通過使用抗骨硬化蛋白抗體治療牙槽骨流失的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種治療牙槽骨流失的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用骨硬化蛋白抑制劑。
【專利說明】通過使用抗骨硬化蛋白抗體治療牙槽骨流失的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年12月28曰提交的美國臨時申請第61/580，964號的優(yōu)先權益。所述優(yōu)先權申請的公開內容以全文引用的方式并入本文中。
[0003]發(fā)明【技術領域】
[0004]本發(fā)明總體上涉 及使用骨硬化蛋白抑制劑治療牙槽骨流失的方法。
[0005]以電子方式提交的材料的引入并入
[0006]以全文引用的方式并入的是與此同時提交且鑒別如下的計算機可讀核苷酸/氨基酸序列表:ASCII (文本)文件名稱“46570_SeqListing.txt”，805, 989個字節(jié)，2012年12月7曰創(chuàng)建。
[0007]以引用方式并入
[0008]以下申請?zhí)卮艘匀囊玫姆绞讲⑷?2006年4月25曰提交的美國專利申請第11/410, 540號，其要求2006年4月17曰提交的美國臨時專利申請第60/792，645號、2006年3月13日提交的美國臨時專利申請第60/782，244號、2006年2月24日提交的美國臨時專利申請第60/776,847號以及2005年5月3日提交的美國臨時專利申請第60/677,583號的優(yōu)先權；以及2006年4月25日提交的美國專利申請第11/411，003號(以美國專利第7，592，429號頒布)，其要求2006年4月17日提交的美國臨時專利申請第60/792,645號、2006年3月13日提交的美國臨時專利申請第60/782,244號、2006年2月24日提交的美國臨時專利申請第60/776,847號以及2005年5月3日提交的美國臨時專利申請第60/677，583號的優(yōu)先權。以下申請?zhí)卮艘惨砸玫姆绞讲⑷?2008年9月17日提交的美國專利申請第12/212,327號，其要求2007年9月17日提交的美國臨時專利申請第60/973，024號的優(yōu)先權；以及2010年6月29日提交的美國專利申請第12/811，171號，其根據美國法典第35篇371條為2008年12月15日提交的國際專利申請第PCT/US08/86864號的美國國家階段申請，其要求2007年12月14日提交的美國臨時專利申請第61/013，917號的優(yōu)先權。
[0009]發(fā)明背景
[0010]已知牙周感染和牙齦發(fā)炎為牙周疾病的主要原因。兩者皆為慢性發(fā)炎性疾病，且隨著其進展，牙周組織損壞且牙槽骨因在一些狀況下引起牙齒支撐物損失的骨吸收而減少。另外，牙槽骨可能因由外科治療引起的穿孔或所進展的齲齒的頂端病變而變得缺損。
[0011]發(fā)明概述
[0012]本發(fā)明是針對使用骨硬化蛋白抑制劑來增強牙槽骨的方法。在一方面，本文描述一種治療受試者牙槽骨流失的方法，所述方法包括施用有效減小牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離的量的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)，劑量任選地為每周約5mg至約l，000mg。在一個實施方案中,在整個治療期內，每周兩次施用骨硬化蛋白抑制劑。在另一實施方案中，在整個治療期內，每周一次施用骨硬化蛋白抑制劑。
[0013]治療期可為至少約I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3個月、13周、14周、15周、16周、4個月、17周、18周、19周、20周、5個月、21周、22周、23周、24周、6個月、25周、26周、27周、28周、7個月、29周、30周、31周或更長(例如8個月、9個月、10個月、11個月、I年、15個月、18個月或更長)。在一些實施方案中，治療期為約6-12周。在一些實施方案中，治療期為4-12周或約1-3個月。在一些實施方案中，治療期為約12-20周或約3-5個月。在一些實施方案中，治療期為約20-32周或約5_8個月。在一些實施方案中，治療期為約24-36周或約6-9個月。在一些實施方案中，治療期至多為約28周。在一些實施方案中，治療期為約I年。在一些或任何實施方案中，治療期至多為約18個月。
[0014]在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與治療前距離相比，牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離減小了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少7 0%、至少80%、至少90%或更多)。在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與對照受試者(即不接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比，牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離減小了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90 %或更多)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離恢復至疾病前狀態(tài)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離小于或等于約2mm(例如約2mm、約1.9mm、約1.8mm、約
1.7mm、約 1.6mm、約 1.5mm、約 1.4mm、約 1.3mm、約 1.2mm、約 1.1mm 或約 1mm)。
[0015]在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與治療前牙槽骨高度相比，牙槽骨高度增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與對照受試者(即不接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比，牙槽骨高度增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙槽骨高度恢復至牙槽骨高度的疾病前狀態(tài)。
[0016]在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與治療前牙槽骨高度相比或與對照受試者(即不接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比，牙槽骨高度增加了至少0.1mm(例如至少約0.1_、約0.2mm>約0.3mm>約0.4mm、約0.5mm>約0.6mm>約
0.7_、約 0.8_、約 0.9_、約 1_、約 1.5_、約 2_、約 2.5_、約 3_、約 3.5_、約 4mm、約
4.5_、約 5_、約 5.5_、約 6_、約 6.5_、約 7_、約 7.5_、約 8_、約 8.5_、約 9_、約 9.5或約1mm)或更多。
[0017]在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與治療前牙槽骨密度相比或與對照受試者(即不接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比，牙槽骨密度增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙槽骨密度恢復至疾病前狀態(tài)。
[0018]在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與治療前牙槽骨體積分數(shù)(BVF)相比或與對照受試者(即不接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比，牙槽BVF增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。[0019]在一些或任何實施方案中，本文所述的方法可以進一步包括在施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)之前測量牙槽骨的骨骼礦物密度以鑒別需要用骨硬化蛋白抑制劑治療的受試者。牙槽骨密度測量值小于約750亨斯菲爾德單位(Hounsfield Unit)(例如為約 750HU、約 700HU、約 650HU、約 600HU、約 550HU、約 500HU、約450HU、約400HU或更小)的受試者被鑒別為需要用抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段治療的受試者。
[0020]本文所述的方法治療的牙槽骨流失包括但不限于與以下狀況相關的牙槽骨流失:牙周炎(例如晚期牙周病)、牙齒損失、拔牙、戴假牙、口腔外科、骨髓炎、放射性骨壞死、發(fā)育畸形(例如出生時缺陷，如牙齒、面顱骨或頜的缺失部分)、竇不足、未對準、或外傷(例如牙齒撕脫或頜骨折)。在一些實施方案中，欲治療的受試者患有晚期牙周炎。
[0021]在一些實施方案中，牙槽骨流失因去除含有腫瘤(例如良性腫瘤)的骨骼部分而產生。示例性良性骨腫瘤包括但不限于骨瘤、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤、骨軟骨瘤、內生軟骨瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、動 脈瘤樣骨囊腫、單房性骨囊腫、骨纖維性發(fā)育異常及骨骼巨細胞瘤。
[0022]在一些或任何實施方案中，施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)，并且組合使用支持骨骼的再生長的材料，所述材料如骨移植物、骨粉、骨碎片、去礦化骨基質、骨骼支架、修復體、金屬穩(wěn)定劑或骨骼支架物質，包括一或多種聚合物、陶瓷、牙骨質及基于磷酸鈣的骨骼移植物取代物。本領域中已知所述材料的許多變化形式。
[0023]在一些或任何實施方案中，所述方法包括在施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)之前向受試者施用用于治療牙周病的標準護理療法。例如，在一些實施方案中，用于治療牙周病的標準護理療法為治療劑，包括但不限于Per1stat?和/或化學改性的四環(huán)素-3 (CMT-3)。在一些實施方案中，標準護理療法包括口沖洗法和/或刮牙術以及受試者感染區(qū)域的牙齦上和/或牙齦下清創(chuàng)術(例如去除微生物牙菌斑和牙垢)。在一些實施方案中，標準護理包括在施用骨硬化蛋白抑制劑之前進行口沖洗法和/或刮牙術以及感染區(qū)域清創(chuàng)術與Per1stat和/或CMT-3的組合。在一些實施方案中，所述方法包括與施用骨硬化蛋白抑制劑并行施用標準護理療法。在其它實施方案中，標準護理療法相繼施用。例如，標準護理療法可在向受試者施用骨硬化蛋白抑制劑之前I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周或更長時間來施用。在優(yōu)選實施方案中，在施用骨硬化蛋白抑制劑之前，受試者的牙周病進展減緩、停止或逆轉。
[0024]在一些或任何實施方案中，所述方法進一步包含施用抗生素，如選自由以下組成的組的抗生素:阿莫西林(amoxicillin)、鹽酸四環(huán)素、多西環(huán)素(doxycycline)、米諾霉素、阿奇霉素(azithromycin)、羅紅霉素、莫西沙星(moxif1xacin)、環(huán)丙沙星以及甲硝咕唑。在一些實施方案中，所述方法包括在向受試者施用骨硬化蛋白抑制劑之前或施用之后向受試者施用抗生素。在其它實施方案中，所述方法包括與施用骨硬化蛋白抑制劑并行向受試者施用抗生素。
[0025]在一些或任何實施方案中，所述方法進一步包括施用第二骨骼增強治療劑以治療骨骼礦物密度減小或骨折。本領域中已知許多此類型的治療劑。在一些實施方案中，骨骼增強治療劑選自由以下各物組成的組:抗再吸收藥物、成骨劑、雌激素受體調節(jié)劑(包括但不限于雷諾昔芬(raloxifene)、巴多昔芬(bazedoxifene)以及拉索昔芬(Iasofoxifene))以及對破骨細胞具有抑制作用的藥物。在一些實施方案中，第二骨骼增強劑選自由以下組成的組:雙膦酸鹽(包括但不限于阿侖膦酸鈉(alendronate sodium ； FOSAMAX?.)、利塞勝酸鹽(risedronate)、伊班勝酸鈉(ibandronate sodium ； BONIVA? )以及
唑來膦酸(zoledronic acid ； RECLAST? ))、雌激素或雌激素類似物、鈣來源、替勃龍
(Tibolone)、降鈣素、骨化三醇以及激素替代療法。在一些實施方案中，第二骨骼增強劑包括但不限于副甲狀腺素(PTH)或其肽片段、PTH相關蛋白質(PTHrp)、骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白、成骨素、NaF, PGE2激動劑、士他汀(statin)、抗DKKl抗體或抑制劑、抗RANK配體(RANKL)抗體(例如PR0LIA? )或RANKL抑制劑、雷奈酸銀(strontium ranelate)、維生素D、或維生素D衍生物或其模擬物。在一些實施方案中，第二骨骼增強劑為Forteo⑩(特立帕肽(Teriparatide)或重組人副甲狀腺素類似物(1-34))或Preotact? (副甲狀腺素)。在一些或任何實施方案中，骨骼增強劑為Protelos?。 [0026]在一些實施方案中，與骨硬化蛋白抑制劑(例如，持續(xù)治療期內一段時間)并行施用第二骨骼增強劑。在其它實施方案中，一旦骨硬化蛋白抑制劑治療期結束，就施用第二骨骼增強劑持續(xù)一段時間(即，持續(xù)一段維持期)。在此類實施方案中，施用第二骨骼增強劑持續(xù)約I周至約5年的一段維持期。
[0027]所述方法可以進一步包括隨后施用一或多個有效維持骨骼礦物密度的量的骨硬化蛋白抑制劑，維持期任選地為在治療期結束后至少約12周、6個月、I年、2年、3年、4年、5年或更長時間(例如受試者一生)。
[0028]牙周病治療計劃還可包括積極治療完成后的支持性跟蹤療法。支持性跟蹤療法包括但不限于機械清創(chuàng)術、口腔衛(wèi)生增強(例如定期專業(yè)清潔、日常刷洗及清牙垢)以及施用抗生素。
[0029]在任何本文公開的實施方案中，骨硬化蛋白抑制劑任選地為骨硬化蛋白結合劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。尤其涵蓋美國專利公布號2007/0110747中所公開的骨硬化蛋白結合劑在本文公開的任何方法中的使用或用于制備根據本文公開的任何方法施用的藥劑的用途。一個或多個劑量的骨硬化蛋白抑制劑以可有效治療牙槽骨流失的一定量和一段時間來施用。在不同實施方案中，每周向受試者(例如人受試者)施用包含約50毫克至約1，000毫克骨硬化蛋白抑制劑的一個或多個劑量。例如，骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的劑量可包含至少約5mg、15mg、25mg、50mg、約60mg、約70mg、約 80mg、約 90mg、約 lOOmg、約 120mg、約 150mg、約 200mg、約 240mg、約 250mg、約 280mg、約 300mg、約 350mg、約 400mg、約 420mg、約 450mg、約 500mg、約 550mg、約 600mg、約 650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg或高達約1，OOOmg的骨硬化蛋白抑制劑。還涵蓋任何和所有這些終點之間的范圍，例如約50mg至約80mg、約70mg至約140mg、約 75mg 至約 lOOmg、約 10mg 至約 150mg、約 140mg 至約 210mg、或約 150mg 至約 200mg、或約280至約410mg。劑量以任何間隔施用，如一周多次(例如每周兩次或三次)、每周一次、每兩周一次、每三周一次，或每四周一次。在一些或任何實施方案中，每周兩次施用約120mg至約210mg范圍內的劑量的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。在一些或任何實施方案中，每周兩次施用約140mg的劑量的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。
[0030]在一些實施方案中，所述一或多個劑量的骨硬化蛋白抑制劑可以包含每公斤體重約0.1與約50毫克之間(例如約5與約50毫克之間)、或約I至約100毫克(mg/kg)的骨硬化蛋白抑制劑。例如，骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的劑量可以包含至少約 0.lmg/kg、0.5mg/kg、lmg/kg、約 2mg/kg、約 3mg/kg、約 4mg/kg、約 5mg/kg、約 6mg/kg、約 7mg/kg、約 8mg/kg、約 9mg/kg、約 10mg/kg、約 20mg/kg、約 25mg/kg、約 26mg/kg、約 27mg/kg、約 28mg/kg、約 29mg/kg、約 30mg/kg、約 3lmg/kg、約 32mg/kg、約 33mg/kg、約34mg/kg、約 35mg/kg、約 36mg/kg、約 37mg/kg、約 38mg/kg、約 39mg/kg、約 40mg/kg、約 41mg/kg、約 42mg/kg、約 43mg/kg、約 44mg/kg、約 45mg/kg、約 46mg/kg、約 47mg/kg、約 48mg/kg、或約 49mg/kg、或約 50mg/kg、約 55mg/kg、約 60mg/kg、約 65mg/kg、約 70mg/kg、約 75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg、或高達約100mg/kg。還涵蓋任何和所有這些終點之間的范圍，例如約lmg/kg至約3mg/kg、約lmg/kg至約5mg/kg、約lmg/kg至約1mg/kg、約 lmg/kg 至約 20mg/kg、約 lmg/kg 至約 40mg/kg、約 5mg/kg 至約 30mg/kg、或約 5mg/kg至約 20mg/kg。
