專利名稱：抗喹乙醇單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株、其制備方法及用于檢測飼料中喹乙醇的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小分子免疫化學(xué)分析與檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及喹乙醇單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株、其制備方法及用于檢測飼料中喹乙醇的試劑盒。
背景技術(shù)：
喹乙醇(o-laquindox，OLA)又稱喹酰胺醇，化學(xué)名稱為2_羥乙基氨基甲酰_3_甲基-喹喔啉-1，4- 二氧化物，具有良好的廣譜抗菌效果，對大腸桿菌、沙門氏桿菌等革蘭氏陰性致病菌所致的消化道疾病具有良好的療效，并且能夠促進(jìn)畜禽對飼料的消化利用，提高生長速度，在動物性食品生產(chǎn)中發(fā)揮了一定的作用。大量的國內(nèi)外研究報告表明:殘留于動物組織中的喹乙醇是一種基因毒劑和生殖腺誘變劑，不但能使動物發(fā)生中毒或死亡，并且殘留在畜產(chǎn)品中對人體也有較大的危害。因此，2001年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》規(guī)定，禁止喹乙醇用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖，并且只能用于低于35 kg體重的豬飼料，使用量為50 g/t飼料。近幾年來，一些飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖戶受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動，違規(guī)大劑量、長期使用喹乙醇的現(xiàn)象仍很嚴(yán)重，為了確保人類安全與健康，開展飼料及飼料添加劑中喹乙醇含量檢測的工作有重要意義。飼料中喹乙醇的檢測方法主要是高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但此方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)操作人員，而且操作步驟繁瑣、費(fèi)時。由于酶聯(lián)免疫吸附方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，在獸藥殘留分析領(lǐng)域應(yīng)用越來越多。目前國內(nèi)用于檢測OLA的間接競爭ELISA試劑盒多采用進(jìn)口抗喹乙醇單克隆抗體，檢測費(fèi)用很高；國內(nèi)文獻(xiàn)和專利中也有報道選用抗OLA多克隆抗體和抗OLA單克隆抗體用于喹乙醇?xì)埩魴z測，但都不是十分理想，主要是由于抗體的特異性不強(qiáng)、線性范圍小、專屬性不夠等問題。例如楊曙明、于洪俠關(guān)于一種檢測喹乙醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的發(fā)明專利(CN1888903)選用的是喹乙醇多克隆抗體；2009年宋春梅碩士畢業(yè)論文一喹乙醇單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)快速檢測方法的建立中抗體特異性不強(qiáng)、線性范圍小，并且該方法主要是針對動物性食品中喹乙醇的殘留檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種具有高效價及靈敏度的高特異性抗喹乙醇單克隆抗體。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:具有保藏號為CGMCC N0.6260的雜交瘤細(xì)胞株。上述雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號為:CGMCC N0.6260，分類命名為小鼠脾細(xì)胞-骨髓瘤雜交瘤細(xì)胞；保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期是2012年7月4日。本發(fā)明的第二個目的是提供了上述具有保藏號為CGMCC N0.6260的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，包括以下步驟:
1)制備喹乙醇衍生物一載體蛋白偶聯(lián)物，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白或鑰孔嘁血藍(lán)蛋白；所述喹乙醇衍生物為結(jié)構(gòu)式為式(I )的化合物；
權(quán)利要求
1.具有保藏號為CGMCCN0.6260的小鼠脾細(xì)胞-骨髓瘤雜交瘤細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有保藏號為CGMCCN0.6260的雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)制備喹乙醇衍生物一載體蛋白偶聯(lián)物，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白或鑰孔嘁血藍(lán)蛋白；所述喹乙醇衍生物為結(jié)構(gòu)式為式(I )的化合物
3.具有高特異性的抗喹乙醇單克隆抗體，其特征在于，是由保藏號為CGMCCN0.6260的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有高特異性的抗喹乙醇單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: а)腹水的制備:取成年BALB/C雌性小鼠按0.5ml/只腹腔注射液體石蠟，10天后腹腔注入權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株，注入量為I 5 X IO6個/只，注射10 14天后進(jìn)行無菌操作采集腹水，將采集到的腹水以轉(zhuǎn)速1000 rpm離心10 min，收集中間層澄清液體，SP得到腹水型單克隆抗體； b)抗體純化:將步驟a)得到的離心后的腹水上清用飽和硫酸銨沉淀，獲得抗喹乙醇單克隆抗體粗品j^Sephacryl S-200層析柱進(jìn)行純化分離，收集陽性管的腹水蛋白，得到抗喹乙醇單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有高特異性的抗喹乙醇單克隆抗體在定性和定量檢測飼料中喹乙醇中的應(yīng)用。
6.一種利用具有高特異性的抗喹乙醇單克隆抗體檢測飼料中喹乙醇的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組成: 1)用含有喹乙醇衍生物一卵清白蛋白偶聯(lián)物的包被緩沖液包被的酶標(biāo)板； 2)最佳工作濃度的抗喹乙醇單克隆抗體溶液； 3)最佳工作濃度的山羊抗小鼠IgG-HRP； 4)底物A液:含體積百分含量 為0.1%H202的pH為5.0的磷酸鈉檸檬酸溶液； 5)底物B液:2mg/mL的3，3、5，5'-四甲基聯(lián)苯胺無水乙醇溶液； б)終止液:2M的硫酸； 7)喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別為0、l、3、9、27、81、243ng/mL ；8)2倍濃縮樣本工作溶劑:含體積百分含量O 50%甲醇，pH為7.4的PBS溶液； 9)20倍濃縮洗液:濃度為0.2M，pH為7.4的PBST溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒在檢測喹乙醇中的應(yīng)用，其特征在于，試劑盒的使用方法為: 1)樣本的前處理:稱取1.0g飼料樣品，研碎，加入IOmL去離子水，搖勻后，放入80°C水浴40min ；4000r/min離心lOmin，吸出上清液，濾紙過濾；用樣本工作溶劑10倍或400倍稀釋上清液，混合均勻，取50μ 進(jìn)行分析； 2)操作方法:將喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測飼料樣本對應(yīng)微孔編號、記錄；每孔加入喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測樣本各50μ ，再加入喹乙醇單克隆抗體50μ 7孔，37°C反應(yīng)30min ；揭開蓋板膜，甩干孔內(nèi)液體，PBST洗滌4 5次；加入酶標(biāo)二抗IOOPL/孔，37°C反應(yīng)30min，PBST洗滌4 5次；加入底物A液、底物B液各50μ 7孔，37°C反應(yīng)10 15min ;加入終止液50μ 7孔，用酶標(biāo)儀測定0D45Qnm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有高效價及靈敏度的高特異性抗喹乙醇單克隆抗體，并公開了能夠生產(chǎn)抗喹乙醇單克隆抗體的具有保藏號為CGMCCNo.6260的雜交瘤細(xì)胞株、其制備方法及用于檢測飼料中喹乙醇的試劑盒。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的抗喹乙醇單克隆抗體具有較高特異性和靈敏度，并且線性范圍大，能夠用于建立快速檢測飼料中喹乙醇非法添加的免疫學(xué)方法，其應(yīng)用方法為間接競爭ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒與膠體金試紙條，該方法對儀器設(shè)備和人員操作的要求較低，檢測成本低，能夠滿足對大批量飼料樣品檢測的需要。
文檔編號C07K16/44GK103146652SQ20131005367
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月19日
發(fā)明者李建喜, 張景艷, 王磊, 楊志強(qiáng), 張凱, 王學(xué)智, 張宏, 秦哲, 孟嘉仁 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所