一種多特異性融合抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多特異性融合抗體及其應用，特別是一種能同時與四種殘留藥物發(fā)生免疫學反應的抗體，屬于免疫學檢測【技術領域】。本發(fā)明通過將氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的VH和VL基因進行整合，得到能同時與上述四種殘留藥物發(fā)生反應的多特異性抗體。以此多聯特異性融合單鏈抗體為探針建立一種快速的免疫學檢測方法，從而達到一次性、快速、篩檢多種殘留藥物的目的。
【專利說明】一種多特異性融合抗體及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多特異性融合抗體，特別是一種能同時與四種殘留藥物發(fā)生免疫 學反應的抗體，屬于免疫學檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 傳統(tǒng)的單克隆抗體由于其分子本身F。龐大結構特點使得其在疾病診斷和治療方 面存在許多問題：首先，傳統(tǒng)單克隆抗體都是異源性的，誘發(fā)免疫反應普遍較強；其次，在 體內代謝快，特異性稍差；再次，雜交瘤技術篩選的單克隆抗體多數只能保持天然抗體的活 性，且挑選的抗體無中和抗原生物活性的能力，要挑選中和性抗體是相當復雜和困難的。最 后，許多特異性抗體在體內并不能夠完全發(fā)揮其預期的凝集活性；許多優(yōu)良的抗體雜交瘤 細胞株在傳代過程中穩(wěn)定性不強，容易丟失。再附以制備工作過程繁瑣拖沓和費時費力，使 得單克隆抗體技術的普及一度受限。
[0003] 單鏈抗體，是在DNA水平上將抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因用一段適當的寡核 苷酸（Linker)連起來，使之在適當生物體中表達成為一條單一肽鏈，稱為單鏈抗體 (SinglechainFv，ScFv)。作為一個重要基因工程抗體，ScFv更易于在原核細胞進行表達和 在基因水平進行改造。對ScFv的進一步研究中，在取得了重大進展的同時，一些應用于臨 床出現的問題也暴露出來，如親和力較低，穩(wěn)定性較差，半衰期短等缺點，這些缺點也限制 著ScFv在治療過程中的普及性。
[0004] 利用兩種不同的單鏈抗體的Vh和 '基因，使其在表達過程中實現重新組合，形成 具有雙特異性的單鏈抗體，這種雙特異性單鏈抗體可以同時與兩種抗原特異性地結合。與 傳統(tǒng)的雙特異性抗體相比，雙特異性單鏈抗體既保持了特異性結合抗原的特點，又具有以 下優(yōu)點：缺失Fc片段，減少了與FcR陽性細胞發(fā)生非特異性結合的可能性；最大限度地降 低了鼠源性蛋白和免疫變態(tài)反應的可能性；分子量小，有利于穿透腫瘤組織；避免了傳統(tǒng) 制備雙特異性抗體需要進行細胞雜交的步驟，減少了工作量，提高了制備的成功率。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種多特異性融合抗體，是將來源于小鼠的4 種單鏈抗體的V h和 '基因進行整合得到，含有8個抗體重鏈與8個抗體輕鏈。
[0006] 所述4種單鏈抗體分別是氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單 鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體。
[0007] 所述多特異性抗體，包含（a)氯霉素單鏈抗體的V1^P '基因片段；（b)環(huán)丙沙星 單鏈抗體的Vh和 '基因片段；（c)磺胺二甲嘧啶單鏈抗體的單鏈抗體片段；（d)克倫特羅 單鏈抗體的單鏈抗體片段；所述片段（a)、（b)、（c)、（d)通過有別于組裝單鏈抗體基因的連 接肽連接。
[0008] 所述融合抗體包含4個結構域，第一結構域可與氯霉素的表位結合，第二結構域 可與磺胺二甲嘧啶的表位結合，第三結構域可與環(huán)丙沙星的表位結合，第四結構域可與克 倫特羅的表位結合。
[0009] 編碼所述融合抗體的基因序列為SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 獲得所述融合抗體的方法是通過PCR獲得氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、 磺胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的Vh和 '，并通過重疊 PCR將4個片段連接起 來，純化后雙酶切、回收、連接到表達載體PGEX-6P-1，得到重組質粒pGEX-CCSC，轉化DH5 α 感受態(tài)細胞，測序驗證后，將重組質粒pGEX-CCSC轉化DE3在20°C條件下培養(yǎng)表達融合抗 體。
[0011] 本發(fā)明所提供的多特異性融合抗體具有廣譜特異、低耗高效和靈敏便捷地同步篩 檢多種殘留獸藥的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為構建重組蛋白pET-22b-CPFX - ScFv的載體。
[0013] 圖2為pET-22b-CAP-ScFv不同時間內的誘導表達SDS-PAGE ;
