一種從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法
【專利摘要】一種從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工及副產(chǎn)品綜合利用領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括以下步驟：（1）大豆乳清的預處理；（2）大豆乳清蛋白的初級分離；（3）大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復凝聚；（4）回收Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制劑。原料預處理，初級分離后經(jīng)復凝聚得到終蛋白多糖復合物，終蛋白多糖復合物經(jīng)超濾除糖，超濾脫鹽，二次離心后即得含有純化Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制劑的蛋白溶液，該蛋白溶液經(jīng)過真空冷凍干燥得到Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制劑高純度樣品。本發(fā)明對大豆乳清綜合利用，設(shè)備要求低，操作簡單，無環(huán)境污染。且胰蛋白酶抑制劑回收率高，純度高，蛋白活性高。
【專利說明】一種從大豆乳清中回收Kun i tz及Bowman-B i rk型胰蛋白酶抑制劑的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及大豆乳清蛋白的回收方法，具體是指一種利用聚陰離子多糖回收大豆乳清中的Kunitz及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工及副產(chǎn)品綜合利用領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]大豆乳清蛋白是殘存于大豆乳清中不能為酸所沉淀的蛋白質(zhì)，在大豆乳清蛋白中2S組分所占的比重較大；乳清蛋白質(zhì)中除含有球蛋白、白蛋白之外，還主要含有:①Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI，ρΗ3.0-10.0，20kDa)；②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制劑(BBI，pH3.0-10.0,20KDa) ；(3) β -淀粉酶(61.7KDa) 凝集素(pH2.2-10.8,120KDa) 脂氧合酶(L0X，102KDa)等多種生理活性物質(zhì)，約占大豆蛋白的9%_15.3%。
[0003]在醫(yī)學和生物學中，抑制劑已成為蛋白水解研宄的有用工具。由于蛋白酶抑制劑在控制涉及一些疾病如膜腺炎、休克和肺氣腫的蛋白酶方面，以及作為調(diào)節(jié)劑用于調(diào)節(jié)哺乳動物受精作用方面的治療潛力，它們是尤其受關(guān)注的。蛋白酶抑制劑已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制調(diào)控一些關(guān)鍵代謝功能的多種其它關(guān)鍵跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部給藥對于例如特應性皮炎的病癥是有用的，特應性皮炎是皮膚炎癥的一種普通形式，其可以局限于少數(shù)區(qū)塊或涉及身體的大部分。蛋白酶抑制劑的褪色活性和它們防止紫外線導致的色素沉著的能力在體外和體內(nèi)均已被證明。蛋白酶抑制劑還被報道有利于創(chuàng)傷愈合。例如，分泌性白細胞蛋白酶抑制劑被證明當被局部施用時逆轉(zhuǎn)了組織的破壞并加速了創(chuàng)傷愈合過程。此外，絲氨酸蛋白酶抑制劑還能夠有助于在紅斑狼瘡病人中降低疼痛。
[0004]目前，大豆胰蛋白酶抑制劑抗營養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白質(zhì)消化吸收和造成胰腺腫大兩個方面。這些被認為影響人類消化吸收的具有生物活性的大豆乳清蛋白，現(xiàn)在對預防治療某些疾病具有顯著效果，這使得大豆乳清成為一種有效的原料來源。例如，低濃度的胰蛋白酶抑制劑是廣譜抗致癌因子，能預防結(jié)腸癌、肝癌、口腔癌、肺癌等多種癌癥的發(fā)生，還有降低膽固醇水平的作用；能增強胰臟生長和增加胰消化酶的活性，且對動物內(nèi)皮細胞生長因子具有活化作用；能控制腎小球腎炎或腎盂腎炎的一些炎癥發(fā)展過程。此外，微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)有一定效果。醫(yī)藥上提取胰蛋白酶抑制劑(抑肽酶)治療急性胰腺炎。
[0005]已有大量文獻報道了大豆乳清蛋白的回收方法。CN1954689和CN1364765公開的膜分離制備和提取大豆乳清蛋白的方法。例如CN1537865公開的從大豆黃漿水提取乳清蛋白、核酸等成分；CN1027812公開了了從乳清工藝流中回收和分離大豆乳清蛋白和其它組分的方法。CN102746375公開的一種具有抗腫瘤作用的大豆乳清蛋白的制備方法?，F(xiàn)有技術(shù)均采用膜分離或者離子交換層析等方法，一般具有復雜紛繁的流程。本發(fā)明采用了天然可食性的聚陰離子多糖作為回收材料，充分利用蛋白與多糖的復凝聚原理，其形成的復凝聚物既可以作為食品材料直接利用，也可以完整實現(xiàn)蛋白與多糖的分離。從資源回收利用的角度來看，本發(fā)明不僅可以有效降低大豆乳清的抗營養(yǎng)組分，還可以制備具有高純度及生理活性的兩種胰蛋白酶抑制劑組分。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種簡單易于操作的實驗室規(guī)模制備回收并純化Kunitz(KTI)及Bowman -Birk (BBI)型胰蛋白抑制劑的方法，該發(fā)明制備的KTI及BBI純度約90%-93%，仍然保持天然的胰蛋白酶抑制劑活性。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman -Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，步驟為:
(1)大豆乳清的預處理:將大豆乳清調(diào)至pH4.5-4.8，9500rpm離心30min除沉淀；再次調(diào)至pH 8.0-10.0，9500rpm離心30min，收集上清液，得試驗用大豆乳清液；用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH ；
(2)大豆乳清蛋白的初級分離:量取一定體積的上述大豆乳清液，調(diào)節(jié)pH至4.5-5.0，在4-30°C下，加入硫酸錢至終飽和度為30%-40%，9500rpm離心30min，收集沉淀，加入去離子水溶解，使蛋白質(zhì)量終濃度為1%_10%，截留分子量3500透析脫鹽36-48h，截留液真空冷凍干燥，獲得含有Kunitz及Bowman - Birk型兩種胰蛋白酶抑制劑的大豆乳清蛋白組分；
(3)大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復凝聚:將步驟(2)制備的大豆乳清蛋白組分，用去離子水配制w/v終濃度為0.1%-0.4%的大豆乳清蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0，并同時配制w/v0.l%-0.4%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0 ;向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入v/v
2.5% -10%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至5.0-3.0，4000rpm離心20min，收集沉淀；對上清液再次加聚陰離子多糖溶液重復沉淀1-2次，合并沉淀物，即得Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陰離子多糖的復凝聚物；
合并上述去沉淀后的上清液，繼續(xù)緩慢加入v/v 5% -10%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至4.5-3.8，4000rpm離心20min，收集上清液，即得含有Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑與聚陰離子多糖的復合物溶液。
[0008](4)回收Kunitz及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑:將得到的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑/聚陰離子多糖的復凝聚物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0-9.0，過超濾膜100kD-300kD除糖，收集濾過液；截留分子量3000-4000超濾脫鹽，截留液真空冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑；
將得到的Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑/聚陰離子多糖的復合物溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0-9.0，過超濾膜100kD-300kD除糖，收集濾過液；截留分子量3000-4000超濾脫鹽，截留液真空冷凍干燥，即得純化的Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑。
[0009]所述pH調(diào)節(jié)劑為:酸性:有機酸:包括但不限于甲酸、乙酸；無機酸:包括但不限于鹽酸，硫酸；優(yōu)先選擇無機酸；堿性:包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，優(yōu)先選擇氫氧化鈉；
所述聚陰離子多糖包括但不限于:卡拉膠，硫酸酯化半乳聚糖及其它硫酸酯化多糖，阿拉伯膠，海藻酸鈉，果膠；優(yōu)先卡拉膠；其相對分子量范圍大于300kD，但不超過2000kD。
[0010]步驟(I)大豆乳清的來源包括:常規(guī)的大豆分離蛋白生產(chǎn)形成的副產(chǎn)物，以及實驗室利用脫脂豆柏，經(jīng)醇洗后，提取分離蛋白后的乳清液；大豆乳清的預處理，其條件為:生產(chǎn)大豆分離蛋白的大豆乳清需經(jīng)pH4.5靜止l-2d，離心脫沉淀，以脫出殘留大豆分離蛋白。
[0011]步驟(2)大豆乳清蛋白的初級分離，其條件為:在進行鹽析處理前，優(yōu)先將大豆乳清液重新調(diào)整PH至酸性4.5-4.8范圍內(nèi)；溫度范圍以低溫最為適宜，包括但不限于4-30°C;其硫酸銨飽和度應不低于30%，但不高于40%，優(yōu)先選擇高飽和度；其相應硫酸銨飽和度需按照硫酸銨飽和度表，根據(jù)實際溫度，控制操作；沉淀溶解需加入2-4倍體積的去離子水，溶解完全；脫鹽處理包括但不限于透析，超濾，納濾，需保證脫鹽完全。
[0012]步驟(3)大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復凝聚，其條件為:優(yōu)先選擇等濃度的蛋白溶液與多糖溶液按照上述比例混合；若選擇不等濃度溶液進行混合，需保證最終濃度比與以上混合比一致。
