一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，包括以下步驟：（1）將去甲腎上腺素溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白溶于去離子水制備載體蛋白溶液，碳二亞胺溶于去離子水制備催化溶液；（2）將抗原溶液和載體蛋白混合并攪拌15分鐘；（3）將催化溶液邊震蕩邊滴入步驟（2）制備的抗原溶液和載體蛋白溶液的混合溶液中，4℃震蕩反應(yīng)4小時(shí)，得反應(yīng)混合物；（4）反應(yīng)混合物通過(guò)超濾、透析或者脫鹽柱處理除去反應(yīng)混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種制備方法簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于去甲腎上腺素抗體制備和免疫學(xué)檢測(cè)的完全抗原。
【專利說(shuō)明】一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的是一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]去甲腎上腺素(INN名稱:Norepinephrine,也稱 Noradrenaline,縮寫 NE 或 NA),舊稱“正腎上腺素”，學(xué)名1- (3，4- 二羥苯基)-2-氨基乙醇，是腎上腺素去掉N-甲基后形成的物質(zhì)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于兒茶酚胺。它既是一種神經(jīng)遞質(zhì)，主要由交感節(jié)后神經(jīng)元和腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成和分泌，是后者釋放的主要遞質(zhì)，也是一種激素，由腎上腺髓質(zhì)合成和分泌。
[0003]去甲腎上腺素和腎上腺素既是腎上腺髓質(zhì)所分泌的激素，又是交感神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中去甲腎上腺素能纖維的神經(jīng)介質(zhì)。去甲腎上腺素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛，含量較多，而腎上腺素含量則較少。多巴胺主要集中在錐體外系部位，也是一種神經(jīng)介質(zhì)。它們是重要的典型的腎上腺素受體激動(dòng)劑。
[0004]通常，兒茶酚胺是指多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素。這三種兒茶酚胺都是由酪氨酸衍生而來(lái)的化合物。血漿里兒茶酚胺水平的變化顯示不同的病態(tài)情形。一般通過(guò)不正常兒茶酚胺水平能斷定兩個(gè)方面:第I點(diǎn)涉及到腎上腺髓質(zhì)瘤，這些瘤結(jié)合大量的兒茶酚胺導(dǎo)致循環(huán)失常。第2點(diǎn)涉及到心血管系統(tǒng)。(兒茶酚胺)含量超標(biāo)會(huì)引發(fā)高血壓與心肌梗塞，含量過(guò)低時(shí)則通常導(dǎo)致低血壓。兒茶酚胺含量水平的不同和心臟猝死及冠狀心臟病和心臟不充血等也有潛在聯(lián)系。目前，人體內(nèi)的兒茶酚胺類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要是液相色譜法、熒光光度法。但是檢測(cè)過(guò)程繁瑣，對(duì)儀器要求高，難以廣泛應(yīng)用。
[0005]免疫學(xué)檢測(cè)方法不僅方法簡(jiǎn)單成本低廉，且對(duì)儀器要求不高，靈敏度、準(zhǔn)確性不遜于液相色譜法。但建立高效的免疫學(xué)檢測(cè)方法的關(guān)鍵是需要高品質(zhì)的抗體和完全抗原。而去甲腎上腺素是小分子結(jié)構(gòu)，激發(fā)不了動(dòng)物產(chǎn)生抗體，也無(wú)法直接應(yīng)用于免疫檢測(cè)。因此，需要研究人員提供一種簡(jiǎn)單可靠的方法，以獲得一種高效的完全抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種制備方法簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于去甲腎上腺素抗體制備和免疫學(xué)檢測(cè)的完全抗原。
[0007]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
[0008]一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0009]( I)將去甲腎上腺素溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白溶于去離子水制備載體蛋白溶液，碳二亞胺溶于去離子水制備催化溶液；
[0010](2)將抗原溶液和載體蛋白混合并攪拌15分鐘，去甲腎上腺素與載體蛋白的摩爾比為 10-20:1 ；
[0011](3)將催化溶液邊震蕩邊滴入步驟(2)制備的抗原溶液和載體蛋白溶液的混合溶液中,4V震蕩反應(yīng)4小時(shí),得反應(yīng)混合物；[0012](4)反應(yīng)混合物通過(guò)超濾、透析或者脫鹽柱處理除去反應(yīng)混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用PH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。
[0013]進(jìn)一步，步驟(1)中，所述載體蛋白為含有游離羧基的蛋白大分子。
[0014]進(jìn)一步，所述含有游離羧基的蛋白大分子為牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍(lán)蛋白。
[0015]進(jìn)一步，所述抗原溶液濃度為lOmmol/L，載體蛋白溶液濃素為0.5mmol/L，催化溶液濃度為20mmol/L。
[0016]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說(shuō)明偶聯(lián)成功。
[0017]實(shí)驗(yàn)對(duì)照組按照上述步驟(1) - (4)制備，只是不添加抗原溶液。
[0018]碳二亞胺是一種水溶液縮合劑，常用作酰胺與伯胺鍵合的羧基活化劑。本方法就是利用其縮合劑的特性，將去甲腎上腺素的氨基與載體蛋白中的羧基縮合形成肽鍵。
[0019]本方法利用去甲腎上腺素的氨基端能通過(guò)催化和蛋白大分子游離的羧基縮合形成肽鍵的特性，將去甲腎上腺素與載體蛋白偶聯(lián)，有效的將免疫原性強(qiáng)的苯環(huán)端暴露在外，有利于激發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體。并且因?yàn)闃?gòu)象與其他兒茶酚胺類物質(zhì)不同，不會(huì)產(chǎn)生與其他J L茶酚胺類物質(zhì)交叉的抗體。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種制備方法簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于去甲腎上腺素抗體制備和免疫學(xué)檢測(cè)的完全抗原，直接應(yīng)用于免疫檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0021]圖1是偶聯(lián)物通過(guò)分光光度計(jì)掃描鑒定圖【具體實(shí)施方式】:
[0022]實(shí)施例1去甲腎上腺素與載體蛋白BSA偶聯(lián)
[0023](1)將去甲腎上腺素溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白BSA溶于去離子水制備載體蛋白溶液，碳二亞胺溶于去離子水制備催化溶液，去甲腎上腺素溶液抗原溶液為10mmol/L (即 3.37mg/ml),載體蛋白 BSA 溶液為 0.5mmol/L (即 33mg/ml) B,碳二亞胺催化溶液為 20mmol/L (即 3.82mg/ml)；
[0024](2)將抗原溶液和載體蛋白BSA混合并攪拌15分鐘，去甲腎上腺素與載體蛋白BSA的摩爾比為20:1 ；
[0025](3)將碳二亞胺催化溶液邊震蕩邊滴入步驟(2)制備的抗原溶液和載體蛋白BSA溶液的混合溶液中，4V震蕩反應(yīng)4小時(shí),得反應(yīng)混合物；
[0026](4)反應(yīng)混合物通過(guò)超濾處理48小時(shí)除去反應(yīng)混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用PH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。
[0027]按照步驟(1) (2) (3) (4)的方法，不需要去甲腎上腺素制備抗原溶液，維持其他各反應(yīng)條件不變，制備實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品。
[0028]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說(shuō)明偶聯(lián)成功。
[0029]實(shí)施例2去甲腎上腺素與載體蛋白卵清蛋白偶聯(lián)
[0030](I)將去甲腎上腺素溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白卵清蛋白溶于去離子水制備載體蛋白溶液，碳二亞胺溶于去離子水制備催化溶液，去甲腎上腺素溶液抗原溶液為10mmol/L (即3.37mg/ml),載體蛋白卵清蛋白溶液為0.5mmol/L (即33mg/ml)B,碳二亞胺催化溶液為20mmol/L (即3.82mg/ml)；
[0031](2)將抗原溶液和載體蛋白卵清蛋白混合并攪拌15分鐘，去甲腎上腺素與載體蛋白卵清蛋白的摩爾比為15:1 ；
[0032](3)將碳二亞胺催化溶液邊震蕩邊滴入步驟(2)制備的抗原溶液和載體蛋白卵清蛋白溶液的混合溶液中，4°C震蕩反應(yīng)4小時(shí)，得反應(yīng)混合物；
[0033](4)反應(yīng)混合物通過(guò)透析處理48小時(shí)除去反應(yīng)混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用PH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。
[0034]按照步驟(1) (2) (3) (4)的方法，不需要去甲腎上腺素制備抗原溶液，維持其他各反應(yīng)條件不變，制備實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品。
[0035]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說(shuō)明偶聯(lián)成功。
[0036]實(shí)施例3去甲腎上腺素與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)
[0037]( I)將去甲腎上腺素溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白溶于去離子水制備載體蛋白溶液，碳二亞胺溶于去離子水制備催化溶液，甲腎上腺素溶液抗原溶液為10mmol/L (即3.37mg/ml),載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白溶液為0.5mmol/L (即33mg/ml)B,碳二亞胺催化溶液為20mmol/L (即3.82mg/ml)；
[0038](2)將抗原溶液和載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白混合并攪拌15分鐘，去甲腎上腺素與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白的摩爾比為10:1 ；
[0039](3)將碳二亞胺催化溶液邊震蕩邊滴入步驟(2)制備的抗原溶液和載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白溶液的混合溶液中，4°C震蕩反應(yīng)4小時(shí)，得反應(yīng)混合物；
[0040](4)反應(yīng)混合物通過(guò)脫鹽柱處理48小時(shí)除去反應(yīng)混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用PH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。
[0041]按照步驟(1) (2) (3) (4)的方法，不需要去甲腎上腺素制備抗原溶液，維持其他各反應(yīng)條件不變，制備實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品。
[0042]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說(shuō)明偶聯(lián)成功。
【權(quán)利要求】
1.一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將去甲腎上腺素溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白溶于去離子水制備載體蛋白溶液，碳二亞胺溶于去離子水制備催化溶液； (2)將抗原溶液和載體蛋白混合并攪拌15分鐘，去甲腎上腺素與載體蛋白的摩爾比為10-20:1 ； (3)將催化溶液邊震蕩邊滴入步驟(2)制備的抗原溶液和載體蛋白溶液的混合溶液中，4°C震蕩反應(yīng)4小時(shí),得反應(yīng)混合物； (4)反應(yīng)混合物通過(guò)超濾、透析或者脫鹽柱處理除去反應(yīng)混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用PH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述載體蛋白為含有游離羧基的蛋白大分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，所述含有游離羧基的蛋白大分子為牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍(lán)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，所述抗原溶液濃度為lOmmol/L，載體蛋白溶液濃素為0.5mmol/L，催化溶液濃度為20mmol/L。
【文檔編號(hào)】C07K14/795GK103570824SQ201310608923
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】張振斌, 李克錦, 楊桂霞, 劉萍, 欒大偉 申請(qǐng)人:博奧賽斯（天津）生物科技有限公司