專利名稱：公斤級合成pna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種合成PNA的方法，具體涉及一種公斤級合成PNA的方法。
背景技術(shù)：
寡核苷酸在治療用藥物、分子生物學(xué)研究工具及診斷試劑上應(yīng)用廣泛。寡核苷酸應(yīng)用的主要制約在于它容易 被核酸酶所降解、雜交后熱穩(wěn)定性差以及會與蛋白等非特異性結(jié)合等。為改造寡核苷酸的理化和生物學(xué)特性，許多寡核苷酸類似物被研究出來。肽核酸是寡核苷酸模擬物中的較為重要的一種。1991年Nielsen等報(bào)道了用N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架代替糖-磷酸酯骨架作為重復(fù)結(jié)構(gòu)單元，合成了以肽鍵連接的寡核苷酸模擬物，稱為肽核酸(Peptide nucleic acid, PNA)。盡管PNA在結(jié)構(gòu)上相對寡核苷酸有了顯著的改變，但PNA與互補(bǔ)核酸之間的結(jié)合仍遵循堿基互補(bǔ)配對原則，甚至比天然核苷酸具有更高的親和性，有較強(qiáng)的抗核酸酶和蛋白水解酶降解的能力?？蒲腥藛T設(shè)計(jì)合成了各種結(jié)構(gòu)的PNA，以優(yōu)化其生物學(xué)穩(wěn)定性和利用度、靶結(jié)合特性以及藥代動力學(xué)特性，并將PNA應(yīng)用于診斷和治療等方面，從而開創(chuàng)了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。各種各樣的構(gòu)建模塊被用于合成PNA及其類似物，包括骨架結(jié)構(gòu)、在N- (2-氨基乙基)甘氨酸上連接手性和非手性的基團(tuán)、堿基的類型等。經(jīng)典的PNA的骨架單體是N-(2-氨基乙基)甘氨酸，在甘氨酸的氮上連接堿基的衍生物。通常先合成端基N有保護(hù)基的氨基乙基甘氨酸酯，然后再將堿基衍生物連在未受保護(hù)的氮上。常用的方法有:烷基化反應(yīng)、席夫堿的還原反應(yīng)、Mitsunobu反應(yīng)。四種堿基都是經(jīng)胺的烷基化反應(yīng)形成堿基乙酸衍生物，再采用通常的多肽合成的方法，聯(lián)結(jié)堿基乙酸和骨架上的未受保護(hù)的氮。胸腺嘧啶的烷基化反應(yīng)通常不需要使用保護(hù)基團(tuán)，因此當(dāng)與溴乙酸酯反應(yīng)再經(jīng)皂化或直接與溴乙酸反應(yīng)即可得胸腺嘧啶乙酸。其余三種堿基上都有活潑基團(tuán)，需先加以保護(hù)。胞嘧啶上的活潑基團(tuán)為4位上的氨基，可選擇的保護(hù)基有:節(jié)氧羰基(benzyloxycarbonyl, Cbz)、對叔丁基苯甲?；?4-tert-butylbenzoyl,4-t_BuBz)、苯甲酸基(benzoyl, Bz)以及 Mmt 等，再與溴乙酸酯進(jìn)行烷基化反應(yīng)，然后皂化即得胞嘧啶乙酸的衍生物。腺嘌呤的保護(hù)過程與胞嘧啶基本相同，可用的保護(hù)基有Cbz, Mmt,對甲氧基苯基(anisoly, An)。鳥嘌呤的保護(hù)比較復(fù)雜,需要在N9的烷基化的過程中避免N7烷基化的副反應(yīng)干擾。一種常用的方法是在烷基化中用2-氨基-6-氯嘌呤，烷基化后再在酸性或堿性條件下回流，將氯水解轉(zhuǎn)化為羰基，或是直接烷基化N2連有保護(hù)基的腺嘌呤，色譜分離N7/N9兩種烷基化產(chǎn)物，然后皂化得鳥嘌呤乙酸的衍生物。目前國內(nèi)已經(jīng)有部分公司可以定制合成PNA系列產(chǎn)品，但是他們的合成規(guī)模很小，一般在毫克級別，這種局面大大制約了 PNA這種化合物的應(yīng)用以及研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種公斤級合成PNA的方法，不通過柱層析的方法，大量生產(chǎn)高純度的PNA。