一種乳清蛋白的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種乳清蛋白的純化方法，以哺乳動物乳汁為原料，經(jīng)預處理得到乳清，進行疏水層析分離，得到純化的α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白。還提供了一種當乳清蛋白含有重組人α-乳清白蛋白時，在進行疏水層析分離之前，先通過陰離子交換層析，使重組人α-乳清白蛋白與內(nèi)源的α-乳清白蛋白以及β-乳球蛋白分離開，再進行疏水層析分離，得到純化的重組人α-乳清白蛋白及動物內(nèi)源的α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白的方法。
【專利說明】-種乳清蛋白的純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人 a-乳清白蛋白的方法，同時也可純化得到動物內(nèi)源a-乳清白蛋白及目-乳球蛋白。

【背景技術(shù)】
[0002] a -乳清白蛋白（a -lacta化umin，LA)是大多數(shù)哺乳動物乳腺特異表達的重要功 能蛋白，除了滿足幼年動物生長發(fā)育所需的必需氨基酸之外，還具有抑制腫瘤生長、改善睡 眠等重要生理功能。a -乳清白蛋白的必需氨基酸含量較高，尤其是色氨酸，它參與神經(jīng)系 統(tǒng)的活動例如情緒調(diào)控等。另外，a-乳清白蛋白能夠刺激粘膜的新陳代謝并且有效地預 防嬰幼兒的胃腸道感染。有意義地是，a-乳清白蛋白可W作用于腫瘤細胞，導致腫瘤細胞 的調(diào)亡，且有效地治療因人乳頭瘤病毒導致的皮膚瘤，由于a-乳清白蛋白具有W上眾多 的生理特性，可W作為潛在的抗腫瘤藥物、功能食品添加劑等。
[0003] 目-乳球蛋白（目-lactoglobulin)是乳中蛋白質(zhì)的一種，約占乳中蛋白質(zhì)的7? 12%，占乳清中50%。根據(jù)相關(guān)研究，目-乳球蛋白在抑值為5. 2-7. 5之間W二聚體形式存 在，而抑值在3 W下或8 W上時W單體形式存在。目-乳球蛋白具有的抗微生物活性主要 是基于它自身的多膚片段，而該些膚段僅對于革蘭氏陽性菌有明顯的效果，并且目-乳球 蛋白還具有抗病毒、抗癌活性，同時它還是參與脂肪酸的新陳代謝與促進哺乳動物細胞生 長的關(guān)鍵因子。
[0004] 與牛等其他哺乳動物相比，人乳中含有的a-乳清白蛋白等功能性蛋白質(zhì)具有含 量高、更適合人體吸收、生物活性更強等優(yōu)勢。研究表明，牛乳a-乳清白蛋白的含量為 1-1. 5g/l，而人乳a -乳清白蛋白的含量為2. 44 + 0. 64g/L，明顯高于牛乳中的蛋白濃度。 近年來，人們提出，在保留牛乳或羊乳中對人體有益營養(yǎng)功能成分的同時，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù) 加入一些人乳功能蛋白質(zhì)，將牛乳或羊乳等改造成更接近于人類母乳的產(chǎn)品，顯著提高了 牛乳中的a-乳清白蛋白含量和總蛋白質(zhì)含量，達到了改善牛乳營養(yǎng)成分的目的；同時通 過將轉(zhuǎn)基因動物乳腺作為生物反應器，可W大規(guī)模生產(chǎn)重組人a-乳清白蛋白，從而開發(fā) W其為主要功能成分的抗腫瘤藥物等產(chǎn)品。而動物內(nèi)源a-乳清白蛋白與目-乳球蛋白作 為哺乳動物內(nèi)源蛋白其本身表達量較高，同時也具有相對重要的生物活性，因此也可作為 工業(yè)開發(fā)的對象。
