專利名稱：抗聚集肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制血小板聚集的新型肽，含有該肽的藥劑組合物，以及使用該肽的方法。特別是發(fā)明了將本發(fā)明的肽與血纖維蛋白溶解劑結(jié)合使用的方法。
血栓是引發(fā)凝結(jié)級聯(lián)反應(yīng)過程的結(jié)果，它由絆在血纖維蛋白聚合網(wǎng)上的血小板聚集體所組成。該過程通常由于組織損傷而引發(fā)，并產(chǎn)生減慢或阻止管中血液流動的影響。與組織損傷沒有直接關(guān)系的病原因子，如動脈粥樣化血小板，血組織的炎癥(靜脈炎)和敗血癥，也可引發(fā)血栓的形成。在某些情況下，血栓的不正常形成，隨之血液流動減慢，可能產(chǎn)生病態(tài)的后果，如中風(fēng)、肺栓塞和心臟病。
凝結(jié)級聯(lián)反應(yīng)是一個(gè)多因子過程，在該過程的倒數(shù)第二步驟中產(chǎn)生蛋白水解酶，凝血酶，這些酶在兩個(gè)特別的Arg-Gly基上水解血纖維蛋白原形成兩個(gè)更小的纖維蛋白肽和纖維蛋白單體。通過除去纖維蛋白肽，兩個(gè)互補(bǔ)的結(jié)合部位暴露出來，每個(gè)纖維蛋白單體都能結(jié)合兩個(gè)其它的單體而形成聚合網(wǎng)。血小板同樣被凝血酶激活，并能結(jié)合血纖維蛋白原和纖維蛋白單體。通過釋放其它的聚集激活劑，這些血小板進(jìn)一步放大該過程。由于纖維蛋白的聚合，血液中聚集的沉淀物則形成所謂的軟凝塊。纖維蛋白穩(wěn)定因子(FSF)是一種同樣由凝血酶激活的酶，它催化共價(jià)交聯(lián)的形成而形成最終的硬凝塊。
血小板在血栓形成中起主要作用。血栓形成主要通過稱為GPIIb-IIIa的血小板接受體復(fù)合物的傳遞。VonWillebrand因子(一種血漿蛋白)和血纖維蛋白原能夠結(jié)合，并在相鄰的血小板上交聯(lián)GpIIb-IIIa接受體，因此影響血小板的聚集。纖維結(jié)合素，Vitronectin，和血栓凝血酶均為已被證明能與GPIIb-IIIa結(jié)合的蛋白質(zhì)，在血漿中發(fā)現(xiàn)纖維結(jié)合素作為一種細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和GPIIb-IIIa之間的結(jié)合可能起著引起血小板粘接在損傷的組織壁上。
纖維結(jié)合素和Vitronectin是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)類中的幾種，該結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)能擴(kuò)大細(xì)胞附著功能的范圍，這些蛋白質(zhì)中的某些蛋白質(zhì)(特別是纖維結(jié)合素)的細(xì)胞附著部位中的氨基酸序列已經(jīng)闡明了作為引發(fā)結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)部分的序列為Arg-Gly-Asp(單字母氨基酸密碼為RGD)。參見Ruoslahti等，Science，238，491-7(1987)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)具有細(xì)胞附著性質(zhì)的多肽能由人的血漿纖維結(jié)合素制備(Pierschbacher等，美國專利4，589，881(1986)和Rouslahti等，Wo84/00540(1984))。當(dāng)采用溶液化形式固定固體支撐物和抑制這些細(xì)胞對纖維結(jié)合素的附著時(shí)，對于正常的鼠腎(NRK)來說，同樣包含有這種順序的低肽已表明具有細(xì)胞附著性能，參見Rouslahti等，美國專利4，578，079(1986)和Rouslahti等，美國專利4，614，517(1986)。
為了使GPIIb-IIIa結(jié)合到血纖維蛋白原上，纖維結(jié)合素和VonWillebrand因子上血小板的激活作用是必需的。盡管準(zhǔn)確的機(jī)制還不清楚，但是血小板的ADP或凝血酶的刺激作用似乎改變接受體復(fù)合物和促進(jìn)結(jié)合。對于血小板聚集來說這種接受體的重要性已被采用掩蔽該接受體的方法所證實(shí)。于是，Coller等(Blood，66，1456-9(1985))證明了這種復(fù)合物的抗體能抑制在狗體上用ADP誘導(dǎo)產(chǎn)生的血小板的聚集。Nievelstein等(ThrombandHemostasvs，58，2133(1987))報(bào)告了-RGDS-肽能抑制誘導(dǎo)血小板聚集和粘接成纖維結(jié)合素的凝血酶，并可通過GPIIb-IIIa復(fù)合物發(fā)生相互作用。Zimmerman等，美國專利4，683，291(1987)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有Arg和Lys及一種-RGD-順序的肽能抑制形成血小板與血纖維蛋白原的結(jié)合和抑制血小板的聚集。
現(xiàn)在的抗血栓形成療法是使用調(diào)節(jié)血小板或內(nèi)皮細(xì)胞花生四烯酸鹽-前列腺素體系的制劑，如前列環(huán)素類似物，環(huán)裂氧合酶抑制劑，凝血惡烷合成物抑制劑和凝血惡烷接受體拮抗物，及抗凝血劑，如肝素，這些制劑抑制血小板聚集的兩個(gè)能獨(dú)立階段的一個(gè)或二個(gè)。反映化學(xué)刺激素，如ADP(腺苷二磷酸)，膠原蛋白，腎上腺素或凝血酶的初次階段引起血小板初步激活。接著進(jìn)行第二階段，該階段由血小板自身引發(fā)，其特征在于凝血惡烷A2(TxA2)的合成和從血小板貯存粒劑中釋放出另外的ADP。這些介質(zhì)進(jìn)一步激活其它的血小板。
前列環(huán)素，也稱為前列腺素I2(PGI2)，是由排列在血液組織壁上的內(nèi)皮細(xì)胞自然形成的。PGI2提高了血小板的CAMP，這導(dǎo)致GPIIb-IIIa接受體調(diào)節(jié)能力降低，因此抑制了無傷血組織中傳遞血小板聚集和血小板激活的血纖維蛋白原，PGI2和穩(wěn)定的PGI2類似物抑制血小板聚集的初級階段和第二階段。然而，如此類似物的使用與血壓的不良變化相聯(lián)系，參見Aiken等，Prostaglandins，19，629-43(1980)。
環(huán)裂氧合酶為負(fù)責(zé)前裂腺素的合成酶，如PGI2和PGH2。PGH2通過凝血惡烷合成酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成TxA2。TxA2為一種血小板聚集的強(qiáng)激活劑。環(huán)裂氧合酶抑制劑和凝血惡烷合成酶抑制劑起著阻斷TxA2生成的作用，而通過結(jié)合TxA2接受體，TxA2拮抗物阻斷TxA2的作用。所有這些療法僅作用于血小板激活作用的第二階段。由于環(huán)裂氧合酶抑制劑抑制PGI2的合成，環(huán)裂氧合酶抑制劑存在另外的缺點(diǎn)，它稍微排除PGI2生成的正抗聚集作用。環(huán)裂氧合酶抑制劑的使用與潰瘍病有關(guān)。
肝素是一種與凝血酶原結(jié)合的粘多糖，且在凝結(jié)級聯(lián)反應(yīng)中有一定的其它因子。它通過凝血酶阻止血纖維蛋白原的激活和通過凝血酶阻止GPIIb-IIIa接受體的激活而產(chǎn)生作用。這僅抑制血小板聚集的初始階段，通過其它方式如膠原蛋白，ADP和腎上腺素對血小板的激活的影響很小。
因此環(huán)裂氧合酶抑制劑前列腺素類似物和肝素都能通過間接抑制血小板或纖維蛋白原激活的初始階段和第二階段而非直接抑制血小板聚集。因此需要選擇能直接消除血小板聚集的治療藥物，而不管它影響血小板激活的初始階段和第二階段。
動脈閉塞和深靜脈血栓形成的療法的最近進(jìn)展是使用纖維蛋白溶解劑溶解血栓或栓子以便恢復(fù)或改善血液流動。纖維蛋白溶解劑為蛋白質(zhì)水解酶，它在特別部位水解纖維蛋白而分裂成纖維蛋白網(wǎng)，纖維蛋白分裂成低肽有增溶血栓或栓子的作用。在本公開文本中，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(tpA)，尿激酶(UR)和前尿激酶(PUK)(為人體源)及鏈激酶(SK)(為細(xì)菌源)作為纖維蛋白溶解劑。在體內(nèi)它們的作用是激活在血液中的蛋白質(zhì)水解的血纖維蛋白溶酶原而形成血纖維蛋白溶酶，血纖維蛋白溶酶實(shí)際上是纖維蛋白溶解劑。當(dāng)然，tpA和SK普通用于纖維蛋白溶解療法，然而如此療法的復(fù)發(fā)問題是由于第二階段的血栓的形成而血管再阻塞。
纖維蛋白溶解療法普遍用于在形成血栓的血管中再次建立流動。這對于經(jīng)常馬上引起阻滯的血栓的溶解來說是有用的，然而，纖維蛋白溶解療法不能使引起血栓引發(fā)的因子逆轉(zhuǎn)。由于這種原因，抗凝血劑(如肝素)常用于防止再阻塞。事實(shí)上，甚至在再次灌注了高劑量的肝素后，動脈高度狹窄的病人還是處于再次形成血栓的極端危險(xiǎn)之中，參見Gold等，Circ，73，347-52(1986)。另外，SK和tpA的使用與血小板聚集過多有關(guān)，參見Ohlstein等，ThrombRes.，4，575-85(1987)。用高劑量tpA治療與系統(tǒng)出血有關(guān)，該療法沒有推薦用于防止再阻塞，因此，在纖維蛋白溶解療法之后，需要有一種防止再次形成血栓的方法。
最近的TxA2拮抗劑表明有希望在再次灌注后抑制再阻塞和降低纖維蛋白溶解所需的tPA劑量，參見未審定的美國專利申請?zhí)?17，122。Yasuda等(Clin.Res.，34，2(1986))已經(jīng)證明在用TPA溶解血栓后由纖維蛋白富集血小板血栓的再阻塞可通過鼠對狗的GPIIb-IIIa單克隆抗體得到抑制。
本發(fā)明的目的是提供一種抑制血小板聚集和血栓形成的方法，該方法是使用結(jié)合在血小板GPIIb-IIIa接受體上的肽或多肽。用這種方法能抑制激活的血小板與VonWillebrand因子，纖維結(jié)合素和纖維蛋白原/纖維蛋白的結(jié)合能力。這種抗聚集活化方式是獨(dú)特的，它不僅僅依賴于抑制聚集過程的刺激，而且它干擾眾所周知的具有刺激的最后階段。因?yàn)槭峭ㄟ^非類似的方法進(jìn)行另外的抗血栓形成/抗促凝，所以如此肽或多肽被稱為“抗纖維變性”以區(qū)別于現(xiàn)在的機(jī)械和結(jié)構(gòu)的方法。
本發(fā)明的一個(gè)方面為(Ⅰ)或(Ⅱ)式化合物或它們的藥理可接受鹽
其中A為Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Ala，Gly，His，Abu或它們的α-R′取代衍生物，或Pro;
B為Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg或它們的α-R′取代衍生物。
C為一種從Tyr，(Alk)Tyr，Phe，(4′W)Phe，HPhe，Phg，Trp，His，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，Cys，(Alk)Cys，Pen，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;
W為鹵素或Alk;
Y為NR1R2或OR3;
R1和R2彼此獨(dú)立地為H，Alk或(CH2)PPh;
R3為Alk，(CH2)PPh，當(dāng)B為HArg，(Me2)Arg;(Et2)Arg)或Arg，HArg，(Me2)Arg或(Et2)Arg的α-R′取代衍生物時(shí)，R3為H;
X為R4R5N;
R4為H或Alk;
R5為H，Alk，HCo，AlkCO，PhCH2或Ph(CH2)qCO，R′為Alk或PhCH2;
q，m和n為0或1;以及P為0，1，2或3。
(Ⅱ)其中，A′為一種從Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Ala，Gly，His，Abu，Lys或它的α-R′取代衍生物，或Pro中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;
B′為一種從Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Lys或它們的α-R′取代衍生物中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;
C′為一種從Tyr，(Alk)Tyr，Phe，(4′W)Phe，Hphe，Phg，Trp，His，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，(Alk)Cys，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal，或它們的α-R′取代衍生物中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;
W為鹵素或Alk;
Y為NR1R2或OR3;
R1和R2彼此獨(dú)立地為H，Alk或(CH2)PPh;
R3為Alk，(CH2)PPh，當(dāng)B為HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg或Arg，HArg，(Me2)Arg或(Et2)Arg的α-R′取代衍生物時(shí)，R3為H;
X為R4R5N或H;
R4為H或Alk;
R5為H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH2或Ph(CH2)qCO;
R′為Alk或PhCH2;
Z1為Cys，Pen或APmp的右旋或左旋異構(gòu)體;
Z2為Cys，Pen或Apmp的右旋或左旋異構(gòu)體;
q，m和n獨(dú)立地為0或1;以及p為0，1，2或3。
本發(fā)明也為一種抑制血小板聚集和血塊形成的藥理可接受的組合物，該組合物由一種抗纖維變性肽和一種藥用載體組成。
另外，本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動物血栓形成或栓塞及抑制哺乳動物血小板聚集或血塊形成的方法，它包括內(nèi)服有效劑量的式(Ⅰ)或式(Ⅱ)抗纖維變性肽。
本發(fā)明的化合物，以及可通過同樣機(jī)理起作用的其它化合物在纖維蛋白溶解療法中防止血栓形成也是特別有用的。因此，另一方面，本發(fā)明的目的是提供一種在血栓溶解后抑制哺乳動物的動脈或靜脈的再阻塞的方法，它包括內(nèi)服有效劑量的纖維蛋白溶解劑和抗纖維變性肽。結(jié)合已知的纖維蛋白溶解酶，如鏈激酶(SK)，尿激酶(UK)，前尿激酶(PUK)和組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(tpA)和它們的變異體或突變體，上述的肽對抑制血栓的再次形成是有用的。另外，某些含有氨基酸序列-RGD-的其它肽和多肽也可用于本發(fā)明，特別是某些VonWillebrand因子，人血漿纖維蛋白原和人血漿纖維結(jié)合素的碎片或衍生物。
本發(fā)明也包括一種影響血栓溶解和再注入及抑制哺乳動物動脈或靜脈再阻塞的藥劑組合物，它包括藥劑載體上的纖維蛋白溶解劑和抗纖維變性肽。
最后，本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)血栓療法而采用一套工具。它包括在一個(gè)容器中纖維蛋白溶解劑，在第二個(gè)容器中抗纖維變性肽。
圖1表明在體內(nèi)肽AC-RGDS-NH2對tpA促進(jìn)人血塊溶解沒有影響，曲線表明4小時(shí)血塊溶解的百分?jǐn)?shù)為組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(tpA)濃度增加的函數(shù)。方塊表示在控制時(shí)期(EC50＝31.5±9.9μg/ml)tpA(MT2N3)誘導(dǎo)溶解，圓圈表示在有tpA和1mM Ac-RGDS-NH2(EC50＝31.9±8.6μg/ml)存在下的溶解。
圖2表明以0.1ml/min速度輸入400mM AC-RGDS-NH2抑制體內(nèi)血小板聚集，血小板聚集/血栓形成由血液流動的減慢來表示。箭頭表示輸液的開始和結(jié)束。SL(解除振動)表明血栓的機(jī)械不沉淀。上面曲線(a)表明冠狀動脈血壓(mmHg)為時(shí)間的函數(shù)，并表明AC-RGDS-NH2的加入對血壓沒有影響。中間曲線(b)表明階段冠狀血流(ml/min)的變化為時(shí)間的函數(shù)，并表明在加入了肽后抑制了血栓的形成。下面曲線(c)表明平均冠狀血流(ml/min)為時(shí)間的函數(shù)，并表明在加入了肽后抑制血栓的形成。
