一種中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體及其制備方法，屬于細(xì)胞免疫【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)、純化獲得了MERS-CoV病毒S蛋白受體結(jié)合區(qū)域RDB蛋白，并用該高純度MERS?RBD蛋白免疫Bab/c小鼠，通過ELISA和假病毒中和實驗等方法篩選到高效的抗病毒的中和抗體。解析抗體和MERS?RBD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，從分子水平確定抗體結(jié)合病毒蛋白的關(guān)鍵氨基酸，從而進(jìn)一步將此抗體人源化，為臨床檢測、預(yù)防和治療MERS-CoV病毒感染提供了可能。
【專利說明】一種中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體及其制備方法，屬于細(xì)胞免疫【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]中東呼吸綜合征冠狀病毒(MiddleEast Respiratory SyndromeCononaviruse, MERS-CoV)與SARS-CoV同屬冠狀病毒科，beta冠狀病毒屬。為正鏈、單鏈RNA病毒。它表面刺突蛋白一S蛋白在病毒感染人和動物時起著關(guān)鍵作用。曾有科學(xué)家推測此病毒可能有來源于蝙蝠。序列分析發(fā)現(xiàn)，MERS-CoV病毒與蝙蝠和豬冠狀病毒序列同源性非常高，與蝙蝠冠狀病毒HKU4和HKU5可高達(dá)60%。目前仍然沒有確定MERS-CoV病毒的來源和天然宿主，無法采取有效的措施來預(yù)防和阻止此病毒傳播。[0003]由于臨床病癥中MERS-CoV和SARS-CoV之間的相似性，提出它們可能會使用相同的細(xì)胞受體一血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):二肽基肽酶-4 (DPP4，也被稱為⑶26)是MERS-CoV的受體，在人支氣管和腎上皮細(xì)胞表達(dá)。病毒感染人時，病毒S蛋白受體結(jié)合區(qū)(Receptor Binding Domain, RBD)會與這種蛋白結(jié)合,病毒以它們?yōu)椤暗顷扅c(diǎn)”，附著到呼吸道細(xì)胞上，隨之進(jìn)一步侵人體內(nèi)。CD26蛋白的氨基酸序列是高度保守的，還存在于蝙蝠和其他許多動物體內(nèi)，因此，MERS-CoV病毒可能利用這種蛋白質(zhì)在多個物種之間持續(xù)傳播，有較大的潛在威脅。目前，感染MERS-CoV病毒后尚無有效治療藥物，主要是對癥治療，也沒有預(yù)防性疫苗。單克隆抗體是針對特異抗原產(chǎn)生的特異抗體，它具有高度專一性，能精確地瞄準(zhǔn)、捕獲目標(biāo)靶點(diǎn)，特異性地與靶目標(biāo)發(fā)生反應(yīng)，從而直接清除病毒的目的。
[0004]MERS-CoV病毒表面有一個膜蛋白稱之為S蛋白，在病毒的復(fù)制和生命周期中發(fā)揮著重要作用。S蛋白上有部分區(qū)域,稱之為受體結(jié)合區(qū)(Receptor Binding Domain, RBD)可以與細(xì)胞表面的CD26蛋白結(jié)合，介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞。因而，尋找和制備有效的抗體阻止MERSRBD蛋白結(jié)合⑶26蛋白，進(jìn)而抑制病毒侵染細(xì)胞，成為檢測、預(yù)防和治療MERS-CoV病毒感染的方法之一。通過制備抗MERS RBD蛋白單克隆抗體，篩選可與之特異性結(jié)合的中和抗體，在分子水平上分析抗體與之結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，進(jìn)一步對其人源化，已成為制備預(yù)防或治療性抗體的有效手段。目前還沒有關(guān)于抗MERS-CoV病毒中和抗體的報道。
[0005]由于目前缺乏抗MERS-CoV病毒中和抗體，而且制備大量抗體及應(yīng)用于臨床需要較長時間，不能快速有效在臨床上進(jìn)行檢測。因此該抗體不僅可以應(yīng)用于臨床檢測，而且對其人源化后為制備預(yù)防或治療性抗體提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和可能性。
[0006]本發(fā)明描述了篩選具有中和活性的MERS-CoV鼠源單克隆抗體的技術(shù)，及基于序列和結(jié)構(gòu)信息的中和抗體人源化改造技術(shù)。用于MERS-CoV的檢測、預(yù)防和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)抗體，所述抗體是MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體，其重鏈、輕鏈氨基酸序列分別如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 所示。