[0005] 目前，對于a-乳清白蛋白及目-乳球蛋白分離純化的方法主要是運用層析分離 的方法、膜分離的方法和鹽類沉淀的方法，但由于膜分離的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進 行粗分離，因此導致人a-乳清白蛋白的純度下降且回收率也相應降低；而通過鹽類沉淀 蛋白會導致蛋白質(zhì)的變性及收率降低；利用層析色譜的分離方法主要包括疏水互作色譜、 離子交換色譜、凝膠過濾色譜等。其中離子交換色譜是最為常用的層析技術(shù)，具有低成本、 耐酸堿、上樣體積大且較易放大進行工業(yè)化生產(chǎn)；凝膠過濾色譜一般位于蛋白質(zhì)純化流程 的精細純化階段，具有分辨率高、蛋白純度高等特點，但由于此層析技術(shù)的成本較高，因此 不適合應用于工業(yè)放大生產(chǎn)；疏水互作色譜需要配置高濃度鹽溶液來稀釋蛋白溶液，因此 可能會產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象而造成蛋白質(zhì)的損失，但由于不同蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)不同，耐 受高濃度鹽溶液的能力也有所不同。
[0006] 從乳中分離純化a -乳清白蛋白及目-乳球蛋白且規(guī)?；苽涞南嚓P(guān)專利文獻發(fā) 現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?01110191731. 5描述了在加有保護劑0. 05 - 0. 4M氯化巧條件下將乳 樣加熱至6(TC -95C保溫10min-60min后冷卻的預處理得到富含目-乳球蛋白和a -乳 清白蛋白的清液，再通過陰離子色譜分離得到人a-乳清白蛋白、牛a-乳清白蛋白和牛 目-乳球蛋白，由于此方法在前處理階段加入無機化合物(氯化巧）并將乳樣加熱處理且時 間較長，易導致乳清蛋白變性，活性丟失，因此很難適用于工業(yè)化生產(chǎn)。中國專利申請?zhí)?200910072780. X公開了一種含有低目-乳球蛋白的乳清蛋白粉的制備方法，此方法步驟繁 瑣、收率較低，很難應用于大規(guī)模生產(chǎn)。美國專利US4834994闡述了在酸性條件下目-乳球 蛋白與陽離子交換介質(zhì)結(jié)合的方法進行分離。美國專利US6312755說明了將乳清在酸性pH 值下處理進行a -乳清白蛋白的分離，此方法不適用于規(guī)模化生產(chǎn)。而美國專利US5008376 則描述了利用不同孔徑的膜分離技術(shù)來分離a-乳清白蛋白，先選用lOOkD大小孔徑的超 濾膜將富有a-乳清白蛋白的蛋白溶液通過此膜，再選用lOkD小孔徑的超濾膜將a-乳清 白蛋白富集，但此方法所得到的a-乳清白蛋白的純度較低。
[0007] 為了開發(fā)a-乳清白蛋白及目-乳球蛋白為主要功能成分的產(chǎn)品，需要將重組人 a-乳清白蛋白、動物內(nèi)源a-乳清白蛋白及目-乳球蛋白分別從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中分離 純化出來，但是由于牛等哺乳動物a-乳清白蛋白與人a-乳清白蛋白的分子特性非常相 近，如牛a -乳清白蛋白具有76%的氨基酸序列同源性和88%的結(jié)構(gòu)相似性，分子量分別為 14, 078化和14, 18抓a,等電點pI4. 2 - 4. 6,而且牛乳中含有大量牛內(nèi)源蛋白質(zhì)，導致從牛 乳中純化重組人a-乳清白蛋白存在較高的難度，而且根據(jù)W上方法都有一定的局限性， 產(chǎn)量低、純度低、成本高而不能形成大規(guī)模生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種從哺乳動物乳汁中高 效分離重組人a-乳清白蛋白、動物源a-乳清白蛋白及目-乳球蛋白的方法，得到的重組 蛋白與天然人a-乳清白蛋白具有天然的理化特性和生物活性，同時動物內(nèi)源的a-乳清 白蛋白與目-乳球蛋白也具有較好的生物活性。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種乳清蛋白的純化方法，W哺乳動物乳 汁為原料，經(jīng)預處理得到乳清，進行疏水層析分離，得到a-乳清白蛋白和目-乳球蛋白純 品。
[0010] 進一步地，所述預處理為將乳樣通過高速離也脫脂，采用0. 8-1. 4 y m陶瓷膜微濾 技術(shù)除菌，并采用80nm-0. 2 y m陶瓷膜去除脫脂乳中的酪蛋白，得到澄清的乳清。