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):公斤級合成PNA的方法，包括以下步驟:步驟I) I升三口瓶裝入500毫升乙二胺，冰浴冷卻至10度，將75克氯乙酸分批加入控制溫度在10度以下，每批加完后，觀察完全消耗掉之后再加下一批，加料完畢后，室溫過夜反應(yīng)，將乙二胺旋干，回收乙二胺可以循環(huán)使用，用油泵將乙二胺盡可能去除干凈，用DMSO重結(jié)晶得到白色粉末狀晶體，為N-(2-氨乙基)甘氨酸；步驟2)將50克N-(2-氨乙基)甘氨酸溶于850毫升二氯甲烷和50毫升DMF的混合溶液中，加入134毫升(1.05mol)三甲基氯硅烷，反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?0分鐘，然后冷卻至5度，將134克Fmoc-OSu加入上面混合物中，在5度下滴加NMM186毫升，30分鐘滴完，在此溫度下攪拌2小時(shí)，然后加入100毫升甲醇，再攪拌20分鐘，加入I升乙酸乙酯，20分鐘后過濾固體，用乙酸乙酯洗滌，產(chǎn)品粉末旋干，產(chǎn)品水中打漿洗滌，過濾水洗，干燥得到純品，為N- (2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸；步驟3)將12克N-(2-Fm0C-氨乙基)甘氨酸溶于100毫升的無水甲醇中，7.72毫升二氯亞砜在冰浴下滴入，滴完后此溫度下繼續(xù)反應(yīng)15分鐘，然后回流2小時(shí)，除掉溶劑，用9/1的乙醚和甲醇溶解，O度析晶，過濾，乙醚洗滌，干燥，得到純品，為N- (2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽；步驟4)將389克干燥的腺嘌呤懸浮于6升的DMF中，加入40克的氫化鈉，反應(yīng)液攪拌，有氫氣溢出，攪拌15分鐘后，再加入42克氫化鈉，攪拌I小時(shí)后,有大量固體析出，攪拌困難，再加入1.5升的DMF，繼續(xù)攪拌3小時(shí)，351毫升的溴乙酸乙酯在半個(gè)小時(shí)內(nèi)滴加完畢，此過程中有冰浴保持溫度在20-30度范圍內(nèi)，然后室溫?cái)嚢柽^夜，蒸除容積，加入3升水，攪拌一小時(shí)，過濾固體，水洗三次，固體懸浮于2升乙醇中，攪拌回流45分鐘，冷到室溫，攪拌過夜，抽濾，得固體 ，乙醇洗滌，干燥，得純品，為9-乙酸乙酯腺嘌呤；步驟5)將433克9-乙酸乙酯腺嘌呤和478克羰基二咪唑懸浮于4升的DMF中，反應(yīng)液緩慢加熱至105度，然后在此溫度下攪拌2小時(shí)，將溫度降到95度，加入541克二苯甲醇，撤掉加熱，反應(yīng)液攪拌過夜，2.5倍的水加入反應(yīng)液，快速攪拌I小時(shí)，固體析出，過濾，水洗三次，甲醇重結(jié)晶，得到純品，為6-N-(二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸乙酯，淡黃綠色；步驟6)將300克的6-N_( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤_9_乙酸乙酯懸浮于1.5升乙醇和1.5升乙腈的混合溶劑，加熱至溶解，加入I升水,有固體析出，冷至10度以下，將294克氫氧化鋰溶于2.5升水中，加入上面的懸濁液，溫度上升至20度，繼續(xù)攪拌6分鐘，溫度升至25度，把按1346克檸檬酸加水3升的比例配制好的檸檬酸溶液加入反應(yīng)液，攪拌10分鐘，加入I升水，冰鹽浴冷卻，直到大量固體析出，繼續(xù)攪拌半個(gè)小時(shí)，過濾，水洗，得到純品，為6_N_( 二苯甲氧擬基)腺嘌呤-9-乙酸；步驟7) 2克6-N_( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸溶于5毫升乙腈和5毫升DMF的混合溶劑中，加入1.9克苯并三氮-N，N，N，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽，反應(yīng)液冷至O度，在此溫度下滴加1.6毫升N-甲基嗎啉，攪拌反應(yīng)一下小時(shí)后，O度下將1.896克的C 一次加入反應(yīng)液，此反應(yīng)液室溫?cái)嚢枰粋€(gè)小時(shí)，后室溫反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)，冷卻至O度，加水產(chǎn)物分層，分液水洗三次，取有機(jī)相，旋干有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品3.7克Fmoc-PNA-A (Bhoc)-OMe ；
