的多肽。37.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA順序?qū)嶋H上已示于SEQIDNO2中。38.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA序列實際上已示于SEQIDNO4中。39.如權(quán)利要求29所述的重組宿主細胞，其特征是，所指DNA序列實際上已示于SEQIDNO6中。40.一種生產(chǎn)高效殺蟲多肽的方法，其特征是，(a)培養(yǎng)重組宿主細胞，其特征在于，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所指宿主細胞的重組表達載體中含有一段編碼可自Diguetia蜘蛛毒液中大量分離的有效殺蟲多肽的DNA序列;表達載體特征在于，此載體能實現(xiàn)所指編碼序列在轉(zhuǎn)化細胞中的表達，以及(b)自重組宿主細胞培養(yǎng)液中回收所指的有效殺蟲多肽。41.如權(quán)利要求40所述的方法可獲得經(jīng)重組產(chǎn)生的多肽。42.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列編碼一種有效殺蟲多肽，此多肽特征是，質(zhì)譜分析表明其分子量為6371-97D，在逆向高效液相層析時以單一峰移動。43.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列實際上編碼已示于SEQIDNO1的多肽。44.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列編碼一種有效殺蟲多肽，此多肽特征是，質(zhì)譜分析表明其分子量為6740D，在逆向高效液相層析時以單一峰移動。45.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列實際上編碼示于SEQIDNO3的多肽。46.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列編碼一種有效殺蟲多肽，此多肽特征是，質(zhì)譜分析表明其分子量為7080D，逆向高效液相層析時以單一峰移動。47.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列實際上編碼示于SEQIDNO5的多肽。48.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列實際上已示于SEQIDNO2中。49.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列實際上已示于SEQIDNO4中。50.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所指DNA序列實際上已示于SEQIDNO6中。51.一種控制無背椎動物害蟲的方法，其特征是，用有效作用量一種自Diguetia蜘蛛毒液中可分離到的多肽與害蟲接觸，或一種農(nóng)業(yè)上或園藝上可接受的鹽類。52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，蜘蛛毒液獲得自Diguetiacanities。53.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，害蟲是昆蟲。54.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，害蟲屬鱗翅目。55.一種控制無背椎動物害蟲方法，其特征是，令所指的害蟲與重組棒狀病毒接觸，該病毒可表達產(chǎn)生有效作用量的一種可自Diguetia蜘蛛毒液中分離的多肽。56.一種殺蟲混合物，其特征是，按權(quán)利要求55結(jié)合于農(nóng)業(yè)或園藝上可接受的載體上的多肽的有效殺蟲數(shù)量。57.一種與Diguetia蜘蛛毒液中分離到的多肽產(chǎn)生強烈免疫反應(yīng)的抗體。58.如權(quán)利要求57所述的抗體，其特征在于，蜘蛛毒液得自Diguetiacanities。59.一種探測方法，用權(quán)利要求57的抗體探測是否存在一種自Diguetia蜘蛛毒液中可大量分離到的有效殺蟲多肽，其特征是，(a)獲得蜘蛛毒液(b)令蜘蛛毒液與所指的連有可探測標記的抗體接觸，以及(c)探測此連接所指多肽的帶標記抗體。60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，蜘蛛毒液得自Diguetiacanities。61.衍生于一段DNA順序的DNA探針，該DNA序列編碼一種自Diguetia蜘蛛毒液中大量分離的有效殺蟲多肽。62.一種探測方法，探測是否存在編碼一種自Diguetia蜘蛛毒液中可大量分離的有效殺蟲多肽之DNA，其特征是(a)獲得蜘蛛核酸(b)令所指毒液與權(quán)利要求61之DNA探針相接觸，以及(c)探測與所指核酸雜交的所指探針。63.一種純化方法，用權(quán)利要求57中抗體純化可自Diguetiacanities毒液中大量分離的有效殺蟲多肽，其特征是，(a)把抗體連接于一固體支持物上(b)令含有所指多肽的溶液與連于所指固體支持物的所指抗體相接觸，因而存在于溶液中的所指多肽可結(jié)合于所指抗體。(c)洗脫與連于所指固體支持物上的所指抗體相結(jié)合的所指多肽。(d)收集前述洗下的多肽。64.與SEQIDNO7或其一部分編碼的氨基酸順序有同源性的前體前的一段順序，引導(dǎo)成熟蛋白的折疊和分泌。65.與SEQIDNO7編碼的氨基酸順序有同源性的一個基因構(gòu)造物可與一個肽操作相連。66.與SEQIDNO8或其一部分有同源性的啟動子順序，能夠在重組構(gòu)造中引導(dǎo)基因的表達。67.與SEQIDNO8順序或其一部分有同源性的一個重組構(gòu)造物，與被表達的基因操作相連。68.這里所指殺蟲多肽包含(a)大小為約55到65個氨基酸(b)與SEQIDNO1，3，5有大于40%的同源性(c)有大約7到8個光胱氨酸殘基。69.權(quán)利要求68中所指多肽來源是Diguetia蜘蛛毒液。全文摘要本發(fā)明提供了一種自Diguetiacanities蜘蛛毒液中可分離到的高效殺蟲多肽，制備和應(yīng)用這些殺蟲劑的方法，及編碼這些高效殺蟲多肽的DNA。文檔編號C07K16/00GK1064684SQ9210139公開日1992年9月23日申請日期1992年3月1日優(yōu)先權(quán)日1991年3月1日發(fā)明者卡倫·喬安妮·克拉肖,布拉德福特·卡爾·范瓦格納,約翰·倫道夫·亨特·杰克遜申請人:Fmc有限公司,天然產(chǎn)品科學股份有限公司