專利名稱：人的上皮細(xì)胞成長(zhǎng)因子的制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用遺傳工程的方法有效地制造人的上皮細(xì)胞成長(zhǎng)因子(hEGF)的方法。
現(xiàn)在，人們已經(jīng)判明hEGF與β-尿抑胃激素是同一物質(zhì)，而本發(fā)明擬大量且方便地提供作為抗?jié)儎┑人幤窞橛行У膆EGF。
已經(jīng)公知的遺傳工程之方法是以下的一系列操作(1)把對(duì)所需物質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳因子組建到載體中，(2)使用該載體對(duì)宿主大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，(3)對(duì)如此獲得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，(4)通過從培養(yǎng)液中的回收來(lái)獲取所需物質(zhì)，此外還進(jìn)行了種種研究以通過上述方法來(lái)得到對(duì)人體有利的微量蛋白質(zhì)。
Tacon，W.，Carey，N.，Emetage，S.Molec.gen.Genet.，177，427(1980)。
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根據(jù)最新技術(shù)已經(jīng)公開的有這樣的方法，例如通過同時(shí)具備對(duì)來(lái)自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子之啟動(dòng)子進(jìn)行編碼的遺傳因子和在其控制下對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行編碼的遺傳因子，并把對(duì)hEGF進(jìn)行編碼的遺傳因子也組建進(jìn)去而形成重組DNA。最后獲得hEGF(特開昭63-003799號(hào)公報(bào)、特開昭63-003800號(hào)公報(bào))。這里，為了達(dá)到在培養(yǎng)時(shí)能提高得率的目的，例如蛋白質(zhì)合成能的誘導(dǎo)發(fā)生之前是在低溫區(qū)域進(jìn)行培養(yǎng)，而在蛋白質(zhì)合成能誘導(dǎo)后則在高溫區(qū)域進(jìn)行培養(yǎng)，或者，蛋白質(zhì)合成能的誘導(dǎo)發(fā)生之前在弱酸性或中性條件下進(jìn)行培養(yǎng)，而在蛋白質(zhì)合成能誘導(dǎo)之后則在弱堿性條件下進(jìn)行培養(yǎng)等，已對(duì)其培養(yǎng)方法作了種種研究，且分別取得了成果。
根據(jù)以上所述的已有技術(shù)，則目的產(chǎn)物hEGF確實(shí)能夠獲得一定程度之得率。然而，在欲進(jìn)行伴有往培養(yǎng)基的分泌的高密度培養(yǎng)時(shí)卻存在著不少缺點(diǎn)。例如(1)按照目前的方法，還不能任意控制轉(zhuǎn)化的大腸桿菌開始產(chǎn)生hEGF的時(shí)期，(2)因此，還不能在開始產(chǎn)生hEGF之前，先使轉(zhuǎn)化的大腸桿菌充分繁殖，(3)因而，在進(jìn)行所謂的高密度培養(yǎng)(在本發(fā)明說明書中，它是指對(duì)借助400D550以上的大腸桿菌所進(jìn)行的培養(yǎng))之時(shí)，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不能夠控制產(chǎn)生hEGF之過程。
再者，在原理上也不可能適用高密度培養(yǎng)中所必須的Fed-Batch法(在培養(yǎng)過程中一邊加入培養(yǎng)基一邊繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的方法)。
根據(jù)本發(fā)明者們的實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌一旦開始產(chǎn)生hEGF，就會(huì)有轉(zhuǎn)化大腸桿菌本身的繁殖受到抑制的現(xiàn)象。其原因未必十分清楚，但是從所產(chǎn)生的hEGF不停留在轉(zhuǎn)化大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)或胞外質(zhì)(內(nèi)膜與外膜之間)中而分泌在細(xì)胞外這一hEGF特異的現(xiàn)象來(lái)看，可以推測(cè)在轉(zhuǎn)化大腸桿菌上受有很大的應(yīng)激，因此也可推測(cè)出這是由于在產(chǎn)生hEGF的同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌本身的繁殖受到抑制的緣故。
根據(jù)以上分析，為了實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，有必要在使轉(zhuǎn)化大腸桿菌充分繁殖的時(shí)候開始hEGF的產(chǎn)生，為此，就必須做到能對(duì)hEGF產(chǎn)生的時(shí)間進(jìn)行任意的控制。
本發(fā)明的要點(diǎn)為以下各點(diǎn)(1)作為啟動(dòng)子應(yīng)使用能對(duì)trp合成酶系遺傳因子的啟動(dòng)子進(jìn)行編碼的遺傳因子。
(2)應(yīng)通過添加3-吲哚丙烯酸(IAA)來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生hEGF的時(shí)期進(jìn)行控制。
(3)在培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用能對(duì)需添加的培養(yǎng)基的添加速度進(jìn)行變化的Fed-Batch法。
(4)添加培養(yǎng)基的碳源應(yīng)為葡萄糖、甘油或葡萄糖與甘油的組合物。
(5)進(jìn)而，在上述(4)中，在使用Fed-Batch法之基礎(chǔ)上，作為添加培養(yǎng)基的碳源，應(yīng)在使用了葡萄糖之后再使用甘油。
以下，就上述各點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)描述。