[0014] (1 :未誘導，2?5 :1?4h誘導，6 :空載體對照，7 :Marker，8?10 :5?7h誘導)。
[0015] 圖3為pET-22b-CPFX-ScFv不同時間內的誘導表達SDS-PAGE ;
[0016] (I :0h，2 :lh，3 :2h，4 :3h，5 :4h，6 :5h，7 :Marker，8、9 :空載體對照）。
[0017] 圖4為pET-22b-SM2-ScFv不同時間內的誘導表達SDS-PAGE ;
[0018] (1 :未誘導，2?5 :1?4h誘導，6 :Marker，7?9 :5?7h誘導，10 :空載體對照)。
[0019] 圖5為pET-22b-CL-ScFv不同時間內的誘導表達SDS-PAGE ;
[0020] (1 :未誘導，2?5 :1?4h誘導，6 :Marker，7?9 :5?7h誘導，10 :空載體對照)。
[0021] 圖6為重組質粒pGEX-CCSC (DE3)梯度誘導表達產物的SDS-PAGE ;
[0022] (M :蛋白 Marker (200,130,97. 4,66. 2,43ku)，1 :誘導的 pGEX-6P-l 載體，2 :誘導 的 pGEX-CCS 載體，3、4 :未誘導的 pGEX-CCS 載體，5-9 :誘導的 pGEX-CCSClh-5h)。

【具體實施方式】
[0023] 實施例1氯霉素、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克倫特羅單鏈抗體的制備
[0024] 采用化學合成的方法分別獲得氯霉素、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克倫特羅單鏈 抗體。編碼氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單鏈抗體、克倫特羅單鏈抗 體的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 所示。
[0025] 實施例2氯霉素、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克倫特羅單鏈抗體在pET_22b (+)原 核載體中表達
[0026] 利用實施例1中的4個基因與pET-22b表達系統(tǒng)，分別構建pET-22b-CAP-ScFv、 pET-22b-CPFX-ScFv、pET-22b-SM2-ScFv 表達載體和 pET-22b-CL-ScFv。以 pET-22b-CPFX -ScFv的構建為例進行說明，詳見圖1，其余質粒的構建參見pET-22b-CPFX - ScFv的構建方 法。
[0027] 目的基因產物與表達載體質粒的雙酶切體系為如表1。雙酶切的目的片段純化回 收，按表2體系連接，瞬時離心混勻于管底。4°C連接過夜，備用。
[0028] 表1雙酶切體系
[0029]

【權利要求】
1. 一種多特異性融合抗體，其特征在于，是將氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺 胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅抗體的VH和 '基因進行整合得到。
2. 根據權利要求1所述的融合抗體，其特征在于，所述多特異性抗體，包含（a)氯霉素 單鏈抗體的VH和 '基因片段；（b)環(huán)丙沙星單鏈抗體的VH和 '基因片段；（c)磺胺二甲嘧 啶單鏈抗體的單鏈抗體片段；（d)克倫特羅單鏈抗體的單鏈抗體片段；所述片段（a)、（b)、 (c)、（d)通過有別于組裝單鏈抗體基因的連接肽連接。
3. 根據權利要求1所述的融合抗體，其特征在于，所述融合抗體包含4個結構域，第一 結構域可與氯霉素的表位結合，第二結構域可與磺胺二甲嘧啶的表位結合，第三結構域可 與環(huán)丙沙星的表位結合，第四結構域可與克倫特羅的表位結合。
4. 編碼權利要求1所述融合抗體的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所 /_J、i 〇
5. 含有權利要求4所述基因的質粒或細胞。
6. 獲得權利要求1所述融合抗體的方法，其特征在于，是化學合成序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5所示的4條單鏈抗體基因，連接表達載 體 pET-22b，分別構建 pET-22b-CAP-ScFv、pET-22b-CPFX-ScFv、pET-22b-SM2-ScFv 和 pET-22b-CL-ScFv;設計合成引物，通過PCR方法從制備的四個重組質粒中擴增獲得四個單 鏈抗體的VH和 '基因片段，再通過重疊PCR組裝起來，所得目的基因純化后連接到表達載 體PGEX-6P-1上，得到重組質粒pGEX-CCSC，轉化DH5 a感受態(tài)細胞，篩選測序正確的重組質 粒pGEX-CCSC轉化E. coli感受態(tài)BL21 (DE3)，在20°C條件下誘導表達。
7. 權利要求1所述融合抗體在殘留藥物檢測中的應用。
【文檔編號】C07K16/46GK104371020SQ201310721847
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王穎, 柳增善, 張東杰, 安宇, 霍方珍 申請人:黑龍江八一農墾大學