Sso7d-Sau重組DNA聚合酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種Sso7d-Sau重組DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA聚合酶I(Sau)蛋白序列N端以柔性連接序列共價連接Sso7d蛋白而得到的雜合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼該蛋白的基因以及該蛋白的制備方法和用途。本發(fā)明改造后的DNA聚合酶催化活力維持不變，但是持續(xù)合成能力顯著提高，并且對鹽的耐受性提高，在田間和現(xiàn)場檢測過程中能夠顯著提高重組酶介導(dǎo)的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)的DNA擴(kuò)增效果，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】Sso7d-Sau重組DNA聚合酶

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，涉及一種Sso7d-Sau重組DNA聚合酶。

【背景技術(shù)】
[0002] 在生物學(xué)研宄、醫(yī)學(xué)檢驗、法醫(yī)鑒證及農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域，核酸的擴(kuò)增都是一種非常 重要的技術(shù)。目前，應(yīng)用最為廣泛的核酸擴(kuò)增技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)。PCR技術(shù)利用反應(yīng)溫度的循環(huán)變化來實現(xiàn)目的序列的變性、復(fù)性和延伸， 能夠在2-3小時之內(nèi)實現(xiàn)目的序列的指數(shù)級擴(kuò)增。然而，由于PCR技術(shù)依賴體積大、耗電量 高、價格昂貴的PCR儀來實現(xiàn)，限制了其在現(xiàn)場及田間檢測中的廣泛應(yīng)用。
[0003] 近些年，在DNA、RNA合成的分子生物學(xué)領(lǐng)域有許多的研宄進(jìn)展，許多在體內(nèi)核酸 擴(kuò)增過程中發(fā)揮重要輔助作用的蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)。在這些研宄進(jìn)展的基礎(chǔ)上，人們開發(fā)了 多種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)、鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)核酸恒 溫擴(kuò)增技術(shù)，及重組酶介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)等。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù) 除了脫離PCR儀，能夠在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的優(yōu)勢以外，有一些恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù) 還對一些擴(kuò)增反應(yīng)的抑制因素具有更高的耐受能力。
[0004] 重組酶介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)是新近開發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)之一。該技術(shù)模擬生 物體內(nèi)DNA的復(fù)制過程，利用酵母Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白來介導(dǎo)模板鏈的解鏈以 及實現(xiàn)模板和擴(kuò)增引物之間的鏈替換；在SSB蛋白的輔助下，DNA聚合酶可以對鏈替換后的 DNA實現(xiàn)特異性的延伸。該技術(shù)由ATP供能，并由磷酸肌酸催化實現(xiàn)ATP的再生。37°C恒溫 條件下，重組酶介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)能夠在20-60min之內(nèi)實現(xiàn)對目的片段的指數(shù)級別擴(kuò) 增。該技術(shù)還能夠與SYBR green I，SYT0-13或SYT0-82等共同作用，利用肉眼可見熒光染 料來對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判斷。這樣既可以避免反復(fù)開關(guān)反應(yīng)管而造成交叉污染的問題，又無 需依賴具有致癌性的核酸電泳試劑以及昂貴的凝膠成像系統(tǒng)，使得重組酶介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增 技術(shù)的應(yīng)用與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比更加便捷，也更加適用于現(xiàn)場和田間檢測使用。
[0005] 重組酶介導(dǎo)的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)中使用的DNA聚合酶是枯草芽孢桿菌DNA聚合酶 I (Bacillus subtilis Pol I，Bsu)或金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Pol I， Sau)，這兩種DNA聚合酶均屬于DNA聚合酶I家族。DNA聚合酶I家族是負(fù)責(zé)DNA復(fù)制過程 中損傷修復(fù)的聚合酶，該家族中大部分DNA聚合酶的持續(xù)合成能力都不高，也就是說該家 族的聚合酶與模板結(jié)合一次能催化的聚合反應(yīng)數(shù)目較少。