在作為啟動(dòng)子而適用來(lái)自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的物質(zhì)時(shí)，由于培養(yǎng)基中磷酸鹽的存在，hEGF的產(chǎn)生能已停。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌繁殖并在該過程中磷酸鹽被消耗而下降到一定濃度，來(lái)自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的啟動(dòng)子就開始工作，于是開始產(chǎn)生出hEGF?，F(xiàn)有技術(shù)是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH及溫度來(lái)提高其hEGF的產(chǎn)生能的。
在本發(fā)明中，不是使用來(lái)自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的啟動(dòng)子，而是使用上述trp合成酶系遺傳因子的啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明，是在培養(yǎng)基中事先加入50mg/l左右的色氨酸。隨著轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖，色氨酸被消耗，降到一定濃度以下之后，trp合成酶系遺傳因子的啟動(dòng)子開始工作，于是hEGF開始產(chǎn)生，但如有足夠的色氨酸存在于培養(yǎng)基中，則本發(fā)明的啟動(dòng)子就不會(huì)開始產(chǎn)生hEGF。另外，如以后的實(shí)施例所示的那樣，尤其是轉(zhuǎn)化大腸桿菌具有一旦分泌hEGF、就會(huì)減弱繁殖速度或停止繁殖這樣的性質(zhì)。
由此而了解到，由于具有本發(fā)明所用的trp啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒載體，能容易地進(jìn)行嚴(yán)密的發(fā)現(xiàn)控制，從而極其適合于利用在后述的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的高密度培養(yǎng)中。即，為了把hEGF的產(chǎn)生量提高到150mg/l以上，在色氨酸的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)化大腸桿菌已繁殖到充分的高密度時(shí)，快速地加入IAA，然后經(jīng)過短時(shí)間(10-18小時(shí))之后，能從培養(yǎng)基中回收產(chǎn)物。
此外，在Fed-Batch法的添加培養(yǎng)基中不事先加入葡萄糖而加入甘油，或者在添加過程中通過把葡萄糖變更為甘油，就可能象以后將說到的那樣巧妙地控制trp啟動(dòng)子工作的開始時(shí)期。
然而，IAA是色氨酸結(jié)構(gòu)的類似體，而且對(duì)于阻遏物蛋白的親和性要比色氨酸還強(qiáng)，所以通過優(yōu)先與阻遏物結(jié)合來(lái)防止阻遏物與啟動(dòng)子(操作者)的結(jié)合。因此，即使在培養(yǎng)基中存在著色氨酸之情況下，也能由于在培養(yǎng)基中添加IAA而使該啟動(dòng)子開始工作。
由于以上原因，故能夠理解到，在本發(fā)明中，在培養(yǎng)過程中的任何一個(gè)階段，通過添加IAA都可使得在高密度培養(yǎng)條件下的往培養(yǎng)基中的分泌所導(dǎo)致的hEGF的產(chǎn)生得以開始。本發(fā)明的重要內(nèi)容實(shí)際上就在這里。
如果提高轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖，那么可斷定其后的hEGF之產(chǎn)生是隨之成比例提高的。通過對(duì)培養(yǎng)基本身的研究，或通過Fed-Batch法的適用，能提高培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化大腸桿菌的密度，所以如果在通過高密度培養(yǎng)提高了轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖之后，使hEGF開始產(chǎn)生，就能以相應(yīng)的有效率來(lái)獲得hEGF。
在本發(fā)明中，可適當(dāng)使用通常的遺傳工程學(xué)上常用的方法。例如，作為宿主大腸桿菌的可使用來(lái)自廣泛使用著的K12的大腸桿菌株，又，作為載體可以對(duì)市售的質(zhì)粒按遺傳工程的方法進(jìn)行重組。更具體地講，在本發(fā)明中可以使用以下的大腸桿菌。
JM101、TB1、HB101、RR1、DH1、MM294、C600galk-、Y1090(pMC9消失株)
此外，還可使用它們的誘發(fā)株。
另外，在本發(fā)明中，例如可以使用以下的質(zhì)粒以及噬菌體DNA。
pDR540[フアルマシヤ公司制造]、M13mp18以及mp19(寶酒公司制造)再者，在本發(fā)明中，還可把以下的培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及添加培養(yǎng)基。
LB培養(yǎng)基(10g/l巴克土(バクトトリプトン)5g/l酵母抽捉物、5g/l食鹽)。
M9培養(yǎng)基(6g/l磷酸氫二鈉、3g/l磷酸二氫鉀、0.5g/l食鹽、1g/l氯化銨、2mM硫酸錳、0.1mM氯化鈣)4YTM9培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中添加以下成份。32g/l巴克土(バクトトリプトン)、20g/l酵母抽提物)。
另外，在平板培養(yǎng)基上可加入瓊脂以使之達(dá)到1.5%，而在M13噬菌體上層培養(yǎng)基中可加入瓊脂以使之達(dá)到0.6%，然后進(jìn)行調(diào)制。在所有含質(zhì)粒的大腸桿菌的培養(yǎng)過程中，可在培養(yǎng)基中加入氨必西林且使其達(dá)到100mg/l之濃度，以防止質(zhì)粒的脫離。