圖3表明在體內(nèi)抑制用冠狀血栓形成模型產(chǎn)生的血小板聚集所需劑量的關(guān)系。曲線表明平均冠狀血液流動為時(shí)間的函數(shù)，箭頭表示AC-RGDS-NH2加入的開始和結(jié)束，血栓的形成通過血液流動的減慢來表示，SL(解除振動)表示血栓的機(jī)械不沉淀，X表示血栓自發(fā)溶解。上面曲線表示完全抑制了血栓形成(400mM，以0.052ml/min速度加入)。中間曲線表示血栓自發(fā)溶解的中等抑制(在0.026ml/min下400mM)，下面曲線(C)表示延長時(shí)間至完全阻塞的部分抑制(在0.013ml/min下400mM)，這需要血栓機(jī)械不沉淀。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些肽能抑制血小板的聚集。如此肽被認(rèn)為能與血小板上的接受體相互作用，特別是通過GPIIb-IIIa復(fù)合物，它能夠結(jié)合在內(nèi)源的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(如纖維結(jié)合素和Vitronectin)的廣泛范圍上。因此，血組織內(nèi)膜的損傷，破裂或紊亂暴露出了細(xì)胞外基質(zhì)隱蔽的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，能夠證明血小板可通過GPIIb-IIIa接受體結(jié)合在組織壁上。此外，現(xiàn)已表明纖維蛋白原/纖維蛋白和Von Willebrand因子能與血小板上的GPIIb-IIIa接受體復(fù)合物發(fā)生相互作用。通過GPIIb-IIIa接受體的多價(jià)結(jié)合促進(jìn)血小板的聚集，隱藏這些蛋白質(zhì)的結(jié)合部位將干擾血小板接受體和纖維蛋白質(zhì)，Von Willebranel因子及纖維結(jié)合素間粘著相互作用。纖維結(jié)合素的活性片斷的分析表明了含氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD)的纖維結(jié)合素的結(jié)合部位。此外，它還表明含有這種序列的肽能夠抑制細(xì)胞對纖維結(jié)合素的附著，并抑制Von Willebrands因子和纖維蛋白原結(jié)合在血小板上。因此，天然存在多肽片斷和這些片斷的衍生物能抑制血小板聚集。單克隆抗體的F(ab′)2片斷(Coller等，Blood，66，1456-9(1985))和人血漿纖維結(jié)合素的肽片斷(Rouslahti等，PCT WO 84/00540(1984)和Pierschbacher等，美國專利4，589，881(1986))能夠與GPIIb-IIIa接受體結(jié)合。
本發(fā)明公開了由序列Gly-Asp構(gòu)成的肽，該肽能與血小板GPIIb-IIIa接受體結(jié)合，因此能抑制血小板聚集。本發(fā)明的一個(gè)方面是通過選擇合適的鄰近氨基酸和在這種序列中取代Arg改變RGD序列的構(gòu)象以便促進(jìn)肽與血小板的結(jié)合。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過乙?；蛲榛Ｗo(hù)肽的末端氨和修改作為酰胺、取代酰胺或酯的末端羧基。這些修改增強(qiáng)了肽對蛋白質(zhì)水解酶的穩(wěn)定性和將它們從以前使用的增強(qiáng)細(xì)胞粘接的化合物中分辨出來(Rouslahti等，美國專利4，578，079(1986)和Rouslahti等，美國專利4，614，517(1986))和抑制血小板聚集(Zimmerman等，美國專利4，683，291(1987))。本發(fā)明的某些肽含有分子內(nèi)二硫鍵，該鍵既能增強(qiáng)它們的代謝的穩(wěn)定性又能增強(qiáng)它們的生物活性。
本發(fā)明的化合物為式(Ⅰ)和(Ⅱ)的三，四，五，六和七肽或其藥理可接受的鹽
其中A為Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Ala，Gly，His，Abu或它的α-R′取代衍生物，或Pro;
B為Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg或它的α-R′取代衍生物;
C為從Tyr，(Alk)Tyr，Phe，(4′W)Phe，Hphe，Phg，Trp，His，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，Cys，(Alk)Cys，Pen，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal中選擇出來的左旋或右旋氨基酸;
W為鹵素或Alk;
Y為NR1R2或OR3;
R1和R2為彼此獨(dú)立的H，Alk或(CH2)PPh;
R3為Alk，(Ch2)PPh，當(dāng)B為HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg或Arg，HArg，(Me2)Arg或(Et2)Arg的α-R′取代衍生物時(shí)，R3為H;
X為R4R5N;
R4為H或Alk;
R5為H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH2或Ph(CH2)qCO;
R′為Alk或PhCH2;
q，m和n為0或1;以及p為0，1，2或3。
合適的A為Gly或Arg，當(dāng)m為1時(shí)，合適的n為0，合適的B為HArg或Arg和HArg的α-R′取代衍生物，優(yōu)選的B為MeArg，合適的C為Ser，(Me)Ser，Thr，Tyr，Phe，Val或Nal。當(dāng)n為1時(shí)，合適的m為0;
本發(fā)明的化合物也為式(Ⅱ)的五，六和七肽或其藥理可接受的鹽
(Ⅱ)其中A′為一種從Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Ala，Gly，His，Abu，Lys或它的α-R′取代衍生物，或Pro中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;
B′為一種從Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Lys或它的α-R′取代衍生物中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;
C′為一種從Tyr，(Alk)Tyr，Phe，(4′W)Phe，HPhe，Phg，Trp，His，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，(Alk)Cys，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal，或它的α-R′取代衍生物中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;
W為鹵素或Alk;
Y為NR1R2或OR3;
R1和R2彼此獨(dú)立地為H，Alk或(CH2)PPh;
R3為Alk，(CH2)PPh，當(dāng)B為HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg或Arg，HArg，(Me2)Arg或(Et2)Arg的α-R′取代衍生物時(shí)，R3為H;
X為R4R5N或H;
R4為H或Alk;
R5為H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH2或Ph(CH2)qCO;
R′為Alk或PhCH2;
Z1為Cys，Pen或APmp的右旋或左旋異構(gòu)體;
Z2為Cys，Pen或APmp的右旋或左旋異構(gòu)體;
q，m和n獨(dú)立地為0或1;以及P為0，1，2或3。
合適的A′為Gly或Arg，當(dāng)m為1時(shí)，n優(yōu)選為0。
合適的B′為HArg或Arg及HArg的α-R′取代衍生物，B′優(yōu)選為MeArg。
合適的C′為Ser，(Me)Ser，Thr，Tyr，Phe或Nal。當(dāng)n為1時(shí)，m宜為0。
Z2優(yōu)選為APmp，Cys或Pen的左旋異構(gòu)體。
優(yōu)選的m和n均為0。
于此描述的在式中X的意思是欲表示肽的末端氨基，而區(qū)別于常規(guī)。當(dāng)X為H時(shí)，Z1應(yīng)為脫氨基酸，例如，當(dāng)Z1為Cys和X為H時(shí)，相應(yīng)于脫氨基半胱氨酸的殘基為3-巰基丙酸。
本發(fā)明的具體化合物為Nα-Ac-Cyclo(S，S) Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S) Cys-Arg-Gly-Asp-(D，L)APmp-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S) Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;
Cyclo(S，S)Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(Me)Ser-Cys-NH2;
Cyclo(S，S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2;
Cyclo(S，S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEtNα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg(Et2)-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;
Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH2;
Nα-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH2-CH2-C6H5Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH2;
NαAc-HArg-Gly-Asp-Ser-NH2;
Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;
Nα-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;
Nα-Formyl-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;或Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;
在該技術(shù)領(lǐng)域中常用的名稱在此用于描述肽。
三字母單字母氨基酸三字母符號單字母符號氨基酸符號符號丙氨酸AlaA異亮氨酸IleI精氨酸ArgR亮氨酸LeuL天冬酰胺AsnN賴氨酸LysK天冬氨酸AspD蛋氨酸MetMAsn和/或AspAsxB苯丙氨酸PheF半胱氨酸CysC脯氨酸ProP谷氨酸胺GlnQ絲氨酸SerS谷氨酸GluE蘇氨酸ThrTGln和/或GluGlxZ色氨酸TrpW甘氨酸GlyG酪氨酸TyrY組氨酸HisH纈氨酸ValV根據(jù)習(xí)慣表示，氨基末端位于左邊，羥基末端位于右邊。除非另有說明，所有的手性氨基酸(AA)都被假定為左旋絕對構(gòu)型。Pen表示L-青霉胺或β，β-二甲基半胱氨酸，APmp表示2-氨基-3，3-環(huán)戊亞甲基-3-巰基丙酸，Mpa表示3-巰基丙酸，Pmp表示3，3-環(huán)戊亞甲基-3-巰基丙酸，Mdp表示3-巰基-3-甲基丁酸，HArg表示高精氨酸，(Me2)Arg表示N′，N′-二甲基精氨酸，(Et2)Arg表示N′N-二乙基精氨酸，Nva表示正纈氨酸，Nle表示正亮氨酸，α-MeAsp表示Nα-甲基天冬氨酸，Nal表示，β-2-萘基丙氨酸，Phg表示苯基甘氨酸，Hphe表示高苯基丙氨酸，Trp表示色氨酸，Abu表示2-氨基丁酸，(Alk)Tyr表示O-C1-4烷基-酪氨酸，(Alk)Ser表示O-C1-4烷基-絲氨酸，(Alk)Thr表示O-C1-4烷基-蘇氨酸，(Alk)Cys表示S-C1-4烷基半胱氨酸，(Alk)Pen表示S-C1-4烷基青霉胺，(4′W)Phe表示在苯環(huán)的4位上用W取代的苯丙氨酸，Boc表示t-丁基氧羰基，F(xiàn)moc表示芴基甲氧羰基，Ph表示苯基，cbz表示碳芐氧基，Brz表示O-溴芐基氧羰基，Clz表示O-氯芐氧羰基，Bzl表示芐基，4-MBzl表示4-甲基芐基，Ac表示乙酰基，Alk表示C1-4的烷基，Ph表示苯基，Chx表示環(huán)己基，DCC表示二環(huán)己基碳化二亞胺，DmAp表示二甲基氨基吡啶，HOBT表示1-烴基苯并三唑，THF表示四氫呋喃，DMF表示二甲基甲酰胺，HF表示氫氟酸，TFA表示三氟乙酸。應(yīng)用于此的1-4個(gè)碳原子的烷基意味著包括甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基和異丁基。
本發(fā)明的氨基酸的α-R′取代衍生物(可用(α-R′)AA表示)表示在α-氨基上用R′單取代的氨基酸，其中R′為Alk或芐基。R′優(yōu)選為甲基。Nα-甲基精氨酸和Nα-甲基甘氨酸分別為(α-Me)Arg和(α-Me)Gly，為了與以前通用符號一致也用MeArg和Sar(肌氨酸)表示。所有其它N-α-取代氨基酸在它們的表示符號中將帶有α-標(biāo)志。因此，可在硫醇，胍基或羥基上烷基化的氨基酸，如Tyr，Ser，Thr，Cys或Pen由于沒有該符號而辨別出來。所以，(α-Me)Ser為Nα-甲基絲氨酸，(Me)Ser為O-甲基絲氨酸，(α-Me，Et)Ser為Nα-甲基，O-乙基絲氨酸以及(α-Me，Et2)Arg為Nα-甲基-N′，N″-二乙基精氨酸。
用MerriJield的固相技術(shù)(J.Am.Chem.Soc，85，2149(1964))制備肽的方法為優(yōu)選的，盡管用已知的溶液方法也是可以成功的。也可結(jié)合使用固相和溶液合成方法，如在聚集合成中，通過固相合成可制備二，三，四或五肽的片段，通過溶液合成或結(jié)合或進(jìn)一步變更。Ali等在J.Med.Chem，29，984(1986)和J.Med.Chem，30，2291(1987)上發(fā)表了使用一般合成肽的方法制備本發(fā)明的大多數(shù)肽，在此提出該方法作為參考。
正如肽技術(shù)中所知的，每一種氨基酸或肽都應(yīng)適當(dāng)保護(hù)。例如，Boc，Cbz或Fmoc基團(tuán)可用來保護(hù)氨基，特別是α-氨基。Boc基團(tuán)通常最好用來保護(hù)α-氨基。芐基或合適的取代芐基用于保護(hù)半胱氨酸的巰基或氨基酸中的其它硫羥基，或絲氨酸及蘇氨酸的羥基。甲苯磺?；脕肀Ｗo(hù)His的咪唑基，甲苯磺酰基或硝基用來保護(hù)Arg的胍基氮。合適的取代芐氧羰基或芐基可用于保護(hù)Tyr，Ser，或Thr的羥基或賴氨酸的ε-氨基。鄰苯二甲酰胺基可用于保護(hù)賴氨酸的ε-氨基。保護(hù)基團(tuán)芐氧羰基或芐基的合適的取代基為用氯、溴、硝基或甲基取代的鄰和/或?qū)θ〈?，并用來改變保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)性。半胱氨酸和其它的含硫氨基酸也可通過用硫代烷基或硫代芳基形成二硫化物得到保護(hù)。除了Boc基外，最常用的保護(hù)基團(tuán)是通過中等酸處理而不能除去的那些基團(tuán)，這些保護(hù)基團(tuán)可通過已知的方法如催化氫化，在液態(tài)氮中的鈉或HF處理而除去。
如果使用固相方法，則從羧基末端開始朝肽的氨基末端進(jìn)行順序合成肽。固相合成開始于被保護(hù)的氨基酸的C末端共價(jià)地連接在合適的樹脂上，如二苯甲基胺樹脂(BHA)，甲基二苯甲基胺樹脂(MBHA)或氯甲基酯(CMR)，如在美國專利4，244，946中所公開的。如果產(chǎn)物肽的羧基末端為羧酰胺則使用BHA或MBHA支撐樹脂，如果產(chǎn)物肽的羥基末端為羥基則一般用CMR支撐，盡管這也可能被用來生產(chǎn)羧酰胺或酯。