[0011] 進一步地，所述疏水層析的具體步驟包括；將乳清上樣到用電導率為130-160ms/ cm的（NH)2S04, 10-50mM、p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液平衡的Butyl疏水互作層析柱，此填料 的配基密度為25-50ymol/ml，流速為100-300cm/h，上樣過程中收集含有目-乳球蛋白的 穿透液，得到目-乳球蛋白純品；上樣完畢用電導率為130-160ms/cm的（NH)2S04, 10-50mM、 p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液沖洗層析柱待280nm吸收信號至基線，使用電導率為50-80ms/ cm的（NH)2S04, 10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，使用電導率為6ms/cm W 下、10-50mM、p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫a -乳清白蛋白，得到a -乳清白蛋白純品。
[0012] 進一步地，哺乳動物乳汁還可能含有重組人a-乳清白蛋白。
[0013] 當哺乳動物乳汁還含有重組人a -乳清白蛋白時，上述純化方法將W含有重組人 a-乳清白蛋白的哺乳動物乳汁為原料，經(jīng)預處理得到乳清，通過陰離子交換層析，分離得 到重組人a-乳清白蛋白純品，W及富含內(nèi)源a-乳清白蛋白和目-乳球蛋白的分離溶液， 再通過膜分離或疏水層析進行精細純化，得到內(nèi)源a -乳清白蛋白、目-乳球蛋白純品和純 度更高的重組人a-乳清白蛋白。
[0014] 進一步地，所述的重組人a -乳清白蛋白純化方法是將乳清上樣到經(jīng)30-60mM， P冊.5-7. 5Tris-Cl緩沖液平衡的陰離子交換層析柱，收集穿透液，收集含有重組人a -乳 清白蛋白的穿透液。
[0015] 作為優(yōu)選，重組人a-乳清白蛋白精細純化是通過對含有重組人a-乳清白蛋白 的穿透液進行膜分離，優(yōu)選30-80kD的超濾膜進行分離，得到重組人a -乳清白蛋白純品。
[0016] 作為優(yōu)選，所述重組人a-乳清白蛋白精細純化是通過對含有重組人a-乳清白 蛋白的穿透液通過疏水層析分離去除雜蛋白，將含有重組人a -乳清白蛋白的穿透液上樣 到用電導率為130-160ms/cm的（NH)2S04, 10-50mM、p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液平衡的Butyl 疏水互作層析柱；上樣完畢用電導率為130-160ms/cm的（NH) 2SO" 10-50mM、p冊.5-7. 5的磯 酸鹽緩沖液沖洗層析柱待280nm吸收信號至基線，使用電導率為50-80ms/cm的（NH)2S04， 10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，使用電導率為6ms/cm W下、10-50mM， P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫重組人a-乳清白蛋白，得到重組人a-乳清白蛋白純品。
[0017] 進一步地，所述的內(nèi)源a-乳清白蛋白與目-乳球蛋白純化方法是將乳清上樣 到30-60mM、P冊.5-7. 5的Tris-Cl緩沖液平衡的陰離子交換層析柱，繼續(xù)使用30-60mM、 P冊.5-7. 5的Tris-Cl緩沖液沖洗層析柱至基線，用電導率為50-84ms/cm的化C1，50mM、 P冊.5-7. 5的Tris-Cl緩沖液洗脫層析柱，收集得到富含內(nèi)源a -乳清白蛋白與目-乳球蛋 白的分離溶液。