[0008]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供所述MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體的制備方法，首先是制備獲得高純度、有活性的MERS RBD (MERS-CoV病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白)，然后以該蛋白為抗原篩選得到抗MERS-CoV病毒的鼠源單克隆中和抗體。
[0009]所述MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體制備方法的具體步驟為:
[0010](I)將編碼MERS-CoV病毒表面S蛋白受體結(jié)合區(qū)的基因序列連接到載體pFastBacl中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac_MERS RBD，并轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞、篩選鑒定陽性克隆，提取重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，培養(yǎng)獲得大量高滴度病毒；然后感染Hi5細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化濃縮得到目的蛋白MERS-RBD。
[0011](2)以MERS-RBD蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取血清抗體效價最高的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5:1比進(jìn)行融合，通過HAT篩選培養(yǎng)基和有限稀釋法獲得雜交瘤細(xì)胞；并進(jìn)一步用ELISA檢測篩選獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細(xì)胞株，注入小鼠腹腔制備腹水單抗，純化獲得鼠源抗體。
[0012](3)將所得鼠源抗體通過流式細(xì)胞儀檢測抑制RBD結(jié)合⑶26的效果，并用假病毒中和試驗確認(rèn)得到有中和假病毒活性的抗體；所述假病毒是將質(zhì)粒pCAGGS-MERS S與HIVPNL4-3.1uc.RE共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)獲得。
[0013]本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種人源化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體。
[0014]所述人源化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體的重鏈、輕鏈的氨基酸序列分別如SEQID N0.3、SEQ ID N0.4 所示。
[0015]本發(fā)明要解決的第四個技術(shù)問題是提供所述人源化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體的制備方法，是先制備獲得高純度活性MERS-CoV病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白，以該蛋白為抗原篩選、獲得抗MERS-CoV病毒的鼠源單克隆中和抗體；然后對抗鼠源單克隆中和抗體和MERS-RBD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和序列比對，獲取此鼠源抗體與MERS-RBD蛋白結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，最終對鼠源抗體進(jìn)行人源化改造設(shè)計。
[0016]所述人源化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體制備方法的具體步驟為:
[0017](I)將編碼MERS-CoV病毒表面S蛋白受體結(jié)合區(qū)的基因序列連接到載體pFastBacl中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac_MERS RBD，并轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞、篩選鑒定陽性克隆，提取重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，培養(yǎng)獲得大量高滴度病毒；然后感染Hi5細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化濃縮得到目的蛋白MERS-RBD。