步驟8)將3.7克的粗產(chǎn)品Fmoc-PNA-A(Bhoc) -OMe溶于25毫升的四氫呋喃中，冷至零度，將10毫升濃度為5mol/l的氫氧化鋰水溶液，劇烈攪拌緩慢滴加入反應(yīng)液中，溫度控制在零度左右，有固體析出，此溫度下繼續(xù)攪拌20分鐘，TLC跟蹤為準(zhǔn)，反應(yīng)完畢，力口入事先按6克檸檬酸加10毫升水的比例配好的檸檬酸水溶液，冷至零下析晶，攪拌半個(gè)小時(shí)后過濾，水洗三次，得到的固體干燥后用乙醚打漿洗掉低極性雜質(zhì)，過濾干燥，得到純品Fmoc-PNA-A(Bhoc)-OH,純度為 95% ；過程如下:
權(quán)利要求
1.公斤級合成PNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I) I升三口瓶裝入500毫升乙二胺，冰浴冷卻至10度，將75克氯乙酸分批加入控制溫度在10度以下，每批加完后，觀察完全消耗掉之后再加下一批，加料完畢后，室溫過夜反應(yīng)，將乙二胺旋干，回收乙二胺可以循環(huán)使用，用油泵將乙二胺盡可能去除干凈，用DMSO重結(jié)晶得到白色粉末狀晶體，為N-(2-氨乙基)甘氨酸； 步驟2)將50克N-(2-氨乙基)甘氨酸溶于850毫升二氯甲烷和50毫升DMF的混合溶液中，加入134毫升(1.05mol)三甲基氯硅烷，反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?0分鐘，然后冷卻至5度，將134克Fmoc-OSu加入上面混合物中，在5度下滴加NMM186毫升，30分鐘滴完，在此溫度下攪拌2小時(shí)，然后加入100毫升甲醇，再攪拌20分鐘，加入I升乙酸乙酯，20分鐘后過濾固體，用乙酸乙酯洗滌，產(chǎn)品粉末旋干，產(chǎn)品水中打漿洗滌，過濾水洗，干燥得到純品，為N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸； 步驟3)將12克N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸溶于100毫升的無水甲醇中，7.72毫升二氯亞砜在冰浴下滴入，滴完后此溫度下繼續(xù)反應(yīng)15分鐘，然后回流2小時(shí)，除掉溶劑，用9/1的乙醚和甲醇溶解，O度析晶，過濾，乙醚洗滌，干燥，得到純品，為N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽； 步驟4)將389克干燥的腺嘌呤懸浮于6升的DMF中，加入40克的氫化鈉，反應(yīng)液攪拌，有氫氣溢出，攪拌15分鐘后，再加入42克氫化鈉，攪拌I小時(shí)后,有大量固體析出，攪拌困難，再加入1.5升的 DMF，繼續(xù)攪拌3小時(shí)，351毫升的溴乙酸乙酯在半個(gè)小時(shí)內(nèi)滴加完畢，此過程中有冰浴保持溫度在20-30度范圍內(nèi)，然后室溫?cái)嚢柽^夜，蒸除容積，加入3升水，攪拌一小時(shí)，過濾固體，水洗三次，固體懸浮于2升乙醇中，攪拌回流45分鐘，冷到室溫，攪拌過夜，抽濾，得固體，乙醇洗滌，干燥，得純品，為9-乙酸乙酯腺嘌呤；步驟5)將433克9-乙酸乙酯腺嘌呤和478克羰基二咪唑懸浮于4升的DMF中，反應(yīng)液緩慢加熱至105度，然后在此溫度下攪拌2小時(shí)，將溫度降到95度，加入541克二苯甲醇，撤掉加熱，反應(yīng)液攪拌過夜，2.5倍的水加入反應(yīng)液，快速攪拌I小時(shí)，固體析出，過濾,水洗三次，甲醇重結(jié)晶，得到純品，為6-N-( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸乙酯，淡黃綠色；步驟6)將300克的6-N-( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸乙酯懸浮于1.5升乙醇和1.5升乙腈的混合溶劑，加熱至溶解，加入I升水，有固體析出，冷至10度以下，將294克氫氧化鋰溶于2.5升水中，加入上面的懸濁液，溫度上升至20度，繼續(xù)攪拌6分鐘，溫度升至25度，把按1346克檸檬酸加水3升的比例配制好的檸檬酸溶液加入反應(yīng)液，攪拌10分鐘，加入I升水，冰鹽浴冷卻，直到大量固體析出，繼續(xù)攪拌半個(gè)小時(shí)，過濾，水洗，得到純品，為6-N-( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸； 步驟7) 2克6-N- ( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸溶于5毫升乙腈和5毫升DMF的混合溶劑中，加入1.9克苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽，反應(yīng)液冷至O度，在此溫度下滴加1.6毫升N-甲基嗎啉，攪拌反應(yīng)一下小時(shí)后，O度下將1.896克的C 一次加入反應(yīng)液，此反應(yīng)液室溫?cái)嚢枰粋€(gè)小時(shí)，后室溫反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)，冷卻至O度，加水產(chǎn)物分層，分液水洗三次，取有機(jī)相，旋干有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品3.7克Fmoc-PNA-A (Bhoc)-OMe ； 步驟8)將3.7克的粗產(chǎn)品Fmoc-PNA-A (Bhoc) -OMe溶于25毫升的四氫呋喃中，冷至零度，將10毫升濃度為5mol/l的氫氧化鋰水溶液，劇烈攪拌緩慢滴加入反應(yīng)液中，溫度控制在零度左右，有固體析出，此溫度下繼續(xù)攪拌20分鐘，TLC跟蹤為準(zhǔn)，反應(yīng)完畢，加入事先按6克梓檬酸加10毫升水的比例配好的梓檬酸水溶液，冷至零下析晶，攪拌半個(gè)小時(shí)后過濾，水洗三次，得到的固體干燥后用乙醚打漿洗掉低極性雜質(zhì)，過濾干燥，得到純品Fmoc-PNA-A(Bhoc)-OH,純度為 95% ； 過程如下:
全文摘要
本發(fā)明公開了一種公斤級合成PNA的方法，包括以下步驟乙二胺與氯乙酸反應(yīng)，用DMSO重結(jié)晶得到N-(2-氨乙基)甘氨酸；以N-(2-氨乙基)甘氨酸為反應(yīng)物，加入原料，反應(yīng)得N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽；以腺嘌呤為反應(yīng)物，加入原料，反應(yīng)得9-乙酸乙酯腺嘌呤；以9-乙酸乙酯腺嘌呤和羰基二咪唑?yàn)榉磻?yīng)物，加入原料，反應(yīng)得6-N-(二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸；以6-N-(二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸為反應(yīng)物，加入原料，反應(yīng)即得。本發(fā)明屬于大規(guī)模生產(chǎn)工藝，為PNA的大規(guī)模研究做好物質(zhì)準(zhǔn)備，以及為以后的大規(guī)模應(yīng)用做好工藝準(zhǔn)備。
文檔編號C07D473/34GK103145714SQ20131007852
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者凌靜, 劉金永 申請人:蘇州維泰生物技術(shù)有限公司