[001引作為優(yōu)選，所述的內(nèi)源a-乳清白蛋白與目-乳球蛋白精細純化是將富含內(nèi)源 a-乳清白蛋白和目-乳球蛋白的分離溶液上樣到用電導率為130-160ms/cm的（NH)2S04， 10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液平衡的郵切1疏水互作層析柱，流速為100-300cm/h， 上樣過程中收集含有目-乳球蛋白的穿透液，得到目-乳球蛋白純品；上樣完畢用電導率為 130-160ms/cm的（NH)2S04, 10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液沖洗層析柱待280nm吸收 信號至基線，使用電導率為50-80ms/cm的（NH)2S04, 10-50mM、p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗 脫雜蛋白，使用電導率為6ms/cm W下、10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫a -乳清 白蛋白，得到內(nèi)源a-乳清白蛋白純品。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于；本發(fā)明提供了一種可W經(jīng)濟高效地從含重組人a-乳 清白蛋白的哺乳動物乳汁中分離純化出重組人a-乳清白蛋白、動物源a-乳清白蛋白及 目-乳球蛋白的方法，并且可W快速、低成本、大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白及動物內(nèi)源蛋白。本發(fā)明 W乳樣為原料，經(jīng)過預處理、膜分離、層析分離、膜分離的純化步驟可W有效地將普通乳汁 中a-乳清白蛋白、目-乳球蛋白分離純化，也可W將轉(zhuǎn)基因動物乳腺表達的重組人a-乳 清白蛋白、內(nèi)源a-乳清白蛋白W及內(nèi)源目-乳球蛋白從乳中分離純化。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明所述方法分別得到的重組人a -乳清白蛋白的純度> 99%、牛a -乳 清白蛋白純度>95%及目-乳球蛋白純度>99%，且重組人a-乳清白蛋白具有和天然人 a-乳清白蛋白相似的理化活性和生理功能。因此本發(fā)明不僅能夠?qū)⒅亟M人a-乳清白蛋 白與動物源a-乳清白蛋白可W很好地且有效地分離，而且可W同時獲得高純度的重組人 a-乳清白蛋白純品、動物源a-乳清白蛋白純品及目-乳球蛋白純品，非常適用于規(guī)模化 生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為DEAE介質(zhì)陰離子交換分離組分的12%Native-PAGE電泳結(jié)果，方框內(nèi)表示 含有重組人a -乳清白蛋白分離組分；Whey為前處理后乳清樣品；FT為重組a -乳清白蛋 白穿透組分；P為100%NaCl梯度洗脫組分；N為普通全乳樣品巧為人a -LA標準品；D為牛 a -LA標準品。
[002引圖2為Q介質(zhì)陰離子交換分離組分的12%Native-PAGE電泳結(jié)果，方框內(nèi)表示含有 重組人a -乳清白蛋白分離組分；FT為重組a -乳清白蛋白穿透組分；P為l00%NaCl梯度 洗脫組分；N為普通全乳樣品巧為人a -LA標準品；D為牛a -LA標準品。
[0023] 圖3為重組人a -乳清白蛋白膜分離的超濾圖譜。
[0024] 圖4為重組人a -乳清白蛋白疏水互作純化色譜各分離組分的12%SDS-PAGE電泳 結(jié)果，方框內(nèi)表示含有重組人a -乳清白蛋白分離組分；Whey為前處理后乳清樣品；FT為 雜蛋白穿透組分；P1為42%NaCl梯度洗脫組分；P2為100%NaCl梯度洗脫重組人a -乳清白 蛋白組分；N為普通全乳樣品；H為人a -LA標準品；D為牛a -LA標準品。
[0025] 圖5為目-乳球蛋白與牛a-乳清白蛋白疏水互作純化色譜各分離組分的 12%SDS-PAGE電泳結(jié)果，方框內(nèi)分別表示目-乳球蛋白與牛a-乳清白蛋白分離組分；FT為 目-乳球蛋白組分；P1為雜蛋白組分；P2為！00%NaCl梯度洗脫牛a -乳清白蛋白組分。
[0026] 圖6為凝膠過濾鑒定經(jīng)疏水互作色譜后的目-乳球蛋白的純度色譜圖，目-乳球 蛋白純度> 99%。
[0027] 圖7為凝膠過濾鑒定經(jīng)疏水互作色譜后的重組人a -乳清白蛋白的純度色譜圖， 重組人a-乳清白蛋白純度>95%。
[0028] 圖8為凝膠過濾鑒定經(jīng)疏水互作色譜后的牛a -乳清白蛋白的純度色譜圖，牛 a-乳清白蛋白純度> 95%。