[0018](2)以MERS-RBD蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取血清抗體效價最高的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5:1比進(jìn)行融合，通過HAT篩選培養(yǎng)基和有限稀釋法獲得雜交瘤細(xì)胞；并進(jìn)一步用ELISA檢測篩選獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細(xì)胞株，注入小鼠腹腔制備腹水單抗，純化獲得鼠源抗體。
[0019](3)將所得鼠源抗體通過流式細(xì)胞儀檢測抑制RBD結(jié)合⑶26的效果，并用假病毒中和試驗確認(rèn)得到有中和假病毒活性的抗體；所述假病毒是將質(zhì)粒pCAGGS-MERS S與HIVPNL4-3.1uc.RE共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)獲得。
[0020](4)通過測序比對獲得所述鼠源抗體的Fab全序列，制備和純化抗體Fab片段；將MERS RBD蛋白與抗體Fab片段共孵育，通過對復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析，確定了抗體Fab片段中對于結(jié)合MERS RBD蛋白起關(guān)鍵作用的氨基酸；將所述鼠源抗體的Fab片段與已報道的人源抗體相比對，找與之同源性最高的序列，保留CDR區(qū)中對于結(jié)合MERS RBD蛋白起關(guān)鍵作用的氨基酸，其它氨基酸替換為人源抗體相對應(yīng)的氨基酸序列，最終獲得人源化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體。
[0021]本發(fā)明成功篩選到了抗MERS-CoV病毒中和抗體，并通過晶體結(jié)構(gòu)解析了抗體在病毒S蛋白上的精確結(jié)合位點(diǎn)。此抗體是首次發(fā)現(xiàn)的、能夠有效抑制MERS-CoV病毒侵入的中和抗體，對MERS-CoV表面蛋白具有高親和力，因此該抗體不僅可以應(yīng)用于臨床檢測，而且對其人源化后為制備預(yù)防或治療性抗體提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和可能性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1:MERS RBD蛋白純化分子篩和SDS-PAGE圖；分子篩圖中線為280nm吸收值；SDS-PAGE圖中I號泳道為低分子量蛋白Marker，其余泳道分別對應(yīng)分子篩圖中MERS RBD二聚體和單體。
[0023]圖2:單克隆細(xì)胞株上清對MERS RBD蛋白結(jié)合⑶26抑制作用流式圖。
[0024]圖3:抗體4C2中和假病毒曲線；橫坐標(biāo)是抗體稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)是中和率。
[0025]圖4:抗體4C2結(jié)合MERS RBD蛋白表面等離子共振動力學(xué)曲線；橫坐標(biāo)是結(jié)合解離時間，單位是秒；縱坐標(biāo)是芯片表面的結(jié)合響應(yīng)強(qiáng)度，單位是RU (即Response unit)。
[0026]圖5:MERS RBD蛋白與抗體4C2Fab共孵育后分子篩與SDS-PAGE圖；SDS_PAGE圖中
I為MERS RBD蛋白，2為4C2Fab，M為低分子量蛋白Marker，3為MERS RBD蛋白與4C2Fab。
[0027]圖6 =MERS-RBD與抗體4C2Fab的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。
[0028]圖7:人源化抗體4C2中和假病毒曲線；橫坐標(biāo)是抗體稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)是中和率。
【具體實施方式】
[0029]實施例1質(zhì)粒構(gòu)建
[0030]我們將編碼MERS RBD蛋白的DNA片段(氨基酸E367-Y606，NCBI登錄號JX869059)用EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)連入pFastBacl載體中，并在蛋白的編碼片段前加入信號肽gp67有助于蛋白分泌表達(dá),在蛋白的編碼片段后插入6組氨酸標(biāo)簽(hexa-His-tag)的編碼序列及翻譯終止密碼子，這樣會得到一個C-端帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，利于后續(xù)的蛋白純化，命名為PFastBac-MERS RBD。將MERS RBD基因(氨基酸E367-Y606，NCBI登錄號JX869059)插入pCAGGS載體EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，在Xho I和Bgl II酶切位點(diǎn)間加入鼠Fe基因片段(氨基酸239G-469K，NCBI登錄號AY311599)，利于后續(xù)蛋白純化及細(xì)胞染色，命名為pCAGGS-MERS RBD mFc。將CD26基因序列(氨基酸S39-P766，NCBI登錄號NP_001926)插入pEGFPCl載體Xho I和Sma I酶切位點(diǎn)之間，命名為pEGFPCl_CD26。將ACE2基因序列(氨基酸S19-D615，NCBI登錄號BAJ21180)插入pEGFPNl載體Xho I和Sma I酶切位點(diǎn)之間，命名為pEGFPNl-ACE2。將MERS S基因(氨基酸M1-H1353，NCBI登錄號JX869059)插入到pCAGGS載體EcoR I和Sma I酶切位點(diǎn)之間，在基因后面加入Flag標(biāo)簽SEQ ID N0.5，命名為pCAGGS-MERS S。重組質(zhì)粒通過PCR、酶切鑒定和測序證實插入的外源片段完全正確。