[0006] Sso7d是一種來源于嗜熱菌種Sulfolobus solfataricus的非特異性DNA結(jié)合蛋 白。有研宄表明，將Ss〇7d與來源于DNA聚合酶I家族和II家族的高溫DNA聚合酶共價連 接，能夠顯著提高高溫DNA聚合酶的持續(xù)合成能力。另外，還有研宄證明，低溫DNA結(jié)合輔 助蛋白（37°C )能夠在高溫（60°C )發(fā)揮DNA結(jié)合的作用，也就是說，DNA結(jié)合蛋白有可能 在非最適條件下也能正常發(fā)揮作用。因此，將Ss〇7d與低溫DNA聚合酶Sau共價連接或許 能夠為DNA聚合酶的改造提供一種新的思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種Sso7d_Sau重組DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA 聚合酶I (Sau)N端共價連接來源于嗜熱菌種Sulfolobus solfataricus的DNA結(jié)合蛋白 Ss〇7d，力求克服DNA聚合酶I家族中大部分DNA聚合酶的持續(xù)合成能力不高的問題。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供編碼上述Sso7d_Sau重組DNA聚合酶的基因。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述Sso7d_Sau重組DNA聚合酶的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的是提供上述Sso7d_Sau重組DNA聚合酶的用途。
[0011] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0012] 一、一種Sso7d-Sau重組DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)蛋 白序列N端以柔性連接序列共價連接Sso7d蛋白而得到的雜合DNA聚合酶，其氨基酸序列 如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。
[0013] 二、編碼上述的Sso7d-Sau重組DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0014] 三、上述的Sso7d_Sau重組DNA聚合酶的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0015] (1)根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的Sau基因序列以及Sso7d基因序列信息設(shè)計并合成 引物，并通過Overlap PCR技術(shù)擴(kuò)增得到帶有純化標(biāo)簽、酶切位點(diǎn)的Sso7d_Sau序列；
[0016] (2)將步驟（1)中得到的Sso7d-Sau克隆至表達(dá)載體pTrc99A中構(gòu)建重組載體 pTrc99A-Sso7d-Sau ；
[0017] (3)表達(dá)載體pTrc99A-Sso7d_Sau轉(zhuǎn)化大腸桿菌、誘導(dǎo)表達(dá)得目的蛋白 Sso7d_Sau〇
[0018] 四、上述的Sso7d-Sau重組DNA聚合酶在常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中的應(yīng)用。
[0019] 采用上述技術(shù)方案的積極效果：本發(fā)明對恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中DNA聚合酶進(jìn)行了 分子生物學(xué)改造，改造后聚合酶的持續(xù)合成能力得到有效提高，并且在重組酶介導(dǎo)的核酸 恒溫擴(kuò)增反應(yīng)中對鹽的耐受性大幅提高；在田間和現(xiàn)場進(jìn)行核酸檢測時，由于采用比較簡 便的DNA提取技術(shù)，因此DNA樣品模板常不夠純，可能含有鹽離子等擴(kuò)增抑制類物質(zhì)；改造 后的DNA聚合酶，由于對鹽具有更高的耐受能力，因此在田間和現(xiàn)場檢測過程中能夠顯著 提高重組酶介導(dǎo)的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)的DNA擴(kuò)增效果，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是Ss〇7d、Sau蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果及共價連接位置指示；
[0021] 圖2是pTrc99A-Sso7d-Sau重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；
[0022] 圖3是pTrc99A-Sso7d-Sau重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；
[0023] 圖中，M Marker，lpTrc99A-Sso7d_Sau 質(zhì)粒，2pTrc99A-Sso7d_Sau 質(zhì)粒雙酶切產(chǎn) 物；
[0024] 圖 4 是 Sso7d_Sau 蛋白 SDS-PAGE 分析結(jié)果；
[0025] 圖中，M Marker，l誘導(dǎo)前，2誘導(dǎo)后，3上清，4沉淀，5流穿，6目的蛋白（約75KD);
[0026] 圖5是Sau和Sso7d_Sau持續(xù)合成能力檢測的電泳峰圖；
[0027] 圖中，橫坐標(biāo)表示加入的核苷酸量，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度；
[0028] 圖 6 是 Sau、Sso7d_Sau 和 Sau_TBD(+thioredoxin)鹽耐受度比較的電泳圖。

【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合實施例和對比例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)理解為對 本發(fā)明的限制：
[0030] 本發(fā)明中的生物材料來源：
[0031] 1、金黃色葡萄球菌CICC21600購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，大腸桿菌 BL21 (DE3)購自 Novagen 公司；
