一種膠原蛋白膜片材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，該方法先將動物皮在弱堿性溶液中清洗干凈，然后在含Na2S和Ca（OH）2的水溶液中，對動物皮進行脫毛清洗處理，再使用弱酸性銨鹽調(diào)節(jié)溶液的pH值在6-8，獲得膠原纖維層后，將膠原纖維層加丙酮進行多次脫脂后，風干，獲得原料；然后將原料進行破碎，純化，精制和凍干得到所述的膠原蛋白膜片材料，該膠原蛋白膜片材料質(zhì)地柔韌、粘附性好、鹽分含量低、具有完整3D結構、生物活性和生物安全性都好，非常適合于臨床應用。
【專利說明】一種膠原蛋白膜片材料的制備方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及膠原蛋白純化方式【技術領域】，尤其涉及一種以動物皮為原料制備膠原 蛋白膜片材料的方法。 【背景技術】
[0002] 膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最多，分布最為廣泛的蛋白質(zhì)。是機體的主要結構蛋白， 是構成組織和結締組織的主要組成成分。它所特有的三重螺旋的氨基酸鏈結構賦予了它許 多有用的特性：如高拉伸強度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性和細胞毒性以及促進 細胞生長的特性。所有的這些特點使其成為理想的生物醫(yī)用材料。
[0003] 膠原蛋白的臨床用途非常廣泛，已證實的作用有：促進傷口愈合和肉芽組織的生 長、止血功能、填充作用以及生物支架等。其中膠原蛋白的止血作用非常突出。同時，它和窄 傷口的愈合過程中起到關鍵作用的生長因子之間也存在著特殊的親和力。在血液凝固后， 膠原蛋白還可以通過刺激組織的再生和修復來防止再次出血的發(fā)生。
[0004] 在醫(yī)學中，特別是外科治療中，膠原蛋白被主要應用于如下領域：創(chuàng)傷治療與控 制，特別是特殊的瘡口如糖尿病造成的肢體潰瘍，自2010年來，F(xiàn)DA陸續(xù)批準兩種新型膠原 蛋白類海綿或膠體系列產(chǎn)品作為全功能性創(chuàng)傷控制藥品，特別推薦用于糖尿病造成的潰瘍 治療和除3度燒傷以外的全部創(chuàng)傷控制（Cellerate和Excellagen)，并且有多種用于創(chuàng)傷 控制和治療的膠原蛋白海綿或膠體產(chǎn)品正在臨床試驗中；在骨外科，膠原蛋白海綿，膠原蛋 白膜片，被廣泛應用于骨填充和軟骨損傷修復；腦外科，腦硬膜創(chuàng)傷修復的填充，也大量使 用膠原蛋白膜材料。
[0005] 正常人在受到損傷和創(chuàng)傷發(fā)生出血時，機體就會在受損傷的局部發(fā)生一系列的生 理反應來控制出血。膠原蛋白不僅在局部刺激了血小板的黏附和聚集，還激活了凝血系統(tǒng)， 從而達到局部止血的目的。在大多數(shù)情況下，特別是在一些病理情況下（如創(chuàng)面較大、創(chuàng)面 較深、血小板數(shù)量或者活性不足以確保凝血功能等），生理性的止血很難達到控制出血的目 的。而此時適當?shù)难a充外源性的膠原蛋白，可以對局部止血有明顯的促進作用，從而達到滿 意的止血效果。
[0006] 組織損傷修復一般分為三個階段：（1)局部炎癥反應階段；（2)細胞增殖分化和肉 芽組織生成階段；(3)組織修復塑形階段。在哺乳動物中，大部分的組織損傷，不管是內(nèi)部 的還是外部的，都經(jīng)由凝血塊的產(chǎn)生，纖維化和功能的修復而愈合。但是，大部分組織沒有 完全恢復到他原來的結構和功能。例如，當皮膚損傷僅涉及到外皮和表皮層時，表皮會通過 傷口邊緣的細胞遷移而再生；但當傷口涉及到表皮或皮膚下層時，缺損的皮膚將被瘢痕組 織替代，而表皮將在瘢痕組織上再生。添加外源性的膠原蛋白，可以起到止血，隔絕病菌，通 氣等一般性的敷料特征，同時還能對傷口修復起到調(diào)節(jié)作用，刺激膠原蛋白酶的表達，避免 膠原蛋白的過度增生，減少或者避免瘢痕性疙瘩的產(chǎn)生。而在特定組織，比如軟骨組織，其 發(fā)生創(chuàng)傷后，自我修復能力非常弱，通過組織工程技術可以幫助修復恢復其原有功能，膠原 蛋白膜片是其首選材料。