[0031]本文還描述有效量的抗骨硬化蛋白抑制劑用于治療受試者牙槽骨流失的用途，所述抗骨硬化蛋白抑制劑是例如按上述任何量，如每周約50mg至約1，OOOmg，其中在一段治療期內進行骨硬化蛋白結合劑的一次或多次施用，所述治療期持續(xù)至少I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3個月、13周、14周、15周、16周、4個月、17周、18周、19周、20周、5個月、21周、22周、23周、24周、6個月、25周、26周、27周、28周、7個月、29周、30周、31周或更長時間(例如8個月、9個月、10個月、11個月、I年、15個月、18個月或更長時間)。
[0032]在一些或任何實施方案中，皮下施用骨硬化蛋白抑制劑。在其它實施方案中，對受試者頜局部施用骨硬化蛋白抑制劑。在一些或任何實施方案中，對受試者的患病牙齦區(qū)域局部施用骨硬化蛋白抑制劑。在一些或任何實施方案中，對受試者牙周袋施用骨硬化蛋白抑制劑。
[0033]骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)還可用于制備使用本文所述的任何給藥和/或時機方案施用給牙槽骨流失受試者的藥劑。因此，本發(fā)明還涵蓋根據本文所述的任何給藥和/或時機方案使用的骨硬化蛋白抑制劑。任選地，骨硬化蛋白抑制劑存在于容器中，如單次劑量或多次劑量小瓶或注射器。本發(fā)明包括一種包含抗骨硬化蛋白抗體或其片段以及根據本文所述的任何給藥和/或時機方案施用抗體或其片段以治療牙槽骨流失的說明書的容器。
[0034]在不同實施方案中，骨硬化蛋白抑制劑為骨硬化蛋白結合劑，例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段。任選地，所述抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段交叉封閉以下抗體中至少一者與骨硬化蛋白的結合:Ab-A、Ab-B、Ab-C,Ab-D、Ab-1、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23以及Ab_24，和/或被以下抗體中至少一者交叉封閉與骨硬化蛋白的結合:Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab_l、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23以及Ab-24。[0035]在一些實施方案中，所述抗骨硬化蛋白抗體包含SEQ ID NO:245的⑶R-Hl、SEQID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQ ID NO:78 的 CDR-LU SEQ ID NO:79 的CDR-L2、以及 SEQ ID NO:80 的 CDR-L3。
[0036]在一個實施方案中，所述抗骨硬化蛋白抗體包含含SEQ ID NO:378的重鏈以及含SEQ ID NO:376的輕鏈。在另一實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體具有SEQ ID NO: 145或SEQ IDNO:392的重鏈以及SEQ ID NO: 141的輕鏈。
[0037]在另一實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體包含國際專利公布號WO 2008/115732的SEQ ID NO:20-25 的 CDR(SEQ ID N0:416_421)、國際專利公布號 TO 2008/115732 的 SEQ IDNO:26-31 的 CDR(SEQ ID N0:422_427)、國際專利公布號 WO 2008/115732 的 SEQ ID NO:32-37的 CDR(SEQ ID NO:428-433)或國際專利公布號 WO 2009/047356 的 SEQ ID NO:4、15、26、37、48以及59的CDR(分別 為SEQ ID NO:443、454、465、476、487以及498)。在另一實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體包含國際專利公布號WO 2010/130830的SEQ ID NO: 135-143、153-161或171-179中的至少一者的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO:745-753、763_771、781_789)。
[0038]還涵蓋包含本文所述的抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)的牙齒植入物、基質、凝膠劑以及傷口敷料。在一些實施方案中，牙齒植入物、基質、凝膠劑以及傷口敷料用抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)涂布。在其它實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)與本文所述的載體一起配制且施加至目標區(qū)域(即受試者的患病牙齦區(qū)域或患病牙周袋)，任選地在施加牙齒植入物、基質或傷口敷料之前(或之后)。抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)可通過本領域已知的任何方式施加。在一些實施方案中，在施加牙齒植入物、基質或傷口敷料之前，通過皮下注射向目標區(qū)域施用骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)。在其它實施方案中，在施加牙齒植入物、基質或傷口敷料之前，通過刷涂或以其它方式涂布受感染區(qū)域向受感染區(qū)域施用骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)。
[0039]另外，尤其涵蓋抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)在本文公開的任何方法中的用途或用于制備根據本文公開的任何方法施用的藥劑的用途。在此方面，本發(fā)明包括一種用于在治療受試者牙槽骨流失的方法中使用的抗骨硬化蛋白抗體，所述方法包括施用有效減小牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離的量的抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)，劑量任選地為每周約5mg至約1，OOOmg0
[0040]本發(fā)明還包括抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)的用途，其用于制備供治療受試者牙槽骨流失用的藥劑，其量有效減小牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離，其中所述抗骨硬化蛋白抗體(或抗體片段)的劑量任選地為每周約5mg至約1，OOOmgo
[0041]上述概述不意欲限定本發(fā)明的每個方面，并且在其它部分(如詳述)中描述了其它方面。整個文件意欲作為統(tǒng)一的公開內容聯(lián)系起來，且應理解涵蓋本文所述的特征的所有組合，即使特征的組合未能在此文件的同一句子或段落或部分中找到。就本發(fā)明的用“一(a或an) ”描述或要求的方面來說，應理解除非上下文明顯地需要更具限制性的含義，否則這些術語意指“一個或多個”。除非上下文明顯地需要其它意思，否則術語“或”應理解涵蓋替代性項目或聯(lián)合項目。如果本發(fā)明的方面描述為“包含”特征，則還涵蓋實施方案“由所述特征組成”或“基本上由所述特征組成”。
[0042]附圖簡述
[0043]圖1為列出本文所述的不同抗骨硬化蛋白抗體的氨基酸序列和氨基酸序列的序列標識符的圖表。序列標識符指同時提交的序列表中所提供的氨基酸序列。氨基酸序列還闡述于美國專利公布號2007/0110747或國際專利公布號WO 2008/115732,WO 2009/047356或TO 2010/130830中，所述公布特此以引用的方式并入。
[0044]圖2A和2B為描繪實驗牙周炎期間全身性施用抗骨硬化蛋白抗體對骨骼體積分數(shù)(圖2A)和骨骼礦物密度(圖2B)的作用(2周及4周研究終點時進行測量)的曲線。
[0045]圖3A和3B為描繪實驗牙周炎誘發(fā)之后全身性施用抗骨硬化蛋白抗體對骨骼體積分數(shù)(圖3A)和骨骼礦物密度(圖3B)的作用(4周、7周以及10周研究終點時進行測量)的曲線。
[0046]圖4A和4C為描繪實驗牙周炎誘發(fā)后施用抗骨硬化蛋白抗體對牙骨質-牙軸質接面與骨骼嵴之間的距離的作用(圖4A)以及7周(圖4B)和10周(圖4C)時上頜第二磨牙的位點特異性測量的曲線。
[0047]發(fā)明詳述
[0048]本發(fā)明至少部分地基于如下發(fā)現(xiàn):骨硬化蛋白抑制劑可治療與例如牙周病相關的牙槽骨流失。在此方面，本發(fā)明提供一種治療牙槽骨流失的方法。所述方法包括在治療期期間以有效減小牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離的量向受試者(例如哺乳動物，如人)施用一個或多個劑量的骨硬化蛋白抑制劑，如骨硬化蛋白結合劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。本發(fā)明的材料和方法優(yōu)于現(xiàn)有療法，所述現(xiàn)有療法的治療功效依賴于侵襲性手術方法(例如骨移植物)來將受試者牙槽骨恢復至疾病前狀況(例如高度和/或密度和/或三維骨骼質量)。
[0049]通過本文所述的方法治療的牙槽骨流失包括但不限于與以下狀況相關的牙槽骨流失:牙周炎、牙齒損失、拔牙、戴假牙、口腔外科、骨髓炎、放射性骨壞死、發(fā)育畸形(例如出生時缺陷，如牙齒、面顱骨或頜的缺失部分)、竇不足、未對準、或外傷(例如牙齒撕脫或頜骨折)。在一些實施方案中，欲治療的受試者患有晚期牙周炎。
[0050]如本文所用的術語“牙周病”意欲涵蓋一系列臨床病狀。牙周病的臨床診斷基于視覺和放射照相評價牙周組織并且基于牙齒與牙齦之間的間隙的測量。在人中，這些間隙的深度通常為1_3_，并且在支撐結締組織與骨骼損失時加深。在綜合臨床檢查期間，在每個牙齒周圍的不同位置(例如4-6個位置)處測量袋深度和組織支撐物，并且記錄牙菌斑、牙垢、牙齦出血以及分泌液的量。牙齒放射照相通常用于評估牙齒骨骼支撐物的量。
[0051]牙周病的嚴重性通常基于由牙骨質-牙軸質接面或頂邊緣測量的臨床附著損失(CAL),且可被視為輕度(l-2mm)、中度(3_4mm)、或重度(≥5mm)。術語“臨床附著損失”(CAL)是指牙骨質-牙軸質接面(即頂邊緣)至頂端牙齦緣的距離(以毫米測量)。牙周病的特征也可在于袋探測深度，其中輕度疾病的特征在于牙周袋探測深度為約4-5mm，中度疾病的特征在于袋探測深度為約6-7mm，并且重度疾病的特征在于袋探測深度為約> 8mm。術語牙周的“袋探測深度”(PPD)是指牙骨質-牙軸質接面(即頂邊緣)至牙槽骨嵴的距離(以毫米測量)。PH)與CAL測量用牙周探針在各牙齒周圍的不同部位(例如近中頰部位或中頰部位)進行。其提供牙周病嚴重性的度量。或者，PH)與CAL可獲自具有一些解剖學標志的標準數(shù)字放射照相。
[0052]牙周病包括但不限于牙菌斑誘發(fā)及非牙菌斑誘發(fā)的牙齦疾??；慢性牙周炎(分類為輕度(l-2mm CAL)、中度(3_4_ CAL)、或重度(≥5mm)系統(tǒng)化或局部化牽涉；侵襲性牙周炎(分類為(l-2mm CAL)、中度(3_4mm CAL)、或重度(> 5mm)系統(tǒng)化或局部化牽涉)；作為與血液學病癥和遺傳性病癥相關的全身性疾病的表現(xiàn)的牙周炎；壞死性牙周疾病，包括壞死潰瘍性牙齦炎和壞死性潰瘍性牙周炎；牙周組織膿腫(包括牙齦、牙周和冠周膿腫)；與牙髓病變相關的牙周炎；以及發(fā)育或后天性畸形和病癥，例如改變或易感染牙菌斑誘發(fā)的牙齦疾病或牙周炎的局部化牙齒相關因子、牙齒周圍的粘膜牙齦畸形和病狀、以及缺齒脊和咬合面外傷的病狀。所有這些病狀可局限于一個或幾個特定牙齒或更系統(tǒng)化(即牽涉>30%的部位)。
[0053]如本文所用的術語“晚期牙周病”是指呈現(xiàn)CAL≥5mm或牙周PB)≥8mm的受試者。牙齦回縮、牙齒移動、活動性以及化膿為通常與歸因于牙槽骨進行性破壞的晚期牙周病相關的病征。
[0054]在一些實施方案中，牙 槽骨流失因移除含有良性腫瘤的骨骼部分而產生。示例性良性骨腫瘤包括但不限于骨瘤、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤、骨軟骨瘤、內生軟骨瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、動脈瘤樣骨囊腫、單腔骨囊腫、骨纖維性發(fā)育異常以及骨骼巨細胞瘤。
[0055]施用骨硬化蛋白抑制劑增加牙槽骨的一或多個參數(shù)(例如牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨密度、牙槽骨體積、牙槽骨礦物含量以及改善的牙齒穩(wěn)定性中的一或多個)。在此方面，“治療”牙槽骨流失包括例如牙槽骨高度、牙槽骨質量以及牙槽骨密度的任何增加以及牙槽骨修復的加速。類似地，“治療”牙槽骨流失包括調節(jié)牙槽骨修復的程度超出(即大于)未施用骨硬化蛋白抑制劑的受試者(即對照受試者)(例如哺乳動物，如人)中所經歷的牙槽骨修復的程度。牙槽骨修復通過例如與治療之前的此類參數(shù)相比，牙槽骨高度增加、牙槽骨體積增加、牙槽骨礦物含量和密度增加、牙齒穩(wěn)定性增加或受感染區(qū)域的患者使用改善來證明。牙槽骨的任何一或多個參數(shù)的增加可為測量參數(shù)完全或部分回復至例如(a)基線程度(例如在疾病發(fā)作之前的程度)，(b)本領域中所用的規(guī)范化數(shù)據庫或臨床標準中所提供的值，或(C)對側的功能程度(例如完全或部分地回復至例如受試者非患病牙槽骨的功能能力)。在一些情況中，增加可為超出基線程度的改善。需要時，施用一或多個劑量的骨硬化蛋白抑制劑的受試者的測量參數(shù)可與未施用骨硬化蛋白抑制劑的呈現(xiàn)牙槽骨流失的其它受試者(任選地年齡和性別匹配)的相同參數(shù)進行比較以進一步分析本文所述的方法的功效。
[0056]牙槽骨參數(shù)(例如牙槽骨高度、牙槽骨質量和/或牙槽骨密度)可以使用放射照相術(例如放射照相吸光光度法)、單一和/或雙重能量X射線吸光光度法、定量計算機斷層攝影術(QCT)、超聲波掃描術、放射照相術(例如放射照相吸光光度法)以及磁共振成像來測量。在一些實施方案中，牙槽骨流失的量通過牙周袋探測深度測量來鑒別及/或定量。
[0057]在一些實施方案中，截至治療開始后六周，施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的劑量和時間段有效使牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離與治療前距離或對照受試者(即未接受骨硬化蛋白抑制劑治療的具有類似疾病病況的受試者)相比減小了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離恢復至疾病前狀態(tài)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離小于或等于約2mm(例如約 2_、約 L 9_、約 L 8_、約 L 7_、約 L 6_、約 L 5_、約 L 4mm、約 1.3_、約1.2mm、約1.1mm或約1mm)。在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離與受試者口中的非患病區(qū)域(例如鄰接或對側牙齒)中的距離可比。
[0058]在一些實施方案中，截至治療開始后六周，施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的劑量和時間段有效使牙槽骨高度與治療前牙槽骨高度或對照受試者(即未接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90 %或更多)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙槽骨高度恢復至牙槽骨高度的疾病前狀態(tài)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，與治療前牙槽骨高度相比，牙槽骨高度增加了至少0.1mm (例如至少約0.1mm、約0.2mm、約0.3mm、約0.4mm、約0.5mm、約0.6_、約 0.7_、約 0.8_、約 0.9_、約 1_、約 L 5_、約 2_、約 2.5_、約 3_、約 3.5mm、約 4_、約 4.5_、約 5_、約 5.5_、約 6_、約 6.5_、約 7_、約 7.5_、約 8_、約 8.5_、約9mm、約9.5或約1mm)或更多。在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，牙槽骨高度與受試者口中的非患病區(qū)域(例如鄰接或對側牙齒)中的距離可比。