[0013]步驟(4)回收Kunitz及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑，其條件為:除糖超濾膜截留分子量范圍不小于100kD，且不大于300kD ;脫鹽處理包括但不限于超濾，透析，納濾，需保證脫鹽完全；回收的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑KTI及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑BBI經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE及高效液相色譜SEC-HPLC檢測樣品純度，經(jīng)過雙縮脲法測定蛋白含量，經(jīng)過苯酚硫酸法GB/T 15672-2009測定含糖量，經(jīng)過干燥法GB/T5497-1985測定水分，經(jīng)過灼燒重量法測定灰分。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明對大豆乳清綜合利用，設(shè)備要求低，操作簡單，無環(huán)境污染。且胰蛋白酶抑制劑回收率高，純度高，蛋白活性高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1.KTI及BBI的回收工藝流程圖。
[0016]圖2.KTI及BBI的純度的SEC-HPLC檢測圖譜。
[0017]圖3.KTI及BBI的純度SDS-PAGE檢測圖譜。

【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明工藝流程如附圖實施例1:
將大豆乳清調(diào)至pH 4.5，離心(9500rpm，30min )除沉淀；再次調(diào)至pH 8.0，離心(9500rpm，30min )，棄沉淀，收集上清液。將上述上清液調(diào)節(jié)pH至4.5，量取IL溶液，在4-30°C下按照硫酸錢飽和度表加入固體硫酸錢至35%飽和度，離心(9500rpm，30min )，得到含有的KTI及BBI蛋白粗品約2.12g，加入30mL去離子水溶解，透析(截留分子量:3500)脫鹽36h，截留液真空冷凍干燥制備含KTI及BBI抑制劑樣品。
[0019]分別精確稱取0.2g上述初級分離的KTI及BBI抑制劑樣品及0.2g聚陰離子多糖粉末，分別加入到10mL去離子水中，攪拌至兩種物質(zhì)完全溶解，分別配制成質(zhì)量濃度w/v為0.2%均一蛋白及多糖溶液。將上述大豆乳清蛋白以及聚陰離子多糖溶液均調(diào)至pH7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入6.67% (v/v)聚陰離子多糖溶液，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至4.3，離心(4000rpm，20min)，收集沉淀；對上清液再次加聚陰離子多糖溶液重復I次，合并沉淀物，即得KTI與聚陰離子多糖的復凝聚物。合并兩次上清液，繼續(xù)緩慢加入v/v 5%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至4.5，4000rpm離心20min，收集上清液，即得含有Bowman -Birk與聚陰離子多糖的復合物溶液。
[0020]將得到的KTI與聚陰離子多糖的復凝聚物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.5，過截留分子量為10kD的超濾膜除糖，收集濾過液；超濾(截留分子量:3000)脫鹽，即得純化的KTI。
[0021]將得到的含有BBI與聚陰離子多糖復合物的溶液，調(diào)節(jié)pH至7.5，過截留分子量為10kD的超濾膜除糖，收集濾過液；超濾(截留分子量:3000)脫鹽，即得純化的BBI。稱取純化的KTI及BBI各3.0mg,溶解于1.0mL超純水中，配制成濃度為3.0mg/mL的溶液，過0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測蛋白純度，并做SDS-PAGE電泳分析。
[0022]經(jīng)測定，以上實例所得KTI，約含有蛋白95.5 %，總糖1.2%，灰分1.8%及水分1.5% ；以上實例所得BBI，約含有蛋白95.0 %，總糖1.8%，灰分1.2%及水分2.0%。
[0023]實施例2:
將大豆乳清調(diào)至pH 4.5，離心(9500rpm，30min )，除沉淀；再次調(diào)至pH 8.5，離心(9500rpm，30min )，棄沉淀，收集上清液。將上述上清液調(diào)節(jié)pH至4.7，量取L 5L溶液，在4-30°C下按照硫酸錢飽和度表加入固體硫酸錢至40%飽和度，離心(9500rpm，30min )，得到含有的KTI及BBI蛋白粗品約3.35g，加入40mL去離子水溶解，透析(截留分子量:3500)脫鹽48小時，真空冷凍干燥制備樣品。
[0024]分別精確稱取0.4g上述初級分離的KTI及BBI抑制劑樣品及0.4g聚陰離子多糖粉末，加入到10ml去離子水中，攪拌至兩種物質(zhì)完全溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.4%均一蛋白及多糖溶液。將上述大豆乳清蛋白以及聚陰離子多糖溶液均調(diào)至PH7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入5.0% (v/v)聚陰離子多糖溶液，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至4.0，離心(4000rpm，20min)，收集沉淀；對上清液再次重復I次，合并沉淀物，即得KTI與聚陰離子多糖的復合物。合并兩次上清液，繼續(xù)緩慢加入v/v 7 %的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至4.2，4000rpm離心20min，收集上清液，即得含有Bowman - Birk與聚陰離子多糖的復合物溶液。
