用于產(chǎn)生纖維素降解酶的轉(zhuǎn)錄因子的制作方法
【專利摘要】本文提供用于增加由真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法和組合物。當(dāng)前的公開是基于以下驚人的發(fā)現(xiàn)，即絲狀真菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子clr-2的異位表達(dá)能夠在非誘導(dǎo)或饑餓條件下誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)，引起細(xì)胞增加的纖維素酶分泌。有利地，在缺乏纖維素或纖維二糖的存在下培養(yǎng)的絲狀真菌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子clr-2的異位表達(dá)引起增加的纖維素酶分泌。當(dāng)前的公開尤其涉及降解含有纖維素的材料的方法、增加由真菌細(xì)胞生產(chǎn)一種或多種纖維素酶的方法、以及通過使經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼clr-2或相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸來降低該經(jīng)預(yù)處理生物質(zhì)材料的粘度的方法。
【專利說明】用于產(chǎn)生纖維素降解酶的轉(zhuǎn)錄因子
[0001]相關(guān)申請的交叉參考
[0002]本申請要求于2011年7月21日提交的美國臨時(shí)申請第61/510，466號(hào)的權(quán)益，在此將其全文通過引用的方式并入。
[0003]作為ASCII文本文件的序列表的提交
[0004]在此通過引用的方式將以下以ASCII文本文件提交的內(nèi)容全部并入:計(jì)算機(jī)可讀形式(CRF)的序列表(文件名:677792002140SeqList.txt，數(shù)據(jù)記錄于:2012年7月23日，大小:978KB)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本公開內(nèi)容涉及纖維素的降解。具體地，本公開內(nèi)容涉及與細(xì)胞對纖維素的應(yīng)答有關(guān)的多肽，以及相關(guān)的核苷酸和組合物。本公開內(nèi)容還涉及與細(xì)胞對纖維素的應(yīng)答有關(guān)的多肽、核苷酸及其組合物的方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0006]長久以來已經(jīng)對源自生物質(zhì)的液體燃料進(jìn)行研究，以作為化石燃料的替代品。盡管用當(dāng)前的生物燃料轉(zhuǎn)化過程實(shí)現(xiàn)的凈能量產(chǎn)出與溫室氣體降低尚存爭議，作為可再生的碳中性液體燃料的來源，由纖維素原料制成的生物燃料擁有巨大的潛力。目前的轉(zhuǎn)化過程嚴(yán)重依賴于纖維素到葡萄糖的酶促轉(zhuǎn)化，以發(fā)酵成乙醇或其他燃料。由絲狀真菌產(chǎn)生這些酶，或從另一方購買，均呈現(xiàn)為整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中的主要成本。降低這一成本的努力已經(jīng)成為當(dāng)前對生物燃料產(chǎn)生的公眾和私人研究的主要焦點(diǎn)。
[0007]迄今，纖維素產(chǎn)生方面最大的進(jìn)展已經(jīng)由絲狀真菌的迭代隨機(jī)誘變而實(shí)現(xiàn)。盡管該策略已經(jīng)大大降低了酶產(chǎn)生的成本，但產(chǎn)生的菌株具有數(shù)百個(gè)突變。不清楚哪些突變引起所需的收率增加，哪些突變與纖維素酶產(chǎn)生無關(guān)或損害纖維素酶的產(chǎn)生。沒有對于特定突變?nèi)绾翁岣呃w維素酶的收率的根本性理解，將難以進(jìn)一步設(shè)計(jì)工程菌株，或?qū)⒃黾拥纳a(chǎn)率轉(zhuǎn)移至其他目標(biāo)菌株。需要對于與絲狀真菌產(chǎn)生纖維素酶有關(guān)的生物過程的系統(tǒng)理解，以及需要相關(guān)的組合物和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為滿足上述需求，本公開內(nèi)容提供一種新的方法和組合物，來增加由真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶。而且，本公開內(nèi)容至少部分地基于以下出人意料的發(fā)現(xiàn)，即絲狀真菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子clr-2的異位表達(dá)(mis-expression)能夠誘導(dǎo)纖維素酶基因在非誘導(dǎo)性或饑餓條件下的表達(dá)，引起細(xì)胞的纖維素酶的分泌增加。有利地，clr-2在不存在纖維素或纖維二糖的條件下培養(yǎng)的絲狀真菌細(xì)胞中的異位表達(dá)引起纖維素酶分泌的增加。
[0009]因此，本公開內(nèi)容的某些方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，其中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細(xì)胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少一個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少兩個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少三個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有SEQ ID N0:184、185、186和 187。
[0010]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQ IDNO: 184 ;以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細(xì)胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID N0:185。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 185和186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 185和187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 186和187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID N0:185、186和187。
[0011]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQ IDNO: 184和185 ;以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細(xì)胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID N0:186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID N0:186和187。
[0012] 本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQID NO: 184、185和186 ;以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細(xì)胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ IDNO:187。
[0013]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQ IDNO: 184、185、186和187 ;以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細(xì)胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。
[0014]在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞在足以使真菌宿主細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的條件下孵育。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少至少一個(gè)重組核酸的真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，含有纖維素的材料包括生物質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，在與真菌宿主細(xì)胞接觸之前對生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理。在某些實(shí)施方式中，預(yù)處理包括一種或多種選自以下的處理:氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破(steamexplosion)、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機(jī)溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，生物質(zhì)包括植物材料。在某些實(shí)施方式中，植物材料選自芒草(Miscanthus)、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜秸桿、燕麥秸、玉米秸桿、大豆秸桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘鹿。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還包括一個(gè)或多個(gè)對參與至少一種生物燃料的產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸。在某些實(shí)施方式中，方法還包括將真菌宿主細(xì)胞與所降解的含有纖維素的材料在足以使得真菌宿主細(xì)胞將含有纖維素的材料轉(zhuǎn)化成至少一種生物燃料的條件下孵育。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，將所降解的含有纖維素的材料與發(fā)酵微生物在足以由所降解的含有纖維素的材料產(chǎn)生至少一種發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。 [0015]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及(b)將宿主細(xì)胞在足以支持至少一種重組核酸的表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該至少一個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少一個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少兩個(gè)選自SEQ ID N0s:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少三個(gè)選自SEQ ID N0s:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有SEQ ID N0s:184、185、186和187。在某些實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞在不存在纖維素的條件下培養(yǎng)。
