一種重組蛋白的提取純化方法
【專利摘要】本發(fā)明一種重組蛋白的提取純化方法，屬生物工程領(lǐng)域。此方法特別適合一類以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白，這類重組蛋白在低濃度變性劑環(huán)境中對(duì)超聲促溶作用不敏感。本工藝的特征在于利用逆流超聲設(shè)備依次進(jìn)行工程菌破碎和去除包涵體中雜蛋白，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的純化。本發(fā)明與已有的技術(shù)相比，工藝簡(jiǎn)單和成本低，在保證產(chǎn)品純度前提下，回收率相應(yīng)提高，適用于重組蛋白大批量純化。
【專利說(shuō)明】一種重組蛋白的提取純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別是指一種基因工程菌表達(dá)的重組蛋白提取純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]通常外源基因的表達(dá)，特別是來(lái)自真核生物的基因在原核生物(如大腸桿菌)中的表達(dá)，由于宿主菌缺乏此種基因相應(yīng)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)環(huán)境與其天然環(huán)境差異(如氧化還原環(huán)境、胞內(nèi)pH、自由水的濃度等)，這些使得宿主的細(xì)胞在非正常狀態(tài)下生長(zhǎng)，導(dǎo)致所表達(dá)的蛋白質(zhì)多數(shù)以無(wú)活性的包涵體的形式存在。
[0003]包涵體是微生物細(xì)胞中密度最大的結(jié)構(gòu)，密度在1.1-1.3之間，對(duì)機(jī)械攪拌和超聲破碎作用不敏感。以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)在下游生產(chǎn)過(guò)程中具有一些優(yōu)越性。表現(xiàn)在:
(1)異源表達(dá)的蛋白質(zhì)很容易被宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)酶降解，而以包涵體形式表達(dá)重組蛋白質(zhì)，由于包埋了蛋白酶水解的作用位點(diǎn)，可以最大限度地降低細(xì)胞內(nèi)降解； (2)包涵體蛋白沒(méi)有活性，細(xì)胞破碎和以后的純化步驟不用考慮蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)變化引起的失活問(wèn)題；
(3)與可溶性形式表達(dá)的重組蛋白相比，包涵體形式表達(dá)的蛋白與宿主細(xì)胞其他蛋白的分離更加簡(jiǎn)便和低成本，使用簡(jiǎn)單的離心或者過(guò)濾方法就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白成分進(jìn)行有效的分離；
(4)有些表達(dá)的外源蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性或致死效應(yīng)，大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)緩慢或死亡，最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)停园w形式表達(dá)的蛋白質(zhì)由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達(dá)和積累。
[0004]以包涵體表達(dá)的重組蛋白提取純化方法通常為:工程發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞破碎，離心收集沉淀，包涵體洗滌，離心收集沉淀(重復(fù)洗滌離心若干次)，包涵體變性溶解，離心收集上清，純化(親和純化和稀釋沉淀法等)。此類方法有如下缺點(diǎn):
(I)操作繁瑣，需要多次離心操作，成本高，不適合放大連續(xù)操作。
[0005](2)所用溶劑種類多，細(xì)胞破碎，包涵體清洗，包涵體溶解純化都需要多種特定的緩沖液，成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服已有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的提供一種工藝簡(jiǎn)單，所需要的溶劑少，成本低，產(chǎn)品的純度和回收均高，適合大批量生產(chǎn)重組蛋白的純化方法。
[0007]本發(fā)明提供的重組蛋白的提取純化方法，按照下述步驟進(jìn)行:
(I)安裝逆流超聲設(shè)備，超聲波控制器控制聚能式超聲波探頭發(fā)出超聲作用于杯型超聲腔緩沖液A中，超聲腔進(jìn)出口帶有閥門(mén)A和閥門(mén)B，蠕動(dòng)泵通過(guò)兩條管道與燒杯中緩沖液B連接，燒杯中緩沖液B在攪拌器的攪拌已保證充分反應(yīng)，燒杯置于裝有冰水混合物的容器中，液體的定向循環(huán)流動(dòng)由安裝在進(jìn)口管道上的蠕動(dòng)泵完成。