[0032] 2、所用引物及含有Sso7d-linker基因的質(zhì)粒pUC57-Sso7d-linker委托中國華大 基因生物科技有限公司合成；
[0033] 3、所用載體 pTrc_99A 和 pET28a 購自 Novagen 公司。
[0034] 實施例1
[0035] 本實施例用于說明Sso7d_Sau片段的獲取。
[0036] 1、合成 Sso7d_linker 序列如 SEQ ID No. 3 所不，其中 Sso7d 序列參照 GenBank 中公布的序列信息（NCBI參考序列號為NC_002754. I)，linker序列為GGAGGCGGAGGCTCA GGAGGCGGAGGCTCA GGAGGCGGAGGCTCAo
[0037] 2、Sso7d-linker序列及GenBank已經(jīng)公布的Sau基因序列（NCBI參考序列號為 ΥΡ_006237943· 1)設(shè)計并合成引物：
[0038] Sso_F:5' -CATGCCATGGCAACAGTAAAGTTCAA-3' (NcoI)(SEQ ID No. 4)
[0039] Linker_R :5, -GTCGACGCTTGCTGATGAGCCTCCG-3'（SEQ ID No. 5)
[0040] PS_F :5' -CGGAGGCTCATCAGCAAGCGTTG-3'（SEQ ID No. 6)
[0041] PS_R :5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTTTGCATCATACCAAGTTGC-3' (NotI)(SEQ ID No. 7)
[0042] 3、采用特異性引物Sso_F/Linker_R以人工合成的含有Sso7d-linker基因的質(zhì)粒 pUC57-Ss〇7d-linker為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用特異性引物PS_F/PS_R，以金黃色葡萄球 菌CICC21600的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為PrimeSTAR HS(TAKARA) 建議的常規(guī)擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)程序：98°C預(yù)變性2min，98°C變性10s，55°C退火30s，72°C 延伸lmin，循環(huán)27次，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0043] 4、用PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒分別進(jìn)行Sso7d-linker和Sau片段的回收，步驟如 下：
[0044] (1)在紫外燈下使用手術(shù)刀片快速切下目的片段瓊脂糖凝膠，放入I. 5ml離心管 中。
[0045] (2)按 1:3 的比例加入 Extraction Buffer。
[0046] (3)在50°C恒溫水浴鍋放置10min，每隔2min輕柔顛倒。
[0047] (4)將上一步中混合液加入Spin column中，6000 Xg離心lmin，倒掉收集管液體。
[0048] (5)向 Spin column 內(nèi)加 500 μ I Extraction Buffer，于 12000 X g 離心 lmin，棄 去接液內(nèi)液體。
[0049] (6)向 Spin column 內(nèi)加 750 μ I Wash Buffer，于 12000 X g 離心 lmin，棄去接液 管內(nèi)液體。
[0050] (7)將 Spin column 放回收集管內(nèi)，12000Xg 離心 lmin。把 Spin column 放到無 菌的I. 5ml Ep管內(nèi)。
[0051] (8)向 Spin column 內(nèi)加 50 μ I Elution Buffer，并于室溫靜置 lmin。于 12000 X g 離心lmin，微量離心管內(nèi)溶液中含有目的DNA片段。存放-20°C。
[0052] 5、以 Sso7d-linker 和 Sau片段為模板，以 Sso_F*PS_R為引物進(jìn)行 Overlap PCR。 擴(kuò)增體系為：
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種Sso7d-Sau重組DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)蛋白序 列N端以柔性連接序列共價連接Sso7d蛋白而得到的雜合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基 酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的Sso7d-Sau重組DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
3. 權(quán)利要求1所述的Sso7d-Sau重組DNA聚合酶的制備方法，其特征在于：該方法包 括以下步驟： (1) 根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的Sau基因序列以及Ss〇7d基因序列信息設(shè)計并合成引物， 并通過Overlap PCR技術(shù)擴(kuò)增得到帶有純化標(biāo)簽、酶切位點(diǎn)的Sso7d_Sau序列； (2) 將步驟（1)中得到的Sso7d-Sau克隆至表達(dá)載體pTrc99A中構(gòu)建重組載體 pTrc99A-Sso7d-Sau ； (3) 表達(dá)載體pTrc99A-Sso7d_Sau轉(zhuǎn)化大腸桿菌、誘導(dǎo)表達(dá)得目的蛋白Sso7d_Sau。
4. 權(quán)利要求1所述的Sso7d-Sau重組DNA聚合酶在常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/195GK104480081SQ201410752979
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】程奇, 翟冰, 周國輝, 李賢禎, 劉國憲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所