[0029] 圖9為凝膠過濾鑒定膜分離后重組人a-乳清白蛋白的純度色譜圖，重組人 a-乳清白蛋白純度> 99%。

【具體實施方式】
[0030] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031] 實施例中所用的主要試驗儀器與試劑如下：
[0032] AKTA explorerlOO快速蛋白液相層析系統(tǒng)、XK50/20層析柱、DEAE Se地arose Fast flow 填料、Q Se地arose Fast flow 填料、Butyl Se地arose Fast flow 填料、凝膠過 濾色譜柱Superdex2005/150化層析柱購自GE Healthcare ;陶瓷膜冷除菌及超濾憑介裝置 (型號 T0P/CMM-1/3/3TX1. 4um 與 80nm 陶瓷膜購自陶普森公司；Cogent M1TFF system (型 號 2143)Jellicon XL Filter PXB030A5030邸、PXB050A5050邸購自 Millipore;高速冷凍 離也機購自Beckman公司；超濾濃縮管Amicon⑧叫tra-15,購自Millipore。
[0033] 實施例1
[0034] 收集含有重組人a -乳清白蛋白（含量為0. 1-5克/升）的哺乳動物奶樣，包括含 重組人a-乳清白蛋白的轉(zhuǎn)基因動物奶樣，也可W是混有重組人a-乳清白蛋白的非轉(zhuǎn)基 因動物奶樣，其中奶樣W新鮮液態(tài)奶樣為宜，也可W是冷凍樣品解凍后或奶粉復溶后獲得 的液態(tài)奶樣，哺乳動物奶樣包括牛奶、羊奶、兔奶等，W牛奶為優(yōu)選。將上述奶樣通過蝶式離 也機進行脫脂，利用0. 8-1. 4 y m陶瓷膜微濾技術(shù)進行牛乳中細菌的去除，操作溫度為0? 35C，進口壓為0. 38MPa，而后打開透過閥口，將操作壓設(shè)置為0. 15MPa，流速為5. 8m/s，通 量為35化-mVh (LMH)。再通過80nm-1.4ym陶瓷膜去除脫脂乳中的酪蛋白，將操作壓設(shè) 置為0. 05-0. 2MPa，流速為5-8m/s，通量為60-100LMH，便可得到澄清的乳清。
[00對 實施例2
[0036] 實施例1制備得到的乳清上樣到用60mM，P冊.5Tri S-C1緩沖液平衡的DEAE Se地arose Fast flow陰離子交換層析柱，流速為lO-lOOml/min，收集含有重組人a-乳清 白蛋白的穿透液，得到的重組人a -乳清白蛋白純度> 85%，收率> 90% ;使用60mM、P冊.5 的Tris-Cl緩沖液沖洗層析柱至基線，用電導率為50-84ms/cm的化Cl，60mM、P冊.5的 Tris-Cl緩沖液將含有牛a-乳清白蛋白與目-乳球蛋白的組分洗脫下來收集。DEAE介質(zhì) 陰離子交換色譜分離組分的12%Native-PAGE電泳結(jié)果見圖1?？梢娡ㄟ^陰離子交換層析 將牛內(nèi)源a-乳清白蛋白與重組人a-乳清白蛋白有效的分離開，且牛a-乳清白蛋白與 目-乳球蛋白全部洗脫下來。
[0037] 實施例3
[0038] 實施例1制備得到的乳清上樣到用50mM，pH7. OTris-Cl緩沖液平衡的Q Se地arose Fast flow陰離子交換層析柱，流速為lO-lOOml/min，收集含有重組人a-乳清 白蛋白的穿透液，得到蛋白純度> 80%，回收率> 90%，使用50mM、pH7. OTris-Cl緩沖液沖洗 層析柱至基線，用電導率為50-84ms/cm的化Cl，50mM、抑7. 0的Tris-Cl緩沖液將含有牛 a-乳清白蛋白與目-乳球蛋白的雜蛋白洗脫下來收集。Q介質(zhì)陰離子交換色譜分離組分 的12%Native-PAGE電泳結(jié)果見圖2。由此可知通過陰離子交換層析可將牛內(nèi)源a -乳清白 蛋白與重組人a-乳清白蛋白分離。
[00測 實施例4
[0040] 實施例2或?qū)嵤├?得到的含有重組人a -乳清白蛋白的蛋白溶液裝入Cogent M1TFF system的儲液罐中，使用30-80kD的超濾膜裝置，設(shè)置流速為40ml/min，轉(zhuǎn)膜壓 (TMP)為1-化ar開始進行膜分離，去除大分子雜蛋白，得到重組人a-乳清白蛋白純度 > 99%，回收率為75%。見圖3為重組人a -乳清白蛋白膜分離的超濾圖譜，根據(jù)色譜圖可 知有大量的重組人a -乳清白蛋白穿透超濾膜，收集穿透液，通過凝膠過濾色譜對其進行 蛋白純度分析。