一旦第一保護(hù)的氨基酸(AA)偶聯(lián)在所希望的樹脂上，則通過中等酸處理而水解氨基，第二保護(hù)的AA的自由羧基偶合在此氨基上，該過程可按順序完成，沒有中間體的離析，直至形成所希望的肽。然后按順序?qū)⑼瓿傻碾膹闹蔚臉渲厢尫藕?或裂解出來。
用含水乙醇中的堿處理CMR支撐的肽將肽從樹脂中分離出來并產(chǎn)生了作為一種羧酸的羧基末端氨基酸。用含水乙醇中的氨或烷基胺處理CMR支撐的肽從而在羧基末端產(chǎn)生了羧酰胺或烷基羧酰胺。
如果希望生成酯，則可用適宜的醇，如甲基，乙基，丙基，丁基或芐基醇處理CMR樹脂，在三乙胺存在下將肽從樹脂中分離出來并直接生成酯。
本發(fā)明的肽的酯也可通過常用的方法從羧酸前體中制備，特別地，在酸催化存在下用醇處理羧酸，另一方面，羧酸可轉(zhuǎn)換成一種活性?；虚g體，如?；u，用醇處理時(shí)優(yōu)選在堿存在下進(jìn)行。
不用天冬氨酸的側(cè)鏈羧基的酯化來生成肽的C-末端酯的方法稍微復(fù)雜，但這在肽合成中已是熟知的。例如，合成開始于通過溶液合成將C末端的氨基酸或二肽的酯偶聯(lián)至一種合適的側(cè)鏈被保護(hù)的天冬氨基酸殘基上，然后有選擇性地脫保護(hù)基和側(cè)鏈羧基偶合至氯甲基酯(CMR)上。釋放氨基并使用固相肽合成，當(dāng)肽的羧基末端仍為酯時(shí)，接著使用HF從樹脂中分裂合成所希望的側(cè)鏈羧酸。同樣，如果合成順序開始于合適的被保護(hù)的氨基酸或二肽的烷基酰胺，則可得到相應(yīng)的肽的C-末端烷基酰胺。
在這樣的方法中，為了生成酯和取代的酰胺，用于天冬氨酸的4-羧基的合適的保護(hù)基團(tuán)為芐酯和鹵素或烷基-取代的芐基酯。當(dāng)用Boc基，芐基酯保護(hù)氨基時(shí)，保護(hù)基團(tuán)可選擇性地通過氫化除去，并偶聯(lián)在CMR支撐體上。
如果在氨基酸(或二肽)上有芐基或取代芐基保護(hù)基團(tuán)(如用于羥基，硫醇或氨基)并被偶聯(lián)在天冬氨酸上且優(yōu)先于與樹脂的連接，則t-丁基酯或其它酸不穩(wěn)定基團(tuán)適合于保護(hù)天冬氨酸的側(cè)鏈羧基。假若這樣，則可用堿不穩(wěn)定基保護(hù)天冬氨酸的氨基，如芴基甲氧基羰基部分(Fmoc)。在溶液相天冬氨酸偶聯(lián)氨基酸(或二肽后)，通過中等酸水解完成t-丁基酯的選擇性的再保護(hù)，并且用常用方法將側(cè)鏈羧基偶合至樹脂上。然后為了接著固相肽合成，則用中等堿除去芴基甲氧基羰基。
將肽從支撐樹脂中分離出來的優(yōu)選方法是在合適的陽離子清除劑(如苯甲醚或二甲氧基苯)下用無水HF處理樹脂支撐的肽。該方法同時(shí)除去所有的保護(hù)基團(tuán)(除了保護(hù)硫的硫代烷基)并且將肽從樹脂中分離出來，用該方法從CMR中水解出的肽為羧酸，從BHA樹脂中分離得到羧基酰胺。
通過烷基化或乙?；_(dá)到肽的末端氨基的改變，這在該技術(shù)領(lǐng)域中已是公知的。這種改變可在氨基酸上完成并優(yōu)先于與肽的結(jié)合，或在肽上完成，該過程是在肽被合成和末端氨基被釋放出來后，但在除去保護(hù)基團(tuán)以前。
典型地，在叔胺存在下，使用相應(yīng)烷基酸的?；u或酐，在自由氨基上完成乙?；Ｔ谥械冗€原劑如氰基氫硼化鋰或鈉存在下，用合適的脂肪族醛或酮通過氨基的還原烷基化，而最方便地完成單烷基化。在堿存在下，用大量的烷基鹵處理氨基而完成二烴基化。
使用常用方法形成酰胺鍵達(dá)到肽的溶液合成，典型地，可選擇地在催化劑如1-羥基芐基三唑(HOBT)和二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，使用合適的碳化二亞胺偶聯(lián)劑，如N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，將具有自由羧基的被保護(hù)的BOC-氨基酸偶聯(lián)至被保護(hù)的具有自由氨基的氨基酸上。其它方法也是合適的，如生成活化酯，酐或?；u，被保護(hù)的BOC-氨基酸的自由羧基，按著可選擇地在堿存在下與被保護(hù)的氨基酸的自由胺反應(yīng)。例如，在堿(如N-甲基嗎啉，DMAP或三烷基胺)存在下，在無水溶劑(如二氯甲烷，四氫呋喃(THF))中用異丁基氯仿處理形成“活化酐”，接著將它與第二被保護(hù)的氨基酸或肽反應(yīng)。由這些方法生成的肽可用通用的方法有選擇性地在胺基或羧基末端上選擇性地脫除被保護(hù)基，并使用相似的方法與其它肽或氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)。
本發(fā)明的氨基酸的α-R′取代衍生物，包括Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Ala，Gly，His，Abu，Tyr，(Alk)Tyr，Phe，(4′W)Phe，HPhe，Trp，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，Cys，(Alk)Cys，Pen，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle和Nal的衍生物可用化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域通用方法制備。正如在此之前所定義的R′為Alk或芐基。制備這些衍生物的有代表性的方法已公開于美國專利4，687，758;Cheung等，Can.J.Chem.，55，906(1977);Freidinger等，J.Org.Chem，48，77(1982);和Shuman等，PetidesProceedings of the 7th American Peptide Symposium，Rich，D，Gross，E，Eds，Pierce Chemical CO.，Rockford，Ill，617(1981)，之中，在此提出這些資料作為參考。典型地，堿如氫化鈉或氫化鉀存在下，用合適的烷基鹵如甲基或乙基碘與Cbz-或Boc-氨基酸的DMF/THF溶液縮合。冠醚(如18-冠醚-6)與氫化鉀一起加入可促進(jìn)反應(yīng)。通常在該過程或接著的過程中，如果氨基酸具有功能基團(tuán)如羥基，巰基，氨基，胍基，吲哚基或咪唑基，則正如在此之前所描述的，這些基團(tuán)將被保護(hù)起來。因此用氫化鈉和甲基碘的THF/DMF溶液于0℃下處理Boc-Tyr(Bzl)并在室溫下攪拌24小時(shí)生成Boc-(α-Me)Tyr(Bzl)。
另一方面，在還原劑如氰基氫硼化鈉存在下，氨基酸的自由胺與合適的醛或苯甲醛反應(yīng)產(chǎn)生單烷基化，此方法對于制備α-芐基氨基酸特別有用。α-芐基化氨基酸也可用作制備α-甲基氨基酸的中間體。例如，用下述三步制備α-甲基精氨酸;1).在甲醇溶液中將Arg(Tos)與苯甲醛和氰基氫硼化鈉反應(yīng)生成(α-Bzl)Arg(Tos);2).用甲醛/甲酸溶液還原芐基化產(chǎn)物生成(α-Bzl，α-Me)Arg(Tos);3).通過催化氫化(在冰乙酸/HCl中的5%Pd/C)釋放出芐基生成MeArg(Tos)。
氨基酸的α-R′取代衍生物也可通過由Fmoc或Cbz-氨基酸制備的惡唑烷酮的還原來制備。典型地，在有甲苯磺酸存在下，于甲苯溶液中將Fmoc或Cbz-氨基酸與合適的醛如乙醛或苯甲醛一起加熱生成2-取代5-氧代-惡唑烷。用三乙基硅烷和TFA的氯仿溶液還原該惡唑烷直接得到Cbz-或Fmoc-α取代氨基酸。當(dāng)使用甲醛時(shí)，惡唑烷酮的2位未被取代以及生成α-甲基氨基酸，這在本領(lǐng)域中已是熟知的。
本發(fā)明的優(yōu)選的一組化合物為式(Ⅱ)所描述的那些化合物。這些化合物包括兩個(gè)具有硫羥基的氨基酸，該硫羥基參與生成二硫鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。如此結(jié)構(gòu)由相應(yīng)的線性肽(Ⅲ)制得，
(Ⅲ)其中A′，B′，Asp，C′，Z1，Z2，m，n，p，q，w，x，y，R′，R1，R2，R3，R4和R5如上文定義，如前面所描述的選擇性保護(hù)化學(xué)反應(yīng)中心。T1和T2為可移除基團(tuán)，如硫代烷基，硫代芳基，取代芐基或氫。合適的可移除基團(tuán)為氫，硫代乙基，芐基和4-甲基芐基。
可通過兩種通用方法中的一種來形成二硫鍵。如果線性肽的含硫氨基酸的保護(hù)基不同，用如此方法可形成單巰基，可通過催化第二個(gè)含硫氨基酸的保護(hù)基團(tuán)的親核置換的堿產(chǎn)生成環(huán)作用。特別有用的可移除的保護(hù)基團(tuán)為硫代烷基或硫代芳基。該方法的實(shí)例為用硫代乙基保護(hù)一含硫氨基酸，用取代芐基保護(hù)第二個(gè)含硫氨基酸。用HF脫去該肽的保護(hù)基而從第一氨基酸中除去芐基，而留下被保護(hù)的第二氨基酸為一種乙基二硫化物。在Ph值大約為7到8時(shí)，攪拌巰基/二硫化物的稀溶液，進(jìn)行硫代乙基的置換和線性肽成環(huán)。
如果相應(yīng)的式(Ⅲ)的線性肽完全脫保護(hù)基生成二巰基，則可使用任何一種已知的能將二巰基轉(zhuǎn)換成二硫化合物的氧化劑。這種氧化劑的實(shí)例為一種堿金屬的鐵氰化物，特別是鐵氰化鉀或鐵氰化鈉，氧氣，二碘甲烷或碘。該反應(yīng)在合適的惰性溶劑(如含水甲醇或水)，于大約0至40℃溫度下和在高稀釋下進(jìn)行。通常PH值保持在7至8左右。當(dāng)肽還連接在支撐樹脂上或當(dāng)其它功能基團(tuán)還被保護(hù)時(shí)，成環(huán)作用可在肽上完成，但優(yōu)選的是在脫除保護(hù)基的自由肽上完成。
用標(biāo)準(zhǔn)方法，在合適的溶劑中由母體化合物和過量的酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、琥珀酸或甲磺酸)制備肽的酸加成鹽。乙酸鹽特別有用。某些化合物生成合格的內(nèi)鹽或兩性離子。用含有合適陽離子的過量的堿性試劑，如氫氧化物，碳酸鹽，或醇鹽處理母體化合物制備陽離子鹽。Na+，K+，Ca++和NH+4陽離子為藥理可接受鹽中的陽離子的例子。
本發(fā)明提供了一種抗纖維變性的組合物，該組合物由一種根據(jù)式(Ⅰ)或(Ⅱ)的肽和一種藥用載體組成。肽的藥劑組合物的制備如上文所述，纖維結(jié)合素，纖維蛋白原或VonWillebrand因子的其它肽或多肽衍生物可配制成溶液或凍干成為腸胃外服法的粉末。在使用之前，通過加入合適的稀釋劑或其它藥用載體，將粉末進(jìn)行再配制。該液體配方通常為一種緩沖物，等滲的水溶液。合適稀釋劑為正常等滲的鹽溶液，標(biāo)準(zhǔn)的在水中5%葡萄糖或乙酸鈉或銨的緩沖溶液。如此配方特別適合于腸胃外給藥，但也可用于口服或用于吹入法，在吸入器或噴霧器中含有一定劑量。在配方中需要加入賦形劑如聚乙烯基吡咯烷酮，明膠，羥基纖維素，亞拉伯膠，聚乙二醇，甘露醇，氯化鈉或枸櫞酸鈉。
另外，為了口服這些肽可用膠囊包，制成片劑或在乳劑或糖漿中制備。可加入藥用的固體或液體載體增強(qiáng)或穩(wěn)定組合物，或便于制備組合物。固體載體包括淀粉，乳糖，硫酸鈣二水合物，石膏粉，硬脂酸鎂或硬脂酸，滑石，果膠，亞拉伯膠，瓊脂或明膠。液體載體包括糖漿，花生油，橄欖油，鹽水和水。載體也可包括一種持續(xù)釋放劑(如單硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯)，單獨(dú)的或與蠟一起。固體載體的用量可變，但優(yōu)先為每劑量單位大約20mg至1g。藥劑可按通用的藥學(xué)工藝制備，當(dāng)必要時(shí)，對于片劑型，可用碾磨、混合、制粒和加壓，對于硬明膠囊型，可用碾磨、混合和填充。當(dāng)使用液體載體時(shí)，制劑將以糖漿，酏劑，乳劑或含水的或不含水的懸浮液形式出現(xiàn)。如此液體制劑可直接口服或裝填于軟明膠囊中。
為了頰服，本發(fā)明的肽也可與賦形劑如可可豆油、甘油、明膠或聚乙二醇結(jié)合形成栓劑。
本發(fā)明也提供了一種抑制哺乳動物特別是人體的血小板聚集和血塊形成(在它需要時(shí))，它包括內(nèi)服有效劑量的抗纖維變性肽和藥用的載體。如此療法的適應(yīng)癥包括心肌梗塞形成，深靜脈血栓形成，肺栓塞，分割性無尾癥，中風(fēng)和其它與梗塞有關(guān)的病。聚集過多的慢性或急性狀態(tài)，如分散于血管內(nèi)的凝固(DIC)，敗血癥，外科的或傳染的休克，手術(shù)后和分娩后的外傷，心肺分流外科，不一致血液的轉(zhuǎn)輸，意外的胎盤，血栓形成的血小板減少紫癜(TTP)，蛇毒和免疫病都可能對如此治療敏感。病人不是口服就是腸胃外服抗纖維變性肽，用這種方法血漿中藥的濃度應(yīng)足以抑制血小板聚集。含該肽的藥劑組合物的服用劑量大約為0.2至50mg/Kg，其用法應(yīng)與病人的狀況符合。急性療法腸胃外給藥為優(yōu)選。對于聚集過多的持續(xù)狀態(tài)，靜脈內(nèi)注射肽的5%葡萄糖水或生理鹽水溶液最為有效，盡管肌內(nèi)藥團(tuán)注射也是有效的。
對于慢性的，但非危急的血小板聚集狀態(tài)，膠囊或片劑的口服或藥團(tuán)的肌內(nèi)注射都是合適的。每天服肽一至四次，劑量大約為0.4至50mg/Kg，從而達(dá)到每天總劑量大約為0.4至200mg/Kg/天。
另外，本發(fā)明提供了一種在纖維蛋白溶解療法之后抑制動脈或靜脈再阻塞的方法，它包括在它需要的時(shí)候給哺乳動物內(nèi)服有效劑量的抗纖維變性肽和纖維蛋白溶解劑。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在纖維蛋白溶解療法中服用抗纖維變性肽既能完全防止再阻塞又能延長再阻塞時(shí)間。當(dāng)在纖維蛋白溶解療法后抑制血管的再阻塞的方法使用該肽，本發(fā)明的意圖是不僅包括上述的肽，而且包括其它肽，多肽和肽及多肽的斷片或衍生物，它們具有氨基酸序列-RGD-并能結(jié)合在GPIIb-IIIa接受體上。因此抗纖維變性化合物為纖維結(jié)合素，纖維蛋白原和VonWillebrand因子的斷片和衍生物。通過重組DNA方法或通過固相肽合成或通過慣用的溶液合成或溶液合成制備這些肽/多肽在本領(lǐng)域已是熟知的。已經(jīng)公開了制備纖維結(jié)合素片斷的方法(Rouslahti等，WO84/00540;Pierschbacher等，美國專利4，589，881;和Rouslahti等，美國專利4，661，111)，在此提出作為參考。通過酰胺化、酯化、烷基化、乙?；褂眠@種方法制備的肽進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，或偶聯(lián)至其它的天然的或非天然的氨基酸。用這種方法制備的肽/多肽可用上述方法配制成腸胃外給藥或口服藥。
用于本發(fā)明中的纖維蛋白溶解劑是指任意化合物，不管是天然的還是合成的產(chǎn)物，它們直接或間接引起纖維血塊的溶解。纖維蛋白溶酶原激活劑為一組已知的纖維蛋白溶解劑，例如，實(shí)用纖維蛋白溶酶原激活劑包括尿激酶(UK)，前尿激酶(PUK)，鏈激酶(SK)，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(tpA)和它的變異體或突變體，它們保持了纖維蛋白溶酶原激活劑的活性，如變異體，在變異體中增加，除去或取代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或在變異體中增加，除去或改變一個(gè)或多個(gè)或功能性范圍，如通過纖維蛋白結(jié)合纖維蛋白溶酶原激活劑的活性位置，如，tpA，該纖維蛋白結(jié)合在其它纖維蛋白溶酶原激活劑的范圍上，如尿激酶的一個(gè)或多個(gè)Kringle范圍，或用結(jié)合在分子如抗纖維蛋白IgG的Fab片斷上的其它纖維蛋白。另外作為例證的變異體包括tpA分子，在變異體中的一或多個(gè)糖基化基位點(diǎn)發(fā)生了變化。優(yōu)選的纖維蛋白溶酶原激活劑為tpA的變異體，在生長因子區(qū)域內(nèi)變異體的主氨基酸序列發(fā)生變化以便增加纖維蛋白溶酶原激活劑的血漿半衰期?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了tpA生長因子變異體，例如，Robinson等EP-A-297589和Browne等EP-A-240334以及由BritishBiotechnologyLtd.聯(lián)系為SmithklineBeckmanCorporationDocketNumberSKB14422，于1988年6月24日提交的英國專利申請，在此提出這些資料作為參考，盡管在上文中已經(jīng)全部提到。纖維蛋白溶解劑可從天然源中分離出來，但通常用傳統(tǒng)的遺傳工程方法制備。