[0007] 一般膠原蛋白膜片的制備方法為通過酶解，酸提取等方式制備膠原蛋白原料，然 后通過與其他材料交聯(lián)或者通過異戊二醛等交聯(lián)劑交聯(lián)制備。通過酶解步驟，使其較易溶 于水，便于其后續(xù)的分離純化，但是以膠原蛋白完整結構的破壞作為代價，使其無法直接形 成具有足夠強度的膠原蛋白膜材料，其應用受到限制；使用交聯(lián)方式主要是為了增加其強 度，延長體內(nèi)的降解時間，但這又帶來了交聯(lián)劑的殘留問題，降低了其生物安全性，并在其 代謝過程中加重肝臟負擔。
[0008] 而另外一種方式是采用加熱酸或者堿提取方式制備明膠敷料，熱處理使蛋白發(fā)生 變性，此類膜材料失去了其生物活性，只能作為創(chuàng)傷敷料，其止血效果也不如膠原蛋白海綿 類材料。
[0009] 因此，需要找到一種具有完整3D結構，生物活性和生物安全性都好的膠原蛋白膜 片材料的制備方法，以便適用于臨床應用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[〇〇1〇] 本發(fā)明要解決的技術問題是針對目前膠原蛋白膜材料生物活性和生物安全性不 高等問題，提供一種質(zhì)地柔韌、粘附性好、鹽分含量低、具有完整3D結構、生物活性和生物 安全性都好的膠原蛋白膜片材料的制備方法。
[〇〇11] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所述的膠原蛋白膜片材料的制備方法是按照以下步 驟進行的：
[0012] (1)原料的準備
[〇〇13] 將動物皮洗凈后投入轉鼓，對動物皮進行清洗和脫毛處理，然后使用片皮機將動 物皮上的下層附肉和上層表皮去除，獲得膠原纖維層，將膠原纖維層加丙酮進行多次脫脂 后，風干，獲得原料；
[0014] ⑵膠原纖維的破碎
[0015] 將步驟（1)得到的膠原纖維層原料采用物理方式破碎后，將其加入揮發(fā)性酸溶液 中浸泡脫除鹽分，將膠原纖維層與鹽酸的混合液放于分散機中以5?50m/s的速度分散，獲 得粗提液；
[0016] (3)膠原蛋白的純化
[〇〇17] 將步驟（2)得到的膠原蛋白粗提液通過不銹鋼篩網(wǎng)或者紗布過濾，除去不溶性的 大顆粒雜質(zhì)和未分散的膠原纖維；
[0018] ⑷膠原蛋白的精制
[〇〇19] 將步驟⑶得到的濾液采用透析方式進行透析，去除H+，鹽和雜質(zhì)；
[0020] (5)凍干
[0021] 采用程序化凍干方式將步驟（4)得到的精制膠原蛋白進行凍干，即得到所述的膠 原蛋白膜片。
[0022] 進一步的，本發(fā)明所述步驟（1)中對動物皮進行清洗和脫毛的處理過程是按照以 下步驟進行的：加入動物皮質(zhì)量一倍以上的弱堿液攪拌2h，并用清水清洗，然后將動物皮 置于動物皮質(zhì)量1?5倍的含Na 2S和Ca (0H) 2的水溶液中，對動物皮進行脫毛處理，再使用 弱酸性銨鹽調(diào)節(jié)溶液的pH值在6-8之間，將動物皮洗凈。
[0023] 再進一步的，本發(fā)明步驟（1)中所述的弱堿液是0. 1?5%的Na2C03溶液；所述 Na2S和Ca(OH)2的水溶液，其中Na2S和Ca(OH) 2的質(zhì)量分數(shù)是1?10% ;所述弱酸性銨鹽 為1-10%的順4(：1溶液。
[0024] 進一步的，本發(fā)明步驟（2)所述的揮發(fā)性酸溶液為0. 05?0. 5M的HC1溶液。
[0025] 進一步的，本發(fā)明步驟（4)膠原蛋白的精制也可以采用超濾方式，膜為中空纖維 膜，膜孔徑為5k_50k道爾頓，采用切向流方式進行，超濾至pH值達到4-7為止。
[0026] 本發(fā)明在對膠原蛋白進行凍干時采用程序化凍干方式，先將膠原蛋白粗提液放入 容器，經(jīng)過預凍，主干燥，后干燥程序制備膠原蛋白膜片。
[0027] 本發(fā)明所述的方法除了可以制作膠原蛋白膜片外，還可以用于膠原蛋白海綿以及 泡沫的制備。
[0028] 本發(fā)明涉及的膠原蛋白膜片適用于二類醫(yī)療器械創(chuàng)傷敷料，也適用于三類醫(yī)療器 械止血材料，同時可以作為細胞培養(yǎng)的支架材料用于組織工程修復。
[0029] 本發(fā)明涉及產(chǎn)品原料可使用牛皮、豬皮等，不限于某一特定動物種類。
[0030] 采用了上述技術方案后，本發(fā)明具有以下的有益效果：
[0031] (1)通過純物理方式提取，避免了酶解等工藝對膠原蛋白的破壞，使其具有完整的 3D結構，確保了其生物活性；