作為本發(fā)明中所使用的限制酶和DNA修飾酶，可適合于使用通常的遺傳工程學(xué)上常用的方法。例如，可適宜于使用寶酒制造公司、東洋紡織公司、フアルマシヤ公司以及バ-リンガ-マンハイム公司制造的產(chǎn)品。在本發(fā)明中，這些產(chǎn)品的使用可通過以下說明書以及文獻(xiàn)來(lái)進(jìn)行(MolecularCloning;aLaboratoryManual.ColdSpring，HarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork)。
另外，在本發(fā)明中，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的精制以及噬菌體DNA的精制，可適宜于使用通常的遺傳工程上常用的手法。另外，也可按照文獻(xiàn)(MolecularCloning)的記載及說明書進(jìn)行精制。
本發(fā)明中的低(聚)核苷酸可以通過通常的DNA合成中常用的方法(例如トリエステル法)進(jìn)行合成。另一方面，也可以利用市售的DNA合成機(jī)(AppliedBiosystem公司制造，型號(hào)380B)進(jìn)行合成。
此外，本發(fā)明中的低(聚)核苷酸的連接，可適合于采用通常的遺傳工程學(xué)上常用的方法。具體地說，把各合成的低(聚)核苷酸1μg放在20μl的磷酸二氫鉀激酶緩沖液(根據(jù)MolecularCloning)中進(jìn)行磷酸化處理，然后進(jìn)行混合，在70℃下加熱10分鐘之后，又化1小時(shí)逐漸冷卻至室溫，接著，加入與混合液同量的1倍濃度的磷酸二氫鉀激酶緩沖液，又加入T4DNA連接酶，在16℃下放置一個(gè)晚上。以后，在70℃下加熱10分鐘以使T4連接酶失活，再根據(jù)乙醇沉淀法交換該緩沖液，然后，為生成目的產(chǎn)物的斷片而用兩端的限制酶加以切斷后，再用8%的聚丙烯酰胺塊的凝膠電泳進(jìn)行區(qū)分。用借助緩沖液進(jìn)行的提取法(根據(jù)MolecularCloning)從含有目的產(chǎn)物的DNA斷片的凝膠提取出DNA并加以精制。這種方法是本發(fā)明的低(聚)核苷酸的連接的典型例子。
作為本發(fā)明的目的物的hEGF量的測(cè)定可適宜使用通常的遺傳工程學(xué)上常用的方法。具體地說，例如可以市售的hEGF[湧永制藥公司制、アマシヤム公司制]為標(biāo)準(zhǔn)，利用放射免疫測(cè)定(使用アマシヤム公司的儀器)進(jìn)行測(cè)定。
以下，通過揭示參考例以及實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述。
參考例1發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒的制備(1)trp啟動(dòng)子、SD排列、大腸桿菌堿性磷酸酶信號(hào)肽遺傳因子的合成。
把要利用的trp啟動(dòng)子及其SD序列(Shine-Dargarno核蛋白體結(jié)合部位)，規(guī)定為以復(fù)制開始點(diǎn)的A為+1時(shí)的-60位的T至+26位的A。在-60位的T的5′一側(cè)考慮與載體的連結(jié)，而設(shè)置HindⅢ切斷點(diǎn)。大腸桿菌堿性磷酸酶信號(hào)肽遺傳因子是根據(jù)天然排列的，但是考慮到與載體的連結(jié)以及往hEGF遺傳因子的連結(jié)，則把開始密碼子的GTG變更到ATG，把C末端的GCT變更到GCG，并在其3′一側(cè)設(shè)置EcoRⅠ切斷點(diǎn)。把以上的排列分成8個(gè)低(聚)核苷酸加以合成，根據(jù)常用的方法進(jìn)行連結(jié)，接著作為HindⅢ-EcoRIDNA斷片加以精制。此外，把該斷片插入在MBmp18噬菌體復(fù)制型DNA的HindⅢ-EcoRⅠ切斷點(diǎn)之間，并通過dideoxy法確認(rèn)其堿的排列(

圖1)。
(2)hEGF遺傳因子的合成。
hEGF遺傳因子的排列，是以天然的hEGF的氨基酸排列為基礎(chǔ)而加以設(shè)計(jì)的。在設(shè)計(jì)排列時(shí)考慮了使用大腸桿菌中使用頻率較高的密碼子，除去能獲得二次結(jié)構(gòu)那樣的反復(fù)排列，在遺傳因子中途為設(shè)置連結(jié)遺傳因子而必要的SphⅠ切斷點(diǎn)。
具體地說，是作為由21個(gè)低(聚)核苷酸構(gòu)成的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片而制作了hEGF遺傳因子。
首先按照普通方法，對(duì)構(gòu)成前半部分的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片的11個(gè)低(聚)核苷酸進(jìn)行合成、連結(jié)，并將其插入在MBmp18噬菌體復(fù)制型DNA的EcoRⅠ-SacⅠ切斷點(diǎn)之間。再采用dide-oxy法確認(rèn)堿的排列。
接著，也采用常用的方法，對(duì)構(gòu)成后半部分的SphⅠ-SacⅠDNA斷片的10個(gè)低(聚)核苷酸進(jìn)行合成和連結(jié)，并將其插入MBmp18噬菌體復(fù)制型DNASphⅠ-SacⅠ切斷點(diǎn)之間，再采用dideoxy法確認(rèn)堿的排列。
從各自的重組M13噬菌體的復(fù)制型DNA，切出前半部分的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片和后半部分的SphⅠ-SacⅠDNA斷片，并進(jìn)行連結(jié)，從而制備了hEGF遺傳因子。
已完成的hEGF遺傳因子上，5′末端變?yōu)镋coRⅠ切斷點(diǎn)，這部分相當(dāng)于hEGF的N末端氨基酸的天門東酰胺。3′末端變?yōu)镾ac切斷點(diǎn)，并形成在它的前面，連續(xù)著終止密碼子TGA、TAG。此后，把連結(jié)了的hEGF遺傳因子的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片插入M13mp18噬菌體復(fù)制型DNA的EcoRⅠ-SacⅠ切斷點(diǎn)，再通過dideoxy法再次確認(rèn)了堿的排列(圖2)。
(3)發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒的制備首先，通過使用DNA聚合酶Klenow斷片和T4連接酶(ligase)的常用方法，使pDR540(ファルマシヤ公司制造)的EcoRⅠ切斷點(diǎn)消失，從而制備了pDR540 E-質(zhì)粒。