[0059]在一些實施方案中，截至治療開始后六周，施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的劑量和時間段有效使牙槽骨密度與治療前牙槽骨密度或對照受試者(即未接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90 %或更多)。在一些實施方案中，截至治療開始后六周，牙槽骨密度恢復至疾病前狀態(tài)牙槽骨密度(例如受試者口中的非患病牙齦區(qū)域的可比密度)。在人中，骨骼礦物密度通常使用雙重X射線吸收測量法(DXA)在臨床上測定。其它技術包括定量計算機斷層攝影術(QCT)、超聲波掃描術、單一能量X射線吸光測定法(SXA)、磁共振成像、放射照相術以及放射照相吸光測定法。除超聲波掃描術以外，美國醫(yī)藥協(xié)會注意到BMD技術典型地包括使用X射線且基于輻射衰減取決于輻射路徑中組織的厚度和組成的原理。所述技術通常包括將結果與規(guī)范化數(shù)據庫作比較。
[0060]適用于評估成功的骨硬化蛋白抑制劑治療的另一參數(shù)為牙槽骨體積分數(shù)(BVF)。如本文所用的術語“骨骼體積分數(shù)”是指每單位體積骨骼樣品的礦化骨骼體積(BV/TV，% )且可例如通過微計算機斷層攝影術(miCTo-CT)測量。在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，與治療前牙槽骨BVF相比或與對照受試者(即不接受骨硬化蛋白抑制劑治療的晚期牙周病受試者)相比，牙槽骨BVF增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些或任何實施方案中，截至治療開始后六周，牙槽骨BVF與受試者口中的非患病區(qū)域(例如鄰接或對側牙齒)中的牙槽骨BVF可比。
[0061]牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨密度以及牙槽骨體積分數(shù)中的一個或多個的增加和/或牙骨質-牙軸質接面與骨骼嵴之間的距離減小(或任何其它牙槽骨參數(shù)的改進)可在最初施用骨硬化蛋白抑制劑后I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更長時間時確定?；蛘?，牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨體積分數(shù)以及牙槽骨密度中任一個或多個的增加(和/或牙骨質-牙軸質接面與骨骼嵴之間的距離減小)可在治療期結束后確定(例如治療期結束后I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或I
年)。在一個方面，所述方法減少建立牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨密度及/或牙槽骨體積分數(shù)的所需程度和/或牙骨質-牙軸質接面與骨骼嵴之間的距離減小所需的時間量，與未接受骨硬化蛋白抑制劑的年齡和性別匹配患者相比，例如本文所述的牙槽骨高度、牙槽骨質量或牙槽骨密度和/或牙槽骨體積分數(shù)和/或牙骨質-牙軸質接面與骨骼嵴之間的距離的任何增加％，從而減少受試者恢復時間。例如，在一個實施方案中，與未接受骨硬化蛋白抑制劑的受試者相比，骨硬化蛋白抑制劑使增加牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨密度和/或牙槽骨體積分數(shù)和/或減小牙骨質-牙軸質接面與骨骼嵴之間的距離所需的時間量減少了至少約10% (例如至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、或至少約50% )。
[0062]指示牙槽骨增強的功能性生活質量參數(shù)包括但不限于牙齒損失風險減小；牙齦出血減少、牙周袋深度減小、牙齦組 織附著程度增加、發(fā)音改善；味覺改善；食用某些食品的能力增加；張力減??；進食改善及刺激性減小。如本文所述施用一個或多個劑量的骨硬化蛋白抑制劑在測試的患者群體中以統(tǒng)計學上顯著的方式加速與牙槽骨流失相關的功能性生活質量參數(shù)的改進。
[0063]在一些實施方案中，在一段治療期時程內對人施用一或多個劑量的骨硬化蛋白抑制劑(如骨硬化蛋白結合劑)(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)，所述治療期包含1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31周、8個月、9個月、10個月、11個月、I年、18個月或更長時間。“治療期”在施用第一劑量的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)時開始且在施用最后劑量的骨硬化蛋白抑制劑之后結束。涵蓋在治療期期間施用骨硬化蛋白抑制劑任何次數(shù)。例如，在治療期內，為受試者提供骨硬化蛋白抑制劑的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20個劑量或施用。在一個實施方案中，治療期包含至少6周。在一些實施方案中，治療期持續(xù)至少28周。在其它實施方案中，治療期持續(xù)至少I年。或者或另外，治療期持續(xù)至多18個月。實際上，在至多18個月、少于I年、至多8個月、至多28周或至多20周的治療或治療期內可以進行一或多次施用包含骨硬化蛋白抑制劑的醫(yī)藥組合物。在一個實施方案中，治療期為約28周且與具有牙槽骨流失的未治療的受試者相比，牙槽骨參數(shù)，如(但不限于)牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨體積分數(shù)以及牙槽骨密度顯著改善。
[0064]施用促進、增強或加速牙槽骨修復的量的骨硬化蛋白結合劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。在任何實施方案中，骨硬化蛋白抑制劑可施用給受試者(例如人受試者)，其量為每周約5毫克至約1，000毫克骨硬化蛋白抑制劑。例如，骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的量可包含至少約5mg、15mg、25mg、50mg、約60mg、約70mg、約 80mg、約 90mg、約 lOOmg、約 120mg、約 140mg、約 150mg、約 170mg、約 180mg、約 200mg、約 210mg、約 240mg、約 250mg、約 270mg、約 280mg、約 300mg、約 350mg、約 400mg、約 420mg、約 450mg、約 500mg、約 550mg、約 600mg、約 650mg、約 700mg、約 750mg、約 800mg、約 850mg、約900mg、約950mg或高達約1，OOOmg骨硬化蛋白抑制劑。還涵蓋任何和所有這些終點之間的范圍，例如約50mg至約80mg、約70mg至約140mg、約70mg至約210mg、約75mg至約lOOmg、約 10mg 至約 150mg、約 120mg 至約 270mg、約 140mg 至約 210mg、或約 150mg 至約 200mg、或約280至約410mg。劑量以任何間隔施用，如一周多次(例如每周兩次或三次)、每周一次、每兩周一次、每三周一次、或每四周一次。在一些或任何實施方案中，每周兩次施用約120mg至約210mg范圍內的劑量的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。在一些或任何實施方案中，每周兩次施用約140mg劑量的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。在一些或任何實施方案中，治療期為12周，并且在治療期的第2周、第6周以及第12周施用骨硬化蛋白，劑量任選地為約140mg。本文所述的任何劑量可以作為分次劑量施用。例如，140mg劑量的骨硬化蛋白抑制劑可在牙科醫(yī)生診視期間以兩次70mg骨硬化蛋白抑制劑的注射液或7次20mg骨硬化蛋白抑制劑的注射液施用。
[0065]在一些實施方案中，向受試者(例如哺乳動物，如人)施用的骨硬化蛋白結合劑的劑量范圍可為約0.lmg/kg至約100mg/kg體重或約10mg/kg至約50mg/kg體重。例如，骨硬化蛋白抑制劑(例如骨硬化蛋白結合劑)的劑量范圍可為約0.lmg/kg、約0.5mg/kg、約 lmg/kg、約 2mg/kg、約 3mg/kg、約 4mg/kg、約 5mg/kg、約 6mg/kg、約 7mg/kg、約 8mg/kg、約9mg/kg、約 10mg/kg、約 20mg/kg、 約 25mg/kg、約 26mg/kg、約 27mg/kg、約 28mg/kg、約 29mg/kg、約 30mg/kg、約 3lmg/kg、約 32mg/kg、約 33mg/kg、約 34mg/kg、約 35mg/kg、約 36mg/kg、約37mg/kg、約 38mg/kg、約 39mg/kg、約 40mg/kg、約 41mg/kg、約 42mg/kg、約 43mg/kg、約 44mg/kg、約 45mg/kg、約 46mg/kg、約 47mg/kg、約 48mg/kg、約 49mg/kg、或約 50mg/kg、約 55mg/kg、約 60mg/kg、約 65mg/kg、約 70mg/kg、約 75mg/kg、約 80mg/kg、約 85mg/kg、約 90mg/kg、或約95mg/kg、高達約 100mg/kg 體重。
[0066]另外，有利的可能是施用多次劑量的骨硬化蛋白結合劑或各劑量的施用隔開，這取決于針對特定患者而選擇的治療方案。例如，骨硬化蛋白抑制劑的劑量可每四周一次、每三周一次、每兩周一次、每周一次或一周多次(例如每周兩次、每周三次、每周四次或更多次)施用，這取決于疾病狀態(tài)的嚴重性、患者的年齡和身體健康以及其類似因素。
[0067]在一些實施方案中，受試者任選地患有選自由晚期牙周病、軟骨發(fā)育不全、經絕后骨質流失、口骨質流失、頜骨壞死以及與老化相關的頜骨流失組成的組的骨骼相關病癥。受試者任選地正經受或已經受口或上頜面手術。
[0068]在一些實施方案中，受試者任選地患有選自由以下組成的組的繼發(fā)性病狀--幼年型佩吉特氏病(juvenile Paget’s disease)、肢骨紋狀肥大、代謝骨骼疾病、肥大細胞增多癥、鐮刀型細胞貧血癥/疾病、器官移植相關骨質流失、腎移植相關骨質流失、全身性紅斑狼瘡、強直性脊椎炎、癩癇癥、幼年型關節(jié)炎皮疹、地中海貧血、粘多糖癥、法布里疾病(Fabry Disease)、托納綜合癥(Turner Syndrome)、唐氏綜合癥(Down Syndrome)、克蘭菲特爾綜合癥(Klinefelter Syndrome)、麻瘋病、帕瑟氏疾病(Perthe’s disease)、青春特發(fā)性疫柱側凸、嬰兒的發(fā)作多系統(tǒng)發(fā)炎性疾病、威徹斯特綜合癥(Winchester Syndrome)、曼克斯疾病(Menkes Disease)、威爾遜氏疾病(Wilson’s Disease)、局部缺血骨骼疾病(如雷卡佩氏病(Legg-Calve-Perthes disease)和區(qū)域性遷移骨質疏松癥)、貧血狀態(tài)、由類固醇引起的病狀、糖皮質激素誘發(fā)的骨質流失、肝素誘發(fā)的骨質流失、骨髓病癥、壞血病、營養(yǎng)不良、鈣缺乏癥、骨質疏松癥、骨質減少、酒精中毒、慢性肝病、經絕后狀態(tài)、慢性發(fā)炎性病狀、類風濕性關節(jié)炎、發(fā)炎性腸疾病、潰瘍性結腸炎、發(fā)炎性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn’sdisease)、月經過少、經閉、懷孕、糖尿病、甲狀腺機能亢進、甲狀腺病癥、甲狀旁腺病癥、庫欣氏病(Cushing’s disease)、肢端肥大癥、性腺低能癥、固定化或廢棄、反射性交感神經營養(yǎng)不良綜合癥、區(qū)域性骨質疏松癥、骨軟化、與關節(jié)移位相關的骨質流失、HIV相關骨質流失、與生長激素損失相關骨質流失、與囊腫性纖維化相關骨質流失、化學療法相關的骨質流失、腫瘤誘發(fā)的骨質流失、癌癥相關的骨質流失、激素易消融骨質流失、多發(fā)性骨髓瘤、藥物誘發(fā)的骨質流失、神經性厭食、疾病相關面骨損失、疾病相關顱骨損失、疾病相關頜骨質流失、疾病相關顱骨骨質流失、與老化相關骨質流失、與老化相關面骨損失、與老化相關顱骨損失、鎖骨顱骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不良、纖維性結構不良、高雪氏病(Gaucher’sDisease)、血磷酸鹽 過少拘僂病、馬氏綜合癥(Marfan’s syndrome)、多發(fā)性遺傳性外生骨疣、多發(fā)性神經纖維瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、鞏膜病變、假關節(jié)、化膿性骨髓炎、牙周病、抗癩癇藥物誘發(fā)的骨質流失、原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺機能亢進、家族性甲狀旁腺機能亢進綜合癥、失重誘發(fā)的骨質流失、男性骨質疏松癥、骨關節(jié)炎、腎病性骨營養(yǎng)不良、骨骼滲透性病癥、與老化相關顱骨骨質流失、以及與航天飛行相關的骨質流失。
[0069]在一些實施方案中，受試者任選地患有(或已患有)癌癥。術語“癌癥”是指與不受控制的細胞增殖、無限制的細胞生長、以及降低的細胞死亡/細胞凋亡相關的增殖病癥。癌癥包括但不限于乳癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤、P53突變癌、以及激素依賴性腫瘤，包括但不限于結腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、成視網膜細胞瘤、成膠質細胞瘤、腸癌、睪丸癌、胃癌、神經母細胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、內皮瘤、骨母細胞瘤、破骨細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、卵巢癌、白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴球性白血病、急性髓細胞性白血病，包括成髓細胞、前髓細胞、粒單核細胞、單核細胞以及紅白血病)和慢性白血病(例如慢性髓細胞(粒細胞)白血病以及慢性淋巴細胞白血病)、骨髓發(fā)育不良綜合癥真性紅細胞增多癥、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、萬達斯曲姆氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重鏈疾病，以及實體腫瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、鱗狀細胞癌瘤、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌瘤、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝瘤、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威姆氏腫瘤(Wilm’s tumor)、子宮頸癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少枝膠質瘤以及腦膜瘤(menang1ma)。術語“轉移”和“癌轉移”本文互換使用來指癌細胞擴散至其它組織的能力。例如，“轉移至骨骼”是指某些類型的癌癥轉移至骨骼的能力，所述類型的癌癥包括但不限于乳腺、前列腺、肺、腎、甲狀腺以及黑色素瘤。
[0070]本文所述的方法還適用于其它形式的牙周病，包括與以下全身性病癥相關的牙周病:如心血管疾病、中風、肺病、發(fā)炎性疾病以及全身性紅斑狼瘡；與以下代謝障礙相關的牙周病:如糖尿?。灰约芭c與例如絕經期相關的激素變化相關的牙周病。使用某些藥物(如抗驚厥藥、鈣離子通道封閉劑以及環(huán)孢素)也可升高牙齦增生或牙周病風險，包括由例如HIV引起的免疫系統(tǒng)病癥的某些血液學病癥也如此。尤其涵蓋用本文所述的骨硬化蛋白抑制劑治療患有上述病癥或有風險患上述病癥的受試者。
[0071]在一些實施方案中，受試者任選地患有溶骨病癥。如本文所用的術語“溶骨病癥”是指由破骨細胞活性增加引起的任何病狀，破骨細胞為造成骨吸收的細胞。術語“骨質溶解”和“溶骨骨質流失”互換使用來指破骨細胞介導的骨吸收或與溶骨病癥相關的骨質流失。溶骨病癥發(fā)生在具有發(fā)展溶骨病癥傾向的受試者中，或其發(fā)生在患有因刺激破骨細胞活性而導致或促成溶骨病癥的疾病的受試者中。在一些實施方案中，溶骨病癥為溶骨骨質流失。在其它實施方案中，溶骨病癥為癌癥轉移誘發(fā)的溶骨骨質流失。在其它實施方案中，溶骨病癥為代謝骨骼疾病，包括但不限于內分泌病(例如皮質醇過多癥、性腺低能癥、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、以及甲狀腺機能亢進)；營養(yǎng)缺乏，包括但不限于佝僂病、骨軟化、壞血病以及營養(yǎng)不良；骨質疏松癥；藥物使用，包括糖皮質激素(糖皮質激素誘發(fā)的骨質疏松癥)、肝素以及酒 精；慢性疾病，包括吸收不良綜合癥；慢性腎衰竭，包括腎病性骨營養(yǎng)不良；慢性肝病，包括肝骨營養(yǎng)不良；遺傳性疾病，包括成骨不全和高胱氨酸尿癥；以及與關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬關節(jié)炎、纖維性結構不良、牙周病以及佩吉特氏病相關的骨骼發(fā)炎。