[0016]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQ IDN0:184;以及(b)將宿主細(xì)胞在足以支持該至少一個(gè)重組核酸的表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該至少一個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 185。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 185和186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 185和187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 186和187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 185、186和187。在某些實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞在不存在纖維素的條件下培養(yǎng)。
[0017]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域以及SEQ IDNO: 184和185 ;以及(b)將宿主細(xì)胞在足以支持該至少一個(gè)重組核酸的表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該至少一個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID N0:186和187。在某些實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞在不存在纖維素的條件下培養(yǎng)。
[0018]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域以及SEQ IDNO: 184、185和186 ;以及(b)將宿主細(xì)胞在足以支持該至少一個(gè)重組核酸的表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該至少一種重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID N0:187。在某些實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞在不存在纖維素的條件下培養(yǎng)。
[0019]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域以及SEQ IDNO: 184、185、186和187 ;以及(b)將宿主細(xì)胞在足以支持該至少一種重組核酸的表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該至少一種重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞在不存在纖維素的條件下培養(yǎng)。
[0020]在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，至少一個(gè)重組核酸編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，至少一個(gè)重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQ ID NO: 165。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，至少一個(gè)重組核酸與選自ccg-1、gpd-1、vvd、qa_2、pdA、trpC、tef-Ι和xlr-Ι的啟動(dòng)子可操作地連接。
[0021]在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸，其中額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少一個(gè)選自SEQ IDN0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少兩個(gè)選自SEQ ID NO: 188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少三個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少四個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有SEQ ID N0:188、189、190、191和192。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸，其中額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQ ID N0:188。在某些實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 189。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 190。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO:189和190。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO:191。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO:189和191。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID N0:190和191。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 192。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 189和192。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 190和192。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO:191和192。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 189.190.191和192。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子的額外重組核酸是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:119或SEQID NO:183。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸與選自ccg-l、gpd-l、vvd、qa_2、pdA、trpC、tef-1和xlr_l的啟動(dòng)子可操作地連接。
[0022]在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼半纖維素酶的重組核酸。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞選自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、玉蜀泰赤 霉(Gibberella zeae)、鞭毛藻叢赤殼菌(Nectria haematococca)、稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)、四抱脈抱菌(Neurospora tetrasperma)、大抱類殼菌(Sordaria macrospora)、球毛殼菌(Chaetomium globosum)、四抱柄抱殼(Podosporaanserina)、黃萎輪枝抱(Verticillium albo-atrum)、禾生小叢殼(Glomerellagraminicola)、Grosmannia clavigera、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、富氏葡萄抱盤菌(Botryotinia fuckeliana)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、穎枯殼針抱(Phaeosphaeria nodorum)、偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritic1-repentis)、圓核腔菌(Pyrenophora teres)、馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei )、柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Uncinocarpus reesi1、厭酷球抱子菌(Coccidioides immitus)、普賽德斯球抱子菌(Coccidioides posadasii)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、嗜熱側(cè)抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila))、Thielavia terrestris-thermophilic、角軍纖維素枝丁頁抱(Acremonium cellulolyticus)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia IipoIytiCa)、多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、費(fèi)希新薩托菌(Neosartorya fischeri)、疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces Ianuginosus)(短小腐質(zhì)霉(Humicola brevis)、短芽孢腐質(zhì)霉(Humicola brevispora)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、Monotospora lanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節(jié)菌(Talaromyces thermophilus) (Talaromyces duponti1、杜邦青霉(Penicilliumdupontii))和勒克瑙金抱菌(Chrysosporium IucknowenseX