此后，在該pDR540 E-DNA的BamHⅠ切斷點(diǎn)插入按照通常的方法合成并連結(jié)的聯(lián)結(jié)子，并重新導(dǎo)入EcoRⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、PvuⅡ切斷點(diǎn)。
再者，在該P(yáng)vuⅡ切斷點(diǎn)插入TrpA終止區(qū)序列(フアルマシヤ公司制造)，從而制備pATGt質(zhì)粒。在該pATGt質(zhì)粒DNA的EcoRⅠ切斷點(diǎn)與SacⅠ切斷點(diǎn)之間插入含有合成hEGF遺傳因子的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片，從而制備了pBT19質(zhì)粒。
接著，把含有trp啟動(dòng)子、SD序列、大腸桿菌堿性磷酸酶信號(hào)肽遺傳子的HindⅢ-EcoRⅠDNA斷片插入在pBT19的HindⅢ切斷點(diǎn)與EcoRⅠ切斷點(diǎn)之間，從而制備了有hEGF分泌發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pBT23(圖3及圖4)。
參考例2hEGF的發(fā)現(xiàn)及其分布使用pBT23DNA，對(duì)大腸桿菌C600galk-進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而獲得保持了BT23的轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
在0.1l的LB培養(yǎng)基中對(duì)保持有該pBT23的C600galk-株進(jìn)行一夜的振蕩培養(yǎng)，并把它作為前培養(yǎng)液。然后在0.5l的振蕩燒杯中于0.2l的M9培養(yǎng)基內(nèi)(含有5g/l的酷蛋白氨基酸、2g/l的葡萄糖、10mg/l的維他命、100mg/l的氨必西林)，對(duì)上述的前培養(yǎng)液進(jìn)行4ml植菌(2%植菌)，接著在37℃下進(jìn)行125次/分的振蕩，加以培養(yǎng)。在對(duì)數(shù)繁殖初期(這時(shí)的OD約為0.1)，添加3-吲哚丙烯酸(IAA)，使其達(dá)到20mg/l的濃度，進(jìn)而進(jìn)行trp啟動(dòng)子的誘發(fā)。在培養(yǎng)開始的1、2、4、6、8、24小時(shí)后取得試樣，進(jìn)行離心分離而分離出培養(yǎng)基和菌體成分，再通過浸透壓振動(dòng)法(ショツク)從菌體中進(jìn)一步分離出胞外質(zhì)組分。培養(yǎng)基和胞外質(zhì)組分中的hEGF量，通過放射免疫測(cè)定法(マシヤム公司的儀器)被作了測(cè)定。其結(jié)果顯示在表1。
表1hEGF的分布hEGF量(mg/l)培養(yǎng)時(shí)間胞外質(zhì)培養(yǎng)基10.0110.01720.0160.03040.0220.19060.0170.43080.0140.490240.0040.730培養(yǎng)開始的24小時(shí)后，培養(yǎng)基中hEGF的量為0.73mg/l，成為最大。積蓄在胞外質(zhì)中的hEGF的量在培養(yǎng)了4小時(shí)后達(dá)到最大，其量至多不過0.02mg/l之程度，而培養(yǎng)了24小時(shí)后，該量就減少，幾乎不再存在。
由此可以確認(rèn)，被分泌的hEGF的幾乎全部是存在于培養(yǎng)基中的，因此在以后的實(shí)驗(yàn)中對(duì)于產(chǎn)生的hEGF，只沉淀了培養(yǎng)基中的量。
參考例3對(duì)宿主大腸菌桿株的探討使用pBT23DNA，對(duì)大腸桿菌HB101，RR1、DH1、MM294、Y1090(pMC9消失株)、JM101、TB1株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了分別保持了其pB23的轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
在與參考例2相同的條件下，與先前的C600yalk轉(zhuǎn)化株一起，進(jìn)行了培養(yǎng)。借助IAA進(jìn)行的trp啟動(dòng)子的誘發(fā)是在培養(yǎng)開始后的9.5小時(shí)時(shí)進(jìn)行，并測(cè)定了此時(shí)與24小時(shí)后培養(yǎng)基中的hEGF的量(表2)。
表2各種轉(zhuǎn)化大腸桿菌的hEGF量hEGF量(mg/l)大腸桿菌株9.5小時(shí)24小時(shí)C600galk-0.54 1.25HB1010.541.25RR11.230.93DH10.640.45MM2940.280.50Y1090(pMC9消失株)0.030.02JM1010.810.67TB12.304.00在8種轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，以TB1的產(chǎn)生量為最多，達(dá)到了4mg/l。其次是C600galk-和HB101，它們均為1.25mg/l，可以認(rèn)為這些菌株適合于hEGF的產(chǎn)生。
參考例4對(duì)rep啟動(dòng)子衍生時(shí)期的探討采用保持有pBT23的HB101轉(zhuǎn)化株，在與參考例2相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)繁殖中期、后期和定期中分別添加IAA并使它達(dá)到20mg/l并測(cè)定了培養(yǎng)基中的hEGF的量。其結(jié)果顯示在表3。
可以看出，在對(duì)數(shù)繁殖中期或定期中添加IAA可獲得較多的hEGF的產(chǎn)生量。
參考例5培養(yǎng)基組成與hEGF的產(chǎn)生量采用保持有pBT23的TB1轉(zhuǎn)化株，在與參考例2相同的條件下進(jìn)行了培養(yǎng)(作為培養(yǎng)基的是使用表4的物質(zhì))。在把4YM9、M9-1、M9-2用作培養(yǎng)基的場(chǎng)合，經(jīng)過5小時(shí)后添加IAA以使其達(dá)到20mg/l，而把M9-3、M9-4用作培養(yǎng)基的場(chǎng)合則經(jīng)過9小時(shí)后添加IAA以使其達(dá)到20mg/l，并測(cè)定了24小時(shí)以后的培養(yǎng)基中的hEGF的量。