[0072]術語“轉移誘發(fā)的溶骨骨質流失”和“癌癥轉移誘發(fā)的溶骨骨質流失”本文互換使用來指由癌細胞轉移至骨骼產生的骨質溶解或溶骨骨質流失。術語“癌癥轉移誘發(fā)的破骨細胞活化”本文用來指已轉移至骨骼的癌細胞誘發(fā)破骨細胞活化的能力。
[0073]本文所述的方法包括施用一定量的“骨硬化蛋白抑制劑”。如本文所用的術語“骨硬化蛋白抑制劑”意指抑制骨上的骨硬化蛋白的生物活性的任何分子，如由以下各項的變化所測量:骨骼礦化、骨骼密度、骨骼高度、對骨母細胞和/或破骨細胞的作用、骨形成標記物、骨吸收標記物、骨母細胞活性標記物和/或破骨細胞活性標記物。此類抑制劑可通過結合骨硬化蛋白或其受體或結合搭配物來起作用。這個類別中的抑制劑包括“骨硬化蛋白結合劑”，例如像抗體或基于肽的分子?！肮怯不鞍滓种苿边€指結合骨硬化蛋白并且抑制其活性的任選地分子量小于約1000道爾頓的小有機化學化合物。抑制劑或者可通過抑制骨硬化蛋白的表達起作用。這一類別中的抑制劑包括結合骨硬化蛋白DNA或mRNA且抑制骨硬化蛋白表達的多核苷酸或寡核苷酸，包括但不限于反義寡核苷酸、抑制性RNA、DNA酶(脫氧核糖酶)、核糖酶、適體或抑制骨硬化蛋白表達的其醫(yī)藥學上可接受的鹽。
[0074]“骨硬化蛋白結合劑”結合骨硬化蛋白或其一部分以便封閉或減弱人骨硬化蛋白與一種或多種配體的結合。骨硬化蛋白，SOST基因的產物，不存在于硬化性骨化病中，硬化性骨化病為一種特征在于骨骼過度生長和強密度骨的骨骼疾病(Brunkow等人，Am.J.Hum.Genet.，68:577-589 (2001) ；BaIemans 等人，Hum.Mol.Genet.，10:537-543(2001))。人骨硬化蛋白的氨基酸序列由Brunkow等人報告且以SEQ ID NO:1公開于美國專利公布號20070110747(所述專利公布的骨硬化蛋白結合劑的描述和序列表全部并入)。重組人骨硬化蛋白 /SOST 可購自 R&D Systems (Minneapolis, Minn., USA ；2006 目錄號 1406-ST-025)。另外，重組小鼠骨硬化蛋白/SOST可購自R&D Systems (Minneapolis, Minn., USA ；2006目錄號1589-ST-025)。研究級骨硬化蛋白結合單克隆抗體可購自R&DSystems (Minneapolis, Minn.,USA ;小鼠單克隆:2006 目錄號 MAB1406 ;大鼠單克隆:2006目錄號MAB1589)。美國專利號6，395，511和6，803，453以及美國專利公布號20040009535和20050106683總體上涉及抗骨硬化蛋白抗體。適合用于本發(fā)明的上下文的骨硬化蛋白結合劑的實例還描述于美國專利公布號20070110747和20070072797中，所述公布特此以引用的方式并入。關于產生骨硬化蛋白結合劑的材料和方法的另外的信息可見于美國專利公布號20040158045 (特此以引用的方式并入)。
[0075]本發(fā)明的骨硬化蛋白結合劑優(yōu)選為抗體。術語“抗體”是指完整抗體或其結合片段?？贵w可包含完全抗體(免疫球蛋白)分子(包括具有全長重鏈和/或輕鏈的多克隆、單克隆、嵌合、人源化和/或人形式)，或包含其抗原結合片段。抗體片段包括F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fe以及Fd片段,并且可并入單結構域抗體(例如奈米抗體)、單鏈抗體、最大抗體、微型抗體、內抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、v-NAR以及bis-scFv(參見例如Hollinger和 Hudson, Nature B1technology, 23 (9): 1126-1136 (2005))。抗體多肽，包括纖連蛋白多肽單抗體，也公開于美國專利號6，703，199中。其它抗體多肽公開于美國專利公布號20050238646中。美國專利號6，395，511 和6，803，453以及美國專利公布號20040009535和20050106683(其抗骨硬化蛋白抗體的公開內容以引用的方式全部并入)總體上涉及抗骨硬化蛋白抗體。人骨硬化蛋白的氨基酸序列闡述于序列表的SEQ ID NO:1中且以美國專利公布號20070110747的SEQ ID NO:1提供(所述專利公布的骨硬化蛋白和骨硬化蛋白結合劑的描述和序列表全部并入)。關于產生抗骨硬化蛋白抗體的材料和方法的另外信息可見于美國專利公布號20040158045(特此以引用的方式全部并入)。
[0076]抗體片段可為合成或基因工程化蛋白質。例如，抗體片段包括由輕鏈可變區(qū)組成的分離的片段、由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段，以及輕鏈與重鏈可變區(qū)經由肽連接子連接的重組單鏈多肽分子(scFv蛋白質)。
[0077]抗體片段的另一形式為包含抗體的一個或多個互補決定區(qū)(OTR)的肽。⑶R(還稱為“最小識別單位”或“高變區(qū)”)通過例如構筑編碼所關注的⑶R的多核苷酸獲得。此類多核苷酸例如通過利用聚合酶鏈反應使用抗體產生細胞的mRNA作為模板合成可變區(qū)來制備(參見例如 Larrick 等人，Methods: A Compan1n to Methods in Enzymology, 2:106 (1991)；Courtenay-Luck, “Genetic Manipulat1n of Monoclonal Antibodies，，，見 MonoclonalAntibodies Product1n, Engineering and Clinical Applicat1n, Ritter 等人(編)，第 166 頁,Cambridge University Press (1995);以及 Ward 等人，“Genetic Manipulat1nand Express1n of Antibodies”， 見 Monoclonal Antibodies: Principles andApplicat1ns, Birch 等人(編)，第 137 頁，ffiley-Liss, Inc.(1995))。
[0078]抗骨硬化蛋白抗體可結合SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白或其天然存在的變異體，親和力(Kd)為小于或等于1χ10_7Μ、小于或等于1χ10_8Μ、小于或等于1χ10_9Μ、小于或等于ΙχΙΟ,Μ、小于或等于1χ10_ηΜ、或小于或等于1χ10_12Μ。親和力利用多種技術測定，所述技術的一個實例為親和力ELISA分析。在不同的實施方案中，親和力通過BIAcore測定來測定。在不同的實施方案中，親和力通過動力學方法測定。在不同的實施方案中，親和力通過平衡/溶液法測定。美國專利公布號20070110747含有適于測定抗體對骨硬化蛋白的親和力(Kd)的親和力測定的其它描述。
[0079]在一些或任何實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段結合包含SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的骨硬化蛋白多肽，并結合SEQ ID NO: 6 (CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC ；對應于SEQ ID NO:1的氨基酸86-111)的序列。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO:1的氨基酸57-146的骨硬化蛋白多肽。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO:1的氨基酸89-103和/或SEQ ID NO:1的氨基酸137-151的骨硬化蛋白多肽。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的骨硬化蛋白多肽并且結合SEQ ID NO:1內的以下中至少一者的序列:SEQ ID NO: 2 (DVSEYSCRELHFTR ；對應于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 51-64)、SEQ ID NO: 3 (SAKPVTELVC SGQCGPAR ;對應于 SEQ IDNO:1 的氨基酸 73-90)、SEQ ID NO:4 (WWRPSGPDFRCIPDRYR ;對應于 SEQ ID NO:1 的氨基酸101-117) ；SEQ ID NO: 5 (LVASCKCKRLTR ;對應于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 138-149)、SEQ IDNO: 70 (SAKPVTELVCSGQC ;對應于 SEQ ID NO:1 的氨基酸73-86)、SEQ ID NO: 71 (LVASCKC ;對應于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 138-144)、SEQ ID NO: 72 (ClRE LHFTR ;對應于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 57-64)、或 SEQ IDNO:73(CIPDRYR ;對應于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 111-117)。例如，在一個方面，抗骨硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO: 2-5 (和/或SEQ ID NO: 70-73)(任選地呈其天然三維構形)的SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的亞區(qū)。任選地,抗骨硬化蛋白抗體結合由SEQID NO:2, SEQ I D NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73中的一個或多個組成的肽(例如由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4 以及 SEQ IDNO:5 組成的肽或由 SEQ ID NO:70,SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72 以及SEQ ID NO: 73組成的肽)。
[0080]在一些或任何實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體結合具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:5的氨基酸序列的骨硬化蛋白多肽，其中SEQ IDN0:2與4在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111處通過二硫鍵連接，并且SEQ ID N0:3與5通過以下中的至少一者連接:(a)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142處的二硫鍵，以及(b)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144處的二硫鍵；所述多肽可保留SEQ ID NO:1的人骨硬化蛋白的相應多肽區(qū)的三級結構?；蛘呋蛄硗?，骨硬化蛋白結合劑(例如抗骨硬化蛋白抗體)結合具有 SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72 以及 SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO: 72與73在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111處通過二硫鍵連接，并且SEQ ID NO: 70與71通過以下中的至少一者連接:(a)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142處的二硫鍵，以及(b)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144處的二硫鍵。
[0081]任選地，抗骨硬化蛋白抗體結合基本上由SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDN0:4以及SEQ ID NO:5的氨基酸序列組成的肽，其中SEQ IDN0:2與4在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111處通過二硫鍵連接，并且SEQ ID N0:3與5通過以下中的至少一者連接:(a)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142處的二硫鍵，以及(b)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144處的二硫鍵。
[0082]任選地，抗骨硬化蛋白抗體結合基本上由SEQ ID NO:1的多截斷人骨硬化蛋白組成的多肽，其中(a)所述多肽無SEQ ID NO:1的氨基酸1-50、65-72、91_100、118-137以及 150-190，或(b)所述多肽無 SEQ ID NO:1 的氨基酸 1_56、65-72、87_110、118-137 以及145-190。
[0083]在一些或任何實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體結合具有SEQ ID NO:70, SEQ IDN0:71、SEQ ID NO: 72以及SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO: 72與73在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111處通過二硫鍵連接，并且SEQ ID NO: 70與71通過以下中的至少一者連接:(a)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142處的二硫鍵，以及(b)在參考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144處的二硫鍵。
[0084]在一些或任何實施方案中，多肽保多留SEQ ID NO:1的人骨硬化蛋白的相應肽區(qū)的
三級結構。
[0085]在一些或任何實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體結合:[0086](i)人骨硬化蛋白的包含 SEQ ID NO:1 的 51_64、73_90、101-117 以及 138-149 的一部分，其中所述部分具有以下至少一者、至少兩者或所有三者:
[0087](a)氨基酸57與111之間的二硫鍵；
[0088](b)氨基酸82與142之間的二硫鍵；以及
[0089](c)氨基酸86與144之間的二硫鍵；或
[0090](ii)人骨硬化蛋白的包含 SEQ ID NO:1 的 57_64、73_86、111-117 以及 138-144 的一部分，其中所述部分具有以下至少一者、至少兩者或所有三者: [0091 ] (a)氨基酸57與111之間的二硫鍵；
[0092](b)氨基酸82與142之間的二硫鍵；以及
[0093](c)氨基酸86與144之間的二硫鍵。
[0094]在一些或任何實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體還結合SEQ ID NO:6的表位。
[0095]本文所述的方法中使用的抗骨硬化蛋白抗體優(yōu)選在美國專利公布號2007/0110747中所述的基于細胞的測定中和/或在美國專利公布號20070110747中所述的體內分析中調節(jié)骨硬化蛋白功能，和/或結合美國專利公布號2007/0110747中所述的一個或多個表位和/或交叉封閉美國專利公布號2007/0110747中所述的抗體中的一個的結合和/或通過美國專利公布號2007/0110747中所述的抗體中的一個交叉封閉結合骨硬化蛋白(其表征抗骨硬化蛋白抗體的測定的描述以引用的方式全部并入)。
[0096]在不同的方面，當與每孔的骨硬化蛋白摩爾數(shù)相比，每孔存在少于6倍過量的摩爾數(shù)的骨硬化蛋白結合位點時，在基于MC3T3細胞的礦化測定中，所述抗骨硬化蛋白抗體能夠中和人骨硬化蛋白。使用培養(yǎng)物中的骨母細胞譜系細胞(原代細胞或細胞系)礦化作為骨形成的體外模型。示例性基于細胞的礦化測定描述于美國專利公布號20070110747的例如實施例8(特此以引用的方式并入)中。MC3T3-E1細胞(Sudo等人，J.Cell B1l., 96:191-198(1983))和原始細胞系的亞克隆在分化劑存在下生長之后可形成培養(yǎng)物中的礦物。此類亞克隆包括MC3T3-El-BF(Smith等人，J.B1l.Chem.，275:19992-20001(2000))。對于 MC3T3-E1-BF 亞克隆以及原始 MC3T3-E1 細胞，骨硬化蛋白可抑制一個或多個導致且包括礦物沉積的一系列事件(即骨硬化蛋白抑制礦化)。能夠中和骨硬化蛋白抑制活性的抗骨硬化蛋白抗體允許培養(yǎng)物在骨硬化蛋白存在下礦化，以致例如磷酸鈣(作為鈣加以測量)沉積與僅骨硬化蛋白(即無抗體)治療組中所測量的鈣量相比統(tǒng)計上顯著增加。