現(xiàn)已公開了tpA，SK，UK和PUK的實(shí)用配方，如未審定的美國專利申請890，432，德國專利申請?zhí)?032606，歐洲專利申請?zhí)?3103629.8和美國專利4568543，在此提出這些專利作為參考。特別的纖維蛋白溶解劑可在水溶液，緩沖溶液，等滲溶液中配制，如乙酸或己二酸的鈉或銨鹽緩沖液在PH為3.5至5.5。也可加入另外的賦形劑如聚乙烯吡咯烷酮，明膠，氧化纖維素，亞拉伯膠，聚乙烯，乙二醇，甘露糖醇和氯化鈉。如此組合物能被凍干。
可在同一容器中配制既抗纖維變性又能使纖維蛋白溶解的藥劑組合物，但最好在不同的容器中配制。當(dāng)兩種制劑都以溶液形式提供時(shí)，為同時(shí)服用或串列安排使用將它們裝在灌輸/注射裝置中。
如此療法的適應(yīng)癥包括心肌梗塞，深靜脈血栓，肺栓塞，中風(fēng)或其它與梗塞有關(guān)的疾病。抗纖維變性肽的服用可在tpA或其它纖維蛋白溶解劑胃腸外給藥之前，同時(shí)或之后進(jìn)行。在建立起再灌注而最大地抑制治療后的再阻塞后希望用抗纖維變性肽連續(xù)治療一段時(shí)間。tpA，SK，UK和PUK的有效劑量為0.5至5mg/Kg，抗纖維變性肽的有效劑量為0.1至25mg/Kg。
為了同時(shí)或不同時(shí)方便地服用抑制劑和纖維蛋白溶解劑，準(zhǔn)備了一用具包，它包括單獨(dú)的瓶子、袋子、裝有上述腸胃外給藥的有效量抑制劑和上述腸胃外給藥的有效量tpA或其它纖維蛋白溶解劑的玻璃瓶或其它容器，并將它們放于一單獨(dú)的箱子如盒子或紙匣中。如此用具還包括如兩種藥劑在各自的容器中或在同一的容器中，任意的凍干的固體，以及為了再配制溶液的容器。這種變化還包括為再配制所需的溶液和單獨(dú)箱子的兩個(gè)室中凍干的固體，在使用之前能夠進(jìn)行摻合。這樣安排的話，纖維蛋白溶解和抗纖維變性肽可分開包裝在兩個(gè)容器中，或作為粉末一起凍干并放在單獨(dú)的容器中。
當(dāng)兩種制劑都以溶液形式提供時(shí)，為同時(shí)服用或串列安排使用將它們裝在灌輸/注射裝置中。例如，血小板聚集抑制劑可用靜脈注射形式，或連在一起的灌輸袋，通過管與裝入纖維蛋白溶解劑的第二個(gè)灌輸袋連接。使用這種裝置時(shí)，在纖維蛋白溶解劑灌輸后，病人能得到最初藥團(tuán)類抗纖維變性抑制劑的注射或灌輸。
通過下列實(shí)驗(yàn)評價(jià)肽的藥物活性與纖維蛋白溶解療法的作用-預(yù)制的人血塊的溶解。
在體外人血塊溶解實(shí)驗(yàn)常用來評價(jià)抗纖維變性肽對誘導(dǎo)纖維蛋白溶解的tpA的作用。將來源于美國紅十字會的的過時(shí)的含枸櫞酸鹽的人血漿在1300×g下離心20分20分鐘除去殘留的血細(xì)胞。將由血漿125I-纖維蛋白原氯化鈣和凝血酶組成的溶液置于6mn組織培養(yǎng)平皿上，于37℃下保溫15至18小時(shí)。第二天早上，沖洗每一井獲得血塊，用含有肝素和白蛋白的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水溶液洗滌血塊兩次。然后將血塊加到1.0ml的用于制備血塊的同樣的血漿中。加入tpA至玻璃管中其濃度范圍為7至250ng/ml(最終濃度)。在37℃下輕輕旋轉(zhuǎn)玻璃管保溫4小時(shí)。在4小時(shí)終點(diǎn)，取出25μl并計(jì)數(shù)測量從血塊中釋出的125I。所有試樣一式三份。
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用圖1的曲線表示，該結(jié)果表明肽Ac-RGDS-NH2與誘導(dǎo)血塊溶解的tpA沒有相互作用。
抑制血小板聚集的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)根據(jù)Aiken等在Prostaglandins，19，629-43(1980)中敘述的方法，通過記錄輸入了的肽麻醉的狗的全身和血液動力學(xué)效應(yīng)可驗(yàn)證體內(nèi)血栓形成的抑制。簡言之，將一小的Lexan 圓柱放在機(jī)械損傷的右邊彎曲的冠狀動脈中以形成一個(gè)固定區(qū)域的80-90%的阻塞。在這些條件下，血小板粘連在露置的內(nèi)皮下膠原蛋白上并聚集在阻塞位置上。在血流的2～3分鐘內(nèi)估計(jì)聚集會逐漸減少。直到用機(jī)械的方法將血栓從被阻塞的血管腔內(nèi)取出，冠狀血流才能恢復(fù)。這一過程可通過控制實(shí)驗(yàn)期而每2-3分鐘重復(fù)一次。
用Ac-RGDS-NH2進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果以圖2(a-c)加以說明。上面的圖(a)，測量動脈血壓(mmHg)，中間的圖(b)，測量期的冠狀血流量(ml/min)和下面的圖(c)，測量冠狀血流量平均值。在控制期間，血流量降低(圖(b)和圖(c))直到血塊被振蕩松動(SL)。箭頭表示開始冠狀輸入Ac-RGDS-NH2(在0.1ml/mM下的400mM)。這種輸入導(dǎo)致完全抑制血栓的形成直到停止輸入為止(第二個(gè)箭頭)。停止輸入后由于血栓的出現(xiàn)又導(dǎo)致血流量降低。
抗聚集活性的劑量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)是通過當(dāng)改變抗纖維變性肽的輸入速度而觀察對平均冠狀血流(ml/mM)的作用。對于Ac-RGDS-NH2來說，其實(shí)驗(yàn)用圖3表示。上面曲線(a)表示血栓形成的完全抑制(在0.052ml/min下400mM)。中間曲線(b)表示血栓自發(fā)消散的中等抑制(在0.026ml/min下400mM)。下面曲線(c)表示延長時(shí)間至完全阻塞的部分抑制(在0.013ml/min下400mM)，這需要血栓振蕩松動(SL)。用箭頭表示輸入的再開始和結(jié)束。
血小板聚集的抑制從成年的初次用以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的雜種狗上收集血液含枸櫞酸鹽以防止凝固)。通過在室溫下在150×g離心10分鐘制備血小板富集的血漿(PRP)。通過在800×g的PRP離心10分鐘制備洗滌過的血小板。用沒有Ca2+的泰克緩沖液(pH6.5)洗滌所得的細(xì)胞碎片兩次，然后再懸浮于在3×105Cells/ml下含有1.8mM Ca2+的泰克緩沖液中。在所有的血小板聚集實(shí)驗(yàn)中，先于激動劑加入前三分鐘加入肽。最終激動劑濃度為0.1單位/ml凝血酶和2μM ADP(σ)。用Chrono-Log Lumi-Aggregometer檢驗(yàn)聚集作用。在激動劑加入5分鐘后，透光率被用于計(jì)算百分聚集數(shù)。根據(jù)下面公式聚集%＝〔(90-CR)÷(90-10)〕×100其中CR為圖的讀數(shù)，90為基線，和10為PRP的空白讀數(shù)。通過繪制〔聚集抑制%〕對〔肽濃度〕曲線來確定IC50′的值。在200μM下進(jìn)行肽的實(shí)驗(yàn)，并以2為因子來連續(xù)稀釋，從而確定一條合適的劑量反應(yīng)曲線。
為了評價(jià)肽對血漿蛋白酶的穩(wěn)定性，在激動劑加入之前在PRP中培養(yǎng)3小時(shí)(而不是3分鐘)。
下表說明了本發(fā)明的肽對血小板聚集的活性抗聚集活性實(shí)施例結(jié)構(gòu)活性%抗聚集活性在PRP IC50，IC50，中3小μMμMPRP/WP/時(shí)后ADP凝血酶1 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2100 1.1 NT2 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-D,L-APmp-NH2100 1.53 NT3 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2100 32.7 54.34 cyclo Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2NT 10.9 NT5 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH2NT 1.3 NT6 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-(α-Me)Ser-Pen-NH279.96 NT7 cyclo Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2NT 1.2 NT8 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2NT 0.91 NT10 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2NT 4.12 NT11 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH2NT 20.3 NT12 cyclo Ac-Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2NT 55.3 NT13 cyclo Ac-Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH2NT 3.85 NT14 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2NT 0.26 NT
15Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEtNT＞200NT16cycloAc-Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEtNT9.5NT17 cyclo Ac-Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2NT 4.10 NT18 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH2NT 1.49 NT24 cyclo Ac-Cys-(Et2)Arg-Gly-Asp-Pen-NH2NT 81.7 NT26 Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2100 7.4 28.227 Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH20 91.3 67.228 Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH298 101.5 13729 Ac-Arg-Gly-Asp-NH254.2 137.8 35630 Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH233.3 138.8 ＞20031 Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH291.7 55.5 NT32 Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH2100 40.5 NT33 Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH25.9 112.7 NT34 Ac-Arg-Gly-Asp-NHCH2CH2Ph 100 75.9 NT35 Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH2100 10.8 NT36 Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH233.3 68.2 NT37 MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2NT 66.3 NT38 HCO-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2NT 6.9 NT39 Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2NT 12.0 NTPRP＝血小板富集血漿WP＝洗滌過的血小板下面的實(shí)施例并不是要限制本發(fā)明范圍，只是提供說明如何制造和使用本發(fā)明化合物。
實(shí)施例在下面的實(shí)施例中，全部溫度都是攝氏溫度。氨基酸分析是在Dionexautoion100上進(jìn)行。肽含量分析基于氨基酸分析。質(zhì)譜在VGZab質(zhì)譜儀上用快原子轟擊進(jìn)行。EM薄層硅膠板(0.25mm)用于薄層色譜。ODS指的是十八烷基甲硅烷基硅膠色譜載體。用于代表洗脫組合物的縮寫是B丁醇，A乙酸，W水，E乙酸乙酯，IP異丙醇，P吡啶和CA氯乙酸。HPLC是在Beckman344梯度色譜系統(tǒng)上用CRIB紀(jì)錄積分儀或者是同溶劑方式或者是梯度洗脫方式進(jìn)行的。這兒簡要地說明肽的純度基于HPLC的積分法。用Ali等在美國專利4，687，758(1987)上公開的方法制備MeArg。
實(shí)施例1制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2合成被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Ser(Bzl)-Cys(4-MBzL)-MBHA，是用固相方法在4-甲基二苯甲基胺樹脂上，在自動化Beckman 990 MP合成器上以1.0m mol規(guī)模進(jìn)行。在全部氨基酸的氨基上用t-丁氧基羰基保護(hù)，并且用Ali等在J.Med.Chem.，29，984(1986)和J.Med.Chem.，30，2291(1987)中所表示的方法，順序地用N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺/1-羥基苯并三唑(DCC/HOBt)進(jìn)行偶聯(lián)。在最后的氨基酸偶聯(lián)到肽上后，用乙酸酐(10當(dāng)量)和二異丙基乙胺(10當(dāng)量)在二甲基甲酰胺的混合物中，將該肽乙?；Ｔ?℃，60分鐘內(nèi)在苯甲醚(3.0ml)的存在下，用無水HF(30ml)脫去側(cè)鏈保護(hù)基，同時(shí)從樹脂上將該肽斷裂出來。在真空蒸發(fā)HF后，用無水乙醚洗滌殘余物，用50%乙酸提取粗肽，并用去離子水稀釋粗肽到21。用濃氫氧化銨調(diào)節(jié)水溶液pH為7.5。在這種弱鹼性條件下從半胱氨酸中除去4個(gè)MBZL基團(tuán)產(chǎn)生游離硫醇，進(jìn)行第二個(gè)半胱氨酸的巰基乙基保護(hù)基的親核取代，然后該肽分子內(nèi)環(huán)化。例如，氮或氬惰性氣體明鼓泡形式通過溶液趕出生成的乙硫醇。環(huán)化過程發(fā)生在24-48小時(shí)。然后該反應(yīng)液通過預(yù)先用水平衡的十八烷基硅烷(ODS)反相色譜柱。用15%乙腈/水-0.1%TFA溶液洗脫該肽，得678.6mg(98%粗產(chǎn)率)。用中壓ODS反相柱和5%乙腈/水-0.1%TFA溶液洗脫劑的色譜法進(jìn)行該肽的純化。標(biāo)題化合物在二個(gè)餾分中洗脫，得222.3mg，具有＞98%純度。
物理數(shù)據(jù)M.F.C24H40N10O10S2M.W.692.231FAB(M+H)+693.5，(M-H)-692.0AAAAsp(1.07);Ser(1.00);Gly(1.00);Cys(2.37)肽含量67.7%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.42;
(B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10)，Rf＝0.36.
