從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法、肽和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法、肽和檢測試劑盒。為此，根據(jù)本發(fā)明，使用了至少兩種肽單元，其中至少一種肽單元包括非來源于絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白1和細胞角蛋白9的部分，并且所述肽單元包括XG基序，以及一種肽單元包括XnonG基序，其中X為瓜氨酸或其類似物，而nonG為除甘氨酸之外的氨基酸。
【專利說明】從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法、肽和檢測試劑盒
[0001]本申請是申請日為2002年12月11日、發(fā)明名稱為“從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法、肽和檢測試劑盒”的中國發(fā)明專利申請N0.02824647.0的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及一種通過使用包含瓜氨酸殘基或其類似物的肽來從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法。
【背景技術】
[0003]該方法由國際專利申請PCT / NL97 / 00624已知。該文獻中描述了來源于絲聚蛋白的，包含瓜氨酸或其類似物的肽用于從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的應用。因此，所用的肽適于診斷應用，并且與當時采用的方法相比，使更可靠的檢測成為可能。更特別的，該方法能降低假陽性率，也就是具有更高的特異性。此外，其敏感性也相對較高。一種被稱為cfcl的肽，被36%的來自患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血清識別。該肽的環(huán)狀變異體表現(xiàn)出被更好地識別(63% )。
[0004]前言所述的方法還由國際專利申請PCT / FROO / 01857已知。該文獻中描述了來源于纖維蛋白或纖維蛋白原的，包含瓜氨酸或其類似物的肽用于從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的應用。
[0005]PCT / EP98 / 07714中描述了來源于絲聚蛋白(原)的合成肽在診斷類風濕性關節(jié)炎中的應用。該申請中還記載了來源于人波形纖維蛋白，細胞角蛋白1，細胞角蛋白9以及其他中間纖絲蛋白的合成`肽。
[0006]然而，上述提到的方法仍只能從全部類風濕性關節(jié)炎患者中檢測出有限數(shù)目的患者。因此，強烈需要一種可實現(xiàn)敏感性增加而同時保持實質上相等或甚至提高的特異性的方法。

【發(fā)明內容】

[0007]為了達到該目的，本發(fā)明提供了一種如前言所述的方法，該方法的特征在于所述的自身抗體與含有XG基序的妝單兀和含有XnonG基序的妝單兀接觸，其中X為瓜氣酸殘基或其類似物，G為甘氨酸，而nonG為除甘氨酸以外的氨基酸。
[0008]下述實驗顯示，獲自患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血清中含有兩種不同的抗體群。其中一群抗體與諸如上文提到的已出版文獻中公開的XG肽單元反應。該群抗體可通過已公開的XG肽單元部分地檢測到，當采用本發(fā)明所述的肽單元時，則能檢測到更大部分的該群抗體。另一群抗體與XnonG肽單元反應。直到目前為止，在已出版的文獻中還沒有觀察到這群抗體。如下文更詳細的記載,來自于患有類風濕性關節(jié)炎患者的大多數(shù)血清都含有這兩群抗體。因此，這些血清可以通過包括XG或XnonG肽單元的診斷測試來檢測。然而看來似乎相當大一部分患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血清只含有兩群抗體中的一種。因此，采用上述已出版公開的文獻中描述的診斷測試，無法檢測或僅能檢測極小一部分的僅含有對XnonG肽單元的抗體的血清。如今,如果診斷測試中包括XnonG肽單元,則可以檢測大部分的這類血清。因而本發(fā)明所述的改進診斷方法包括至少一種XG和一種XnonG肽。因此與已出版公開文獻中記載的測試相比，本發(fā)明所述的診斷測試可達到20%更為敏感。