[0041] 實施例5
[0042] 實施例2或?qū)嵤├?得到的含有重組人a -乳清白蛋白的分離溶液還可通過 疏水層析分離去除雜蛋白，將含有重組人a-乳清白蛋白的分離溶液上樣到用電導率為 130-160ms/cm 的（NH)2S04, 10-50mM、P冊.5-7. 5 的磯酸鹽緩沖液平衡的 Butyl Se地arose Fast flow疏水互作層析柱；上樣完畢用電導率為130-160ms/cm的（NH)2S〇4，l〇-50mM、 p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液沖洗層析柱待280nm吸收信號至基線，使用電導率為50-80ms/ cm的（NH)2S04, 10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，使用電導率為6ms/cm W 下、10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫重組人a -乳清白蛋白，得到重組人a -乳 清白蛋白純度均> 95%，回收率> 60%。重組人a -乳清白蛋白疏水互作色譜分離組分的 12%SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖4,由圖4可知通過疏水互作色譜可純化得到純度更高的重組人 a-乳清白蛋白純品。
[0043] 實施例6
[0044] 實施例2或?qū)嵤├?得到的富含牛a-乳清白蛋白與目-乳球蛋白的洗脫液分 別上樣到用電導率為130-160ms/cm的（NH)2S〇4,20mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液平衡 的Butyl Se地arose Fast flow疏水互作層析柱，流速為40ml/min，上樣過程中收集含 有目-乳球蛋白的穿透液，目-乳球蛋白純度>99%、回收率>92%;上樣完畢用電導率為 13〇-16〇1113/畑1的（饑1)25〇4,2〇1111、9冊.5-7.5的磯酸鹽緩沖液沖洗層析柱待280皿吸收信號 至基線，使用電導率為50-80ms/cm的（NH) 2SO4, 20mM、pH7. 0的磯酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，使 用電導率為6ms/cm W下、20mM、pH7. 0的磯酸鹽緩沖液洗脫牛a -乳清白蛋白，得到牛內(nèi)源 a-乳清白蛋白純度>95%，回收率>60%。目-乳球蛋白與牛a-乳清白蛋白疏水互作純 化色譜分離組分的12%SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖5,由圖5可知通過疏水互作色譜可W很好地 將目-乳球蛋白與牛a-乳清白蛋白分離，并得到高純度的目-乳球蛋白與牛內(nèi)源a-乳 清白蛋白純品。
[0045] 實施例7
[0046] 將疏水互作色譜純化得到的蛋白樣品與膜分離得到的蛋白樣品通過凝膠過濾色 譜的分析純度：緩沖液為抑7. 0的50mM磯酸鹽、0. 15M化C1的水溶液，流速設(shè)置為Iml/min W下進行等度洗脫。圖6為凝膠過濾鑒定經(jīng)疏水互作色譜后的目-乳球蛋白的純度色譜圖， 目-乳球蛋白純度> 99% ;圖7為凝膠過濾鑒定經(jīng)疏水互作色譜后的重組人a -乳清白蛋白 的純度色譜圖，重組人a -乳清白蛋白純度> 95% ;圖8為凝膠過濾鑒定經(jīng)疏水互作色譜后 的牛a-乳清白蛋白的純度色譜圖，牛a-乳清白蛋白純度>95%;圖9為凝膠過濾鑒定膜 分離后重組人a-乳清白蛋白的純度色譜圖，重組人a-乳清白蛋白純度>99%。
[0047] 實施例8