[0031]實施例2MERS RBD蛋白表達(dá)與純化[0032]首先，將重組質(zhì)粒pFastBac-MERS RBD轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，37°C過夜培養(yǎng)，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定出陽性克隆，并提取重組Bacmid (桿狀病毒質(zhì)粒)，即已含有MERSRBD基因序列的質(zhì)粒。將重組Bacmid轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染3d后收取培養(yǎng)上清，得到Pl代桿狀病毒。連續(xù)擴(kuò)增3代病毒即可得到大量高滴度病毒。然后感染Hi5細(xì)胞，48h離心收取細(xì)胞上清，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液與N1-NTA Resin(GE)于4°C結(jié)合過夜。以緩沖液A(20mMTris, 150mM NaCl，pH8.0)洗滌樹脂，以去除非特異結(jié)合的蛋白。最后將目的蛋白以緩沖液B (20mM Tris, 150mM NaCl, pH8.0, 300mM imidazole)從樹脂上洗脫下來，并以 IOK 截留(10K cutoff)的濃縮管將洗脫液濃縮至5ml。將濃縮后的蛋白溶液進(jìn)一步以分子排阻層析純化，使用 AKTA-purifier(GE)和 Superdex200Hiloadl6/60 柱子(GE),使用緩沖液 A(20mMTris, 150mM NaCl，pH8.0),同時監(jiān)測280nm的紫外吸收值，收取目的蛋白，并通過SDS-PAGE鑒定蛋白純度。典型的目的蛋白的分子篩圖譜和SDS-PAGE分析圖如圖1所示。
[0033]實施例3鼠源單克隆抗體制備和純化
[0034]MERS-RBD蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠3只，取100g蛋白溶解于50 μ I無菌的PBS溶液中，與50 μ I弗式完全佐劑均勻混合，皮下多點(diǎn)注射。2周后加強(qiáng)免疫一次，3天后取尾靜脈血，檢測血清抗體效價，取效價最高的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5:1比進(jìn)行融合，通過HAT篩選培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，用有限稀釋法獲得雜交瘤細(xì)胞。取純化的MERS-RBD蛋白為包被抗原，經(jīng)ELISA檢測，獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細(xì)胞株。按照雜交瘤細(xì)胞(1-5) XlO6 /小鼠的量注入小鼠腹腔制備腹水單抗，10天后收取腹水，離心去除沉淀。0.22Μ濾膜過濾腹水,通過Protein G親和層析柱(GE)純化抗體。
[0035]實施例4篩選中和抗體
[0036](I) ELISA篩選分泌抗MERS-RBD抗體的單克隆細(xì)胞株
·[0037]將4μ g MERS-RBD蛋白溶于Iml pH9.6的碳酸鹽緩沖液中包被酶標(biāo)板，400ng /孔，4°C過夜。用含3%牛血清白蛋白BSA的PBS溶液于37°C封閉I小時。用PBST溶液(含
0.05% (體積百分含量)Tween20的PBS)洗滌3次，分別加入梯度稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，?οομ I /孔，37°C孵育I小時，設(shè)小鼠心臟血清為陽性對照，牛血清白蛋白為陰性對照。用PBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的抗鼠的二抗(I:2000稀釋，Santa Cruz, Inc.)，100 μ I /孔，37°C孵育40分鐘。用PBST洗滌3次后，加入TMB (四甲基聯(lián)苯胺，Sigma.)進(jìn)行顯色，37°C孵育15-30分鐘，然后加入0.1M H2SO4終止反應(yīng)。最后，用酶標(biāo)儀檢測0D450nm處的光吸收值。結(jié)果表明:篩選的1000個克隆中，有67個Elisa反應(yīng)陽性，滴度達(dá)到IO4以上。
[0038](2)抗體抑制MERS RBD與受體CD26結(jié)合