表4培養(yǎng)基組成4YM9 M9-1 M9-2 M9-3 M9-4M-培養(yǎng)基←←←←バヶトトリプトン32g/l酪蛋白氨基酸10g/l5g/l←2g/l酵母抽提物20g/l葡萄糖5g/l←2g/l←維他命Bi10mg/l←←←氨比西林100mg/l ← ← ← ←表5培養(yǎng)基組成和hEGF產(chǎn)生量hEGF量(mg/l)培養(yǎng)基9小時(shí)后24小時(shí)后4YTM90.040.09M9-10.680.70M9-21.981.69M9-33.037.25M9-40.912.38在使用M9-3培養(yǎng)基(含有5g/l酷蛋白氨基酸2g/l葡萄糖)之場(chǎng)合，hEGF的產(chǎn)生量達(dá)到最大，為7.25mg/l。此外還了解到，以含有大量色氨酸的天然成分為主體的培養(yǎng)基中，hEGF的產(chǎn)生量較少。
參考例6對(duì)基于培養(yǎng)基中的色氨酸的trp啟動(dòng)子的控制以上各參考例中的培養(yǎng)是這樣一種自然誘發(fā)系統(tǒng)，即，在培養(yǎng)基中不含有色氨酸，從來(lái)自前培養(yǎng)液的色氨酸隨著大腸桿菌的繁殖而下降到一定濃度以下的時(shí)期開始就發(fā)生了trp啟動(dòng)子的誘發(fā)。在該系統(tǒng)中，作為誘發(fā)物質(zhì)的IAA盡管能使hEGF的產(chǎn)生量增加，但并未直接使誘發(fā)啟動(dòng)子的開關(guān)打開。
因此，我們決定事先在培養(yǎng)基中加入色氨酸，以查明能否抑制來(lái)自trp啟動(dòng)子的誘發(fā)，又，即使能抑制，則能否通過添加IAA來(lái)解除抑制。
所加的色氨酸的量為1、3、10、20、30、40mg/l，此外，按照表6所示的濃度加入IAA。
使用保持有pBT23的HB101轉(zhuǎn)化株，在使培養(yǎng)基及其條件與參考例2相同的情況下進(jìn)行了培養(yǎng)。另外，在培養(yǎng)開始的5小時(shí)以后添加IAA，并測(cè)定了培養(yǎng)基中的hEGF的量。其結(jié)果顯示在表6。
表6-1培養(yǎng)基中色氨酸的濃度與hEGF產(chǎn)生量
加入培養(yǎng)基中的色氨酸的濃度在10mg/l以下時(shí)，hEGF產(chǎn)生量為6-10mg/l，然而，色氨酸的濃度為20-40mg/l時(shí)，EGF的產(chǎn)生量為1-1.5mg/l，已大幅度減少了，從而了解到一定濃度以上的色氨酸會(huì)抑制hEGF的產(chǎn)生。
另外，在色氨酸濃度為20mg/l的場(chǎng)合，如添加20或40mg/lIAA，則hEGF的產(chǎn)生量增加了約8倍，但添加80mg/l時(shí)，hEGF產(chǎn)生量的增加停留在約4倍。在色氨酸的濃度為30-40mg/l時(shí)，添加80mg/lIAA而導(dǎo)致的hEGF產(chǎn)生量的增加為1.5倍，相當(dāng)小。
從以上結(jié)果查明了添加適當(dāng)量的色氨酸(這里為20mg/l)可抑制自trp啟動(dòng)子的誘發(fā)，另外，添加IAA(20-40mg/l)可解除這種抑制，并使trp啟動(dòng)子的開關(guān)打開。另外，已知，添加微量的色氨酸可促進(jìn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖(通過添加10-40mg/l的色氨酸，菌體量會(huì)變?yōu)?.5-2倍)。另外也已明白，40mg/l以上的過剩量IAA的添加會(huì)抑制大腸桿菌的繁殖，因而招致hEGF產(chǎn)生量的低下。
綜上所述，得到以下結(jié)論。
(1)作為目的物的hEGF，通過充分的培養(yǎng)幾乎全部進(jìn)入到培養(yǎng)液中。
(2)作為宿主大腸桿菌適當(dāng)?shù)挠蠬B101、TB1或C600galk。
(3)通過IAA進(jìn)行的trp啟動(dòng)子的誘發(fā)，在繁殖后期進(jìn)行為最適合。
(4)作為培養(yǎng)基為適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)有，在M9培養(yǎng)基中加入了5g/l酷蛋白氨基酸、2g/l葡萄糖、10mg/l維他命B1的物質(zhì)。
(5)培養(yǎng)基中即使存在著色氨酸，但通過添加IAA能進(jìn)行trp啟動(dòng)子的誘發(fā)。
以這些事實(shí)為標(biāo)識(shí)，可推測(cè)出，我們能夠從事通過發(fā)酵罐進(jìn)行的大量的高密度培養(yǎng)，并進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。并且，探討了耐大量實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌培養(yǎng)上清液中的hEGF的精制法，并設(shè)計(jì)了以下方法。
實(shí)施例1hEGF的精制法(1)被陽(yáng)離子交換樹脂(BIO-REX70;バイオテッド公司制造)的吸附(pH3.0)→溶出(醋酸銨pH8.0)→透析(醋酸氨pH5.5)。
(2)陰離子交換柱色譜分析(Q-ScpharoseFastFlow;フアルマシヤ公司制造，醋酸銨pH5.5)。
(3)逆相(C18)柱色譜分析(PepRPC;フアルマシヤ公司制造，0.1%三氟醋酸/乙腈)→凍結(jié)干燥。
該方法不但全部工序只需2-4天，而且不包括通常所使用的硅膠過濾色譜法，因此較容易擴(kuò)大其規(guī)模。
例如，使用該方法，能夠從101的培養(yǎng)上清液得到10mg的精制hEGF。
精制hEGF具有與天然型相同的氨基酸組成以及與天然型相同的N末端的氨基酸排列。再者，精制hEGF在以下所述實(shí)驗(yàn)中顯示了其生物活性。
實(shí)施例2與EGF受體的結(jié)合能按照以下所述的方法，確認(rèn)了精制hEGF的與人細(xì)胞表面EGF受體的結(jié)合能。
在含有10%的牛胎血清(ギブコ公司制造)的グルベッコ變法イ-ゲル培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基ニッスイ公司制造)中懸濁人A431細(xì)胞，且使其濃度達(dá)10細(xì)胞ml。然后，在24個(gè)洞的培養(yǎng)板上以每一個(gè)洞1ml地加入該細(xì)胞懸濁液，并在37℃、5%CO2的條件下進(jìn)行了24小時(shí)的培養(yǎng)。接著用含有50mM的N，N-二(2-羥乙基)-2-氨乙基磺酸(BES，pH6.5)、0.1%牛血清白蛋白(BSAシグマ公司制)的DMEM培養(yǎng)基(結(jié)合用緩沖液)對(duì)細(xì)胞洗凈2次，此后加入含有0.2ng/ml的125I標(biāo)識(shí)的hEGF(アマシヤム公司制)與0.1-10，000ng/ml的hFGF的結(jié)合用緩沖液(0.3ml)。