2.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，
在220nm檢測。
同溶劑洗脫2%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝0.2分步梯度淋洗被用于以H2O-0.1%TFA平衡的柱，5%乙腈/水-0.1%TFA(5分鐘內(nèi))，50%(20分鐘內(nèi))，K1＝1.5以Boc-Thr(Bzl)取代上面序列中的Boc-Ser(Bzl)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Thr-Cys-NH2.
以Boc-D-(Me)Cys取代上面序列中的Boc-Ser(Bzl)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-D-(Me)Cys-Cys-NH2.
以Boc-Val取代上面序列中的Boc-Ser(Bzl)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Val-Cys-NH2.
以Boc-NVa取代上面序列中的Boc-Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Nva-Cys-NH2.
以Boc-Phg取代上面序列中的Boc-Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Phg-Cys-NH2.
以Boc-HPhe取代上面序列中的Boc-Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Hphe-Cys-NH2.
實(shí)施例2制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-(D，L)APmp-NH2用與例1相同的方式，在0.5mmol規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-APmp(4-MBzL)-MBHA.用快速色譜法純化該肽，其中用中壓ODS反相柱和15%乙腈/水-0.1%TFA洗脫液洗脫。標(biāo)題化合物在三個(gè)組份中洗脫，給出150.9mg(45.8%)，其純度＞96%。
物理數(shù)據(jù)M.F.C25H41N9O8S2;M.W.659.4FAB(M+H)+660AAAAsp(1.00)，Gly(1.00)，Arg(0.91)肽含量60.6%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.67;
(B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10)，Rf＝0.5.
2.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑10%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝3.24梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，12-50%A(20分鐘內(nèi))，K1＝1.97。
以Boc-MeArg(Tos)取代上面序列中的Boc-Arg(Tos)生成Nα-Ac-cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(D，L)-APmp-NH2.
實(shí)施例3制備Nα-Ac-cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2用與實(shí)施例1同樣的方式，在1.0mmol的規(guī)模上，合成、斷裂和環(huán)化被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Ser(BzL)-Cys(4-MBzL)-MBHA.冷凍干燥，給出530mg(78%)。用快速色譜法純化，其中用中壓ODS反相柱和1%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑。得61mg標(biāo)題肽，純度為90%。
物理數(shù)據(jù)M.F.C23H38N10O10S2M.W.678.75FAB(M+H)+679AAAAsp(1.00);Ser(0.98);Gly(0.97);Arg(0.90);Cys(1.75).
肽含量86.3%。
色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.32;
(B∶W∶IP;CA，6.5∶2∶1.5∶0.3)，Rf＝0.06.
2.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm在220nm處檢測。
梯度A乙腈 BH2O-0.1%TFA，0-50%(在35分鐘內(nèi))，K1＝6.4。
以Boc-Tyr(BrZ)取代上面序列中的Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH2.
以Boc-Phe取代上面序列中的Boc-Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys-NH2.
以Boc-Met取代上面序列中的Boc-Ser(Bzl)生成Nα-Ac-Cyclo(s，s)Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Cys-NHz以Boc-NLe取代上面序列中的Boc-Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-NLe-Cys-NH2.
以Boc-Nal取代上面序列中的Boc-Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Nal-Cys-NH2.
以Boc-ILe取代上面序列中的Boc-Ser(BzL)生成Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-ILe-Cys-NH2.
實(shí)施例4制備Cyclo(S，S)Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2用與實(shí)施例1同樣的方式，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析出被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Mpr(4-MBzL)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Ser(BzL)-Cys(SEt)-MBHA.用快速色譜法純化該肽，其中用中壓ODS反相柱和3.5%乙腈/水-0.1%TFA的洗脫劑。得489mg(79%)純度為96%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C21H35N9O9S2M.W.621.208FAB(M+H)+622.1;(M-H)-620.7AAAAsp(1.00)，Ser(0.97)，Gly(1.00)，Cys(0.57)，Arg(1.03)肽含量73.88%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.42(B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10)，Rf＝0.412.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑4%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝3.6梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，3-50%(在20分鐘內(nèi))，K1＝3.3
實(shí)施例5制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方式，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析出被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Ser(BzL)-Pen(4-MBzL)-MBHA，給出542mg(75%)。用中壓ODS柱和6%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑的快速色譜法純化，給出47.5mg純度為94%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C26H44N10O10S2M.W.720.27FAB(M+H)+721.3AAAAsp(1.00)，Ser(0.96)，Gly(1.00)，MeArg(0.89)肽含量78.12%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.42(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.412.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm在220nm處檢測同溶劑6%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝5.66梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝3.19實(shí)施例6制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-MeSer-Cys-NH2
用與實(shí)施例1相同的方式，在0.5mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-(α-Me)Ser(BzL)-Cys(4-MBzL)-MBHA.用10%乙腈/水-0.1%TFA，從反相ODS柱中洗脫該肽，給出47mg。用制備HPLC進(jìn)一步純化，其中用同溶劑條件(5.5%乙腈/水-0.1%TFA)、Altex Ultras-phere ODS，5μ，10mm×25cm柱和220nm的檢測波長。給出10.6mg純度大于96%的肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C26H42N10O10S2M.W.706.237FAB(M+H)+707.5(M-H)-705.5AAAAsp(1.06)，Gly(1.00)肽含量55.85%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.41(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.492.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm在220nm處檢測。
同溶劑4.5%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝8.95梯度A乙腈，BH2O%-0.1%TFA，0-50%A(20分鐘內(nèi))，K1＝5.97實(shí)施例7制備Cyclo(S，S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2
用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Mpr(4-MBzL)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Ser(O-BzL)-Cys(SEt)-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA，從柱中洗滌該肽，得256.5mg(40%)標(biāo)題化合物。用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex
G-15硅膠過濾進(jìn)行純化。用制備HPLC進(jìn)一步純化，其中梯度條件A乙腈，BH2O-0.1%TFA，5-30%(在10分鐘內(nèi))，在Altex Ultrasphere
ODS，5μ，10mm×25cm，用220nm檢測，給出純度＞98%化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C22H37N9O9S2M.W.635.22FAB(M+H)+636.2AAAAsp(1.00)，Ser(0.84)，Gly(1.04)，Cys(1.48)色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)Rf＝0.39(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)Rf＝0.492.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑5%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝5.93梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝7.86實(shí)施例8制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2
用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(4-MBzL)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Cys(SEt)-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA，從ODS反相柱中洗脫，得780mg標(biāo)題肽。用0.2M乙酸洗脫，用Sphadex G-15硅膠過濾進(jìn)行純化。用制備HPLC進(jìn)一步純化，其中用同溶劑條件5%乙腈/水-0.1%TFA，在Altex Ultrasphere ODS柱上，5μ，10mm×25cm，在220nm處檢測，得純度＞98%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C12H35N9O8S2M.W.605.21FAB(M+H)+606.2;(M-H)-604AAAAsp(1.00)，Gly(1.13)，Cys(2.04)肽含量77.33%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.43(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.562.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑5%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝4.76梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝7.18
實(shí)施例9制備Cyclo(S，S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Mpr(4-MBzL)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Pen(4-MBzL)-MBHA，用0.01MK3Fe(CN)6溶液環(huán)化該肽。用10%乙腈/水-0.1%TFA，于ODS反相柱上色譜分離該肽，得365mg(63%)標(biāo)題化合物。用0.2M乙酸洗脫，并用Sephadex
G-15硅膠過濾純化，得純度＞96%標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C21H36N8O7S2M.W.576.22FAB(M+H)+577.2;(M-H)-575.3AAAAsp(1.00)，Gly(1.15)，Mpr+Pen(1.55)肽含量65.77%。
色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.58(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.52.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑10%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝6.11梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%(在20分鐘內(nèi))，K1＝10.93
實(shí)施例10制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析所保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Pen(4-MBzL)-MBHA，給出400mg(65%)。用(B∶A∶W，4∶1∶5)，并用Sephadex
G-25分配色譜純化，得純度＞97%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C22H37N9O8S2M.W.619.711FAB(M+H)+620.2，(M-H)-618.7AAAAsp(1.00)，Gly(1.01)，Cys(1.00)，Arg(0.67)肽含量95.6%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.37(B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3)，Rf＝0.0972.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑6%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝2.2梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在15分鐘內(nèi))，K1＝3.7實(shí)施例11制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.5mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析出被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-D-Pen(4-MBzL)-MBHA。用快速色譜法純化該肽，其中用中壓ODS反相柱和15%甲醇/水-0.1%TFA的洗脫劑。得50mg(5.4%)純度大于96%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C22H37N9O8S2M.W.619.711FAB(M+H)+620.2(M-H)-618.8AAAAsp(1.00)，Gly(1.03)，Arg(0.88)肽含量54%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.42(B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3)，Rf＝0.112.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑5%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝2.7梯度A乙腈/H2O-0.1%TFA，0-50%A(在15分鐘內(nèi))，K1＝3.3實(shí)施例12制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方式，在2.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Lys(Clz)-Gly-Asp(OBzL)-Pen(4-MBzL)-MBHA。粗肽通過Amberlite
XAD-2柱，用50%乙腈/水-0.1%TFA洗脫。用快速色譜法純化，其中用中壓ODS反相柱，用5%乙腈/水-0.1%TFA洗脫。得180mg(15%)純度＞97%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C22H37N7O8S2M.W.591.698FAB(M+H)+592.3，(M-H)-591AAAAsp(1.00)，Gly(1.13)，Lys(1.09)，Cys(2.25)色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.382.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm，在220nm檢測。
同溶劑3%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝3.5梯度A乙腈;BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在15分鐘內(nèi))，K1＝2.9實(shí)施例13制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH2將肽Nα-Ac-Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2(100mg，0.17mmol)加到O-甲基異脲硫酸氫鹽(290mg，1.7mmol)的2.5MNaOH溶液中，并調(diào)節(jié)pH至11。室溫靜置過夜后，將反應(yīng)混合物經(jīng)過Amberlite XAD-2柱，用50%乙腈/水-0.1%TFA洗脫。用快速色譜法純化，其中用中壓ODS反相柱和10%乙腈/水-0.1%TFA洗脫，得40mg(37%)純度為95%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C23H39N9O8S2M.W.633.74FAB(M+H)+634.2，(M-H)-632.3AAAAsp(1.00)，Gly(1.16)，Cys(2.45)肽含量68.9%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.44(B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3)，Rf＝0.192.HPLCVydac218TPODS柱，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑4%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝2.0梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在15分鐘內(nèi))，K1＝3.2實(shí)施例14制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方式，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析出被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Pen(4-MBzL)-MBHA.用快速色譜法純化，其中用中壓ODS反相柱和用5%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑。得209mg(35%)純度為95%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C23H39N9O8S2M.W.633.738
FAB(M+H)+634.7AAAAsp(1.00)，Gly(0.98)，Cys(1.06)肽含量66%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.62(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.392.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢驗(yàn)。同溶劑5%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝2.39梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，5-50%(在20分鐘內(nèi))，K1＝4.16實(shí)施例15制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEta).制備Boc-Ser(BzL)-NHEt在-15℃將氯甲酸異丁酯(2.7mL，20.8mmol)加到Boc-Ser(BzL)(6.0mg，20.3mmol)和N-甲基嗎啉(2.3mL，20.9mmol)的50mL THF的溶液中。攪拌溶液幾分鐘，氣體乙胺以鼓泡通過混合物。該混合物在-15℃攪拌30分鐘。然后過濾，并將濾液濃縮至干。生成的殘余物溶于乙酸乙酯(100mL)中，連續(xù)地用1M HCl(2×50mL)，水(50mL)，10%Na2CO3(2×50mL)和鹽水(50mL)洗滌。有機(jī)層在無水硫酸鈉上干燥、過濾和濃縮，得6.0mg白色粉末。用NMR數(shù)據(jù)證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
b).制備Boc-Asp(OBzL)-Ser(BzL)-NHEt室溫下40分鐘內(nèi)用無水TFA(10mL/mg)脫去實(shí)施例15(a)化合物的Boc保護(hù)基團(tuán)。除去TFA，用重量法測定殘余物TFA。用實(shí)施例12(a)的步驟，從Boc-Asp(OBzL)(5.82g，18mmol)，Boc-Ser(BzL)NHEt(10.4g，18mmol)，N-甲基嗎啉(8mL，73mmol)和氯甲酸異丁酯(2.4mL，18mmol)中，制備二肽。給出玻璃狀物質(zhì)。用NMR證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
c).制備Boc-Asp-Ser(BzL)-NHEt將5%Pd/BaSO4(2.0g)加到4.0g15(b)的乙酸乙酯(100mL)和甲醇(25mL)溶液中，并將該混合物于Parr Shaker上在45psi氫壓力下氫解30分鐘。過濾該混合物，濃縮濾液，得3.18g白色玻璃狀物質(zhì)。用NMR證實(shí)本結(jié)構(gòu)。
d).制備Boc-Asp(O-芐基樹脂)-Ser(BzL)-NHEt用4-吡咯烷吡啶(0.15g，1mmol)和DCC(620mg，3mmol)于二氯甲烷中，將實(shí)施例15(c)(1.31g，3mmol)的化合物偶聯(lián)到羥甲基樹脂上(1%交聯(lián)，1g，1mmol)。
e).制備Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt肽-樹脂中間體，Ac-Arg-Gly-Asp(OBzL-樹脂)-Ser(BzL)-NHEt的制備是從實(shí)施例15(d)的化合物得來。用實(shí)施例1所述的方法，通過順序地偶聯(lián)Boc-Gly和Boc-Arg(Tos)，從樹脂上斷裂和脫去保護(hù)基即可。用反相ODS硅膠柱和5%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑的快速色譜法純化該肽，得173mg純度＞95%標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C19H34N8O8M.W.502.53
FAB(M+H)+503.0AAAAsp(1.08)，Gly(1.00)，Ser(1.02)，Arg(1.07)肽含量76.36%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.38(B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3)，Rf＝0.082.HPLCVydac218TPODS，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑5%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝0.4梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-10%A(在10分鐘內(nèi))，K1＝3.5用相同的步驟，以二-n-丁胺取代乙胺給出Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-N(C4H9)2.