[0097]當以測定特定抗骨硬化蛋白抗體(或其它骨硬化蛋白抑制劑)是否可以中和骨硬化蛋白為目標進行測定時，測定中所用的骨硬化蛋白的量理想地為與無骨硬化蛋白組中所測量的鈣量相比，在僅骨硬化蛋白組中引起統(tǒng)計上顯著的至少70%的磷酸鈣(作為鈣加以測量)沉積減少的骨硬化蛋白的最低量?？构怯不鞍字泻涂贵w定義為與僅骨硬化蛋白(即無抗體)治療組中測量的鈣量相比引起磷酸鈣(作為鈣加以測量)沉積統(tǒng)計上顯著增加的抗體。為測定抗骨硬化蛋白抗體是中和性的還是非中和性的，用于測定中的抗骨硬化蛋白抗體的量需要使得，與每孔骨硬化蛋白摩爾數(shù)相比每孔骨硬化蛋白結合位點的摩爾數(shù)為過量的。取決于抗體效能而定，可能需要的倍數(shù)過量可為24、18、12、6、3或1.5，并且所屬領域的技術人員熟悉測試超過一個濃度的結合劑(抗體)的常規(guī)實踐。例如，當與每孔的骨硬化蛋白摩爾數(shù)相比，每孔存在少于六倍過量的摩爾數(shù)的骨硬化蛋白結合位點時，極有效的抗骨硬化蛋白中和抗體將中和骨硬化蛋白。不太有效的抗骨硬化蛋白中和抗體將僅在
12、18或24倍過量下中和骨硬化蛋白。
[0098]在基于細胞的分析如骨骼特異性堿性磷酸酶測定(例如國際專利公布號WO2008/115732和美國專利7，744，874(基于細胞的測定和抗骨硬化蛋白抗體的描述以引用的方式全文并入本文中)中描述的骨骼特異性堿性磷酸酶測定)中，抗骨硬化蛋白抗體中和人骨硬化蛋白的IC5tl任選地為10nM或更小，或75nM或更小，或50nM或更小，或25nM或更小。骨骼特異性堿性磷酸酶測定基于骨硬化蛋白降低多潛能鼠類細胞系C2C12中BMP-4和Wnt3a刺激的堿性磷酸酶含量的能力。根據WO 2008/115732，中和抗骨硬化蛋白抗體在此測定中介導堿性磷酸酶活性的劑量依賴性增加。基于細胞的測定的示例性方案提供于實施例I中。
[0099]或者或 另外，在HEK293細胞系中在基于細胞的Wnt信號傳導測定如國際專利公布號TO 2009/047356中描述的STF報告基因的牽涉Wntl介導誘發(fā)的Wnt測定(基于細胞的測定和抗骨硬化蛋白抗體的論述以引用的方式并入)中，抗骨硬化蛋白抗體中和人骨硬化蛋白的IC5tl為10nM或更小(例如75nM或更小，或50nM或更小)?；蛘呋蛄硗猓贛C3T3細胞中的BMP2誘發(fā)的礦化測定如描述于例如國際專利公布號WO 2009/047356中的礦化測定中，抗骨硬化蛋白抗體中和人骨硬化蛋白的IC5tl為500nM或更小(例如250nM或更小、150nM或更小、10nM或更小、或50nM或更小)。示例性方案提供于實例I中。
[0100]適合用于本發(fā)明的上下文的抗骨硬化蛋白抗體的實例描述于美國專利公布號2007/0110747和2007/0072797中，所述公布特此以引用的方式并入。在本發(fā)明的一個實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體交叉封閉至少一種以下抗體與骨硬化蛋白結合:Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2, Ab_3、Ab_4、Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab-12、Ab-13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 以及Ab-24(全部描述于美國專利公布號20070110747中)。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗體被至少一種以下抗體交叉封閉與骨硬化蛋白的結合:Ab_A、Ab-B> Ab-C> Ab-D> Ab-1> Ab_2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24 (全部描述于美國專利公布號20070110747 中)。術語“交叉封閉(cross-block>cross-blocked 以及 cross-blocking) ”本文互換使用以意指抗體干擾其它抗體與骨硬化蛋白的結合的能力?？贵w能夠干擾另一者與骨硬化蛋白結合的程度且因此是否可認為其交叉封閉可使用競爭結合測定來確定。在本發(fā)明的一些方面，交叉封閉抗體或其片段使參考抗體的硬化蛋白結合減少了約40 %至約100%、如約60%至約100%、尤其70%至100%、且更尤其80%至100%。檢測交叉封閉的尤其適合的定量測定使用利用表面等離子體共振技術測量相互作用程度的Biacore機器。另一適合的定量交叉封閉測定使用基于ELISA的方法測量抗體之間結合骨硬化蛋白的競爭。
[0101]在一些或任何實施方案中，抗骨硬化蛋白抗體交叉封閉包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白與SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的結合和/或被包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白交叉封閉與SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的結合，其中所述包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白包含本文公開的⑶R序列，如以下三組⑶R序列中的一者:a)SEQ ID NO:284的⑶R_L1、SEQID NO:285 的 CDR-L2、SEQ ID NO:286 的 CDR_L3、SEQ ID NO:296 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:297 的CDR-H2、以及 SEQ ID NO:298 的 CDR-H3 ；b)SEQ ID NO:48 的 CDR-Ll、SEQ ID NO:49 的 CDR-L2、SEQ IDN0:5(^3CDR-L3、SEQ ID NO:45 的 CDR-Hl、SEQ ID NO: 46 的 CDR-H2、以及 SEQ ID NO:47的 CDR-H3 ;或 c)SEQ ID NO:42 的 CDR-LU SEQ ID NO:43 的 CDR_L2、SEQ ID NO:44 的 CDR-L3、SEQ ID NO:39 的 CDR-HU SEQ ID NO:40 的 CDR-H2、以及 SEQ ID NO:41 的 CDR-H3?；蛘呋蛄硗猓构怯不鞍卓贵w交叉封閉包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白與SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的結合和/或被包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白交叉封閉與SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的結合，其中所述包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白包含以下⑶R:SEQ ID NO:245的CDR-HU SEQ ID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQ ID NO:78 的 CDR-LU SEQID NO:79 的 CDR-L2 以及 S EQ ID NO:80 的 CDR-L3。
[0102]或者或另外，抗骨硬化蛋白抗體交叉封閉包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白與SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的結合和/或被包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白交叉阻斷與SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的結合，其中所述包含全長重鏈和輕鏈的免疫球蛋白包含以下CDR:SEQ ID NO:269 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:270 的 CDR-H2、SEQ ID NO:271 的 CDR-H3、SEQ IDNO: 239 的 CDR-Ll、SEQ ID NO: 240 的 CDR-L2 以及 SEQ ID NO: 241 的 CDR-L3。
[0103]適合的抗骨硬化蛋白抗體和其片段的實例包括具有本文特定公開且美國專利公布號 20070110747 中所公開的 CDR-Hl、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3 中的一或多個的抗體和抗體片段。⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-L1、⑶R-L2以及⑶R-L3的區(qū)中的至少一者可具有至少一個氨基酸取代，其限制條件為抗體保留未經取代的CDR的結合特異性。示例性抗骨硬化蛋白抗體包括但不限于美國專利公布號20070110747的Ab_A、Ab_B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab_3、Ab_4、Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24。
[0104]另外，抗骨硬化蛋白抗體可包含至少一個與選自以下的⑶R具有至少75%—致性(例如 100%—致性)的 CDR序列:SEQ ID NO: 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、353、358、359以及360，其提供于序列表中且公開于美國專利公布號20070110747中。抗骨硬化蛋白抗體優(yōu)選包含至少一個與選自以下的⑶R具有至少75%—致性的⑶R序列:SEQ ID NO:245,246、247、78、79、80、269、270、271、239、240以及241，其全部提供于序列表中且描述于美國專利公布號20070110747中。如美國專利公布號20070110747所述，抗骨硬化蛋白抗體可包含:a) SEQ ID N0:54、55 以及 56 的 CDR 序列和 SEQ ID N0:51、52 以及 53 的 CDR 序列；b)SEQID N0:60、61 以及 62 的 CDR序列和 SEQ ID NO: 57、58 以及 59 的 CDR序列；c) SEQ ID NO: 48、49以及50的CDR序列和SEQ ID NO: 45、46以及47的CDR序列；d) SEQ ID NO: 42、43以及44的CDR 序列和 SEQ ID NO: 39,40 以及 41 的 CDR 序列；e)SEQ ID N0:275、276 以及 277 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 287、288 以及 289 的 CDR序列；f) SEQ ID NO: 278、279 以及 280 的 CDR序列和SEQ ID NO: 290、291 以及 292 的 CDR 序列；g) SEQ ID NO: 78、79 以及 80 的 CDR 序列和 SEQ IDNO: 245、246 以及 247 的 CDR序列;h) SEQ ID NO: 81、99 以及 100 的 CDR序列和 SEQ ID NO: 248、249 以及 250 的 CDR 序歹Ij ；i)SEQ ID NO: 101、102 以及 103 的 CDR 序列和 SEQ ID NO:251、252以及 253 的 CDR 序歹Ij ；j)SEQ ID NO: 104、105 以及 106 的 CDR 序列和 SEQ ID NO:254、255 以及 256 的 CDR 序歹Ij ；k) SEQ ID NO: 107、108 以及 109 的 CDR 序列和 SEQ ID NO:257、258 以及259 的 CDR序歹Ij ；1)SEQ ID NO: 110、111 以及 112 的 CDR序列和 SEQ IDN0:260、261 以及 262的 CDR 序歹Ij ；m) SEQ ID NO: 281、282 以及 283 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 293、294 以及 295 的CDR 序歹Ij ；n) SEQ ID NO: 113、114 以及 115 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 263,264 以及 265 的 CDR序歹Ij ；o)SEQ ID NO: 284,285 以及 286 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 296,297 以及 298 的 CDR 序列；p)SEQ ID N O: 116、237 以及 238 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 266、267 以及 268 的 CDR 序列；q) SEQ ID NO: 239,240 以及 241 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 269,270 以及 271 的 CDR 序列；)SEQ ID NO: 242、243 以及 244 的 CDR 序列以及 SEQ ID NO: 272、273 以及 274 的 CDR 序列；或s)SEQ IDNO:351、352 以及 353 的 CDR 序列和 SEQ IDNO:358、359 以及 360 的 CDR 序列。
[0105]抗骨硬化蛋白抗體可包含至少一個與選自以下的⑶R具有至少75%—致性(例如 100%—致性)的 CDR 序列:CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 245中給出的序列，CDR-H2具有SEQ ID NO: 246中給出的序列，CDR-H3具有SEQ ID NO:247中給出的序列，CDR-Ll具有SEQ ID NO:78中給出的序列，CDR-L2具有SEQ ID NO: 79中給出的序列，并且CDR-L3具有SEQ ID NO:80中給出的序列，全部提供于序列表中并且描述于美國專利公布號20070110747中。在不同的方面，抗骨硬化蛋白抗體包含兩個⑶R或六個⑶R。任選地，抗骨硬化蛋白抗體包含含有SEQ ID NO: 378的重鏈(例如兩個重鏈)的全部或一部分以及含有SEQ ID N0376的輕鏈(例如兩個輕鏈)的全部或一部分。
[0106]抗骨硬化蛋白抗體可包含至少一個與選自以下的⑶R具有至少75%—致性(例如 100%—致性)的 CDR 序列:CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 269中給出的序列，CDR-H2具有SEQ ID NO: 270中給出的序列，CDR-H3具有SEQ IDNO:271中給出的序列，CDR-Ll具有SEQ ID NO:239中給出的序列，CDR-L2具有SEQ ID NO: 240中給出的序列，并且CDR-L3具有SEQ ID N0241中給出的序列，全部提供于序列表中并且描述于美國專利公布號20070110747中。在不同的方面，抗骨硬化蛋白抗體包含至少兩個⑶R或六個⑶R。任選地，抗骨硬化蛋白抗體包含含有SEQ ID NO: 366的重鏈(例如兩個重鏈)的全部或一部分以及含有SEQ ID N0364的輕鏈(例如兩個輕鏈)的全部或一部分.[0107]或者，抗骨硬化蛋白抗體可具有重鏈，所述重鏈包含⑶R的H1、H2以及H3并且包含具有SEQ ID NO: 137、145或392中所提供的序列或其變體的多肽，其中⑶R分別與SEQ IDNO: 245,246以及247具有至少75%—致性(例如100%—致性)；以及輕鏈，所述輕鏈包含⑶R的L1、L2及L3并且包含具有SEQ ID NO: 133或141中所提供的序列或其變體的多肽，其中CDR分別與SEQ ID N0:78、79以及80具有至少75%—致性(例如100%—致性)(如美國專利公布號20070110747中所述)。
[0108]抗骨硬化蛋白抗體可具有重鏈，所述重鏈包含⑶R的H1、H2以及H3并且包含具有SEQ ID NO: 335、331、345或396中所提供的序列或任何上述者的變體的多肽，其中⑶R分別與SEQ ID NO:269,270以及271具有至少75%—致性(例如100%—致性)；以及輕鏈，所述輕鏈包含⑶R的L1、L2以及L3并且包含具有SEQ ID NO:334或341中所提供的序列或任何上述者的變體的多肽，其中⑶R分別與SEQ ID NO:239,240以及241具有至少75% —致性(例如100%—致性)(如美國專利公布號20070110747中所述)。涵蓋重鏈與輕鏈序列的所有組合(例如包含SEQ ID NO:335的重鏈和包含SEQ ID NO:334的輕鏈；包含SEQ IDNO: 331的重鏈和包含SEQ ID NO: 334或341的輕鏈；以及包含SEQ ID NO: 345或396的重鏈和包含SEQ ID NO: 341的輕鏈)。
[0109]或者，抗骨硬化蛋白抗體具有包含具有SEQ ID NO: 137中提供的序列的多肽的重鏈、以及包含具有SEQ ID NO: 133中提供的序列的多肽的輕鏈；包含具有SEQ ID NO: 145或392中提供的序列的多肽的重鏈、以及包含具有SEQ ID NO: 141中提供的序列的多肽的輕鏈；包含具有SEQ ID N0:335中提供的序列的多肽的重鏈、以及包含具有SEQ IDN0:334中提供的序列的多肽的輕鏈；包含具有SEQ ID NO: 331中提供的序列的多肽的重鏈、以及包含具有SEQ ID NO:341中提供的序列的多肽的輕鏈；包含具有SEQ ID NO:345或396中提供的序列的多肽的重鏈、以及包含具有SEQ IDN0:341中提供的序列的多肽的輕鏈(如美國專利公布號200701107 47中所述)。