在室溫下放置1小時(shí)之后，用結(jié)合用緩沖液對(duì)細(xì)胞洗凈2次，在每一個(gè)洞中加入0.3ml的0.2M的氫氧化鈉溶液，細(xì)胞溶解之后，最后測(cè)定了與EGF受體結(jié)合的I-hEGF的放射活性。其結(jié)果顯示在表7。
表7精制hEGF的與人EGF受體的結(jié)合能hEGF，ng/洞/104細(xì)胞結(jié)合阻害率(%)[精制hEGF]0.10181038100821，0009510，00098根據(jù)以上結(jié)果可確認(rèn)，精制hEGF具有人培養(yǎng)細(xì)胞與EGF受體的結(jié)合能。
實(shí)驗(yàn)例3細(xì)胞繁殖促進(jìn)作用根據(jù)以下所述方法，確認(rèn)了精制hEGF的細(xì)胞繁殖促進(jìn)作用。
在含有10%牛胎血清的DMEM培養(yǎng)基中按10細(xì)胞/ml的比例懸濁了鼠Swiss3 T3細(xì)胞。然后在24個(gè)洞的培養(yǎng)板上按照每1個(gè)洞1ml的量加入該細(xì)胞懸濁液，接著在37℃且5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)直到細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)繁殖中期為止。此后，把培養(yǎng)基與含有0.2%牛胎血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行交換，又在37℃且5%CO2的條件下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。在幾乎所有的細(xì)胞都進(jìn)入定期之處，加入hEGF，再培養(yǎng)8小時(shí)。在每一個(gè)洞里添加0.5μCi的[甲基-3H]胸腺密啶核苷(247.9G Bq/mmol;アマシヤム公司制造)，培養(yǎng)了24小時(shí)以后，測(cè)定了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的[H]-胸腺嘧啶核苷的放射活性。其結(jié)果顯示在表8。
表8精制hEGF的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用濃度 ［3H]胸腺嘧啶核比率(ng/ml) 苷的進(jìn)入(cpm)0.028641.000.336711.281.037531.313.0 4742 1.66從以上的結(jié)果證實(shí)了精制hEGF的細(xì)胞繁殖促進(jìn)作用。
實(shí)驗(yàn)例4豚鼠胃壁細(xì)胞中酸生成的抑制根據(jù)以下所述方法，就精制hEGF在分離壁細(xì)胞中胃酸生成的抑制作用，以14C-胞嘧啶(AP)積蓄為指標(biāo)進(jìn)行了確認(rèn)。
在100%的氧氣通氣條件下于37℃中對(duì)分離壁細(xì)胞懸濁液[含有1.80×105細(xì)胞/ml、0.2%BSA的Hanks液(ニッスイ公司制造)]進(jìn)行了20分鐘的保溫，然后加入0.1 μCi的14C-AP(4.37GBq/mmolアマシヤム公司制造)、精制hEGF以及作為刺激劑入加組胺(半井化學(xué)公司制造)(3μM)，或加入(dibutylyl cyclic-AMP)(dbc-AMP。
公司制造)，使其分別達(dá)到3μM和1mM，再次進(jìn)行保溫。60分鐘以后，加入冰冷的Hanks液(4ml)，接著通過低速冷卻離心使反應(yīng)停止。然后，加入2M的氫氧化鈉溶液(0.3ml)使細(xì)胞溶解，又在2M的鹽酸中進(jìn)行中和，最后通過液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定了放射活性。
14C-AP積蓄，是從刺激時(shí)的進(jìn)入值中扣除控制值，并以此為100%，用%刺激表示精制hEGF的作用，從而被顯示在表9
表9精制hEGF的酸生成抑制作用%刺激組銨3μM100組銨3μM+EGF 1nM 105組銨3μM+EGF 10nM 38.1組銨3μM+EGF100nM 23.1dbc-AMP1mM100dbc-AMP1mM+EGF1nM 106dbc-AMP1mM+EGF10nM 82.1dbc-AMP1mM+EGF100nM 50.8從以上結(jié)果可證實(shí)，精制hEGF具有抑制因組胺、dbc-AMP的任何一種之刺激所引起的豚鼠胃壁細(xì)胞的酸生成。
實(shí)施例1[間歇法]在通過前述燒杯培養(yǎng)所得到的種種見識(shí)之基礎(chǔ)上，試驗(yàn)了用10升的發(fā)酵罐進(jìn)行的大量培養(yǎng)。作為發(fā)酵罐的是使用容積為10升的東方酵母公司制的臺(tái)式罐，另外還安裝了能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中pH和溶解的氧氣濃度的控制裝置。在宿主中使用了HB101。
前培養(yǎng)是在LB基中進(jìn)行，并對(duì)此進(jìn)行2%的植菌。作為培養(yǎng)基的是使用M9培養(yǎng)基(含有5g/l酷蛋白氨基酸、2g/l的葡萄糖、10mg/l的維他命B1、100mg/l的氨必西林)6升，在37℃且1vvm通氣量(體積/體積/分鐘;在1分鐘內(nèi)用壓縮機(jī)壓入與培養(yǎng)容量相同量的空氣。這里是6升/分)、溶解酸濃度為4ppm(在100-100rpm的范圍內(nèi)改變攪拌槳的旋轉(zhuǎn)數(shù)且進(jìn)行控制)、pH7.0(通過4M氫氧化鈉溶液的滴入進(jìn)行控制)、自動(dòng)消泡(通過發(fā)酵罐上部的傳感器測(cè)出發(fā)泡狀態(tài)，自動(dòng)地滴入硅系消泡劑進(jìn)行消泡)等的條件下進(jìn)行了培養(yǎng)。經(jīng)過4.5小時(shí)之后添加IAA，添加濃度為20mg/l。
作為對(duì)照，用同樣的前培養(yǎng)液、同樣的培養(yǎng)基組成，并在與參考例2相同的條件下進(jìn)行了燒杯培養(yǎng)。其結(jié)果顯示在圖5。