實(shí)施例16制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEta).制備Boc-Pen(4-MBzL)-NHEt用與實(shí)施例15(a)相同的方法，用Boc-Pen(4-MBzL)制備保護(hù)的標(biāo)題氨基酸。
b).制備Fmoc-Asp(O-tBut)-Pen(4-MBzL)-NHEt根據(jù)實(shí)施例15(b)的步驟，制備標(biāo)題化合物。
c).制備Fmoc-AsP(O-芐基-樹脂)-Pen(4-MBzL)NHEt用無水TFA于室溫?cái)嚢?0分鐘脫去實(shí)施例16(b)化合物的Boc保護(hù)基團(tuán)。除去TFA，用重量法測定殘余物TFA。生成的殘余物在乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶，得1.88g(2.5mmol)TFA鹽。然后用4-吡咯烷吡啶(催化劑量)和DCC(2.5mmol)在二氯甲烷中，將它偶聯(lián)到羥甲基樹脂上(1%交聯(lián)，1.82g，1.0mmol)。
d).制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-BzL-樹脂)-Pen-NHEt，是從實(shí)施例16(c)的化合物得到。它是用Boc-Gly，Boc-Arg(Tos)，Boc-Cys(SEt)順序地偶聯(lián)，并用20%哌啶于DMF中脫去保護(hù)的Fmoc基團(tuán)后再乙酰后制得。然后相似于實(shí)施例1的方法，斷裂、環(huán)化和離析。用中壓ODS反相柱和用15%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑的快速色譜法純化，得307mg(48%)純度為97%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C24H41N9O8S2M.W.647.77FAB(M+H)+648.3，(M-H)-646.7AAAAsp(1.00)，Gly(1.04)，Arg(1.03)肽含量69.5%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.53(B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3)，Rf＝0.162.HPLCVydac218TPODS柱，4.5mm×25cm在220nm處檢測。
同溶劑9%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝1.6
梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在15分鐘內(nèi))，K1＝3.9實(shí)施例17制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Na-Ac-Cys(SEt)-D-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Pen(4-MBzL)-MBHA.用中壓ODS反相柱和6%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑的快速色譜法純化，得300mg(50%)純度為95%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C22H37N9O8S2M.W.619.73FAB(M+H)+620.4，(M-H)-619AAAAsp(1.00)，Gly(1.03)，Cys(2.42)，Arg(1.01).
肽含量71.1%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.31(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.542.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑6%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝5.2梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，5-50%(在20分鐘內(nèi))，K1＝3.9
實(shí)施例18制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Tyr(BrZ)-Cys(4-MBzL)-MBHA.用中壓ODS反相柱和11%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑的快速色譜法純化，得350mg(45%)標(biāo)題化合物。用Sepha-dex G-15硅膠過濾，用0.2M乙酸洗脫進(jìn)一步純化，得純度為95%標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C30H44N10O10S2M.W.768.27FAB(M+H)+769.3，(M-H)-767.8AAAAsp(1.00)，Gly(1.00)，Cys(1.91)，Tyr(1.02)肽含量82.75%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.65(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.782.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑9%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝6.4梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，5-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝5.5
實(shí)施例19制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Pen(4-MBzL)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Pen(4-MBzL)-MBHA.用0.01%K3Fe(CN)6溶液將肽環(huán)化。用10%乙腈/水-0.1%TFA從ODS反相柱中洗脫肽，得395mg(60%)標(biāo)題化合物。用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex
G-1.5硅膠過濾進(jìn)一步純化，得純度為95%的標(biāo)題化合物。
物理數(shù)據(jù)M.F.C25H43N9O8S2M.W.661.27FAB(M+H)+662.3，(M-H)-660.1AAAAsp(1.00)，Gly(1.03)肽含量43.7%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.6(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.562.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑10%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝4.4梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，1-50%(在20分鐘內(nèi))，K1＝6.8
實(shí)施例20制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Pen(4-MBzL)-Arg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Cys(SEt)-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA從ODS反相柱中洗脫該肽，得400mg(65%)標(biāo)題化合物。用0.2M乙酸溶液洗脫，用Sephadex
G-15硅膠過濾進(jìn)一步純化，得純度為95%標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C22H37N9O8S2M.W.619.22FAB(M+H)+620.2，(M-H)-618.9AAAAsp(1.00)，Gly(1.07)，Arg(0.85)肽含量62.4%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.61(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.692.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑3%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝8.4梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，1-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝5.8實(shí)施例21制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2
用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-D-Arg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Ser(BzL)-Cys(4-MBzL)-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA從柱中洗脫該肽，得370mg(55%)標(biāo)題化合物。用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾進(jìn)一步純化，得純度為95%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C23H38N10O10S2M.W.678.22FAB(M+H)+679.2，(M-H)-677.2AAAAsp(1.00)，Gly(1.13)，Ser(0.86)，Cys(2.02)，Arg(1.21)肽含量45.5%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.47(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.622.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑3%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝3.6梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，1-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝5.3實(shí)施例22制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Sar-Arg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Pen(4-MBzL)-MBHA.用7%乙腈/水-0.1%TFA從柱中洗脫該肽，得600mg(87%)標(biāo)題化合物。用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾進(jìn)一步純化，得純度為95%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C25H42N10O9S2M.W.690.26FAB(M+H)+691.2，(M-H)-689AAAAsp(1.00)，Gly(1.14)，Arg(1.04)肽含量78.8%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.53(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.672.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑7%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝4.2梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，1-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝6.5實(shí)施例23制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2用與實(shí)施例1相同的方法，在1.0mmol規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Cys(4-MBzL)-MBHA.用3%乙腈/水-0.1%TFA，從ODS反相柱中洗脫該肽，得280mg(47%)標(biāo)題化合物。進(jìn)一步用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾純化，得純度為95%的標(biāo)題肽。
色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.49(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.452.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑3%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝2.7梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，1-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝5.0實(shí)施例24制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-(Et2)Arg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方式，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-(Et2)Arg-Gly-Asp(Ochx)-Pen-MBHA.用9%乙腈/水-0.1%TFA，從柱中洗脫該肽，得590mg(87%)標(biāo)題肽。進(jìn)一步用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾純化，得純度為95%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C26H45N9O8S2M.W.675.82FAB(M+H)+676.4AAAAsp(1.00)，Gly(1.12)肽含量51.77%
色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.45(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.642.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑9%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝3.2梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，5-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝4.2實(shí)施例25制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例1相同的方式，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-D-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Pen-MBHA.用美國專利4，678，758所述的L-異構(gòu)體的同樣方法，制備Boc-D-MeArg(Tos)。用7%乙腈/水-0.1%TFA，從柱中洗脫該肽，得450mg(71%)標(biāo)題肽。進(jìn)一步用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾純化，得標(biāo)題肽。
實(shí)施例26制備Nα-Ac-Nα-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2用實(shí)施例1中所述的在0.5mmol規(guī)模上的固相法制備被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Ser-(BzL)-BHA.用HF斷鍵和用無水乙醚洗滌后，用冰醋酸提出肽，并冰凍干燥得75.8mg(31%)。用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾純化。標(biāo)題化合物洗脫三個(gè)餾份，得60.6mg，純度＞96%。
物理數(shù)據(jù)M.F.C18H32N8O8M.W.488.501FAB(M+H)+489.5AAAAsp(1.00)，Ser(0.48)，Gly(1.09)色譜數(shù)據(jù)TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.25;
(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.31實(shí)施例27制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH2用與實(shí)施例26相同的方法，在0.5mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-BHA.用B∶A∶W，4∶1∶5以逆流分布法(CCD)純化該肽。240mg轉(zhuǎn)移物產(chǎn)生80.8mg四個(gè)餾份。
物理數(shù)據(jù)M.F.C17H30N8O8M.W.474.474FAB(M+H)+475AAAAsp(0.99)，Ser(0.24)，Gly(1.03)，Arg(1.00)色譜數(shù)據(jù)TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.2;
(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.49
實(shí)施例28制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH2用與實(shí)施例27相同的方法，在0.5mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Tyr(BrZ)-BHA。用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾純化該肽。得142.1mg標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C23H24N8O8M.W.550.57FAB(M+H)+551AAAAsp(1.00)，Gly(1.02)，Tyr(1.00)，Arg(0.90)色譜數(shù)據(jù)TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.41;
(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.4實(shí)施例29制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-NH2用與實(shí)施例27相同的方法，在0.5mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzL)-BHA.用B∶A∶W，4∶1∶5，通過CCD的方法來純化，得98.6mg的四個(gè)餾份。用0.2M乙酸洗脫，用Sephadex G-15硅膠過濾進(jìn)一步純化該肽，給出65.7mg的幾個(gè)餾份。
物理數(shù)據(jù)M.F.C14H25N7O6
M.W.387.389FAB(M+H)+388AAAAsp(1.00)，Gly(1.13)，Arg(0.93)色譜數(shù)據(jù)TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.2(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.44實(shí)施例30制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH2用與實(shí)施例27相同的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-D-Ser(BzL)-BHA.用中壓ODS反相柱和0.5%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑進(jìn)行快速色譜純化，得337mg純度為95%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C17H30N8O8M.W.474.474FAB(M+H)+475.3;(M-H)-473.5AAAAsp(1.00)，Ser(0.99)，Gly(0.96)，Arg(1.01)肽含量44.8%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.32.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-
50%A(在30分鐘內(nèi))，K1＝3.4實(shí)施例31制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH2類似于實(shí)施例27的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Val-MBHA.用中壓ODS反相柱和用15%甲醇/水-0.1TFA洗脫劑的快速色譜法純化。得125mg純度＞95%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C19H34N8O7M.W.486.528FAB(M+H)+487.3;(M-H)-485.9AAAAsp(1.00)，Gly(0.99)，Val(1.06)，Arg(0.96)肽含量79.6%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.43(B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3)，Rf＝0.112.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑5%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝1.3梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，6-50%A(在15分鐘內(nèi))，K1＝0.84實(shí)施例32制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH2
用與實(shí)施例27相同的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Arg(Tos)-Gly-AsP(OBzL)-Nal-MBHA.用中壓ODS反相柱和40%甲醇/水-0.1%TFA的色譜法純化。得57mg純度＞98%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C27H36N8O7M.W.584.632FAB(M+H)+585.3;(M-H)-583.9AAAAsp(1.00)，Gly(0.99)，Arg和Nal存在，但共同洗脫。
肽含量81.3%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.60(B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3)，Rf＝0.232.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑18%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝1.2梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，15-50%A(在15分鐘內(nèi))，K1＝2.1用Boc-(Me)Thr取代這一步驟中的Boc-Nal給出Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-(Me)Thr-NH2.
用Boc-Nva取代這一步驟中的Boc-Nal給出Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Nva-NH2.
用Boc-Nle取代這一步驟中的Boc-Nal給出Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Nle-NH2.
實(shí)施例33制備Nα-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH2用與實(shí)施例27相同的方法，在1.0mmol的規(guī)模上，制備、斷裂和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gly-Asp(Ochx)-Phe-BHA.用中壓ODS反相柱和8%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑的快速色譜法純化。得303.4mg純度為98%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C29H46N12O8M.W.690.356FAB(M+H)+691，(M-H)-690AAAAsp(1.00)，Gly(1.00)，Phe(0.91)，Arg(1.89)肽含量56.3%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.4(B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10)，Rf＝0.42.HPLCUltrasphere ODS，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑10%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝2.78梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，10-50%(在20分鐘內(nèi))，K1＝2.8用Boc-HArg(TOS)取代上面合成序列中添加到樹脂上的第五個(gè)殘基的Boc-Arg(Tos)和用Boc-(4′-Me)Phe取代第一個(gè)殘基上的Boc-Phe給出Nα-Ac-HArg-Arg-Gly-Asp-(4′-Me)Phe-NH2.