[0008](2)取重組大腸桿菌單克隆接種至含卡那霉素(50 μ g/ml) LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.0)恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，將過(guò)夜菌接種于同樣培養(yǎng)基中，其中接種量為1%，恒溫?fù)u床培養(yǎng)至0D_為0.8時(shí)，添加異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度I mM，28°C-37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h_12h，離心收集濕菌體，進(jìn)行反復(fù)凍融法處理(-20° C/37° C)5次。
[0009](3)關(guān)上逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)，超聲腔中加入工程菌濕菌體和緩沖溶液A (50 mMTris,10 mM EDTA，100 mM NaCl, pH 7.5)，其中工程菌和緩沖溶液A的質(zhì)量與體積比為1:30 (g/ml)。利用超聲(400-600W)進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，至液體變稀，鏡檢細(xì)菌破碎率為98%。
[0010](4)在冰浴的燒杯中加入緩沖溶液B(50 mM Tris, 10 mM EDTA，100 mM NaCl, 1.5-2M urea, pH 7.5)，打開(kāi)逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)，打開(kāi)蠕動(dòng)泵，打開(kāi)攪拌器，使液體在超聲腔和燒杯內(nèi)循環(huán)，超聲工作15 min-20 min (400-600 W);其中緩沖溶液A和緩沖溶液B的體積比為1:3。
[0011](5)將混合液于4°C下8000 rpm離心20 min，收集沉淀，溶于6-8 M尿素，4°C下10000 rpm離心20 min取上清，上清液經(jīng)脫鹽柱脫鹽得純化重組蛋白。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明中細(xì)胞破碎和包涵體純化均在逆流超聲設(shè)備中完成，同常規(guī)離心方法(如利用超聲細(xì)胞破碎 儀破碎細(xì)胞，離心去沉淀，用緩沖液對(duì)沉淀包涵體進(jìn)行懸浮清洗離心操作若干次)相比簡(jiǎn)少了操作量，減少了試劑使用量，同親和色譜方法相比，由于沒(méi)有使用相對(duì)昂貴的親和色譜填料，成本低且適合大量制備重組蛋白。在逆流超聲設(shè)備的包涵體純化操作中，在超聲波作用下，沉淀中顆粒變的更小且分散均勻，相比對(duì)超聲促溶作用不敏感的重組蛋白包涵體，顆粒中細(xì)胞組成性蛋白和核酸等物質(zhì)更加容易溶解在含有低濃度變性劑(尿素)緩沖液中，然后通過(guò)一次離心使得重組蛋白得到純化。相比傳統(tǒng)的包涵體純化方法，此方法操作簡(jiǎn)便，成本低。
[0013]下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為逆流超聲設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為超聲波控制器，2為聚能式超聲波探頭，3為緩沖液A，4為閥門(mén)A，5為閥門(mén)B，6為蠕動(dòng)泵，7為緩沖液B，8為冰水混合物，9為攪拌器。
[0015]圖2為逆流超聲設(shè)備的細(xì)胞破碎工作狀態(tài)示意圖(局部)。
[0016]圖3為逆流超聲設(shè)備的包涵體純化工作狀態(tài)示意圖(局部)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0018]在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0019]實(shí)施例中所用方法對(duì)照的方法具體如下實(shí)施:
逆流超聲設(shè)備如附圖1所示，超聲波控制器I控制聚能式超聲波探頭2發(fā)出超聲作用于杯型超聲腔緩沖液A (圖1中的3)中，超聲腔進(jìn)出口帶有閥門(mén)A和閥門(mén)B (圖1中4和
5)，蠕動(dòng)泵6通過(guò)兩條管道與燒杯中緩沖液B (圖1中的7)連接，燒杯中緩沖液B在攪拌器9的攪拌已保證充分反應(yīng)，燒杯置于裝有冰水混合物8的容器中，液體的定向循環(huán)流動(dòng)由安裝在進(jìn)口管道上的蠕動(dòng)泵6完成。
[0020]實(shí)施例所用的重組菌種為大腸桿菌BL21-MF3A3 (已申請(qǐng)專利，專利申請(qǐng)?zhí)枮?CN201010546991)和大腸桿菌BL21-M32PD，(已申請(qǐng)專利，專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010547009)。
