專利名稱：一段人型支原體dna序列(4)特異性的確定及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段人型支原體(Mycoplasma hominis)DNA序列(4)特異性的確定及其應用，屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人型支原體是一種人類生殖器經(jīng)常感染的病原物，可引發(fā)許多泌尿生殖道疾病，準確的診斷是進行即時而可靠的治療的依據(jù)，目前只能根據(jù)臨床指征進行診斷。PCR和基因芯片診斷是一種快速而準確的檢測方法。而這一類的診斷方法依賴于獲得特異的核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于通過生物信息學和分子生物學技術(shù)，確定了一段人型支原體特異核苷酸序列及其PCR引物。該序列和相應的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法進行人型支原體的診斷。
本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明利用現(xiàn)有的方法確定了長度為202bp的一段人型支原體特異DNA序列(4)及其PCR引物，用引物進行PCR擴增，其序列如下ttcacctgtc acaccatcaa atctatatgc gttgaagttt ggatcacgtg ggtcatcaaa 60gctcttaact gtaactttaa ttcttgggtc tagttcagaa aaaacgtttt taactttttc 120tcatgcatta atgtatagtt gtggagcatt taaatatcta aatcctactt caaattcaat 180tgtttgtttt tcgggatcgg ta 202引物序列為1.5’-taccgatcccgaaaaacaaa-3’2.5’-ttcacctgtcacaccatcaaa-3’上述人型支原體的特異DNA序列(4)用于診斷人型支原體的基因芯片的探針序列，并通過上述的引物序列進行PCR擴增，標記后進行雜交檢測或直接用于PCR診斷。
用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低等優(yōu)點。


圖1為臨床標本的PCR擴增圖譜。
圖2、圖2續(xù)是測序圖。其中圖2是測定的序列、圖2續(xù)是原始測序圖譜。
圖3是用Blast軟件對PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果與預計序列的比較分析。
圖4、圖4續(xù)是基因數(shù)據(jù)庫中Blast搜索結(jié)果。
圖5為基因芯片雜交結(jié)果。
具體實施例方式首先以人型支原體為關(guān)鍵詞，在基因數(shù)據(jù)庫中搜索人型支原體的核苷酸序列。共獲得數(shù)條關(guān)系較密切的核苷酸序列，將這些核苷酸序列用NCBI網(wǎng)上的Blast在線使用軟件比對基因數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列(nr)，排出非特異性的核苷酸序列，獲得了1Kb特異性的核苷酸序列。以這段序列設計了20余對PCR引物，以臨床標本提取DNA，進行PCR擴增，篩選到一對適合進行PCR擴增的序列及引物，PCR擴增獲得的產(chǎn)物與預計大小一致(見圖1，圖中序號為1.標準分子量DNA，分子量大小從上至下分別為622，527，404，309，242/238，217，201，190，180，160+160，147+147，123；2.4.5臨床陰性標本，沒有擴增產(chǎn)物；3.臨床陽性標本，擴增產(chǎn)物很純，大小200左右，與預計大小一致。圖譜結(jié)果顯示用本發(fā)明中的引物能特異的擴增臨床樣品)，然后用T-vector進行克隆，并測序(測序報告見圖2、圖2續(xù)，圖中從55位開始，到256位，共202bp為克隆序列，其余序列為克隆載體序列)，序列為202bp，通過Blast軟件比對預計序列，顯示與預計的序列一致(見圖3，圖中除第90位由g改變成a，第104位和132位由a改變成c外，其余均與預計序列一致)，表明該序列可以被特異性的擴增，可用于人型支原體PCR檢測。序列用NCBI網(wǎng)站的Blast搜索基因數(shù)據(jù)庫的DNA(包含cDNA)序列，該序列只與人型支原體的序列一致，而與其它的物種序列沒有同源性(見圖4、圖4續(xù)，圖中搜尋結(jié)果表明，只有人型支原體的質(zhì)粒DNA序列與本序列同源，并且是完全配對。而其它的序列只有40字符左右的短序列，由于這些序列沒有引物與此配對，故在檢測中不會被檢測到)。用這一序列標記后作為探針與含有9種泌尿生殖道感染病原物的45個基因位點的基因芯片雜交，只有本發(fā)明序列與此有雜交信號，而其它所有序列與此無雜交信號(見圖5，圖中是四個重復，每個重復含9種泌尿生殖道感染性疾病病原物共45個不同的位點和4個對照位點。雜交結(jié)果表明只有本序列有特異信號，而其它均無雜交信號)，表明該序列為人型支原體的特異序列。
本發(fā)明可用于PCR方法或基因芯片方法進行人型支原體的臨床檢測。用本發(fā)明提供的序列進行PCR擴增，根據(jù)PCR方法獲得產(chǎn)物是否出現(xiàn)和大小判斷是否為人型支原體感染。也可用本序列為探針，作為基因芯片中的一個檢測位點，然后用本發(fā)明中的PCR引物序列擴增臨床標本，并標記后進行雜交檢測。
說明書序列表SEQUENCE LISTING<110>昆明寰基生物芯片開發(fā)有限公司<120>一段人型支原體DNA序列(4)特異性的確定及其應用<130>
<140>02133331.9<141>2002-06-20<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>202<212>DNA<213>人型支原體(Mycoplasma hominis)<220>
<221>gene<222>(1)..(202)<223>
<400>1ttcacctgtc acaccatcaa atctatatgc gttgaagttt ggatcacgtg ggtcatcaaa60gctcttaact gtaactttaa ttcttgggtc tagttcagaa aaaacgtttt taactttttc120tcatgcatta atgtatagtt gtggagcatt taaatatcta aatcctactt caaattcaat180tgtttgtttt tcgggatcgg ta 20權(quán)利要求
1.一段人型支原體DNA序列(4)特異性的確定，其特征在于該序列的長度為202bp，序列及PCR引物如下ttcacctgtc acaccatcaa atctatatgc gttgaagttt ggatcacgtg ggtcatcaaa 60gctcttaact gtaactttaa ttcttgggtc tagttcagaa aaaacgtttt taactttttc 120tcatgcatta atgtatagtt gtggagcatt taaatatcta aatcctactt caaattcaat 180tgtttgtttt tcgggatcgg ta 202引物序列為1.5’-taccgatcccgaaaaacaaa-3’2.5’-ttcacctgtcacaccatcaaa-3’
2.一段人型支原體DNA序列(4)特異性的應用，其特征在于該序列用于診斷人型支原體的基因芯片的探針序列，并通過上述的引物序列進行PCR擴增，標記后進行雜交檢測或直接用于PCR診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段人型支原體DNA序列(4)的特異性確定及其應用，屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因數(shù)據(jù)庫資料的搜尋和分析，確定了一段人型支原體DNA序列(4)的特異性及PCR擴增引物，該序列長度為202bp。通過對人類生殖道人型支原體感染標本的PCR擴增，克隆，獲得該序列，測序證明與預計序列一致。再經(jīng)生物信息學方法分析，基因芯片雜交分析，結(jié)果證實了該序列對于人型支原體的特異性。本發(fā)明作為基因芯片診斷的探針及PCR擴增檢測序列，用于人型支原體的診斷。用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低等優(yōu)點。
文檔編號C07H21/04GK1492052SQ0213333
公開日2004年4月28日 申請日期2002年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者譚德勇, 朱寶生 申請人:昆明寰基生物芯片開發(fā)有限公司