[0025]將得到的KTI與聚陰離子多糖的復合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8.0，過截留分子量為200kD的超濾膜除糖，收集濾過液；(截留分子量:3500)脫鹽，即得純化的KTI。將得到的BBI與聚陰離子多糖的復合物溶液，調(diào)節(jié)pH至7.5，過截留分子量為200kD的超濾膜除糖，收集濾過液；超濾(截留分子量:3500)脫鹽，即得純化的BBI。稱取純化的KTI及BBI各4.0mg,溶解于1.0ml超純水中，配制成濃度為4.0mg/mL的溶液，過
0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測蛋白純度，并做SDS-PAGE電泳分析。
[0026]經(jīng)測定，以上實例所得KTI，約含有蛋白96.3 %，總糖1.0%，灰分1.0%及水分1.7% ；以上實例所得BBI，約含有蛋白96.0 %，總糖1.4%，灰分1.1%及水1.5%。
[0027]實施例3:
將大豆乳清調(diào)至pH 4.8，離心(9500rpm，30min )，除沉淀；再次調(diào)至pH 9.0，離心(9500rpm, 30min )，棄沉淀，收集上清液。將上述上清液調(diào)節(jié)pH至4.8，量取2L溶液，在4-30°C下按照硫酸銨飽和度表加入30%飽和的硫酸銨，離心，得到含有的KTI及BBI蛋白粗品約0.356g，加入1mL去離子水溶解，透析(截留分子量:3500)脫鹽48小時，真空冷凍干燥制備樣品。
[0028]分別精確稱取0.15g上述初級分離的KTI及BBI抑制劑樣品及0.15g聚陰離子多糖粉末，加入到10mL去離子水中，攪拌至兩種物質(zhì)完全溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.15%均一蛋白及多糖溶液。將上述大豆乳清蛋白以及聚陰離子多糖溶液均調(diào)至PH7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入10% (v/v)聚陰離子多糖溶液，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至4.2，離心(4000rpm，20min)，收集沉淀；對上清液再次重復I次，合并沉淀物，即得KTI與聚陰離子多糖的復合物。合并兩次上清液，繼續(xù)緩慢加入v/v 10%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至3.8，4000rpm離心20min，收集上清液，即得含有Bowman - Birk與聚陰離子多糖的復合物溶液
將得到的KTI與聚陰離子多糖的復合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8.5，過截留分子量為300kD的超濾膜除糖，收集濾過液；超濾(截留分子量:4000)脫鹽，即得純化的KTI。將得到的BBI與聚陰離子多糖的復合物溶液，調(diào)節(jié)pH至8.5，過截留分子量為300kD的超濾膜除糖，收集濾過液；超濾(截留分子量:4000)脫鹽，即得純化的BBI。稱取純化的KTI及BBI各2.0mg，溶解于1.0ml超純水中，配制成濃度為2.0mg/ml的溶液，過0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測蛋白純度，并做SDS-PAGE電泳分析。
[0029] 經(jīng)測定，以上實例所得KTI，約含有蛋白95.5 %，總糖1.6%，灰分1.1%及水分1.8% ；以上實例所得BBI，約含有蛋白97.0 %，總糖1.1%，灰分0.9%及水分1.0%。
【權(quán)利要求】
1.一種從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于步驟為: (1)大豆乳清的預處理:將大豆乳清調(diào)至pH4.5-4.8，9500rpm離心30min除沉淀；再次調(diào)至pH 8.0-10.0，9500rpm離心30min，收集上清液，得試驗用大豆乳清液；用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH ； (2)大豆乳清蛋白的初級分離:量取一定體積的上述大豆乳清液，調(diào)節(jié)pH至4.5-5.0，在4-30°C下，加入硫酸錢至終飽和度為30%-40%，9500rpm離心30min，收集沉淀，加入去離子水溶解，使蛋白質(zhì)量終濃度為1%_10%，截留分子量3500透析脫鹽36-48h，截留液真空冷凍干燥，獲得含有Kunitz及Bowman - Birk型兩種胰蛋白酶抑制劑的大豆乳清蛋白組分； (3)大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復凝聚:將步驟(2)制備的大豆乳清蛋白組分，用去離子水配制w/v終濃度為0.1%-0.4%的大豆乳清蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0，并同時配制w/v0.l%-0.4%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0 ;向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入v/v2.5% -10%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至5.0-3.0，4000rpm離心20min，收集沉淀；對上清液再次加聚陰離子多糖溶液重復沉淀1-2次，合并沉淀物，即得Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陰離子多糖的復凝聚物； 