[0032] (2)產(chǎn)品具有非常好的生物安全性產(chǎn)品通過鹽酸破壞雜質(zhì)，使其通過透析或者超 濾去除，產(chǎn)品純度達到95%以上，無雜蛋白。制備工藝不需要經(jīng)過交聯(lián)，即可達到較高的強 度和生物耐降解性，避免了交聯(lián)劑的帶入。
[0033] (3)產(chǎn)品質(zhì)地柔韌、粘附性好、鹽分含量低，符合臨床的要求。 【具體實施方式】
[〇〇34] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚地理解，下面根據(jù)具體實施例對本發(fā)明作進一 步詳細的說明
[0035] 實施例1
[0036] (1)原料的準備
[0037] 將牛皮洗凈后投入轉鼓，加入動物皮質(zhì)量一倍以上的1 %的Na2C03攪拌2h，并用清 水清洗，然后將牛皮置于牛皮質(zhì)量1?5倍的含1 % Na2S和5%的Ca (0H)2的水溶液中，對 牛皮進行脫毛處理，再使用5%的NH4C1調(diào)節(jié)溶液的pH值在6-8之間，將牛皮洗凈，然后使 用片皮機將牛皮上的下層附肉和上層表皮去除，獲得膠原纖維層，將膠原纖維層加丙酮進 行多次脫脂后，風干，獲得原料；
[0038] (2)膠原纖維的破碎
[0039] 將步驟（1)得到的膠原纖維層原料采用物理方式破碎后，將其加入0. 2mol/L的揮 發(fā)性酸溶液鹽酸中浸泡脫除鹽分，將膠原纖維層與鹽酸的混合液放于分散機中分散，其線 速度為5_50m/s，直至無可見碎屑為止，獲得粗提液；
[0040] (3)膠原蛋白的純化
[0041] 將步驟（2)得到的膠原蛋白粗提液過濾，除去不溶性的大顆粒雜質(zhì)和未分散的膠 原纖維；
[0042] (4)膠原蛋白的精制
[0043] 將步驟⑶得到的濾液采用透析方式進行透析，去除H+，鹽和雜質(zhì)；
[0044] (5)凍干
[0045] 采用程序化凍干方式將步驟（4)得到的精制膠原蛋白進行凍干，即得到所述的膠 原蛋白膜片。
[0046] 實施例2
[0047] 實施例2用于說明本發(fā)明提供的膠原蛋白膜片的制備方法。
[0048] 采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產(chǎn)品，不同的是，步驟（1)是按照以下步 驟進行的：將豬皮洗凈后投入轉鼓，加入豬皮質(zhì)量一倍以上的〇. 1 %的Na2C03攪拌2h，并用 清水清洗，然后將豬皮置于豬皮質(zhì)量1?5倍的含10% Na2S和10% Ca(0H)2的水溶液中， 對豬皮進行脫毛處理，再使用1 %的NH4C1調(diào)節(jié)溶液的pH值在6-8之間，將豬皮洗凈，然后 使用片皮機將豬皮上的下層附肉和上層表皮去除，獲得膠原纖維層，將膠原纖維層加丙酮 進行多次脫脂后，風干，獲得原料。
[0049] 實施例3
[0050] 實施例3用于說明本發(fā)明提供的膠原蛋白膜片的制備方法。
[0051] 采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產(chǎn)品，不同的是，步驟（1)是按照以下步 驟進行的：將牛皮洗凈后投入轉鼓，加入牛皮質(zhì)量一倍以上的5%的Na 2C03攪拌2h，并用清 水清洗，然后將牛皮置于牛皮質(zhì)量1?5倍的含1% Na2S和1% Ca(0H)2的水溶液中，對牛 皮進行脫毛處理，再使用10%的NH4C1調(diào)節(jié)溶液的pH值在6-8之間，將牛皮洗凈，然后使用 片皮機將牛皮上的下層附肉和上層表皮去除，獲得膠原纖維層，將膠原纖維層加丙酮進行 多次脫脂后，風干，獲得原料。
[0052] 實施例4
[0053] 實施例4用于說明本發(fā)明提供的膠原蛋白膜片的制備方法。
[0054] 采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產(chǎn)品，不同的是，步驟（2)中采用的揮發(fā) 性酸溶液鹽酸的濃度是〇. 〇5mol/L。
[0055] 實施例5
[0056] 實施例5用于說明本發(fā)明提供的膠原蛋白膜片的制備方法。
[〇〇57] 采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產(chǎn)品，不同的是，步驟（2)中采用的揮發(fā) 性酸溶液鹽酸的濃度是〇. 5mol/L。