[0023]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，通過使經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少一個(gè)選自SEQ ID NOs: 184,185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少兩個(gè)選自SEQID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有至少三個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有SEQ ID N0:184、185、186和187。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQ IDNO: 165。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子的額外重組核酸，其中額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)或至少五個(gè)選自SEQID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸是 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 183。[0024]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，通過使預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQ ID N0:184。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 185。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID N0:185和186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 185和187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 186和187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID N0:185、186和187。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQID NO: 165。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子的額外重組核酸，其中額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)或至少五個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸是SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 119或SEQ ID NO: 183。[0025]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，通過使預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸
(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域以及SEQ ID NO: 184和185。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子還含有SEQ ID N0:186和187。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)重組核酸是SEQID NO: 5或SEQ IDNO: 165。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子的額外重組核酸，其中額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)或至少五個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸是 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 183。
[0026]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，通過使預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸
(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO: 184、185和186。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 187。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQ IDNO: 165。在某些可以與任意前述實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子的額外重組核酸，其中額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)或至少五個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)額外重組核酸編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸是 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 183。
[0027]在一些實(shí)施方式中，本文提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞。
[0028]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中重組核酸是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 165。
[0029]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞還含有至少一個(gè)編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸。
[0030]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中編碼clr-1蛋白的重組核酸是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:119 或 SEQ ID NO:183。 [0031]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中編碼clr-2蛋白的重組核酸是SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO: 165，并且編碼 clr-Ι 蛋白的重組核酸是 SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:119 或 SEQ ID NO:183。[0032]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)編碼半纖維素酶的額外重組核酸。
[0033]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)編碼半纖維素酶的重組核酸。
[0034]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞選自粗糙脈孢菌、金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻瘟病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmanniaclavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產(chǎn)黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側(cè)孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費(fèi)希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質(zhì)霉、短芽孢腐質(zhì)霉、灰腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、Monotosporalanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節(jié)菌(Talaromyces duponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0035]本文還提供含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞選自粗糙脈孢菌、金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻瘟病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產(chǎn)黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側(cè)孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費(fèi)希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質(zhì)霉、短芽孢腐質(zhì)霉、灰腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、Monotospora lanuginosa、Sepedoniumlanuginosum)、嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces duponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0036]在一些實(shí)施方式中，本文還提供一種增加真菌細(xì)胞生長的方法，該方法包括將含有至少一個(gè)編碼cllr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在介質(zhì)中在足以支持重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，其中宿主細(xì)胞的生長速率比對應(yīng)的缺少該重組核酸的宿主細(xì)胞要快。