用Boc-(Et2)2Arg取代上面合成序列中添加到樹脂上的第五個(gè)殘基和用Boc-His(Tos)取代第一個(gè)殘基上的Boc-Phe給出Nα-Ac-(Et2)Arg-Arg-Gly-Asp-His-NH2.
用Boc-Ala取代上面合成序列中添加到樹脂上的第五個(gè)殘基Boc-Arg(Tos)和用Boc-Ile取代第一個(gè)殘基Boc-Phe給出Nα-Ac-Ala-Arg-Gly-Asp-Ile-NH2.
實(shí)施例34制備Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH2-CH2-C6H5a).制備Boc-Asp(OBzL)-NH-(CH2)2C6H5在-15℃，將氯甲酸異丁酯(15.5mmol)加到氬氣流的Boc-Asp(OBzL)(5.0g，15.5mmol)和N-甲基嗎啉(15.5mmol)的50mL無水THF的攪拌溶液中。幾分鐘后加入苯乙胺(2.0mL，15.5mmol)的15mL無水THF溶液，混合物在-15℃維持15分鐘，并熱至室溫。再攪拌2小時(shí)后，過濾反應(yīng)混合物，在真空下將濾液濃縮至干。所生成的殘余物溶于乙酸乙酯(100mL)，連續(xù)地用1MHCl(2×50mL)，水(50mL)，10%Na2CO3(2×50mL)和鹽水(50mL)洗滌。有機(jī)層在無水硫酸鈉上干燥，過濾和濃縮，得5.59mg(85%)無定形白色固體。
b).制備Boc-Gly-Asp(OBzL)-NH-(CH2)2-C6H5室溫30分鐘，用無水TFA(10mL/g)處理除去實(shí)施例12(a)(4.18g，12.8mmol)化合物的Boc-保護(hù)基。在真空下除去TFA，用重量法測定殘余物TFA。用12(a)的方法，將Boc-Gly(2.24mg，12.8mmol)偶聯(lián)到游離胺上。用3∶1乙酸乙酯-己烷混合物洗脫硅膠柱的色譜法純化，得3.35g(54%)淺黃色玻璃狀物質(zhì)。
c).制備Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-NH-(CH2)2C6H5除去實(shí)施例12(b)化合物中的Boc-保護(hù)基團(tuán)(2.61g，6.8mmol)，并用實(shí)施例12(b)的方法，將生成的二肽偶聯(lián)到Boc-Arg(Tos)(3.4g，6.8mmol)上。用乙酸乙酯-異丙醇混合物1∶1作洗脫劑的硅膠柱的快速色譜法純化，得3.41g(63%)白色玻璃狀物質(zhì)。
d)制備Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)NH-(CH2)2C6H5用實(shí)施例12(b)所述的方法，脫去實(shí)施例12(c)化合物的保護(hù)基。游離堿(2.92g，4.2mmol)和醋酸酐(2.0ml，21.2mmol)溶于30mlDMF中，并用二異丙基乙胺0.73ml(4.2mmol)處理。反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，并在真空下濃縮至干。用1∶1乙酸乙酯-異丙醇混合物洗脫，用硅膠柱的快速色譜法提純，得2.94g(95%)白色玻璃狀物質(zhì)。
(e)制備 Ac-Arg-Gly-Asp-NH-(CH2)2C6H5在0℃，30分鐘內(nèi)用無水HF(25ml)處理實(shí)施例12(d)(2.5g)被保護(hù)肽和苯甲醚(2.5ml)。HF蒸出后，用1M乙酸(3×50ml)處理肽-苯甲醚混合物，并用無水乙醚(3×100ml)洗滌水溶液。水提物冷凍干燥得1.52g。用40%甲醇/水-0.1%TFA洗脫的ODS柱，進(jìn)行快速色譜法純化。得326mg97%純度標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C22H33N7O6M.W.491.547FAB(M+H)+492.1;(M-H)-490.6AAAAsp(0.51)，Gly(0.99)，Arg(1.00)肽含量81.2%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.58;(B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3)，Rf＝0.172.HPLCVydac218TPODS柱，4.6mm×25cm，220nm檢測同溶劑12%乙腈/水-0.1%TFA。K1＝2.3梯度A乙腈 B水-0.1%TFA在15分鐘內(nèi)10～50%A，K1＝2.2用同樣步驟，用苯胺取代苯乙胺，給出Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-NHC6H5實(shí)施例35制備Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH2用與實(shí)施例26同樣的方法，制備、從樹脂中斷裂、離析被保護(hù)肽-樹脂中間體，Nα-Ac-MeArg(Tos)-Gly-Asp-Phe-BHA，得標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C24H36N8O7M.W.548.270FAB(M+H)+549.2，(M-H)-547.8
AAAAsp(1.00)，Gly(1.00)，Phe(1.05)，MeArg(1.18)色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.52(B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10)，Rf＝0.462.HPLCUltrasphere
，DDS，4.6mm×25cm，在220nm檢測同溶劑10%乙腈/水-0.1%TFA，K1＝3.43梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA在20分鐘內(nèi)10-50%A。K1＝3.6實(shí)施例36制備Nα-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH2用與實(shí)施例26相同的方法，制備、從樹脂中裂解和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Lys(Clz)-Gly-Asp(OBzL)-Ser(BzL)-BHA，得Nα-Ac-Lys-Gly-Asp-Ser-NH2.將溶于0.1M NaOH(1ml，用4M NaOH調(diào)PH至11)中的O-甲基異脲硫酸氫鹽(0.34g，1.97mmol)溶液加到溶于2mL碳酸鹽緩沖溶液(pH＝10.5)的二肽(100mg，0.197mmol)的溶液中。室溫下靜置過夜后反應(yīng)進(jìn)行二次色譜(Sephadex
G-10，在水中溶脹，用0.1M水合乙酸洗脫)，并將純化的肽冷凍干燥，得48mg的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C18H32N8O8M.W.488.50FAB(M+H)+489.2，(M-H)-487.7
AAAAsp(1.00)，Ser(0.97)，Gly(0.99)，Cys(0.21)，HArg(0.88)色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.33(B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3)，Rf＝0.042.HPLCAltex Ultrasphere
ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑3%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝0.8梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%(在15分鐘內(nèi))，K1＝2.1實(shí)施例37制備Nα-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2用與實(shí)施例26相同的方法(刪去乙?；襟E)制備和從樹脂中斷裂被保護(hù)的肽-樹脂中間體，MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Ser(BzL)-BHA.用與實(shí)施例26相同的方法，純化游離肽，產(chǎn)生標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C16H30N8O7M.W.446.22FAB(M+H)+447.2，(M-H)-445.6AAAAsp(1.00)，Ser(0.95)，Gly(1.00)，MeArg(1.00)肽含量76.74%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.26
(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)，Rf＝0.312.HPLCUltrasphere ODS，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑H2O-0.1%TFA，K1＝0.66梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝0.64實(shí)施例38制備Nα-甲?；?MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2用通常的方法，在0.5mmol的規(guī)模上，制備被保護(hù)的肽-樹脂中間體，MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Ser(BzL)-BHA.用HF脫去末端氨基酸基團(tuán)保護(hù)基后，用乙酸酐(1mL)的甲酸(98%，7mL)的混合物處理樹脂-支撐肽。從樹脂中連續(xù)斷裂得標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C17H30N8O8M.W.474.219AAAAsp(1.00)，Ser(0.97)，Gly(0.98)肽含量78.15%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.37(B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10)Rf＝0.342.HPLCUltrasphere ODS，4.6mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑1%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝2.02，2.69(順式/反式N-甲?；悩?gòu)體)
梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝2.17實(shí)施例39制備Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2如實(shí)施例26的方法，從樹脂中制備和斷裂被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Boc-Gly-MeArg(Tos)-Asp(Ochx)-Ser(BzL)-BHA.用中壓ODS反相柱和1%乙腈/水-0.1%TFA洗脫劑的閃爍色譜法純化游離肽。在四個(gè)餾份中得406mg(80%)純度＞95%的標(biāo)題肽。
物理數(shù)據(jù)M.F.C18H33N9O8M.W.503.245FAB(M+H)+504，(M-H)-502AAAAsp(1.00)，Ser(0.94)，Gly(1.96)，N-MeArg(0.98)肽含量69.97%色譜數(shù)據(jù)1.TLC(B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1)，Rf＝0.292.HPLCAltex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm處檢測。
同溶劑1%乙腈/H2O-0.1%TFA，K1＝1.07梯度A乙腈，BH2O-0.1%TFA，0-50%A(在20分鐘內(nèi))，K1＝2.35實(shí)施例40制備Ala-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2
用與實(shí)施例26相同的方法(省去乙?；襟E)，制備被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Ala-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Ser(BzL)-BHA.用常規(guī)方法以HF從樹脂中斷裂線型肽，得標(biāo)題肽。
實(shí)施例41制備Nα-Ac-Ala-Arg-Gly-Asp-OCH3用銫鹽方法將Boc-Asp-OMe偶聯(lián)到氯甲基樹脂上，得Boc-Asp(O-芐基樹脂)-OMe，其中天冬氨酸通過其側(cè)鏈羧基連在樹脂上。每一個(gè)被保護(hù)氨基酸的三個(gè)當(dāng)量(Boc-Gly，Boc-Arg(Tos)和Boc-Ala)溶于二甲基甲酰胺中，并連續(xù)地用等摩爾的二環(huán)己基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑進(jìn)行偶聯(lián)。偶聯(lián)的程度測定用定性茚三酮分析方法。必要時(shí)，反復(fù)偶聯(lián)。用1∶1三氟乙酸/二氯甲烷處理除去Boc基團(tuán)，并用二氯甲烷洗滌后，用5%二異丙基乙胺/二氯甲烷產(chǎn)生游離胺。最后偶聯(lián)和除去Boc基團(tuán)之后，肽/樹脂用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗滌干燥。用醋酸酐(10等份)和二異丙基胺(10等份)的混合物乙?；摹Ｔ诒郊酌训拇嬖谙?，在0℃用HF處理1小時(shí)。從樹脂中斷裂出脫去保護(hù)基的肽。在0℃用蒸發(fā)方法除去HF，用乙醚(4×，丟棄)洗滌殘余物。并用反相HPLC純化，生產(chǎn)出標(biāo)題化合物。
實(shí)施例42制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Abu-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2用與實(shí)施例3相同的方法，制備、斷裂、環(huán)化和離析被保護(hù)的肽-樹脂中間體，Nα-Ac-Cys(SEt)-Abu-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzL)-Pen(4-MBzL)-MBHA.用中壓ODS反相柱的快速色譜法純化肽，得標(biāo)題化合物。
用Boc-(Et2)Arg取代上面合成序列中的第五個(gè)殘基上的Boc-Abu得Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-(Et2)Arg-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2.
用Boc-(α-Me)Ala取代上面合成序列中的第五個(gè)殘基上的Boc-Abu得Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-(α-Me)Ala-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2.
實(shí)施例43制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-OCH3a).制備NH2-Asp(O-芐基-樹脂)-Cys(4-MBzL)-OCH3在DMF中，H2N-Cys(4-MBzL)-OMe與3當(dāng)量Fmoc-Asp(4-tBuo)、3當(dāng)量1-HOBT和3當(dāng)量二環(huán)己基碳化二亞胺偶聯(lián)。3小時(shí)后，在真空下蒸發(fā)DMF，并用乙酸乙酯把肽研制成粉和過濾。用5%碳酸氫鈉水溶液和水洗滌濾液。有機(jī)相在硫酸鎂上干燥、過濾，并在真空下除去溶劑。用硅膠色譜法進(jìn)一步純化被保護(hù)的二肽。
在0℃下，用50%TFA/二氯甲烷處理Fmoc-Asp(4-tBuo)-Cys(4-MBzL)-OMe1小時(shí)，并在真空下蒸發(fā)溶劑。該殘余物再溶于二氯甲烷、用水洗滌三次，在MgSO4上短暫干燥有機(jī)層。過濾、蒸出溶劑，得Fmoc-Asp-Cys(4-MBzL)-OMe.
用Gisin等人，Helv.Chim.Acta，56，1476(1973)提出的銫鹽方法，將二肽的游離羧酸偶聯(lián)到氯甲基樹脂上。用20%哌啶的DMF溶液(3×10毫升)處理支撐肽的樹脂。用DMF洗滌樹脂三次，得支撐二肽的標(biāo)題樹脂。
b)制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-OCH3在實(shí)施例43(a)中生成的支撐二肽的樹脂，順序地偶聯(lián)到Boc-Gly，Boc-MeArg(Tos)和Boc-Cys(SEt)上，乙?；?，用實(shí)例1的步驟從樹脂上斷裂和環(huán)化。用反相HPLC來純化標(biāo)題肽。
除了起始物質(zhì)用H2N-Cys(4-MBzL)-OEt和(α-Me)HArg(Tos)取代上面合成序列以外，使用類似步驟，可以給出Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-(α-Me)HArg-Gly-Asp-Cys-OEt.
實(shí)施例44制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NHEta)制備H2N-Cys(4-MBzL)-NHEtBoc-Cys(4-MBzL)-OCH3溶于甲醇，冷卻到0℃加入1體積乙胺(預(yù)冷至0℃)。反應(yīng)混合物蓋緊，并在室溫下攪拌八天。反應(yīng)物再冷至10℃，放空，在真空下除去溶劑。殘余物溶于二氯甲烷，用1體積TFA處理，并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。用硅膠色譜法純化標(biāo)題乙酰胺。
b)制備H2N-Asp(O-芐基-樹脂)-Cys(4-MBzl)-NHEt以實(shí)施例44(a)的乙酰胺取代在21(a)步驟中的H2N-(4-MBzL)Cys-OMe，偶聯(lián)到Fmoc-Asp(4-tBuo)，連在氯甲基樹脂上，放出游離胺，生成標(biāo)題化合物。
c)制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NHEt實(shí)施例44(b)中的支撐二肽樹脂，順序地偶聯(lián)到Boc-Gly，Boc-MeArg(Tos)和Boc-Cys(SEt)上，乙?；?，用實(shí)施例1的步驟從樹脂中斷裂和環(huán)化。用反相HPLC純化標(biāo)題五肽。
除了以異丙胺代替乙胺和開始步驟用Boc-Pen(4-MBzl)-OCH3以外，使用同樣步驟，得Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NHC3H7.