[0058] 實施例6
[0059] 實施例6用于說明本發(fā)明提供的膠原蛋白膜片的制備方法。
[0060] 采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產(chǎn)品，不同的是，步驟（4)膠原蛋白的精 制采用超濾方式，膜為中空纖維膜，膜孔徑為5k-50k道爾頓，采用切向流方式進行，超濾至 pH值為4-7。
[0061] 將本發(fā)明實施例1得到的膠原蛋白膜片材料進行性能測定，得到的各參數(shù)指標見 表1
[0062] 表1實施例1膠原蛋白膜片材料的參數(shù)指標
[0063]
【權利要求】
1. 一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于該方法是按照以下步驟進行的： (1) 原料的準備 清洗動物皮去除鹽漬和污物，將動物皮進行進一步清洗去除油污，然后進行脫毛處理， 最后將動物皮上的下層附肉和上層表皮去除，獲得膠原纖維層，再將膠原纖維層進行多次 脫脂后，風干，獲得原料； (2) 膠原纖維的破碎 將步驟（1)得到的膠原纖維層原料采用物理方式破碎后，將其加入揮發(fā)性酸溶液中浸 泡脫除鹽分，將膠原纖維層與鹽酸的混合液放于分散機中進行分散，分散至無可見碎屑為 止，獲得粗提液； (3) 膠原蛋白的純化 將步驟（2)得到的膠原蛋白粗提液過濾，除去不溶性的大顆粒雜質(zhì)和未分散的膠原纖 維； (4) 月父原蛋白的精制 去除步驟（3)得到的濾液中的酸、鹽和雜質(zhì)，得到精制膠原蛋白； (5) 凍干 將步驟（4)得到的精制膠原蛋白進行凍干，即得到所述的膠原蛋白膜片。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于步驟（1)中 對動物皮進行清洗和脫毛處理的方法是按照以下步驟進行的：首先將動物皮投入轉鼓，向 轉鼓中加入動物皮質(zhì)量一倍以上的弱堿液并攪拌2h，然后用清水清洗，然后將動物皮置于 動物皮質(zhì)量1~5倍的含Na 2S和Ca (0H)2的水溶液中，對動物皮進行脫毛處理，再使用弱酸 性銨鹽調(diào)節(jié)溶液的pH值在6-8之間，將動物皮洗凈。
3. 根據(jù)權利要求2所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于步驟（1)中 所述的弱堿液是〇. 1~5%的Na2C03溶液。
4. 根據(jù)權利要求2所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于步驟（1)中 所述Na2S和Ca (OH) 2的水溶液，其中Na2S和Ca (OH) 2的質(zhì)量分數(shù)分別是1~10%。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于步驟 (1)中所述弱酸性銨鹽為1~1〇%的NH4C1溶液。
6. 根據(jù)權利要求1所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于步驟（2)中 所述的揮發(fā)性酸溶液為〇. 05~0. 5mol/L的鹽酸溶液。
7. 根據(jù)權利要求1所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于所述的步驟 (4)膠原蛋白的精制的方法為采用透析方式進行透析，將粗提液裝入透析袋中，兩邊扎緊， 放入雙蒸水中進行透析，多次透析后將凝膠取出。
8. 根據(jù)權利要求1所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于所述的步驟 (4)膠原蛋白的精制的方法為采用超濾方式，膜為中空纖維膜，膜孔徑為5-50k道爾頓，采 用切向流方式進行，超濾至pH值達到4-7。
9. 根據(jù)權利要求1所述的一種膠原蛋白膜片材料的制備方法，其特征在于：步驟（1)中 脫脂的方法為使用丙酮浸泡并攪拌。
【文檔編號】C07K1/34GK104098783SQ201410272626
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】錢陳, 楊雙雙, 高堅杰 申請人:常州藥物研究所有限公司