[0037]在一些實(shí)施方式中，本文還提供一種增加真菌細(xì)胞生長的方法，該方法包括將含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在介質(zhì)中在足以支持重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，其中宿主細(xì)胞的生長速率比對應(yīng)的缺少該重組核酸的宿主細(xì)胞要快。
[0038] 在一些實(shí)施方式中，本文提供一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在生長介質(zhì)中在足以支持該重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，其中宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的纖維素酶。[0039]在一些實(shí)施方式中，本文提供一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在生長介質(zhì)中在足以支持該重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，其中宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的纖維素酶。
[0040]本文還提供一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在不含纖維素的生長介質(zhì)中在足以支持該重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，其中宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的纖維素酶。
[0041]本文還提供一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在不含纖維素的生長介質(zhì)中在足以支持該重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，其中宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的纖維素酶。
[0042]在一些實(shí)施方式中，本文提供一種產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，該方法包括:a)將含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在介質(zhì)中在足以支持該重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，以及b)從該介質(zhì)和/或該真菌宿主細(xì)胞中收集一種或多種纖維素酶。
[0043]在一些實(shí)施方式中，本文提供一種產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，該方法包括:a)將含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞在介質(zhì)中在足以支持該重組核酸的表達(dá)的條件下孵育，以及b)從該介質(zhì)和/或該真菌宿主細(xì)胞中收集一種或多種纖維素酶。
[0044]本文還提供一種使含有纖維素的材料降解的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在支持纖維素降解的條件下孵育。
[0045]本文還提供一種使含有纖維素的材料降解的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在支持纖維素降解的條件下孵育。
[0046]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0047]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0048]本文還提供一種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成發(fā) 酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0049]本文還提供一種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0050]本文還提供一種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)對生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，b)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及c)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0051]本文還提供一種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)對生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，b)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及c)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0052]本文還提供一種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)通過包括氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機(jī)溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理中的一種或多種的方法對生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，b)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及c)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0053]本文還提供一種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)通過包括氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機(jī)溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理中的一種或多種的方法對生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，b)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及c)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0054]此外，本文提供一種將植物材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0055]此外，本文提供一種將植物材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0056]本文還提供一種將選自芒草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜稻桿、燕麥稻、玉米稻桿、大豆稻桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘鹿洛、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘蔗的植物材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0057]本文還提供一種將選自芒草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜稻桿、燕麥稻、玉米稻桿、大豆稻桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘鹿洛、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘蔗的植物材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:a)使生物質(zhì)與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生糖溶液，以及b)將糖溶液與發(fā)酵微生物在足以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
[0058]本文還提供一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，該方法包括使經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料。
[0059]本文還提供一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，該方法包括使經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和至少一個(gè)編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料。
[0060]在一些實(shí)施方式中，本文提供一種非天然出現(xiàn)的真菌細(xì)胞，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細(xì)胞包含修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達(dá)相比,該修飾引起clr_l和clr_2蛋白的表達(dá)降低。
[0061]本文還提供一種非天然出現(xiàn)的真菌細(xì)胞，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細(xì)胞含有修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達(dá)相比,該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白的表達(dá)降低,并且其中修飾由RNA1、反義RNA、T-DNA插入、轉(zhuǎn)座子插入、插入突變、定點(diǎn)誘變、基因的部分缺失和基因的完全缺失而引起。