實(shí)施例45用適當(dāng)被保護(hù)氨基酸取代實(shí)施例4或11中上面合成序列，得如下的線性肽a)Nα-Ac-Pro-Arg-Gly-Asp-NH2;
b)Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Nle-NH2;
c)Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Met-NH2;
d)Nα-Ac-HArg-Gly-Asp-Leu-NH2;
e)Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Trp-NH2;
f)Nα-Ac-MeArg-Arg-Gly-Asp-Thr-NH2;
g)Nα-Ac-Ala-MeArg-Gly-Asp-(Me)Ser-NH2;
h)Nα-Ac-Arg-(Et2)Arg-Gly-Asp-Ala-NH2;
i)Nα-Ac-Abu-MeArg-Gly-Asp-D-Phe-NH2;
j)Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-D-(Et)Tyr-NH2;
k)Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-HPhe-NH2;和l)Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-(Me)Cys-NH2.
實(shí)施例46依據(jù)實(shí)施例1或20，將適當(dāng)被保護(hù)氨基酸取代上面合成序列，得下述的環(huán)肽a)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2;
b)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-HArg-Gly-Asp-Cys-NH2;
c)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-D，L-APmp-Arg-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;
d)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-MeArg-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2;
e)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Pen-Pro-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2;
f)Cyclo(S，S)-Mpa-Arg-(Et2)Arg-Gly-Asp-(4′-Cl)Phe-D，L-APmp-NH2g)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Pen-Ala-MeArg-Gly-Asp-Trp-Cys-NH2h)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-HArg-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-NH2;
i)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(Me)Thr-Cys-NH2;
j)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-HArg-Gly-Asp-(Et)Tyr-D，L-APmp-NH2;
k)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-D，L-APmp-Arg-Gly-Asp-Leu-Cys-NH2;
l)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-Arg-Gly-Asp-His-Pen-NH2;和m)Cyclo(S，S)-Mpa-Arg-Gly-Asp-(Me)Ser-Cys-NH2.
實(shí)施例47制備Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2用實(shí)施例14的方法(省掉乙?；襟E)，制備標(biāo)題化合物。
實(shí)施例48制備Nα-Phco-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2.
實(shí)施例47(0.5mmol)的化合物在二氯甲烷中攪拌，在0℃用三乙胺(1mmol)處理。加苯甲酰氯(0.6mmol)，反應(yīng)物溫?zé)岬绞覝亍?小時(shí)后，用冰水和二氯甲烷稀釋反應(yīng)物。有機(jī)層分離，用水和5%碳酸氫鈉洗滌，在MgSO4干燥。蒸出溶劑，用中壓ODS反應(yīng)柱，將殘余物進(jìn)行色譜分析，得標(biāo)題化合物。
除了以苯乙酰氯取代外，用同樣步驟，得Nα-PhCH2CO-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2實(shí)施例49制備Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-OH用15(C)步驟，用4-吡咯烷吡啶(0.15g，1mmol)和DCC(620mg，3mmol)的二氯甲烷溶液，將Boc-Pen(4-MBzl)偶聯(lián)到羥甲基樹脂上(1%交聯(lián)，1g，1mmol)。用實(shí)施例1的步驟，偶聯(lián)Boc-Asp(OBzl)，Boc-Gly，Boc-MeArg(Tos)和Boc-Cys(SEt);乙?；?，用HF處理和環(huán)化，得標(biāo)題化合物。
實(shí)施例50用上面詳細(xì)的合成方法，制備下列化合物a)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-(α-Et)HArg-Gly-Asp-Cys-NH2;
b)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-(α-Bzl)Arg-Gly-Asp-Pen-NH2;
c)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-D，L-APmp-MeArg-Gly-Asp-Trp-Cys-NH2;
d)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Pen-D-HArg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys-NH2;
e)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Pen-D-(α-Et)Arg-Gly-Asp-(Et)Ser-Cys-NH2f)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-D-MeArg-Gly-Asp-D-Phe-Cys-NH2;
g)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-D-(α-Et)Arg-Arg-Gly-Asp-D-Cys-NH2;
h)Cyclo(S，S)-Mpr-D-(α-Me)His-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2;
i)Cyclo(S，S)-Pmp-D-Ala-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;
j)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Pen-(α-Me，Et2)Arg-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2;
k)Nα-HCO-Cyclo(S，S)-Cys-(α-Me)Ala-Arg-Gly-Asp-(Me)Pen-Cys-NH2;
l)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-(Me2)Arg-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2;
m)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-Cys-(α-Et)Gly-HArg-Gly-Asp-D-Cys-NH2.
n)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-D-Cys-His-(α-Me)HArg-Gly-Asp-Cys-NH2;和o)Nα-Ac-Cyclo(S，S)-D-Pen-(α-Me)Abu-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH2.
實(shí)施例51用上面詳述的合成方法，制備如下化合物a)Nα-Ac-His-MeArg-Gly-Asp-D-Ala-NH2;
b)Nα-Ac-(Me2)Arg-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-NH2;
c)Nα-Ac-(α-Me，Me2)Arg-Gly-Asp-Nal-NH2;
d)Nα-Ac-(α-Me)HArg-Gly-Asp-(Et)Pen-NH2;
e)Nα-Ac-(α-Bzl)Arg-Gly-Asp-D-Thr-NH2;和f)Nα-PhCO-MeArg-Gly-Asp-D-Leu-NH2.
實(shí)施例52腸胃外劑量單位組合物含實(shí)施例1或2的50mg肽的無菌干粉制劑的制備方法如下20mg肽溶于15ml的蒸餾水中。溶液在無菌條件下過濾進(jìn)入25ml多劑量的安瓿中，并冷凍卻干燥。粉末溶解于20ml5%葡萄糖水溶液(D5W，可再制成靜脈或肌內(nèi)注射液。劑量由注射體積所決定。以后的稀釋可通過把這個(gè)劑量單位所測定的體積加到另一個(gè)D5W的體積中配制用于注射，或者測定的劑量可加到另一種裝置中，以配制這種藥液，比如在瓶中或袋中，供IV點(diǎn)滴輸液用，或供別的注射-輸液方法用。
實(shí)施例53口服劑量單位組合物口服的膠囊是用75mg乳糖和5mg硬脂酸鎂與50mg的肽混合研磨而制成。所得粉末過篩，裝入有硬凝膠的膠囊中。
實(shí)施例54口服劑量單位組合物口服的片劑是用20mg蔗糖、150mg硫酸鈣二水合物和肽與10%明膠溶液混合，制粒而制成。濕粒過篩、干燥，與10mg淀粉、5mg滑石粉和3mg硬酯酸混合，擠壓成片。
上述的說明充分地公開如何制備和使用本發(fā)明。然而本發(fā)明并不限于在此所述的簡明最佳實(shí)施例，而是包括在權(quán)利要求范圍內(nèi)所有的改進(jìn)實(shí)例。
權(quán)利要求
1.一種制備式(Ⅰ)化合物或其藥物可接受鹽的方法其中A為Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Ala，Gly，His，Abu或一種它們的α-R′取代衍生物，或Pro；B為Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，或一和它們的α-R′取代衍生物；C為一種從Tyr，(Alk)Tyr，phe，(4′W)phe，HPhe，phg，Trp，His，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，Cys，(Alk)Cys，Pen，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal中選出的右旋或左旋氨基酸；W為鹵素或Alk；Y為NR1R2或OR3；R1和R2彼此獨(dú)立地為H；Alk或(CH2)pPH；R3為Alk，(CH2)pPH，或當(dāng)B為HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg或一種Arg，HArg，(Me2)Arg或(Et2)Arg的α-R′取代衍生物時(shí)，R3為H；X為R4R5N；R4為H或Alk；R5為H，Alk，HCO，AlkCO，phCH2或ph(CH2)qCO；R′為Alk或phCH2；q，m和n為0或1；以及p為0，1，2或3該方法包括，a).偶聯(lián)被保護(hù)的氨基酸形成一種合適的被保護(hù)的下式化合物其中X、A、B、C，m和n為權(quán)利要求1所定義；[Y″]為氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂，或Y為上述式(Ⅰ)所定義；b).如果必要的話，脫保護(hù)，將肽從樹脂中分離；以及c).選擇制成它的藥物可接受的鹽。
2.一種制備式(Ⅱ)化合物或其藥物可接受鹽的方法
其中A′為一種從Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Ala，Gly，His，Abu，Lys或它們的α-R′取代衍生物;或Pro中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;B′為一種從Arg，HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg，Lys或它們的α-R′取代衍生物中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;C′為一種從Tyr，(Alk)Tyr，Phe，(4′W)Phe，HPhe，Phg，Trp，His，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，(Alk)Cys，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal，或它們的α-R′取代衍生物中選擇出來的右旋或左旋氨基酸;W為鹵素或Alk;Y為NR1R2或OR3;R1和R2彼此獨(dú)立地為H，Alk或(CH2)pPh;R3為Alk，(CH2)pPh，或當(dāng)B為HArg，(Me2)Arg，(Et2)Arg或Arg，HArg，(Me2)Arg及(Et2)Arg的α-R′取代衍生物時(shí)，R3為H;X為R4R5N或H;R4為H或Alk;R5為H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH2或Ph(CH2)qCO，R1為Alk或PhCH2;Z1為Cys，Pen或APmp的右旋或左旋異構(gòu)體;Z2為Cys，Pen或APmp的右旋或左旋異構(gòu)體;q，m和n獨(dú)立地為0，1;以及P為0，1，2或3;該方法包括a).ⅰ.用堿環(huán)化一種選擇保護(hù)的下式化合物
其中X，Z1，A′，B′，C′，Z2，m和n為上述式(Ⅱ)所定義;以及T1和T2為H或一種可除去的基團(tuán);〔Y″〕為氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂;或Y為上述式(Ⅱ)所定義;ⅱ.除去任何保護(hù)基團(tuán)，若有必要，將肽從樹脂中斷裂出來，以及ⅲ.選擇制成它的藥理可接受鹽;或者b).ⅰ.選擇保護(hù)的下式化合物的氧化環(huán)化
其中X，Z1，A′，B′，C′，Z2，Y，m和n為上述式(Ⅱ)所定義;〔Y″〕為氯甲基、二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂，Y為上述式(Ⅱ)所定義;ⅱ.除去任何保護(hù)基團(tuán)，若有必要，將肽從樹脂上斷裂下來，以及ⅲ.選擇制成它的藥理可接受鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中〔Y″〕為二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中用HF除去保護(hù)基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，該方法包括氧化環(huán)化，其中氧化劑為堿金屬的鐵氰化物，氧氣，碘或二碘甲烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，該方法包括堿催化環(huán)化，其中T1和T2中的一個(gè)為H，T1或T2中的另一個(gè)為烷基或芳硫基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中C為Ser，(Me)Ser，Thr，Tyr，Phe，Nal或Val。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中C′為Ser，(Me)Ser，Thr，Tyr，Phe或Nal。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一權(quán)利要求的方法，其中A或A′為Gly或Arg。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一權(quán)利要求的方法，其中B′或B為HArg或一種Arg或HArg的α-R′取代衍生物，其中不是m為0就是n為0。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中m和n為0。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一權(quán)利要求的方法，其中B或B′為MeArg。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，制備的化合物為Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH2;Nα-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH2-CH2-C6H5;Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH2;Nα-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH2;Nα-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;Nα-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;Nα-Formyl-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;或Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2;或它們的藥物可接受的鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，制備的化合物為Nα-Ac-Cyclo(S，S) Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S) Cys-Arg-Gly-Asp-(D，L)APmp-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S) Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;Cyclo(S，S)Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(Me)Ser-Cys-NH2;Cyclo(S，S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2;Cyclo(S，S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2;Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Arg(Et2)-Gly-Asp-Pen-NH2;或Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2;或它們的藥物可接受的鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，制備Nα-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH2。
16.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2，它包括a).用堿環(huán)化一種選擇保護(hù)的下式化合物
其中T1和T2為H或一種可移除的基團(tuán);或者b).氧化環(huán)化下式化合物
17.一種制備Nα-Ac-Cyclo(S，S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2的方法，它包括a).用堿環(huán)化一種選擇保護(hù)的下式化合物
其中T1和T2為H或一種可替換的基團(tuán);或者b).氧化環(huán)化下式化合物
18.一種制備藥物組合物的方法，它包括將一種權(quán)利要求1所定義的式Ⅰ化合物，或權(quán)利要求2所定義的式Ⅱ化合物，或其藥物可接受的鹽，和一種藥用載體進(jìn)行配制。
19.一種制備藥劑組合物的方法，它包括將一種權(quán)利要求1所定義的式Ⅰ化合物，或權(quán)利要求2所定義的式Ⅱ化合物，或其藥物可接受的鹽，一種纖維蛋白溶解劑和一種藥用載體進(jìn)行配制。
20.一種制備藥物組合物的方法，其中纖維蛋白溶解酶為鏈激酶，尿激酶，前尿激酶或tpA，或它們的突變物或衍生物。
21.一種下式化合物X-(A)m-B-Gly-Asp-(C)n-〔Y′〕其中X，A，B，C，m和n為權(quán)利要求1所定義;〔Y′〕為氯甲基、二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂。
22.一種下式化合物
其中X，Z1，A′，B′，C′，Z2，m和n為權(quán)利要求2所定義;T1和T2為H或可移除的基團(tuán);〔Y″〕為氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂，或Y為權(quán)利要求2所定義。
23.一種制備下式化合物的方法
其中X，Z1，A′，B′，C′，Z2，m和n為權(quán)利要求3所定義;以及
T1和T2為H或可移除的基團(tuán);〔Y″〕為氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂，或者Y為權(quán)利要求2所定義，它包括偶聯(lián)合適的被保護(hù)氨基酸。
24.權(quán)利要求1所定義的式(Ⅰ)化合物或權(quán)利要求2所定義的式(Ⅱ)化合物用作一種抑制血塊形成或血小板聚集的藥物。
25.權(quán)利要求1所定義的式(Ⅰ)化合物或權(quán)利要求2所定義的式(Ⅱ)化合物和一種纖維蛋白溶解劑用作一種纖維蛋白溶解療法的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及能有效地抑制血小板聚集的化合物，能產(chǎn)生如此作用的藥物組合物，抑制哺乳動物形成血小板聚集和血塊的方法以及抑制在纖維蛋白溶解療法后的血管的再阻塞的方法。
文檔編號C07K7/50GK1040203SQ89104419
公開日1990年3月7日 申請日期1989年5月9日 優(yōu)先權(quán)日1988年5月9日
發(fā)明者法迪亞·埃爾-費(fèi)海爾·阿里, 詹姆斯·馬丁·沙曼倫, 羅納德·約翰·謝布斯基 申請人:史密絲克萊恩貝克曼公司