[0039]首先，利用Lipof ectamine2000 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pEGFPCl_CD26 和 pEGFPNl_ACE2 至 BHK21細(xì)胞，24小時后在熒光顯微鏡下觀察到CD26-GFP和ACE2-GFP融合蛋白主要分布在細(xì)胞膜上。收取細(xì)胞，并計數(shù)，PBS洗滌兩次后重懸至I X 107cell/ml，分裝細(xì)胞至EP管中，IOOul/管。將pCAGGS-MERS RBD mFc利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293T，72小時后收取上清通過ProteinA親和層析純化得到MERD RBD-Fc融合蛋白，將MERS RBD-Fc融合蛋白與單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)上清混合，室溫共孵育30分鐘后加入到表達(dá)⑶26-GFP或ACE2-GFP融合蛋白的BHK21細(xì)胞中，室溫再孵育30分鐘。PBS洗滌細(xì)胞2次，加入TRITC標(biāo)記的抗鼠的二抗(1:200稀釋)，室溫孵育30分鐘。PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用500 μ I重懸細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測抗體對RBD結(jié)合CD26的抑制作用。其中，陽性對照為MERS RBD-Fc融合蛋白與培養(yǎng)基DMEM混合染色表達(dá)⑶26-GFP的BHK21細(xì)胞，陰性對照為MERS RBD-Fc融合蛋白與培養(yǎng)基DMEM混合染色表達(dá)ACE2-GFP的BHK21細(xì)胞。結(jié)果表明:MERS RBD-Fc染表達(dá)ACE2-GFP融合蛋白的細(xì)胞后沒有紅光偏移，即MERS RBD-Fc不能結(jié)合ACE2-GFP ；MERS RBD-Fc染表達(dá)⑶26-GFP融合蛋白的細(xì)胞后紅光有偏移，即MERS RBD-Fc可以結(jié)合⑶26-GFP。抗體與MERSRBD-Fc混合后，若抗體和RBD有結(jié)合則可抑制RBD與⑶26的結(jié)合，那么紅光則無偏移；反之，若抗體不能與RBD結(jié)合則紅光有偏移。
[0040]將Elisa反應(yīng)陽性的細(xì)胞上請按上述方法進(jìn)行實驗后，我們發(fā)現(xiàn)，單克隆細(xì)胞株4C2上清中分泌表達(dá)的抗體與MERS RBD-Fc混合后，紅光偏移量較少，即此抗體可有效抑制MERS RBD蛋白與CD26結(jié)合(圖2)，抑制率達(dá)到67%。
[0041]圖2中，N-BHK21為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BHK21細(xì)胞，是實驗雙陰性對照；ACE2_GFP為BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFPNl-ACE2質(zhì)粒后可以表達(dá)ACE2-GFP融合蛋白，是實驗單陽性對照；ACE2-GFP+MERS RBD-Fc 是 MERS RBD-Fc 蛋白染表達(dá) ACE2-GFP 融合蛋白的 BHK21 細(xì)胞，是實驗陰性對照；CD26-GFP+MERS RBD-Fc是MERS RBD-Fc蛋白染表達(dá)CD26-GFP融合蛋白的BHK21細(xì)胞，為實驗陽性對照；其它為相應(yīng)抗體與MERS RBD-Fc蛋白混合后染表達(dá)⑶26-GFP融合蛋白的BHK21細(xì)胞。
[0042]實施例5假病毒中和實驗
[0043]( I)假病毒包裝
[0044]利用Lipofectamine2000 將質(zhì)粒 pCAGGS-MERS S 與 HIV pNL4_3.1uc.RE(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6小時后，PBS洗滌細(xì)胞2次，換為無血清DMEM。48小時后收取細(xì)胞上清，離心去掉細(xì)胞碎片，分裝凍存_80°C。
[0045](2)TCID50 測定
[0046]將收取的病毒液10倍倍比稀釋，依次為10' 10_2......10,，加入到96-well
中，此時Huh7細(xì)胞匯合度為80%-100%。感染4小時后，棄掉病毒液，PBS洗滌細(xì)胞2次，換為含10%血清的完全培養(yǎng)基DMEM。48小時后，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，利用GloMax96Microplate Luminometer (Promega)檢測突光素梅活性值。通過Reed-Muench 法計算 TCID50。
[0047](3)中和實驗
[0048]將純化的抗體2倍倍比稀釋，與100TCID50假病毒混合，抗體終濃度依次為25ug/ml、12.5ug/ml……50ng/ml，37 °C共孵育30分鐘，將混合液加入到已鋪滿Huh7細(xì)胞的96-well中。37°C孵育4小時后，棄掉病毒液，PBS洗滌細(xì)胞2次，換為含10%血清的完全培養(yǎng)基DMEM。48小時后，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，檢測熒光素梅活性值。