[0110]抗骨硬化蛋白抗體的實例還包括但不限于國際專利公布號WO 2008/092894、WO2008/115732、WO 2009/056634、WO 2009/047356、WO 2010/100200、WO 2010/100179、WO2010/115932以及WO 2010/130830中所公開的抗骨硬化蛋白抗體(各以引用的方式全部并入本文中)，如包含國際專利公布號WO 2008/115732的SEQ ID NO: 20-25 (本文中的SEQ IDN0:416-421)的CDR的抗骨硬化蛋白抗體、包含國際專利公布號WO 2008/115732的SEQ IDN0:26-31(本文中的SEQ ID NO:422-427)的CDR的抗骨硬化蛋白抗體、包含國際專利公布號WO 2008/115732 的 SEQ ID NO: 32-37 (本文中的 SEQ ID NO:428-433)的 CDR 的抗骨硬化蛋白抗體、包含國際專利公布號WO 2009/047356的SEQ ID NO:4、15、26、37、48以及59(分別為本文中的SEQ ID N0:443、454、465、476、487以及498)的CDR的抗骨硬化蛋白抗體、或包含國際專利公布號 WO 2010/130830 的 SEQ ID NO: 135-143、153-161、或 171-179 中的至少一者(分別為本文中的SEQ ID NO: 745-753、763-771、781-789)的氨基酸序列的抗骨硬化蛋白抗體。
[0111]或者，本文所述的方法包括施用除抗骨硬化蛋白抗體以外的骨硬化蛋白抑制劑。此類藥劑可對SOST或骨硬化蛋白直接或間接起作用。涵蓋用于本文所述的方法的骨硬化蛋白抑制劑包括美國專利公布號2003/0229041(特此整個公開內容以引用的方式并入，尤其著重地描述了骨硬化蛋白抑制劑)中所述的骨硬化蛋白抑制劑。例如，適用于調節(jié)SOST表達和骨硬化蛋白活性的藥劑包括但不限于類固醇(如對應于美國專利公布號2003/0229041的式I的那些)、生物堿、萜類化合物、類肽以及合成化學物質。在一些實施方案中，SOST拮抗劑或激動劑可結合糖皮質激素受體。例如，地塞米松傾向于消除BMP-4和BMP-6對SOST表達的刺激作用。其它化學實體，包括糖皮質激素類似物、膽鹽(如對應于美國專利公布號2003/0229041的式3的那些)以及前列腺素(如對應于美國專利公布號2003/0229041的式2的那些)也調節(jié)骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白對SOST表達的作用，且涵蓋使用于本文所述的方法中。
[0112]可根據本文所述的方法使用的骨硬化蛋白表達抑制劑包括但不限于抑制核酸，包括其藥學上可接受的鹽，例如鈉鹽。在一些實施方案中，如本文別處描述的抑制核酸選自由以下組成的組:反義寡核苷酸、核糖酶、外部引導序列(EGS)寡核苷酸、SiRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物如siRNA化合物、修飾的堿基/鎖定核酸(LNA)、拮抗分子(antagomir)、肽核酸(PNA)、以及與目標核酸的至少一部分雜交且調節(jié)其功能的其它寡聚化合物或寡核苷酸模擬劑。在一些實施方案中，抑制劑核酸為單鏈或雙鏈的。在一些實施方案中，抑制核酸為反義寡核苷酸、修飾的堿基/鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PM)、阿拉伯糖核酸(ANA)(如例如PCT公布號W099/67378中所述)；2’ -氟-D-阿拉伯糖核酸(FANA)(如例如 Lon 等人，B1chem.，41:3457-3467，2002 以及 Min 等人，B10rg.Med.Chem.Lett.，12:2651-2654，2002中所描述；其公開內容以全文引用的方式并入本文中)；磷二酰胺嗎啉代寡聚物(PMO)(例如 Iverson, Curr.0pin.Mol.Ther.，3: 235-238，2001 ；以及Wang等人，J.Gene Med.，12:354-364, 2010中所描述；其公開內容以引用的方式全部并入本文中)；乙烯橋聯(lián) 核酸(如例如國際專利公布號WO 2005/042777 ;Morita等人，NucleicAcid Res.，增刊 1:241-242，2001 ；Surono 等人，Hum.Gene Ther.，15:749-757，2004 ；Koizumi, Curr.0pin.Mol.Ther., 8:144-149，2006 ；以及 Horie 等人，Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf), 49:171-172, 2005中所描述；其公開內容以引用的方式全部并入本文中)；2’ -O, 4’ -C-乙烯橋聯(lián)核酸、核糖酶、外部引導序列(EGS)寡核苷酸、微RNA(miRNA)、小的臨時RNA (StRNA)、以及單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物或siRNA。在一些實施方案中，抑制核酸包含至少一個核苷酸和/或核苷修飾(例如具有修飾的骨架或修飾的糖部分的寡聚核酸)。
[0113]用于本文所述的方法中的特定骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的活性可以多種方式測量，包括上述用于檢測骨骼礦物含量或骨骼密度增加的方法。骨硬化蛋白抑制劑調節(jié)骨骼質量的能力可由體重或利用其它方法計算(參見 Guinness-Hey, Metab.Bone Dis.Relat.Res., 5:177-181 (1984))。本領域中使用動物和特定的動物模型測試醫(yī)藥組合物和方法對例如骨質流失、骨吸收、骨形成、骨骼強度或骨礦化參數(shù)的作用。此類模型的實例包括切除卵巢的大鼠模型(Kalu，Bone andMineral, 15:175-192(1991) ；Frost 以及 Jee，Bone and Mineral, 18:227-236(1992);以及Jee 以及 Yao, J.Musculoskel.Neuron.1nteract., 1:193-207 (2001))。本文所述的測量骨硬化蛋白結合劑活性的方法還可用于測定其它骨硬化蛋白抑制劑的功效。
[0114]或者，可基于調節(jié)骨骼標記物含量的能力選擇骨硬化蛋白抑制劑。骨骼標記物為骨骼重塑過程中產生的產物且由骨骼、骨母細胞和/或破骨細胞釋放。骨吸收和/或骨形成“標記物”含量的波動暗示骨骼重塑/塑造的變化。國際骨質疏松癥基金會(1F)推薦使用骨骼標記物監(jiān)測骨骼密度療法(參見例如Delmas等人，Osteoporos Int.,增刊.6:S2-17(2000)，以引用的方式并入本文中)。指示骨吸收(或破骨細胞活性)的標記物包括例如C-端肽(例如I型膠原蛋白的C末端端肽(CTX)或血清交聯(lián)的C-端肽)、N-端肽(I型膠原蛋白的N末端端肽(NTX))、脫氧吡啶啉(DB))、吡啶啉、尿羥脯氨酸、半乳糖羥賴氨酸、以及酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶(例如血清酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶同功異型物5b)。骨形成/礦化標記物包括但不限于骨骼特異性堿性磷酸酶(BSAP)、I型原膠原的N末端和C末端延伸釋放的肽(P1NP、PICP)、以及骨鈣素(OstCa)。數(shù)種試劑盒可自商業(yè)上購得用于檢測并且定量臨床樣品(如尿和血液)中的標記物。
[0115]施用涂徑
[0116]骨硬化蛋白抑制劑優(yōu)選以可包含載體、賦形劑或稀釋劑的生理學上可接受(例如醫(yī)藥)組合物形式施用給受試者。應了解，本文所述的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)可用于制備使用本文公開的任何劑量和/或時機方案施用的藥劑。醫(yī)藥組合物和治療方法公開于美國專利公布號20050106683和2007/110747中，其以引用的方式并入本文中?！吧韺W上可接受”指分子實體和組合物在施用給人時并不產生過敏性或類似的不良反應。另外，施用給受試者的組合物可以含有超過一種骨硬化蛋白抑制劑(例如兩種抗骨硬化蛋白抗體、或骨硬化蛋白結合劑以及合成的化學骨硬化蛋白抑制劑)或骨硬化蛋白抑制劑與一或多種具有不同作用機制的治療劑組合。
[0117]適用于多種施用途徑的組合物和制劑的研發(fā)在本領域中為熟知的且討論于美國專利公布號2007/0110747中，施用途徑包括例如皮下、經口、胃腸外、靜脈內、鼻內以及肌肉內施用。例如，在某些環(huán)境中，希望皮下、胃腸外、靜脈內、肌肉內或甚至腹膜內遞送包含骨硬化蛋白結合劑的醫(yī)藥組合物。此類方法對所屬領域的技術人員為熟知的，其中一些進一步描述于例如美國專利號5，543，158,5, 641，515以及5，399，363中。適于可注射用途的說明性醫(yī)藥形式包括無菌水溶液或分散液和臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌散劑(例如參見美國專利號5，466，468)。在所有情況下，所述形式必須為無菌的且必須為達到存在可容易注射性(即，無過度粘性以防穿過注射器)的程度的流體。
[0118]在一個方面，骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)全身性施用。在一個實施方案中，對于水溶液形 式的胃腸外施用，所述溶液必要時應合適地緩沖，且所述液體稀釋劑首先用足夠生理鹽水或葡萄糖變得等張。這些特定水溶液尤其適于靜脈內、肌肉內、皮下以及腹膜內施用。例如，一個劑量可溶解于Iml等張的NaCl溶液，且添加至100ml皮下灌注流體或注射在建議的輸注部位(參見例如Remington’s PharmaceuticalSciences,第 15 版，Mack Pub.C0.，Easton, PA,第 1035-1038 頁和第 1570-1580 頁)。劑量和施用頻率的一些變化可取決于所治療受試者的病狀；患者的年齡、身高、體重以及總體健康狀況；以及任何副作用的存在而發(fā)生。另外，包含骨硬化蛋白結合劑的醫(yī)藥組合物可連同提供關于使用此類醫(yī)藥組合物的說明書的包裝材料一起而置放在容器(例如小瓶或預填充注射器)內。一般來說，此類說明書將包括有形的表達，所述表達描述試劑濃度，并且在某些實施方案內，描述可能為復原醫(yī)藥組合物所必需的賦形劑成分或稀釋劑(例如水、生理鹽水或PBS)的相對量。
[0119]在另一方面，局部施用給受試者骨硬化蛋白抑制劑。在一些或任何實施方案中，骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)根據疾病而施用至患病牙齦、骨骼或牙齒區(qū)域。在此方面，骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)任選地通過例如含有骨硬化蛋白抑制劑以及適當載體的注射器直接注射至牙齦組織中和/或施用于牙周袋。
[0120]對于局部施用方面(如直接皮下注射骨硬化蛋白抑制劑至受試者的患病牙齦區(qū)域或患病牙周袋中)，骨硬化蛋白抑制劑任選地以約0.1mg至約20mg的量施用給受試者。在一些實施方案中，骨硬化蛋白抑制劑直接施用至受感染區(qū)域，施用量為約0.lmg、0.5mg、lmg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、llmg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19或約20mg。劑量以任何間隔施用，如每周多次(例如每周兩次或三次)、每周一次、每兩周一次、每三周一次、或每四周一次。在一些或任何實施方案中，每周兩次施用約0.1mg至約20mg范圍內的劑量的骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)。抑制劑的量任選地沿受感染區(qū)域的片區(qū)以分次劑量施用，例如利用多個注射液。
[0121 ] 在一些或任何實施方案中，骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)并入凝膠、網狀物、基質或膠原蛋白海綿中，嵌入牙齒植入物或骨移植物中，或涂布在植入物上。植入物可為受試者的自身牙齒(例如因外傷而丟失)的再植入或假體植入物(由例如塑料、陶瓷、金屬制成或如WO 2004/074464中所述由干細胞制成)。
[0122]術語“網狀物”意指呈任何形式的任何材料，包括例如打結、編織(braided)、擠出、沖壓、編結、編織(woven)、非編織或其它形式，且可包括具有實質上規(guī)則和/或不規(guī)則圖案的材料。可使用非編織網狀物的實例，包括電紡材料(關于制備電紡奈米纖維材料的評論，參見 Zheng-Ming Huang 等人，Composites Science and Technology, 2003, 63:2223-2253)。網狀物可為但不限于交聯(lián)纖維網狀物、奈米纖維網狀物、網狀物織物、生物可降解的聚合物網狀物或任何上述者的組合。網狀物可為不可降解的、可降解的或生物可降解的?？山到獾木W狀物可為 可經由非生物方式(例如水解或光解作用)降解的網狀物。在不同的實施方案中，生物可降解的網狀物為可由生物系統(tǒng)通過細胞或消化酶作用或經由生物分子氧化而分解的一類網狀物。
[0123]用于經口遞送抗體的示例性凝膠制劑物描述于WO 2010/1004179中，其公開內容以引用的方式并入本文中。在一些實施方案中，凝膠為由合成或天然起源的高分子量生物相容的彈性聚合物制成的水凝膠。水凝膠的合乎要求的性質為在人體內快速響應機械應力、尤其剪切和荷載的能力。涵蓋獲自天然來源的水凝膠，因為其對于體內應用更可能為生物可降解的且生物相容的。適合的水凝膠包括天然水凝膠，例如像明膠；膠原蛋白；絲；彈性蛋白；纖維蛋白以及多糖衍生的聚合物；葡甘露聚糖凝膠；透明質酸；多糖，如交聯(lián)的含羧基的多糖，或其組合。合成的水凝膠包括但不限于由聚乙烯醇形成的那些；丙烯酰胺，如聚丙烯酸和聚(丙烯睛-丙烯酸)；聚氨基甲酸酯；聚乙二醇(例如PEG3350、PEG4500、PEG8000);硅酮；聚烯烴，如聚異丁烯和聚異戊二烯；硅酮與聚氨基甲酸酯的共聚物；氯丁橡膠；丁腈橡膠；硫化橡膠；聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)；丙烯酸酯，如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)和丙烯酸酯與N-乙烯基咯烷酮的共聚物；N-乙烯基內酰胺；聚丙烯腈或其組合。水凝膠材料可進一步按需要交聯(lián)以提供進一步強度。不同類型的聚氨基甲酸酯的實例包括熱塑性或熱固性聚氨基甲酸酯、脂族或芳族聚氨基甲酸酯、聚醚型氨基甲酸酯、聚碳酸酯-氨基甲酸酯或硅酮聚醚-氨基甲酸酯、或其組合。
[0124]在不同的實施方案中，不是直接將骨硬化蛋白抑制劑混合于凝膠中，而是將裝載骨硬化蛋白抑制劑的微球體分散在凝膠內。在一個實施方案中，微球體提供骨硬化蛋白抑制劑的持續(xù)釋放。在又一個實施方案中，生物可降解的凝膠阻止微球體釋放骨硬化蛋白抑制劑；微球體因此在其自凝膠釋放之前并不釋放骨硬化蛋白抑制劑。例如，凝膠可布署在靶組織部位(例如牙槽嵴)周圍。
[0125]本發(fā)明還涵蓋使用粘附凝膠劑以限制骨硬化蛋白抑制劑的分散。凝膠劑可布署于例如牙周袋、牙齒、牙槽骨中或布署于周圍的牙齦組織中。
[0126]在一些或任何實施方案中，骨硬化蛋白抑制劑配制成糊狀物、藥膏、蠟、洗劑、沖洗液、有/無增積劑的干燥散劑以及本領域已知的局部施用的不同的其它形式。骨硬化蛋白抑制劑還可以散劑或噴灑溶液或漱口溶液形式局部遞送。或者，骨硬化蛋白抑制劑并入傷口敷料、護墊、紗布、或施加于所關注的患病區(qū)域(例如患病牙齦區(qū)域或牙周袋)的其它裝置，所述骨硬化蛋白抑制劑自所述裝置轉移至所關注的患病區(qū)域。
[0127]組合療法
[0128]通過組合兩種或兩種以上靶向相同病原體或生物化學路徑的藥劑的病理學治療相對于單獨使用治療上有關的劑量的各藥劑有時產生更高的功效和減小的副作用。在一些情況下，藥物組合的功效相加(組合的功效近似等于各藥物單獨作用的總和)，但在其它情況下，作用可為協(xié)同的(組合功效大于單獨給予的各藥物的作用的總和)。如本文所使用，術語“組合療法”意指兩種化合物可以同時的方式(例如并行)遞送，或其中一種化合物首先施用，接著例如相繼施用第二藥劑。所要結果可為劑量接受者中一或多種癥狀的主觀減輕或客觀可識別的改善。 [0129]在一些實施方案中，施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)與使用支持骨骼再生長的材料組合，所述材料如骨移植物、骨粉、骨碎片、去礦化骨基質、骨骼支架、修復體、金屬穩(wěn)定劑或骨骼支架物質，其包含一或多種聚合物、陶瓷、牙骨質以及基于磷酸鈣的骨骼移植物取代物。本領域中已知此類材料的許多變體。
[0130]在一些或任何實施方案中，本文所述的方法或用途包括在施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)之前向受試者施用治療牙周病的標準護理療法。例如,在一些實施方案中，治療牙周病的標準護理療法為選自由Per1stat?和/或化學改性的四環(huán)素-3(CMT-3)組成的組的治療劑。在一些實施方案中，標準護理療法包含受試者感染區(qū)域的口沖洗法和/或刮牙術以及牙齦上及/或牙齦下清創(chuàng)術(例如移除微生物牙菌斑及牙垢)。在一些實施方案中，標準護理包含在施用骨硬化蛋白抑制劑之前進行口沖洗法和/或刮牙術以及感染區(qū)域清創(chuàng)術與Per1stat和/或CMT-3的組合。在一些實施方案中,所述方法包括施用標準護理療法并行施用骨硬化蛋白抑制劑。在其它實施方案中，標準護理療法相繼施用。例如，標準護理療法可在施用給受試者骨硬化蛋白抑制劑之前I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周或更長時間來施用。在優(yōu)選實施方案中，在施用骨硬化蛋白抑制劑之前，受試者的牙周病進展減緩、停止或逆轉。