[0009]當所述的具有XnonG基序的肽單元包括一非來源于天然蛋白如人類絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，或纖維蛋白原，以及相關的蛋白波形纖維蛋白，及細胞角蛋白I和細胞角蛋白9，或其他相關的中間纖絲蛋白的部分時，可以獲得特別好的結果。
[0010]令人驚奇的是，結果顯示，當將該非來源于天然蛋白的XnonG肽與本發(fā)明所述的XG肽組合時，可得到一更加改進的診斷方法。更特別的，這種肽單元組合在本發(fā)明所述的方法中的應用提供了一種敏感性非常高，且保持優(yōu)異的特異性的診斷方法。由于上述提到的公開文獻仍然是基于下述觀念，即來自于RA患者的自身抗體與來源于天然存在的蛋白，例如絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白I或細胞角蛋白9的肽特別好地發(fā)生反應，因此這就更讓人驚訝了。例如，PCT / EP98 / 07714中記載了一種絲聚蛋白來源的XnonG肽(IPG1249)。它與3.3%的SLE患者血清交叉反應，且與絲聚蛋白有82%的同源性。
[0011]當所述的具有XnonG基序的肽單元包含一種三肽時，則可獲得較好的結果，其中三肽的中間氨基酸為瓜氨酸或其類似物，其優(yōu)選選自ΧΧΚ，ΧΧΥ, KXI, MXR, RXY, WXK, MXH,VXK, NXR, WXS, RXff, YXM, IXX, XXF, RXH, TXV, PXH, AXF, FXR, YXF, LXM, LXY, YXP, HXS 和 PXW。
[0012]優(yōu)選的，nonG為選自H，I，W，S，R，K，Y，M，F(xiàn)，V，P，Cit或其類似物的氨基酸。如下述實驗所示，這類XnonG肽單元非常有效。
[0013]包括XG基序的肽單元，可來源于或不來源于絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白I或細胞角蛋白9，并且有效地是由PCT / NL97 / 00624中已知的Cf Cl。
[0014]在本文的上下文中，術語氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，和具有D-構型或L-構型的氨基酸。
[0015]在本申請中，非天然氨基酸應理解為該類的氨基酸存在于反-倒位肽，反向肽，其中側鏈位于肽骨架的酰胺氮原子上的肽，和其中肽骨架上的CO被2，3或優(yōu)選單一 -CH2-基團所替代的肽(假肽)中。
[0016]氨基酸還可被修飾。例如，羧酸基團可以被酯化或可被轉化為酰胺，同時氨基基團可被烷基化，例如，甲基化?？蛇x的，肽上的功能基團可以提供有保護基團或標記(例如熒光或放射性標記)。肽中的氨基基團和羧酸基團可以以通過使用酸或堿而形成的鹽的形式存在。如果采用合成肽，則很容易制備可以使用的本發(fā)明范圍內的所有種類的變異體。例如，芳族側鏈基團，如來源于苯丙氨酸和酪氨酸，可被一個或多個鹵素原子鹵化。肽模擬(peptidomimetic)和有機模擬(organomimetic)的實施方案也落在本發(fā)明的范圍內，及其在本發(fā)明所述方法中的應用。還可采用其類似物來代替Cit殘基，例如那些在圖1中列出的氨基酸形式的類似物。這種類似物及其制備方法為本領域的普通技術人員所公知。例如，Sonke et al.在 Stereoselective Biocatalysis (2000), pp.23-58 中有記載，以及在Greene !Protective groups in Organic synthesis(Wiley, New Yorkl999)中。[0017]依照有利的實施方案，所述的瓜氨酸類似物的側鏈具有如下通式(I):
[0018]
【權利要求】
1.根據(jù)如下通式的肽序列:
(A1-A2-A3-A4-A5)-Cit-(A6)-(A7-A8-A9-A10-A1I)， 其中， a.A1-A2-A3-A4-A5 為選自如下組的氨基酸序列:RHGRQ, IRCitYK, HGRQCit,GRQCitCit, FQMCitH, CitffRGM, ARFQM, QCitYKff, KPYTV, RNLRL, RRRCitY, RFKSN, RGKSN,RffVSQ, MKPRY, KSFVff, YSFVff, FQMRH, RNMNR, RMGRP，及其同源序列；和其中 b.A6表示除甘氨酸以外的氨基酸；和其中 c.A7-A8-A9-A10-A11表示選自如下組的氨基酸序列:KYIIY, TNRKF，KWCitKI，CitRAVI, RCitGHS, CitGRSR, CitYIIY, CitRLIR, IERKR, FMRKP, FMRRP, ERNHA, AVITA, TPNRW,TYNRff, RTPTR, RIVVV, HARPR, RGMCitR, IRFPV，及其同源序列。
2.根據(jù)如下通式的肽序列:
(Β1-Β2-Β3-Β4-Β5-Β6) -Cit-(Β7)-(Β8-Β9-Β10-Β11) 其中， a.B1-B2-B3-B4-B5-B6 為選自如下組的氨基酸序列:INCitRAS，ICitKRLY,KCitCitYNI， RLYFICit, IR QGAR, CitERCitVQ, CitHQRIT, RICitRVCit, GRNQRY, RCitRQHP,CitCitRCitVA, RPKQHV, RKCitGCitR, RCitCitRNT, RCitQCitFT, QLVYLQ, QYNRFK-CitLRHIR,PRCitCitCitK,RCitQVRY, GRCitHAH,ARHVIR,RCitGHMF,GRNIRV,QIFYLCit,RQGPIA,GVYLVR,NCitCitRRV, KCitRLCitY, GRRCitCitL, RMPHCitH，及其同源序列；和其中 b.B7表示除甘氨酸以外的氨基酸；和其中 c.B8-B9-B10-B11 表示選自如下組的氨基酸序列:CitHRR，CitIRR, FRRN, AQTT, GYPK,RPPQ, GCitRK, PIPR, YTIH, RIKA, CitRVR, TRRP，TIRP，IKCitR, RNVV, CitRRY, CitRPR,TRCitCit, CitCitGR, LCitRCit, RVRCit, VPRT, YCitFR, ARCitCit, RQCitR, HIRR, CitMMR,CitRICit, VRKS, PCitCitR, CitRRK，及其同源序列。
3.根據(jù)權利要求1或2的肽序列，其特征在于A6或B7選自CU，H，I，K，R，S，W，Y，M，F(xiàn)，V 和 P。
4.根據(jù)權利要求1-3的肽序列，其選自如下的組:
5.根據(jù)如下通式的肽序列: (C1-C2)-(C3-C4-C5)-Cit-G_C6-(C7-C8-C9—C10) (IV) 其中
a.C1-C2 為 HQ, GF, EG 或 GV ;和其中 b.C3-C4-C5表示3個氨基酸，其中至少I個為堿性，芳族，或V ;和其中 c.C6等于堿性或芳族氨基酸，或等于A，G，E，P，V，S或Cit或其類似物；且其中 d.C7-C8-C9-C10 為 SRAA，SCitAA, RPLD, RVVE 或 PGLD，或其類似物。
6.含有如下通式的肽序列:(D1-D2-D3-D4-D5-D6)， 其中:
a.Dl 是 K，R 或 W，
b.D2 是 R 或 W，
c.D3 是 R，
d.D4 是 Cit， e.D5是G，和
f.D6 是 R，W 或 K。
7.根據(jù)權利要求1-6的肽序列，其中所述的肽是環(huán)狀的。
8.多肽,其含有至少一個根據(jù)權利要求1-7的肽序列。
9.根據(jù)權利要求8的多肽，其含有至少一個根據(jù)權利要求1或2的肽序列和至少一個根據(jù)權利要求5或6的肽序列。
10.根據(jù)權利要求8或9的多肽，其中所述多肽是環(huán)狀的。
11.用于測定來自患有類風濕性關節(jié)炎的患者的自身抗體的存在的離體診斷試劑盒，其含有根據(jù)權利要求ι-?ο的肽或多肽。
12.根據(jù)權利要求11的診斷試劑盒，其是ELISA試劑盒。
【文檔編號】C07K14/47GK103524603SQ201310482892
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2002年12月11日 優(yōu)先權日:2001年12月11日
【發(fā)明者】W·J·W·范文盧伊, J·W·德里夫休特, M·A·M·范伯克爾, G·J·M·普盧伊恩 申請人:技術科學基金會