[0048] 對于不含人a -乳清白蛋白的普通動物乳樣，則可通過對上述方法進行簡化后分 離純化動物內(nèi)源的a-乳清白蛋白和目-乳球蛋白，即將乳樣按實施例1的方法經(jīng)高速離 也脫脂，采用0. 8-1. 4 y m陶瓷膜微濾技術(shù)除菌，并采用80nm-0. 2 y m陶瓷膜去除脫脂乳中 的酪蛋白，得到澄清的乳清，對乳清進行疏水互作層析色譜，具體步驟包括：將乳清上樣到 用電導率為130-160ms/cm的（NH)2S04, 10-50mM、P冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液平衡的Butyl 疏水互作層析柱，此填料的配基密度為25-50ymol/ml，流速為100-300cm/h，上樣過程中 收集含有目-乳球蛋白的穿透液，得到目-乳球蛋白純品，目-乳球蛋白純度>99%、回收率 > 92% ;上樣完畢用電導率為130-160ms/cm的（NH) 2S0" 10-50mM、p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖 液沖洗層析柱待280皿吸收信號至基線，使用電導率為50-80ms/cm的（NH)2S04, 10-50mM、 p冊.5-7. 5的磯酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，使用電導率為6ms/cm W下、10-50mM、p冊.5-7. 5的 磯酸鹽緩沖液洗脫a-乳清白蛋白，得到a-乳清白蛋白純品，牛源a-乳清白蛋白純度 > 95%，回收率 > 60〇/〇。
[0049] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對之作一些修改或改進，該對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的該些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種乳清蛋白的純化方法，其特征在于，以哺乳動物乳汁為原料，經(jīng)預處理得到乳 清，進行疏水層析分離，得到a-乳清白蛋白和乳球蛋白純品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述預處理為通過高速離心脫脂，采 用0. 8-1. 4 y m陶瓷膜微濾技術(shù)除菌，并采用80nm-0. 2 y m陶瓷膜去除脫脂乳中的酪蛋白， 得到澄清的乳清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純化方法，其特征在于，所述疏水層析的具體步驟包括： 將乳清上樣到用電導率為130-160ms/cm的（NH) 2S04,10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液 平衡的Butyl疏水互作層析柱，此填料的配基密度為25-50 y mol/ml，流速為100-300cm/h， 上樣過程中收集含有乳球蛋白的穿透液，得到乳球蛋白純品；上樣完畢用電導率為 130-160ms/cm的（NH) 2S04,10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱待280nm吸收 信號至基線，使用電導率為50-80mS/cm的（NH) 2S04,10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液洗 脫雜蛋白，使用電導率為6mS/cm以下、10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液洗脫a -乳清 白蛋白，得到a-乳清白蛋白純品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純化方法，其特征在于，哺乳動物乳汁還含有重組人 a-乳清白蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的純化方法，其特征在于，以含有重組人a-乳清白蛋白的哺 乳動物乳汁為原料，經(jīng)預處理得到乳清，通過陰離子交換層析，分離得到重組人a _乳清白 蛋白純品，以及富含內(nèi)源乳清白蛋白和乳球蛋白的分離溶液，再通過膜分離或疏水 層析進行精細純化，得到內(nèi)源a -乳清白蛋白純品、0 -乳球蛋白純品和純度更高的重組人 a-乳清白蛋白純品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的純化方法，其特征在于，所述陰離子交換層析是將乳清上樣 到經(jīng)30-60mM、pH6. 