[0131]在一些或任何實施方案中，本文所述的方法或用途進一步包含施用抗生素，如選自由以下組成的組的抗生素:阿莫西林、鹽酸四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、莫西沙星、環(huán)丙沙星以及甲硝噠唑。在一些實施方案中，所述方法或用途包含在施用給受試者骨硬化蛋白抑制劑之前施用給受試者抗生素。在其它實施方案中，所述方法或用途包含與施用骨硬化蛋白抑制劑并行施用給受試者抗生素。
[0132]在一些實施方案中，施用骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)以及適用于治療骨骼礦物密度減小或骨骼缺陷的第二骨骼增強治療劑。在一些實施方案中，骨骼增強治療劑選自由以下組成的組:抗再吸收藥物、成骨劑、雌激素受體調節(jié)劑(包括但不限于雷諾昔芬、巴多昔芬以及拉索昔芬)以及對破骨細胞具有抑制作用的藥物。在一些實施方案中，第二骨骼增強劑選自由以下組成的組:雙膦酸鹽(包括但不限于阿侖膦酸鈉(FOSAMAX?)、利塞膦酸鹽、伊班膦酸鈉(B0NIVA?)以及唑來膦酸
(RECLAST?));雌激素或雌激素類似物；抗RANK配體(RANKL)抗體(例如PR0LIA?)或RANKL抑制劑；維生素D或維生素D衍生物或其模擬物；鈣來源、替勃龍、降鈣素、骨化三醇；以及激素代替療法。在一些實施方案中，第二骨骼增強劑包括但不限于副甲狀腺素(PTH)或其肽片段、PTH相關蛋白質(PTHrp)、骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白、成骨素、NaF 16&激動劑、士他汀、雷奈酸鍶、抗DKKl抗體或抑制劑。在一些實施方案中，第二骨骼增強劑為Forteo?(特立帕肽)、Preotact?或 Protelos?。
[0133]在不同實施方案中，牙周病治療計劃包括在骨硬化蛋白抑制劑積極治療之后進行定期支持性跟蹤療法。在一些實施方案中，本文所述的方法或用途任選地包含進行選自由機械清創(chuàng)術、口腔衛(wèi)生增強(例如定期專業(yè)清潔(即每6個月)、日常刷洗以及清牙垢)以及施用抗生素組成的組 的支援性跟蹤療法。
[0134]在一些實施方案中，采用本文所述的骨硬化蛋白抑制劑的組合療法可在施用另外的一種或多種治療劑(例如抗生素或第二骨骼增強劑)之前或之后，間隔范圍為數(shù)分鐘至數(shù)周。例如，分開的模態(tài)在彼此的約24小時內、例如在彼此的約6-12小時內或在彼此的約1-2小時內或在彼此的約10-30分鐘內施用。在一些情況下，可能希望顯著延長治療期，其中不同模態(tài)的各自施用之間間流逝數(shù)天(2、3、4、5、6或7天)至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。尤其涵蓋組合療法的一種或兩種藥劑/療法的重復治療。
[0135]維持治療方案
[0136]還涵蓋在維持方案中使用第二骨骼增強劑和/或骨硬化蛋白抑制劑以例如預防或減緩牙槽骨的一或多個以下參數(shù)的損失:骨骼礦物密度、牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨體積以及牙槽骨礦物含量。在此方面，本文所述的方法或用途任選地包含施用有效維持骨骼礦物密度、牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨體積以及牙槽骨礦物含量的一或多個量的第二骨骼增強劑，維持期為骨硬化蛋白抗體治療期結束后約I周至約5年。例如，在一些實施方案中，本文所述的方法或用途包含施用給受試者第二骨骼增強劑持續(xù)的維持期為約至少約I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3個月、13周、14周、15周、16周、4個月、17周、18周、19周、20周、5個月、21周、22周、23周、24周、6個月、25周、26周、27周、28周、7個月、29周、30周、31周或更長時間(例如8個月、9個月、10個月、11個月、I年、15個月、18個月、2年、3年、4年、5年或更長時間(例如受試者一生)。在一些實施方案中，維持期為約6-12周。在一些實施方案中，維持期為約4-12周或約1-3個月。在一些實施方案中，維持期為約12-20周或約3-5個月。在一些實施方案中，維持期為約20-32周或約5-8個月。在一些實施方案中，維持期為約24-36周或約6-9個月。在一些實施方案中，維持期為約I年、約2年、約3年、約4年、約5年或更長時間?！熬S持”牙槽骨包括維持接受骨硬化蛋白抑制劑治療的受試者所經受的類似水平的牙槽骨參數(shù)。
[0137]類似地，本文所述的方法或用途任選地包含隨后施用對骨骼礦物密度、牙槽骨高度、牙槽骨質量、牙槽骨體積以及牙槽骨礦物含量有效的一或多個量的骨硬化蛋白抑制劑，維持期為治療期結束后至少約至少約I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3個月、13周、14周、15周、16周、4個月、17周、18周、19周、20周、5個月、21周、22周、23周、24周、6個月、I年、2年、3年、4年、5年或更長時間(例如受試者一生)。在一些實施方案中，維持期為約6-12周。在一些實施方案中，維持期為約4-12周或約1-3個月。在一些實施方案中，維持期為約12-20周或約3-5個月。在一些實施方案中，維持期為約20-32周或約5-8個月。在一些實施方案中，維持期為約24-36周或約6-9個月。在一些實施方案中，維持期為約I年、約2年、約3年、約4年、約5年或更長時間。
[0138]試劑盒[0139]包含骨硬化蛋白抑制劑(例如抗骨硬化蛋白抗體或抗體片段)的醫(yī)藥組合物可連同提供關于使用此類醫(yī)藥組合物的說明書的包裝材料一起置放在容器(例如小瓶或注射器)內。一般來說，此類說明書將包括有形表達，所述表達描述骨硬化蛋白抑制劑濃度，以及在某些實施方案內，描述可能為復原醫(yī)藥組合物所必需的賦形劑成分或稀釋劑(例如水、生理鹽水或PBS)的相對量。
[0140]本發(fā)明在下列實施例中進一步描述。以下實施例僅用于說明本發(fā)明，且無論如何不旨在限制本發(fā)明的范圍。
實施例[0141]實施例1
[0142]本實施例描述適用于表征抗骨硬化蛋白抗體的中和活性的不同的基于細胞的中和測定。
[0143]基于MC3T3細胞 的礦化測定-使用抗壞血酸和B-甘油磷酸鹽誘發(fā)MC3T3-E1-BF細胞分化，從而導致礦物沉積。一種示例性篩選方案在96孔格式中包括在第I天接種細胞，接著在12天時間內，更換7次培養(yǎng)基，大多數(shù)礦物沉積在最后18小時內發(fā)生。礦物沉積的具體時間和程度可以部分地取決于所使用的特定血清批號而變化。如細胞培養(yǎng)實驗領域中一般所熟知，對照實驗將允許慮及所述變量。對于統(tǒng)計分析(使用MS Excel和JMP)，可依次使用單向ANOVA和杜氏比較(Dunnett’ s comparison)來確定組之間的差異。當P值小于
0.05(P〈0.05)時，數(shù)據集的組平均值被視為顯著不同。
[0144]用于MC3T3-E1-BF細胞擴增的細胞培養(yǎng)如下進行。細胞培養(yǎng)在37°C和5 % CO2下進行。出于篩選骨硬化蛋白中和抗體的目的，可產生細胞庫。通過在37°C水浴中攪動，解凍一小瓶冷凍的MC3T3-E1-BF細胞。將解凍的細胞投入50ml試管中的1ml擴增培養(yǎng)基(a-MEM/10% FBS/PenStr印Glu)中，且平緩地離心5分鐘。隨后使細胞再懸浮于4ml a -MEM/10% FBS/PenStr印Glu中。在使用臺盼藍和血球計確定細胞數(shù)目之后，將IxlO6個細胞接種于在一個T175燒瓶中的50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培養(yǎng)基中。
[0145]當此繼代融合(約7天)時，用胰蛋白酶作0了4(0.05%胰蛋白酶；0.531111^0丁八)使細胞進行胰蛋白酶處理，平緩地離心5分鐘，并且隨后再懸浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用臺盼藍和血球計確定細胞數(shù)目之后，接種細胞，每一個T175燒瓶將IxlO6個細胞接種于50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培養(yǎng)基中。用于接種的T175燒瓶的數(shù)目此時取決于可利用的總細胞數(shù)目和將用于下一繼代所要的燒瓶數(shù)目。
[0146]當此繼代融合(約3-4天)時，用胰蛋白酶/EDTA (0.05%胰蛋白酶；0.53mM EDTA)使細胞進行胰蛋白酶處理，平緩地離心5分鐘，并且隨后再懸浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用臺盼藍和血球計確定細胞數(shù)目之后，接種細胞，每一個T175燒瓶將IxlO6個細胞接種于50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培養(yǎng)基中。用于接種的T175燒瓶的數(shù)目此時取決于可利用的總細胞數(shù)目和將用于下一繼代所要的燒瓶數(shù)目。
[0147]當此繼代融合(約3-4天)時，用胰蛋白酶/EDTA (0.05%胰蛋白酶；0.53mM EDTA)使細胞進行胰蛋白酶處理，平緩地離心5分鐘，并且隨后再懸浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用臺盼藍和血球計確定細胞數(shù)目之后，接種細胞，每一個T175燒瓶將IxlO6個細胞接種于50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培養(yǎng)基中。用于接種的T175燒瓶的數(shù)目此時取決于可利用的總細胞數(shù)目和將用于下一繼代所要的燒瓶數(shù)目。以1-2χ106個活細胞/ml在90% FBS/10% DMSO中冷凍額外的細胞。
[0148]當此繼代融合(約3-4天)時，用胰蛋白酶/EDTA (0.05%胰蛋白酶；0.53mM EDTA)使細胞進行胰蛋白酶處理，平緩地離心5分鐘，并且隨后再懸浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用臺盼藍和血球計確定細胞數(shù)目之后，以1_2χ106個活細胞/ml在90% FBS/10% DMSO中冷凍細胞。此“最后繼代”的冷凍細胞為用于篩選測定的繼代。
[0149]用于礦化MC3T3-E1-BF細胞的細胞培養(yǎng)如下進行。細胞培養(yǎng)在37°C和5% CO2下進行。在礦化細胞培養(yǎng)物程序期間，需要將溫度和CO2波動％最小化。通過在37°C水浴中攪動，解凍適當數(shù)目的如上所述制備的“最后繼代”小瓶。將解凍的細胞投入50ml試管中的1ml擴增培養(yǎng)基(a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu)中，并且平緩地離心5分鐘。隨后使細胞再懸浮于4ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用臺盼藍和血球計確定細胞數(shù)目之后，在膠原蛋白I涂布的96孔板上，將每孔2500個細胞接種于200微升擴增培養(yǎng)基中(Becton Dickinson Labware,目錄號 354407)。 [0150]示例性細胞培養(yǎng)程序如下。指示接種細胞起始日為星期三。如果使用所述周中的不同的一天作為用于接種細胞的起始日，則所述日將觸發(fā)如下文指示的整個方法期間移除和添加培養(yǎng)基的日程。例如，如果在星期二接種細胞，則不應在第一個星期五和星期六，也不應在第二個星期五和星期六，移除和添加培養(yǎng)基。在星期二起始情況下，應在最后的星期日制備板用于鈣測定。在星期三接種細胞，2500個細胞接種于200 μ I擴增培養(yǎng)基中。在星期四，移除所有擴增培養(yǎng)基且添加200 μ I分化培養(yǎng)基。在星期五，移除100 μ I培養(yǎng)基且添加100 μ I新鮮的分化培養(yǎng)基。在星期一，移除100 μ I培養(yǎng)基且添加100 μ I新鮮的分化培養(yǎng)基。在星期二，移除100 μ I培養(yǎng)基且添加100 μ I新鮮的分化培養(yǎng)基。在星期三，移除100 μ I培養(yǎng)基且添加100 μ I新鮮的分化培養(yǎng)基。在星期四，移除100 μ I培養(yǎng)基且添加100 μ I新鮮的分化培養(yǎng)基。在星期五，移除100 μ I培養(yǎng)基且添加100 μ I新鮮的分化培養(yǎng)基。在下一個星期一，如下制備板用于鈣測定:用1mM Tris，HCl (ΡΗ7-8)洗滌板一次。在通風櫥下作業(yè)，每孔添加200 μ 10.5Ν HCl。隨后在-80°C下冷凍板。恰好在測量鈣之前，冷凍-解凍板兩次，并且隨后使用多通道吸移管濕磨來分散板的內容物。隨后在4°C下使板的內容物沉降30分鐘，此時移除適量上清液以使用市售鈣試劑盒測量鈣。示例性且非限制性試劑盒為鈣(CPC) Liquicolor,目錄號 0150-250, Stanb1 Laboratory, Boerne, TX0
[0151]在此基于細胞的測定中，骨硬化蛋白抑制導致且包括礦物沉積的一系列事件中的一個或多個(即骨硬化蛋白抑制礦化)。因此，在特定細胞培養(yǎng)實驗中包括骨硬化蛋白的實驗中，在第一個星期四起始和此后的每個飼喂日，向培養(yǎng)基中添加重組骨硬化蛋白。在測試抗骨硬化蛋白抗體中和骨硬化蛋白的能力，即通過中和骨硬化蛋白抑制礦化的能力來允許礦化的情況下，在第一個星期四起始和此后的每個飼喂日，向培養(yǎng)基中添加抗體。在37°C下在分化培養(yǎng)基中與重組骨硬化蛋白一起預孵育抗體45-60分鐘，且隨后使用所述培養(yǎng)基飼喂細胞。
[0152]上述為針對MC3T3-E1-BF細胞的12天礦化方案。原始MC3T3-E1細胞的礦化受重組骨硬化蛋白抑制，并且使用抗骨硬化蛋白中和抗體，例如包含SEQ ID NO:245-247和78-80的CDR的抗骨硬化蛋白抗體封閉這種抑制?；诩毎闹泻蜏y定進一步描述于美國專利公布號7，592，429的例如實施例8處(特此其基于細胞的中和測定的描述以引用的方式并入)。
[0153]骨骼特異性堿性磷酸酶酸測定-示例性骨骼特異性堿性磷酶酸測定描述于國際專利公布號WO 2008/115732和美國專利號7，744，874 (特此其基于細胞的中和測定的描述以引用的方式并入)。示例性方案如下。在96孔組織培養(yǎng)板的補充有5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中按3000-5000個細胞/孔接種C2C12細胞(ATCC，CRL1772)。在371:下在5%0)2中孵育板隔夜。在0.5X Wnt3a調節(jié)培養(yǎng)基(如WO 2008/115732中所述制備)中稀釋抗體至不同的最終濃度。自接種的細胞移除培養(yǎng)基，且添加預混合的抗體-BMP4-骨硬化蛋白溶液(人或獼猴)(150 μ I)，得到30 μ g/ml至0.5 μ g/ml的抗體最終濃度，25ng/ml的最終BMP-4濃度，1.0 μ g/ml的最終骨硬化蛋白蛋白質濃度，且調節(jié)培養(yǎng)基為0.5X濃度。隨后在37°C下在5% CO2中孵育板72小時。自細胞移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌一次，且在-80°C與37°C之間交替冷凍和解凍三次。通過添加堿性磷酸酶底物(1-步PNPP，Pierce#37621) (150 μ I/孔)測量堿性磷酸酶活性。在室溫下孵育細胞板60分鐘，此時在405nm下測量光密度(OD)以確定堿性磷酸酶活性。可以使用例如具S型4參數(shù)擬合方程的SigmaPlot Regress1nWizard進行IC5tl計算。 [0154]BMP2誘發(fā)的MC3T3細胞礦化測定-MC3T3細胞中的示例性BMP2誘發(fā)的礦化測定描述于國際專利公布號WO 2009/047356(特此其基于細胞的中和測定的描述以引用的方式并入)。簡單地說，將MC3T31b細胞接種于96孔板的100 μ I測定培養(yǎng)基(無G418的維持培養(yǎng)基)中(例如6χ103個細胞/孔或2χ103個細胞/孔)并孵育三天達到融合。改變測定培養(yǎng)基,且添加欲測試的化合物與1mM b-甘油磷酸鹽和50 μ M抗壞血酸。在添加至細胞中之前，在室溫下在獨立板上預孵育骨硬化蛋白和候選抗體兩小時。在施加骨硬化蛋白-抗體混合物之前，向測定96孔板中施加2.1或2.8nM BMP-2 (R&D Systems,目錄號355-BM-010)。孵育細胞14天。在孵育結束時，用200 μ I PBS/孔洗滌細胞兩次，向各孔中添加50 μ 10.5ΜHC1，且在_20°C下冷凍板至少24小時。在室溫下解凍板2小時以供測試。將十10 μ I各孔轉移至新板中，且暴露于鈣工作溶液(1:5) (200 μ I)。在5-30分鐘孵育期之后，在微板讀取器上在595nm下測量光密度。根據標準曲線將吸光度轉換成鈣的微克數(shù)，從而測定BMP-2誘發(fā)的礦化的程度。
[0155]基于細胞的wnt信號傳導測定-采用上頂邊(super top flash ；STF)報告蛋白的示例性基于細胞的信號傳導測定描述于國際專利公布號WO 2009/047356中。用以下對 HEK293 細胞進行轉染:對于對照孔，pcDNA3+(480ng) ；SuperTopFlash(STF) (20ng)；以及 phRL-CMV (0.5ng)，并且對于 Wntl 處理孔，pcDNA-wntl (20ng) ；pcDNA3+(460ng)；
SuperTopFlash (STF) (20ng)；以及 phRL-CMV (0.5ng)。將質粒與稀釋于 50 μ I OptiMEM?