[0021]對(duì)比方法(鎳柱親和純化):
1、工程菌的發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)
取重組大腸桿菌(BL21-MF3A3或BL21-M32H))單克隆接種至5 ml卡那霉素(50 μ g/ml)LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7.0) 37°C, 180 rpm培養(yǎng)過(guò)夜，按1%接種量將過(guò)夜菌接種于50 ml同樣的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C、180rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD6tltl為0.8時(shí)，添加異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度I mM，28°C誘導(dǎo) 12 h (BL21-MF3A3)或 37°C誘導(dǎo) 6 h (BL21-M32PD), 5000 rpm 離心 5 min 收集菌體。
[0022]2、細(xì)胞破碎和包涵體純化
將收集到的菌體反復(fù)凍融法處理(-20° C/37° C) 5次，重懸浮于緩沖液3 (100 mMNaH2PO4,10 mM Tris, pH 8.0)，利用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞3 min (300 ff),8000 rpm離心 5 min 取沉淀，重懸浮于緩沖液 4(100 mM NaH2PO4,10 mM Tris, 8 M urea, pH 8.0)，超聲處理20 s (300 W)，10000 rpm離心10 min取上清，將上清液加入含Ni2+-NTA His.Bindresin(Bi0miga，USA)層析柱進(jìn)行親和吸附。利用2倍柱體積的緩沖液5 (100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8 M urea,pH 6.3)洗柱子去除吸附的雜蛋白，再利用緩沖液6( 100 mM NaH2PO4,IOmM Tris,8 M urea, pH 4.5)洗脫吸附的重組蛋白，收集洗脫液。利用CELLUFINE GH-25脫鹽柱(購(gòu)自CHISSO公司)對(duì)洗脫液液進(jìn)行脫鹽得到重組蛋白，并利用SDS-PAGE電泳和BCA法分別檢測(cè)其純度和含量。
[0023]利用此方法，純化的重組蛋白(大腸桿菌BL21-MF3A3和大腸桿菌BL21-M32PD)純度大于95%，回收率分別為32%和59.2%。
[0024]實(shí)施例1、大腸桿菌BL21-MF3A3重組蛋白的純化 1、工程菌的發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)
同對(duì)比方法。
[0025]2、細(xì)胞破碎和包涵體純化
如圖2所示，關(guān)上逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)A和B (此時(shí)設(shè)備相當(dāng)于普通的超聲波細(xì)胞破碎儀)，加入發(fā)酵誘導(dǎo)后的工程菌5 g (經(jīng)-20° C/37° C反復(fù)凍融處理5次)和150 ml緩沖溶液 A(50 mM Tris, 10 mM EDTA，100 mM NaCl, pH 7.5)，利用超聲進(jìn)行細(xì)胞破碎 10 min(400 W)至液體變的不再粘稠，鏡檢細(xì)菌破碎率為98%。
[0026]在冰浴的燒杯中加入450 ml 緩沖溶液 B(50 mM Tris, 10 mM EDTA，100 mM NaCl,1.5 M urea,pH 7.5)，如圖3所示，打開(kāi)逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)A和B，打開(kāi)蠕動(dòng)泵(300 rpm),打開(kāi)攪拌器，使液體在杯型超聲腔和燒杯內(nèi)循環(huán)，超聲工作15 min (400 W)。[0027]將混合液于于4°C下8000 rpm離心20 min，收集沉淀，溶于6 M尿素，4°C下10000 rpm離心20 min取上清，上清液利用CELLUFINE GH-25柱脫鹽得純化重組蛋白，利用SDS-PAGE電泳和BCA法分別檢測(cè)重組蛋白的純度和含量，所得蛋白純度大于95%，回收率為39%，回收率比對(duì)比方法提高了 21.9%。
[0028]實(shí)施例2、大腸桿菌BL21-M32H)重組蛋白的純化
1、工程菌的發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)
同對(duì)比方法。
[0029]2、細(xì)胞破碎和包涵體純化