5-7. 5的Tris-Cl緩沖液平衡的陰離子交換層析柱，收集含有重組人 a-乳清白蛋白的穿透液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的純化方法，其特征在于，重組人a-乳清白蛋白精細純化 是通過對含有重組人a -乳清白蛋白的穿透液進行膜分離，優(yōu)選30-80kD的超濾膜進行分 離，得到重組人a-乳清白蛋白純品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的純化方法，其特征在于，重組人a-乳清白蛋白精 細純化是通過對含有重組人a-乳清白蛋白的穿透液通過疏水層析分離去除雜蛋白， 將含有重組人a-乳清白蛋白的穿透液上樣到用電導率為130-160ms/cm的（NH) 2S04， 10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液平衡的Butyl疏水互作層析柱；上樣完畢用電導率為 130-160ms/cm的（NH)2S0 4,10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱待280nm吸收 信號至基線，使用電導率為50-80mS/cm的（NH) 2S04,10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液 洗脫雜蛋白，使用電導率為6mS/cm以下、10-50mM，pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液洗脫重組人 a-乳清白蛋白，得到重組人a-乳清白蛋白純品。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的純化方法，所述的內(nèi)源a-乳清白蛋白與乳球蛋白純化 方法是將乳清上樣到30-60mM、pH6. 5-7. 5的Tris-Cl緩沖液平衡的陰離子交換層析柱，繼 續(xù)使用30-60mM、pH6. 5-7. 5的Tris-Cl緩沖液沖洗層析柱至基線，用電導率為50-84ms/cm 的NaCl，50mM、pH6. 5-7. 5的Tris-Cl緩沖液洗脫層析柱，收集得到富含內(nèi)源a -乳清白蛋 白與乳球蛋白的分離溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的純化方法，其特征在于，內(nèi)源a-乳清白蛋白與乳球蛋 白精細純化是將富含內(nèi)源a-乳清白蛋白和乳球蛋白的分離溶液上樣到用電導率為 130-160ms/cm的（NH)2S0 4,10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液平衡的Butyl疏水互作層 析柱，流速為100-300cm/h，上樣過程中收集含有乳球蛋白的穿透液，得到乳球蛋白 純品；上樣完畢用電導率為130-160ms/cm的（NH) 2S04,10-50mM、pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖 液沖洗層析柱待280nm吸收信號至基線，使用電導率為50-80mS/cm的（NH) 2S04,10-50mM、 pH6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，使用電導率為6mS/cm以下、10-50mM、pH6. 5-7. 5的 磷酸鹽緩沖液洗脫a-乳清白蛋白，得到內(nèi)源a-乳清白蛋白純品。
【文檔編號】C07K14/76GK104513305SQ201310452798
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】趙建敏, 王建武, 付明波, 湯波, 李寧 申請人:北京濟福霖生物技術(shù)有限公司