中的1.6μ I Lipof ectamine2000混合,且在施加至細胞之前在室溫下孵育30分鐘。一旦施加，在37°C下在5% CO2中孵育細胞5小時。
[0156]將抗體與SOST —起預混合以生成一系列稀釋液。各稀釋液制備Iml培養(yǎng)基，并且在移除轉染混合物后，向各孔中添加450 μ I。細胞與抗體-SOST混合物一起孵育18-20小時。孵育結束時，移除培養(yǎng)基，且向溶解細胞中添加300μ IlX被動溶解緩沖液(Promega，目錄號E194A)。隨后使用Dual-Glo熒光素酶系統(tǒng)(Promega，目錄號E2940)和30 μ I溶解產物一式兩份測量熒光素酶活性。典型地，使用30 μ I Dual-Glo熒光素酶(熒火蟲熒光素酶；對于STF)和30 μ I Dual-Glo Stop與Glo (海腎熒光素酶；對于轉染效率對照)底物。用Mithras LB940儀器(Berthold Technologies)測量發(fā)光信號。計算熒火蟲與海腎熒光素酶的比率。通過將無SOST的Wntl值設定為I來表示最終結果。測定的另外的細節(jié)提供于國際專利公布號WO 2009/047356中。
[0157]實施例2—
[0158]以下實施例說明骨硬化蛋白抑制劑，即抗骨硬化蛋白單克隆抗體(Scl-Ab)在大鼠牙周病模型中增強牙槽骨修復的能力。
[0159]大鼠牙周炎模型:通過如先前所述的結扎置放，在大鼠中誘發(fā)實驗牙周病(Jin Q 等人，2007.J Per1dontol78:1300-1308 ;Graves, DT 等 A, 2008.J ClinPer1dontol35:89-105 ;其公開內容以引用的方式全部并入本文中)。簡單地說，用氯胺酮和噻榛(83/17比率)使雄性Sprague Dawley大鼠(體重約300_350g, HarlanLaboratory, I N)麻醉。隨后環(huán)繞位于小顎的一側的磨牙的頸部分(恰在牙銀上方)固定棉縫合線(3.0)以允許進行正常咀嚼。每周評估結扎三次，自頂端平緩地移入牙齦縫中以確保齦下位置，且必要時更換。
[0160]微電腦斷層(μ CT)掃描和分析:在指定時間點，處死大鼠。解剖小顎且置放于10%中性緩沖福爾馬林中48-72小時。在70%乙醇中通過錐形射束微CT系統(tǒng)(GEHealthcare B1Sciences)掃描固定的未去礦化大鼠小顎。線性且測定體積的分析是基于先前開發(fā)的方法(Park CH等人，2007.J Per1dontol78:273-281)。簡單地說，掃描各上頜試樣，且使用4(^系統(tǒng)在18\18\18-4 111三維像素下重建。使用三維(3-D)體積觀測器和分析軟件(Microview Analysis, GE Healthcare)作為3-D與2-D可視化和定量的工具。通過測量上頜第二磨牙的自牙骨質-牙軸質接面(CEJ)至牙槽骨嵴(ABC)的距離鑒別垂直的線性骨質流失。就體積分析而論，使用第一磨牙的最近中根(m-Ml)、第三磨牙的最遠中根(d-M3)、分叉的頂蓋、M1-M3的根尖作為評估上頜牙槽骨的可重現(xiàn)的標志。在前視圖(coronal view)上以規(guī)則間距(平均值，8個數(shù)據切片)繪制二維感興趣區(qū)域(ROI)且重建為3-D結構以定量體積參數(shù)、骨骼體積分數(shù)(BVF)以及骨骼礦物密度(BMD ；mg/cc)。
[0161]統(tǒng)計分析:使用GraphPad Prism (V.5.01)進行統(tǒng)計分析。通過單向方差分析(ANOVA)與Tukey多重比較事后檢驗在統(tǒng)計上評估線性且測定體積的骨骼測量的組之間的差異。數(shù)據以平均值+SE報告，且顯著性水平設定為P < 0.05。
[0162]研究設計:使10至12周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠經受通過如上所述的結扎置放而誘發(fā)的實驗牙周炎。在一個研究模式中，在結扎置放前三天，用生理鹽水媒介物或Scl-Ab (劑量水平為25mg/kg)皮下注射動物(n = 10只/組)一次。在結扎置放之后立即用生理鹽水媒介物或Scl-Ab處理結扎的動物或其正常完整對照。通過每周皮下注射兩次給予Scl-Ab (劑量水平為25mg/kg)和其媒介物對照。分別在疾病誘發(fā)后兩周和四周進行驗尸。
[0163]在另一研究模式中，結扎誘發(fā)的實驗牙周炎四周后，移除結扎后立即開始處理。用生理鹽水媒介物或Scl-Ab (劑量水平為25mg/kg)每周皮下注射患實驗牙周炎的動物(η =10只/組)或其正常完整對照兩次。處理在疾病誘發(fā)停止后持續(xù)三周或六周，總研究持續(xù)時間為7周或10周。在Scl-Ab施用之前每周進行體重測量直至研究結束為止。分別在疾病誘發(fā)后七周和十周進行驗尸。收集全血(用于血清測定)、小顎以及股骨。研究由密歇根大學(UniversityofMichigan)的機構動物護理與使用委員會(Institut1nAnimal Careand Use Committee)批準。
[0164]結果:
[0165]上頜牙槽骨:圖2和圖3中闡述支持牙槽骨體積和密度的微CT測量。在整個研究過程(兩周和四周)中置放結扎的研究模式中，與處理開始后兩周和四周接受媒介物注射液的正常完整動物相比，正常完整動物組中的全身性Scl-Ab施用在骨骼體積分數(shù)(BVF)與骨骼礦物密度(BMD)方面均產生統(tǒng)計上顯著增加。此外，接受全身性Scl-Ab注射液的結扎誘發(fā)的牙周病組顯示BVF和BMD (雖然統(tǒng)計上不顯著)值與兩周和四周時間點接受媒介物注射液的疾病組相比增加(圖2A和圖2B)。
[0166]在置放后四周和處理開始前立即移除結扎的研究模式中，與正常完整動物組相t匕，實驗牙周炎組中在疾病誘發(fā)期期間BVF和BMD顯示在統(tǒng)計上顯著減小。在疾病誘發(fā)停止后三周內，媒介物處理組中BVF和BMD反彈并且隨后穩(wěn)定直至研究結束為止。與接受媒介物注射液的動物組相比，實驗牙周炎誘發(fā)后接受Scl-Ab處理的結扎動物在六周處理階段始終展示改善的骨骼修復(即骨骼體積和密度值更高)。最重要的是，在處理六周后，BVF和BMD在用Scl-Ab處理的動物中比在媒介物 處理的動物組中在統(tǒng)計上更高。此外，在10周研究結束時，骨骼體積分數(shù)和骨骼密度在Scl-Ab處理的疾病動物與媒介物處理的正常完整動物之間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計性差異，表明Scl-Ab可有助于在牙周病后使牙槽骨再生至健康正常水平。
[0167]線性骨骼測量:牙槽骨高度是用微CT評估自第二磨牙的骨骼嵴至牙骨質-牙軸質接面測量(圖4)。在置放后四周和處理開始前立即移除結扎的研究模式中，scl-Ab施用顯示對線性骨骼修復(即增加牙槽骨高度)有一定作用。處理三周后，在結扎的第二磨牙部位，在Scl-Ab處理與媒介物組之間未觀察到線性骨骼測量統(tǒng)計顯著性。然而，在處理后六周時間點時，Scl-Ab處理顯示線性骨骼修復增加，其中在結扎的第二磨牙部位處在媒介物和Scl-Ab處理組與媒介物組之間統(tǒng)計上顯著差異明顯(圖4A至圖4C)。
[0168]實驗牙周炎誘發(fā)后六周全身性施用Scl-Ab與媒介物處理相比產生統(tǒng)計上更高的BVF和BMD值，以及與正常完整組相比統(tǒng)計上類似的骨骼測量。因此，如由BVF和BMD所測量，全身性Scl-Ab施用促使牙槽骨再生。Scl-Ab可有希望成為增強和/或加速口骨再生的治療劑。
[0169]雖然本發(fā)明已在著重強調優(yōu)選實施方案的情況下予以描述，但是顯然所屬領域的技術人員可使用優(yōu)選化合物和方法的變化形式，并且預期本發(fā)明可以與本文具體描述的方式不同的方式來實踐。因此，本發(fā)明包括如下文權利要求書所限定的本發(fā)明精神和范圍內內所涵蓋的所有修改。
【權利要求】
1.一種治療受試者牙槽骨流失的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效減小牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離的量的抗骨硬化蛋白抗體，劑量為每周約5mg至約1，OOOmg0
2.如權利要求1所述的方法，其中截至治療開始后六周，所述牙骨質-牙軸質接面與所述牙槽骨嵴之間的距離與治療前距離相比減小了至少10 %。
3.如權利要求1所述的方法，其中截至治療開始后六周，牙槽骨高度與治療前牙槽骨高度相比增加了至少10%。
4.如權利要求1所述的方法，其中截至治療開始后六周，所述受試者的牙槽骨高度與治療前牙槽骨高度相比增加了至少1mm。
5.如權利要求1所述的方法，其中截至治療開始后六周，所述受試者的牙槽骨密度與治療前牙槽骨密度相比增加了至少10%。
6.如權利要求1所述的方法，其中截至治療開始后六周，牙槽骨體積分數(shù)與治療前骨骼體積分數(shù)相比增加了至少10%。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述抗體的施用量為約120-270mg。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗體每周施用兩次。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗體局部地施用至所述受試者的患病牙銀區(qū)或患病牙周袋。
10.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述方法包括在施用所述抗骨硬化蛋白抗體之前，施用選自由Per1stat?或化學改性的四環(huán)素-3 (CMT-3)組成的組的護理標準護理治療劑。
11.如權利要求1至10中任一項所述的方法，其進一步包括施用選自由副甲狀腺素、特立帕肽(teriparatide)、雙膦酸鹽、RANKL抗體以及DKK-1抗體組成的組的第二骨骼增強治療劑。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述第二骨骼增強治療劑是在使用所述抗骨硬化蛋白抗體的治療期結束之后施用。
13.如權利要求1所述的方法，其任選地包括施用足以維持牙槽骨的量的所述抗骨硬化蛋白抗體持續(xù)第二段時間。
14.如權利要I至13中任一項所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗體為包含重鏈和輕鏈的免疫球蛋白。
15.如權利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗體為對SEQIDNO:1的骨硬化蛋白顯示小于或等于1x10_9M的結合親和力的抗體或其片段。
16.如權利要求1至15中任一項所述的方法，其中當與每孔的骨硬化蛋白摩爾數(shù)相比，每孔存在少于六倍過量的摩爾數(shù)的骨硬化蛋白結合位點時，在基于MC3T3細胞的礦化分析中，所述抗骨硬化蛋白抗體中和人骨硬化蛋白。
17.如權利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗體交叉封閉以下抗體中至少一者與骨硬化蛋白的結合:Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab_l、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、Ab_13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab_17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23以及Ab_24，和/或被以下抗體中至少一者交叉封閉與骨硬化蛋白的結合:Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5, Ab-6,Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24。
18.如權利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗體包含SEQID NO:245 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQ ID NO:78 的CDR-Ll、SEQ ID NO: 79 的 CDR-L2,以及 SEQ ID NO:80 的 CDR-L3。
19.如權利要求18所述的方法，其中抗骨硬化蛋白抗體包含含有SEQID NO:378的重鏈以及含有SEQ ID N0376的輕鏈。
20.一種包含抗骨硬化蛋白抗體的牙齒植入物，所述抗骨硬化蛋白抗體結合至包含SEQ ID NO:1中所闡明的氨基酸序列的骨硬化蛋肽多，其中所述抗骨硬化蛋白抗體對SEQ IDNO:1的骨硬化蛋白顯示小于或等于1x10_9M的結 合親和力。
21.一種包含抗骨硬化蛋白抗體的凝膠或基質，所述抗骨硬化蛋白抗體結合至包含SEQ ID NO:1中所闡明的氨基酸序列的骨硬化蛋肽多，其中所述抗骨硬化蛋白抗體對SEQ IDNO:1的骨硬化蛋白顯示小于或等于1x10_9M的結合親和力。
22.一種抗骨硬化蛋白抗體，其用于在治療受試者牙槽骨流失的方法中使用，所述方法包括施用有效減小牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離的量的抗骨硬化蛋白抗體，劑量任選地為每周約5mg至約l，000mg。
23.根據權利要求22所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中所述治療牙槽骨流失的方法進一步包括施用選自由副甲狀腺素、特立帕肽、雙膦酸鹽、RANKL抗體及DKK-1抗體組成的組的第二骨骼增強治療劑。
24.根據權利要求23所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中所述第二骨骼增強治療劑是在使用所述抗骨硬化蛋白抗體的治療期結束之后施用。
25.根據權利要求22所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中所述治療牙槽骨流失的方法任選地進一步包括施用足以維持牙槽骨的量的所述抗骨硬化蛋白抗體持續(xù)第二段時間。
26.如權利要求22至25中任一項所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中所述抗骨硬化蛋白抗體為包含重鏈和輕鏈的免疫球蛋白。
27.如權利要求22至26中任一項所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中所述抗骨硬化蛋白抗體為對SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白顯示小于或等于1χ10-9Μ的結合親和力的抗體或其片段。
28.如權利要求22至27中任一項所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中當與每孔的骨硬化蛋白摩爾數(shù)相比，每孔存在少于六倍過量的摩爾數(shù)的骨硬化蛋白結合位點時，在基于MC3T3細胞的礦化分析中，所述抗骨硬化蛋白抗體中和人骨硬化蛋白。
29.如權利要求22至28中任一項所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中所述抗骨硬化蛋白抗體交叉封閉以下抗體中至少一者與骨硬化蛋白的結合:Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-l、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24，和 / 或被以下抗體中至少一者交叉封閉與骨硬化蛋白的結合:Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5,Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、Ab_13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab-17, Ab-18,Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24。
30.如權利要求22至29中任一項所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中所述抗骨硬化蛋白抗體包含 SEQ ID NO:245 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQID NO:78 的 CDR-Ll、SEQ ID NO:79 的 CDR-L2,以及 SEQ ID NO:80 的 CDR-L3。
31.如權利要求30所述的抗骨硬化蛋白抗體，其中抗骨硬化蛋白抗體包含含有SEQIDNO:378的重鏈及含有SEQ ID N0376的輕鏈。
32.一種抗骨硬化蛋白抗體的用途，其用于制備供治療受試者牙槽骨流失的藥劑，其用量有效減小牙骨質-牙軸質接面與牙槽骨嵴之間的距離，其中所述抗骨硬化蛋白抗體的劑量任選地為每周約5mg至約1，OOOmg0
【文檔編號】C07K16/22GK104039828SQ201280064888
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權日:2011年12月28日
【發(fā)明者】柯華珠, 劉敏, W·V·格蘭諾拜爾 申請人:安進公司, 密執(zhí)安州立大學董事會