如圖2所示，關(guān)上逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)A和B (此時(shí)設(shè)備相當(dāng)于普通的超聲波細(xì)胞破碎儀)，加入發(fā)酵誘導(dǎo)后的工程菌5 g (經(jīng)-20° C/37° C反復(fù)凍融處理5次)和150 ml緩沖溶液 A(50 mM Tris, 10 mM EDTA，100 mM NaCl, pH 7.5)，利用超聲進(jìn)行細(xì)胞破碎 10 min(600 W)至液體變的不再粘稠，鏡檢細(xì)菌破碎率為98%。
[0030]在冰浴的燒杯中加入450 ml 緩沖溶液 B(50 mM Tris, 10 mM EDTA，100 mM NaCl,2 M urea, pH 7.5)，如圖3所示，打開(kāi)逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)A和B，打開(kāi)蠕動(dòng)泵(300 rpm),使液體在杯型超聲腔和燒杯內(nèi)循環(huán)，超聲工作20 min (600 W)。
[0031]將混合液于4°C下8000 rpm離心20 min，收集沉淀，溶于8 M尿素，4°C下10000rpm離心20 min取上清，上清液利用CELLUFINE GH-25柱脫鹽得純化重組蛋白，利用SDS-PAGE電泳和BCA法分別檢測(cè)重組蛋白的純度和含量，所得蛋白純度大于95%，回收率為72.6%，回收率比對(duì)比方法提高了 22.6%。
【權(quán)利要求】
1.重組蛋白的提取純化方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行: (1)安裝逆流超聲設(shè)備，超聲波控制器控制聚能式超聲波探頭發(fā)出超聲作用于杯型超聲腔緩沖液A中，超聲腔進(jìn)出口帶有閥門(mén)A和閥門(mén)B，蠕動(dòng)泵通過(guò)兩條管道與燒杯中緩沖液B連接，燒杯中緩沖液B在攪拌器的攪拌已保證充分反應(yīng)，燒杯置于裝有冰水混合物的容器中，液體的定向循環(huán)流動(dòng)由安裝在進(jìn)口管道上的蠕動(dòng)泵完成； (2)取重組大腸桿菌單克隆接種至含50μ g/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，將過(guò)夜菌接種于同樣培養(yǎng)基中，其中接種量為1%，恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD_為0.8時(shí)，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度I mM，28°C-37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h_12h，離心收集濕菌體，進(jìn)行反復(fù)凍融法處理(-20° C/37° C)5次； (3)關(guān)上逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)，超聲腔中加入工程菌濕菌體和緩沖溶液A，其中工程菌和緩沖溶液A的質(zhì)量與體積比為1:30 (g/ml)，利用功率為400-600W超聲進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，至液體變??； (4)在冰浴的燒杯中加入緩沖溶液B，打開(kāi)逆流超聲設(shè)備的閥門(mén)，打開(kāi)蠕動(dòng)泵，打開(kāi)攪拌器，使液體在超聲腔和燒杯內(nèi)循環(huán)， 超聲工作15 min-20 min (400-600 W);其中緩沖溶液A和緩沖溶液B的體積比為1:3 ； (5)將混合液于4°C下8000rpm離心20 min，收集沉淀，溶于6-8 M尿素，4°C下10000rpm離心20 min取上清，上清液經(jīng)脫鹽柱脫鹽得純化重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白的提取純化方法，其特征在于步驟(2)中LB液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白的提取純化方法，其特征在于緩沖溶液A為50mMTris,10 mM EDTA，100 mM NaCl，pH 7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白的提取純化方法，其特征在于緩沖溶液B為50mMTris,10 mM EDTA,100 mM NaCl,1.5-2 M urea, pH 7.5。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103724398SQ201310730638
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】馬海樂(lè), 李云亮, 張赫男, 張艷艷 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)