[0049]結(jié)果表明:抗體4C2有中和假病毒活性，即可以抑制MERS病毒S蛋白與細(xì)胞表面受體CD26的結(jié)合，ND50為103ng/ml (圖3)。
[0050]實施例6表面等離子共振技術(shù)檢測MERS RBD與抗體4C2親和力
[0051]表面等離子共振分析是用Biacore3000 (Biacore Inc.)進(jìn)行的。具體步驟如下:
[0052]首先，將抗體4C2溶于10mMNaAc(pH5.0)固定在CM5芯片(GE)上，然后將濃度梯度為3.125nM-100nM的MERS RBD蛋白分別注入芯片，分析在恒溫25°C進(jìn)行，使用的緩沖液是HEPES-Tween 緩沖液(IOmM HEPES [pH7.4], 150mM NaCl,，0.005%Tween_20)，流速為 30 μ I/min。芯片表面的再生使用的是IOOmM H3PO4，結(jié)合曲線如圖4所示。圖中5條曲線的抗體濃度由上到下分別為100、50、25、12.5,6.25,3.125nM，不同濃度的曲線組成圖示的動力學(xué)曲線。結(jié)合動力學(xué)常數(shù)的計算是利用 BIAevaluation software version3.2 (Biacore, Inc.)軟件進(jìn)行的。結(jié)果表明，抗體4C2和MERS RBD蛋白的親和力常數(shù)為17.5nM。
[0053]實施例7抗體4C2Fab序列測定
[0054](I)抗體亞型鑒定
[0055]將純化的4C2抗體進(jìn)行SDS-PAGE，分別在約45kD和30kD處有重鏈和輕鏈兩條帶，切割用ddH20浸泡洗滌3次。經(jīng)過脫水和酶解后進(jìn)行鑒定，儀器為MALD1-T0F/T0F質(zhì)譜儀。數(shù)據(jù)采集后，將一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合并使用GPS3.6 (Applied Biosystems)和Mascot2.1 (Matrix Science)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和蛋白鑒定。在NCBI中進(jìn)行搜索與比對，鑒定出抗體4C2亞型為IgGl (κ)0
[0056](2)抗體基因克隆
[0057]收取單克隆細(xì)胞株細(xì)胞I X 106，Trizol法提取mRNA。首先設(shè)計基因特異性的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)獲得cDNA，然后利用一輪PCR擴(kuò)增獲得4C2Fab (抗原結(jié)合片段)序列。測序獲得主要序列后，通過NCBI比對獲得4C2Fab全序列。
[0058]4C2Fab Vh-ChI測序所用引物及反應(yīng)條件如下:
[0059]引物:4C2-1gHV-Fl:TCTGGATTCACTTTCAGTAG
[0060]IgHG1-R3: GGATCCAGAGTTCCAGGTCA
[0061]IgHG1-R4: CACTGGCTCAGGGAAATAGC
[0062]RT-PCR:
【權(quán)利要求】
1.一種中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體，其特征在于，是鼠源單克隆中和抗體，其重鏈、輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述鼠源單克隆中和抗體FabVh-ChI的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，F(xiàn)ab ?的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示。
3.一種制備權(quán)利要求1所述中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體的方法，是先制備獲得高純度活性MERS-CoV病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白，然后以該蛋白為抗原篩選獲得抗MERS-CoV病毒的鼠源單克隆中和抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，具體步驟為: Cl)將編碼MERS-CoV病毒表面S蛋白受體結(jié)合區(qū)的基因序列連接到載體pFastBacl中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PFastBac-MERS RBD，并轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞、篩選鑒定陽性克隆，提取重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，培養(yǎng)獲得大量高滴度病毒；然后感染Hi5細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化濃縮得到目的蛋白MERS-RBD ； (2)以MERS-RBD蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取血清抗體效價最高的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，篩選獲得雜交瘤細(xì)胞；并進(jìn)一步用ELISA檢測篩選獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細(xì)胞株，注入小鼠腹腔制備腹水單抗，純化獲得鼠源抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還將所得鼠源抗體通過流式細(xì)胞儀檢測抑制RBD結(jié)合CD26的效果，并用假病毒中和試驗確認(rèn)得到有中和假病毒活性的抗體。
6.一種人源化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體，其特征在于，其重鏈、輕鏈的氨基酸序列分別如 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 所示。
7.一種制備權(quán)利要求6所述人源`化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體的方法，是先制備獲得高純度活性MERS-CoV病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白，以該蛋白為抗原篩選獲得抗MERS-CoV病毒的鼠源單克隆中和抗體；然后對抗鼠源單克隆中和抗體和MERS-RBD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和序列比對，獲取此鼠源抗體與MERS-RBD蛋白結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，最終對鼠源抗體進(jìn)行人源化改造設(shè)計。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，具體步驟為: Cl)將編碼MERS-CoV病毒表面S蛋白受體結(jié)合區(qū)的基因序列連接到載體pFastBacl中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PFastBac-MERS RBD，并轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞、篩選鑒定陽性克隆，提取重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，培養(yǎng)獲得大量高滴度病毒；然后感染Hi5細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化濃縮得到目的蛋白MERS-RBD ； (2 )以MERS-RBD蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取血清抗體效價最高的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5:1比進(jìn)行融合，通過HAT篩選培養(yǎng)基和有限稀釋法獲得雜交瘤細(xì)胞；并進(jìn)一步用ELISA檢測篩選獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細(xì)胞株，注入小鼠腹腔制備腹水單抗，純化獲得鼠源抗體； (3)通過測序比對獲得所述鼠源抗體的Fab全序列，制備和純化抗體Fab片段；將MERSRBD蛋白與抗體Fab片段共孵育，通過對復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析，確定了抗體Fab片段中對于結(jié)合MERS RBD蛋白起關(guān)鍵作用的氨基酸；將所述鼠源抗體的Fab片段與已報道的人源抗體相比對，找與之同源性最高的序列，保留CDR區(qū)中對于結(jié)合MERS RBD蛋白起關(guān)鍵作用的氨基酸，其它氨基酸替換為人源抗體相對應(yīng)的氨基酸序列，最終獲得人源化MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體。
9.權(quán)利要求1所述抗體在制備用于預(yù)防或治療中東呼吸綜合征的抗體中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要 求6所述抗體在制備用于預(yù)防或治療中東呼吸綜合征的抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K16/10GK103864924SQ201410050894
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】高福, 嚴(yán)景華, 李燕, 逯光文, 齊建勛 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所