發(fā)酵罐培養(yǎng)也好燒杯培養(yǎng)也好，經(jīng)過了4小時(shí)之后，hEGF開始產(chǎn)生，到9小時(shí)為止，保持著大體相同的產(chǎn)生量，但經(jīng)24小時(shí)之后，可看到在燒杯中的培養(yǎng)，其產(chǎn)生量為9mg/l，而發(fā)酵罐中的培養(yǎng)，其產(chǎn)生量與經(jīng)過9小時(shí)幾乎相同，僅為2mg/l。
因此可知，采用通常的間歇法不可能提高h(yuǎn)EGF的產(chǎn)生量。我們認(rèn)為其原因是，在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中溶解的氧氣量和pH被保持一定，始終提供了最適合于大腸菌增殖的條件，因此，培養(yǎng)基中的色氨酸被消耗，下降到某一濃度以下，在trp啟動(dòng)子開始工作時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源(碳源、氮源)就枯渴了。
所以，如下所述的那樣，我們考慮了在培養(yǎng)基中連續(xù)地添加新培養(yǎng)基的Fed-Batch法。
實(shí)施例2Fed-Batch法之一采用與實(shí)施例1相同的培養(yǎng)條件，4小時(shí)之后在添加IAA的同時(shí)加入培養(yǎng)基(含有20g/l酷蛋白氨基酸、200g/l葡萄糖、10mg/l維他命B1、100mg/l氨比西林、20mg/lIAA的M9培養(yǎng)基)，使用管式泵按每小時(shí)30ml的速率添加了24小時(shí)。作為對(duì)照，也進(jìn)行了燒杯中的培養(yǎng)。其結(jié)果顯示在圖6。
在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，過了6小時(shí)之后，hEGF的產(chǎn)生量增加了，經(jīng)過9小時(shí)后，其產(chǎn)生量為25mg/l，24小時(shí)之后為55mg/l，與實(shí)施例1的間歇法相比較約增加了25倍。
但是，其最大的產(chǎn)生量也只停留在55mg/l之程度，另外，菌體繁殖也為OD550的6之程度，離開高密度培養(yǎng)的初期目的還相當(dāng)遠(yuǎn)，因此，進(jìn)行了進(jìn)一步探討。
由于已知在培養(yǎng)基中如事先加入色氨酸，則其菌體量就會(huì)增加，因此我們決定在基本培養(yǎng)基中添加色氨酸來(lái)抑制trp啟動(dòng)子的工作，以圖增加菌體量。又由于已知，此時(shí)在培養(yǎng)基中如殘存有色氨酸，則在添加IAA時(shí)就會(huì)阻礙trp啟動(dòng)子的工作，因此可望，在添加IAA時(shí)，色氨酸已被分解。
另一方面，甘油與葡萄糖不一樣，它不能形成對(duì)分解代謝產(chǎn)物的抑制。另外還知道在分解代謝產(chǎn)物的抑制被解除時(shí)，產(chǎn)生了色氨酸酶(色氨酸分解素)，因而分解了大腸桿菌內(nèi)的色氨酸。
所以在添加的培養(yǎng)基中，不是采用葡萄糖，而決定采用甘油。由此可期待如下機(jī)理，即存在于基本培養(yǎng)基中的葡萄糖被耗盡時(shí)，對(duì)分解代謝產(chǎn)物的抑制被解除，而產(chǎn)生色氨酸酶，色氨酸消失，trp啟動(dòng)子的工作開始進(jìn)行。
此外，還使所添加的培養(yǎng)基的添加速度也隨大腸桿菌的繁殖進(jìn)行變化，進(jìn)行了細(xì)致的研究。
實(shí)施例3Fed-Batch法之二除在基本培養(yǎng)基中加入色氨酸，以使其濃度達(dá)到30mg/l之外，使培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件均與實(shí)施例1相同，從3小時(shí)后開始添加培養(yǎng)基(含有5g/l酷蛋白氨基酸、200g/l甘油、10mg/l維他命B1、100mg/氨必西林、5mg/lIAA的M9培養(yǎng)基)，4小時(shí)之后添加了IAA。又，由于過剩量的IAA會(huì)阻礙大腸菌的繁殖與hEGF的產(chǎn)生，因此只加入到5mg/l。
在培養(yǎng)基的添加中，使用了P1管式泵(フアルマシヤ公司制造)、個(gè)人用計(jì)算機(jī)(9801VX41，日本電器公司制造)。對(duì)添加速度，是以添加過程中總計(jì)可變化49次那樣編制了程序。大腸桿菌的繁殖與hEGF的產(chǎn)生量顯示在圖7。
從大腸桿菌的繁殖速度將降低的5小時(shí)之后起，hEGF開始產(chǎn)生，24小時(shí)以后，hEGF的產(chǎn)生量達(dá)到70mg/l。另外，菌體的繁殖也增加到OD550的9。
從以上結(jié)果得知，hEGF的產(chǎn)生量是隨著菌體量的增加而增加的。
因此，為了進(jìn)行更高密度的培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基組成、添加時(shí)期進(jìn)行詳細(xì)的研究。具體說來(lái)，在培養(yǎng)基中加入宿主大腸桿菌的繁殖所必須的氨基酸，在中途把添加培養(yǎng)基中的碳源由葡萄糖變更為甘油。
如上所述，在葡萄糖的存在下，色氨酸會(huì)伴隨著大腸桿菌的繁殖而被消耗，但并不會(huì)因?yàn)樯彼崦付环纸?。于是，在最初的添加培養(yǎng)基中事先加入葡萄糖與色氨酸，一邊抑制trp啟動(dòng)子的工作，一邊使大腸桿菌充分繁殖，然后添加IAA，同時(shí)把添加培養(yǎng)基變更為含有甘油的物質(zhì)，分解殘存的色氨酸，以加強(qiáng)IAA的作用，增加hEGF的產(chǎn)生量。
實(shí)施例4Fed-Batch法之三采用與上述同樣的Fed-Batch法，進(jìn)行了以下的培養(yǎng)。
(1)培養(yǎng)基組成①基本培養(yǎng)基在M9培養(yǎng)基中加入以下物質(zhì)2.5g/l酷蛋白氨基酸、10g/l葡萄糖、50mg/l色氨酸、0.5g/l脯氨酸、1.0g/l亮氨酸、10mg/l維他命B1、10mg/l氨必西林、微量金屬鹽。
②添加培養(yǎng)基1在M9培養(yǎng)基中加入以下物質(zhì)
40g/l酷蛋白氨基酸、300g/l葡萄糖、50mg/l色氨酸、5g/l脯氨酸、5g/l亮氨酸、10mg/l維他命B1、100mg/l氨必西林、微量金屬鹽。