合并上述去沉淀后的上清液，繼續(xù)緩慢加入v/v 5% -10%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至4.5-3.8，4000rpm離心20min，收集上清液，即得含有Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑與聚陰離子多糖的復合物溶液； (4)回收Kunitz及Bowman- Birk型胰蛋白酶抑制劑:將得到的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑/聚陰離子多糖的復凝聚物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0-9.0，過超濾膜100kD-300kD除糖，收集濾過液；截留分子量3000-4000超濾脫鹽，截留液真空冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑； 將得到的Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑/聚陰離子多糖的復合物溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0-9.0，過超濾膜00kD-300kD除糖，收集濾過液；截留分子量3000-4000超濾脫鹽，截留液真空冷凍干燥，即得純化的Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman- Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于:所述PH調(diào)節(jié)劑為:酸性:有機酸:包括但不限于甲酸、乙酸；無機酸:包括但不限于鹽酸，硫酸；優(yōu)先選擇無機酸；堿性:包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，優(yōu)先選擇氫氧化鈉； 所述聚陰離子多糖包括但不限于:卡拉膠，硫酸酯化半乳聚糖及其它硫酸酯化多糖，阿拉伯膠，海藻酸鈉，果膠；優(yōu)先卡拉膠；其相對分子量范圍大于300kD，但不超過2000kD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman- Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是步驟(I)大豆乳清的來源包括:常規(guī)的大豆分離蛋白生產(chǎn)形成的副產(chǎn)物，以及實驗室利用脫脂豆柏，經(jīng)醇洗后，提取分離蛋白后的乳清液；大豆乳清的預處理，其條件為:生產(chǎn)大豆分離蛋白的大豆乳清需經(jīng)PH4.5靜止l-2d，離心脫沉淀，以脫出殘留大豆分離蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman- Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是步驟(2)大豆乳清蛋白的初級分離，其條件為:在進行鹽析處理前，優(yōu)先將大豆乳清液重新調(diào)整PH至酸性4.5-4.8范圍內(nèi)；溫度范圍以低溫最為適宜，包括但不限于4-30°C;其硫酸銨飽和度應不低于30%，但不高于40%，優(yōu)先選擇高飽和度；其相應硫酸銨飽和度需按照硫酸銨飽和度表，根據(jù)實際溫度，控制操作；沉淀溶解需加入2-4倍體積的去離子水，溶解完全；脫鹽處理包括但不限于透析，超濾，納濾，需保證脫鹽完全。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman- Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是步驟(3)大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復凝聚，其條件為:優(yōu)先選擇等濃度的蛋白溶液與多糖溶液按照上述比例混合；若選擇不等濃度溶液進行混合，需保證最終濃度比與以上混合比一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中回收Kunitz及Bowman- Birk型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是步驟(4)回收Kunitz及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑，其條件為:除糖超濾膜截留分子量范圍不小于100kD，且不大于300kD ;脫鹽處理包括但不限于超濾，透析，納濾，需保證脫鹽完全；回收的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑KTI及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制劑BBI經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE及高效液相色譜SEC-HPLC檢測樣品純度，經(jīng)過雙縮脲法測定蛋白含量，經(jīng)過苯酚硫酸法GB/T 15672-2009測定含糖量，經(jīng)過干燥法GB/T 5497-1985測定水分，經(jīng)過灼燒重量法測定灰分。
【文檔編號】C07K1/32GK104513307SQ201410742435
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】張彩猛, 華欲飛, 李興飛, 孔祥珍, 陳業(yè)明 申請人:江南大學