③添加培養(yǎng)基2在M9培養(yǎng)基中加入以下物質(zhì)40g/l酷蛋白氨基酸、300g/l甘油、5g/l脯氨酸、5g/l亮氨酸、10mg/l維他命B1、100mg/l氨必西林、微量金屬鹽。
(2)培養(yǎng)條件質(zhì)粒(宿主)為pBT23(HB101)培養(yǎng)容量(基本培養(yǎng)基1添加培養(yǎng)基1添加培養(yǎng)基2)為51+0.51+1.01。
培養(yǎng)溫度為37℃，pH為7.0。
通氣量為1.5vvm(7.51/分鐘)攪拌速度為900rpm。
消泡過程為自動(dòng)進(jìn)行(通過滴入硅系消泡劑來(lái)進(jìn)行)。
培養(yǎng)基添加時(shí)期添加培養(yǎng)基1是在培養(yǎng)開始后的0.5-6小時(shí)之內(nèi)(添加速度可變);添加培養(yǎng)基2是在培養(yǎng)開始后的6-24小時(shí)之內(nèi)(添加速度一定。50ml/小時(shí))。
IAA的添加時(shí)期規(guī)定為培養(yǎng)開始的6小時(shí)之后，IAA的濃度為5mg/l。
前培養(yǎng)的培養(yǎng)基規(guī)定與基本培養(yǎng)基相同。
植菌量規(guī)定為10%。
添加培養(yǎng)基1的供給速度是以添加過程中合計(jì)變化20次那樣編制了程序。大腸桿菌的繁殖與hEGF的產(chǎn)生量顯示在圖8。
24小時(shí)后的OD550為42，達(dá)到了培養(yǎng)的高密度化，于是獲得160mg/l的hEGF產(chǎn)生量。
4.附圖的簡(jiǎn)要說明圖1顯示了本發(fā)明所涉及的trp啟動(dòng)子、SD的序列、大腸桿菌堿性磷酸酶信號(hào)肽遺傳因子的序列。
圖2顯示了本發(fā)明所涉及的hEGF遺傳因子的序列。
圖3顯示了本發(fā)明所涉及的發(fā)現(xiàn)分泌質(zhì)粒的制備過程。
圖4顯示了本發(fā)明所涉及的發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒pBT23的HindⅢ-BamHⅠ斷片的序列。
圖5顯示了實(shí)施例1的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)?！癖硎景l(fā)酵罐中的培養(yǎng);■表示燒杯中的培養(yǎng)。
圖6表示實(shí)施例2的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)?！癖硎景l(fā)酵罐中的培養(yǎng);■表示燒杯中的培養(yǎng)。
圖7表示了實(shí)施例3的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)以及菌體量(用OD550表示)。○表示菌體量，●表示hEGF量。
圖8表示了實(shí)施例4的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))、縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)、以及菌體量(用OD550表示)?！鸨硎揪w量、●表示hEGF量。
權(quán)利要求
1.一種hEGF的制法是由以下一系列操作構(gòu)成的遺傳工程方法，即(1)把對(duì)所需物質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳因子組建到載體，(2)使用該載體對(duì)宿主大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，(3)對(duì)如此獲得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，(4)通過從培養(yǎng)液中的回收來(lái)獲得所需物質(zhì)，其特征在于(a)所需物質(zhì)為hEGF；(b)在上述(1)的操作中，于hEGF遺傳因子之上流領(lǐng)域組建對(duì)色氨酸(trp)合成酶系遺傳因子的啟動(dòng)子進(jìn)行編碼的遺傳因子以及對(duì)大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的信號(hào)肽進(jìn)行編碼的遺傳因子，而在下流領(lǐng)域中組建連續(xù)了的2個(gè)終止密碼子以及復(fù)制終止區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hEGF制法，其特征是通過在培養(yǎng)時(shí)添加3-吲哚丙烯酸(IAA)，對(duì)宿主大腸桿菌產(chǎn)生hEGF的時(shí)期及量進(jìn)行控制。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的hEGF的制法，其特征是培養(yǎng)方法是使用在添加速度上下了功夫的Fed-Batch法的高密度培養(yǎng)方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hEGF的制法，其特征是在Fed-Batch法中，作為要添加的培養(yǎng)基的碳源是采用葡萄糖、甘油或葡萄糖與甘油的組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hEGF的制法，其特征是在Fed-Batch法中，作為要添加的培養(yǎng)基的碳源是使用葡萄糖之后再使用甘油。
全文摘要
一種作為遺傳工程方法的hEGF制法，其特征是在載體中組建能對(duì)hEGF進(jìn)行編碼的遺傳因子，于hEGF遺傳因子之上流領(lǐng)域組建能對(duì)色氨酸合成酶系遺傳因子的啟動(dòng)子進(jìn)行編碼的遺傳因子以及能對(duì)大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子信號(hào)肽進(jìn)行編碼的遺傳因子，而在下流領(lǐng)域中組建連續(xù)了的2個(gè)終止密碼子以及復(fù)制終止區(qū)。
文檔編號(hào)C07K14/485GK1039843SQ8910457
公開日1990年2月21日 申請(qǐng)日期1989年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1988年7月15日
發(fā)明者矢野純一, 村井正俊 申請(qǐng)人:日本新藥株式會(huì)社