[0062]本文還提供一種非天然出現(xiàn)的脈孢菌屬細(xì)胞，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-1和clr-2蛋白的基因， 并且該細(xì)胞包含修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達(dá)相比,該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白的表達(dá)降低。
[0063]本文還提供一種非天然出現(xiàn)的真菌細(xì)胞，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細(xì)胞包含修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達(dá)相比,該修飾引起clr-1和clr_2蛋白的表達(dá)降低。并且該細(xì)胞還含有編碼與纖維素代謝有關(guān)的多肽的重組核酸。
[0064]本文還提供一種非天然出現(xiàn)的真菌細(xì)胞，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細(xì)胞包含修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達(dá)相比，該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白的表達(dá)降低,且該細(xì)胞還含有編碼纖維素酶的重組核酸。
[0065]在一些實(shí)施方式中，本文提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因，其中該細(xì)胞含有至少一種修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞相比，該修飾引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因的表達(dá)降低，并且，至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ IDN0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相t匕，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達(dá)降低。
[0066]在一些實(shí)施方式中，本文提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因，其中與對應(yīng)的缺少修飾的細(xì)胞相比，該細(xì)胞含有至少一種引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾以及至少一種引起該一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達(dá)降低。
[0067]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因，其中該細(xì)胞含有至少一種修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞相比，該修飾引起至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達(dá)降低，并且其中該修飾由RNA1、反義RNA、T-DNA插入、轉(zhuǎn)座子插入、插入突變、定點(diǎn)誘變、基因的部分缺失或基因的完全缺失造成。
[0068]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQID NO: 2直系同源的基因，其中與對應(yīng)的缺少修飾的細(xì)胞相比，該細(xì)胞含有至少一種引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾以及至少一種引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達(dá)降低，并且其中修飾由RNA1、反義RNA、T-DNA插入、轉(zhuǎn)座子插入、插入突變、定點(diǎn)誘變、基因的部分缺失或基因的完全缺失造成。 [0069]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因，其中細(xì)胞含有至少一種修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞相比，該修飾引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，并且，其中該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達(dá)降低，并且其中該細(xì)胞含有一個(gè)或多個(gè)RNA1-誘導(dǎo)載體，其中一個(gè)或多個(gè)載體產(chǎn)生針對一個(gè)或多個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的RNAi0
[0070]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQID N0:2直系同源的基因，其中與對應(yīng)的缺少修飾的細(xì)胞相比較，該細(xì)胞含有至少一種引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾以及至少一種引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQID NO: 2直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達(dá)降低，并且其中該細(xì)胞含有一種或多種RNA1-誘導(dǎo)載體,其中一種或多種載體產(chǎn)生針對一個(gè)或多個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:2直系同源的基因的RNAi。
[0071]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及編碼與纖維素代謝有關(guān)的多肽的重組核酸，其中該細(xì)胞含有至少一種修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞相比較，該修飾引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比較，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達(dá)降低。
[0072]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因以及編碼與纖維素代謝有關(guān)的多肽的重組核酸，其中與對應(yīng)的缺少修飾的細(xì)胞相比較，該細(xì)胞含有至少一種引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ IDN0:5直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾以及至少一種引起該一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ IDN0:5直系同源的基因以及至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達(dá)降低。
[0073]此外，本文提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因和編碼纖維素酶的重組核酸，其中該細(xì)胞含有至少一種修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞相比較，該修飾引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺失該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比較，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達(dá)降低。
[0074]此外，本文提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因和編碼纖維素酶的重組核酸，其中與對應(yīng)的缺少修飾的細(xì)胞相比較，該細(xì)胞含有至少一種引起該至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾以及至少一種引起一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾，并且，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達(dá)降低。
[0075]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因，其中該細(xì)胞含有至少一種修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞相比較，該修飾引起至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因的表達(dá)降低，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達(dá)降低，并且其中宿主細(xì)胞選自金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻痕病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產(chǎn)黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側(cè)孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費(fèi)希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質(zhì)霉、短芽孢腐質(zhì)霉、灰腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、Monotospora lanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節(jié)菌(Talaromycesduponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0076]本文還提供一種非脈孢菌屬細(xì)胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因和至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因，其中與對應(yīng)的缺失修飾的細(xì)胞相比較，該細(xì)胞含有至少一種引起至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾以及至少一種引起一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低的修飾，其中至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個(gè)與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達(dá)降低，與對應(yīng)的缺少該修飾的細(xì)胞中的纖維素酶多肽的表達(dá)相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達(dá)降低，并且其中宿主細(xì)胞選自金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻瘟病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產(chǎn)黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側(cè)孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費(fèi)希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質(zhì)霉、短芽孢腐質(zhì)霉、灰腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、Monotospora lanuginosa、Sepedoniumlanuginosum)、嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces duponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0077]在另一實(shí)施方式中，本文提供一種含有編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸。
[0078]在另一實(shí)施方式中，本文提供一種含有編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸。
[0079]在另一實(shí)施方式中，本文提供一種非天然出現(xiàn)的真菌細(xì)胞，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且其中細(xì)胞含有修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-Ι和clr-2蛋白的表達(dá)相比較,該修飾引起clr_l和clr_2蛋白中的一種或兩種的表達(dá)降低，其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸。
[0080]本文還提供一種含有編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸，并且其中生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
[0081] 本文還提供一種含有編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸，并且其中生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
[0082]本文還提供一種非天然出現(xiàn)的真菌細(xì)胞，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且其中該細(xì)胞含有修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-1和clr-2蛋白的表達(dá)相比較,該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白中的一種或兩種的表達(dá)降低，其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸，并且其中生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
[0083]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括使含有纖維素的材料與含有編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，并且其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸。
[0084]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括使含有纖維素的材料與含有編碼clr-2轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸和編碼clr-Ι轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，并且其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸。
[0085]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括使含有纖維素的材料與非天然出現(xiàn)的真菌細(xì)胞接觸，其中該細(xì)胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且其中細(xì)胞含有修飾，與對應(yīng)的缺少該修飾的真菌細(xì)胞中的clr-Ι和clr-2蛋白的表達(dá)相比較，該修飾引起clr-1和clr-2蛋白中的一種或兩種的表達(dá)降低，其中該細(xì)胞還含有一個(gè)或多個(gè)對參與生物燃料產(chǎn)生的生物化學(xué)通路的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸
【專利附圖】

【附圖說明】
[0086]專利或申請文件含有至少一張彩色附圖。在請求并繳納必需費(fèi)用時(shí)，將由專利局提供具有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的副本。
[0087]圖1示出培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換之后所分泌的酶的表達(dá)模式。圖1A示出在轉(zhuǎn)換至無碳或新碳源之后所分泌的酶的典型表達(dá)模式。圖1B示出將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換至無碳或新碳源之后16種預(yù)測的粗糙脈孢菌纖維素酶的信息豐度。圖1C示出將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換至無碳或新碳源之后12種預(yù)測的粗糙脈孢菌半纖維素酶的信息豐度。豐度給出為通過Cufflinks計(jì)算的每百萬讀段中每千堿基外顯子長度中的片段數(shù)(FPKM)。
[0088]圖2A示出轉(zhuǎn)移后I小時(shí)時(shí)纖維素與蔗糖培養(yǎng)物之間進(jìn)行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉(zhuǎn)錄豐度。圖2B示出I小時(shí)時(shí)蔗糖與無碳之間進(jìn)行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉(zhuǎn)錄豐度。圖2C示出I小時(shí)時(shí)纖維素與無碳之間進(jìn)行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉(zhuǎn)錄豐度。圖2D示出4小時(shí)時(shí)纖維素與蔗糖之間進(jìn)行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉(zhuǎn)錄豐度。圖2E示出4小時(shí)時(shí)蔗糖與無碳之間進(jìn)行比較的完整粗糙 脈孢菌(N.crassa)基因組的轉(zhuǎn)錄豐度。圖2F示出4小時(shí)時(shí)纖維素與無碳之間進(jìn)行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉(zhuǎn)錄豐度。將Log2倍數(shù)變化針對最大豐度作圖。出于作圖目的，在全部條件下，給予基因IFPKM的最小計(jì)數(shù)。通過Cuffdiff采用的模型，淺灰色的點(diǎn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異。中灰色的點(diǎn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異，但不是一致地相差2倍或更多倍因子。深灰色/黑色的點(diǎn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異，并且一致地相差2倍。
[0089]圖3示出來自RNAseq和微陣列數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因的比較。對纖維素(CMM)vs.無碳(NC)以及纖維素vs.鹿糖(SMM)兩種條件均進(jìn)行比較。圖3A不出來自CMM vs.NC(RNAseq數(shù)據(jù)，紫色圓圈)的差異表達(dá)基因以及來自CMM vs.SMM (RNAseq數(shù)據(jù)，藍(lán)色圓圈)的差異表達(dá)基因的基因集合。第三基因集合(微陣列數(shù)據(jù)，紅色圓圈)包括來自在CMM上生長30小時(shí)vs.在SMM上生長16小時(shí)的培養(yǎng)物的差異表達(dá)基因，Tian等人，Proc Nat AcadSci USA，106:22157-22162(2009)。三個(gè)集合的差異表達(dá)基因中的每個(gè)集合均包括上調(diào)基因和下調(diào)基因。圖3B示出圖3A中的源自RNAseq的差異分化基因列表的比較，并將它們分為上調(diào)和下調(diào)基因集合(該分析中不包括微陣列數(shù)據(jù))。向上指的白色箭頭表示上調(diào)基因，向下指的箭頭表示下調(diào)基因。
[0090]圖4不出cdr-1 (clr-1)和cdr_2 (clr-2)缺失菌株的生長和酶分泌。圖4A不出野生型和缺失菌株在具有SMM、XMM或CMM的5ml管中的生長。圖4B示出飽和纖維素基本培養(yǎng)基的層上的生長。圖4C示出SMM培養(yǎng)物(16hr)的轉(zhuǎn)移至CMM或XMM并孵育24小時(shí)的培養(yǎng)物上清液的SDS-PAGE凝膠。在SDS-PAGE凝膠中，第I道顯示蛋白梯(ladder)；第2道顯示在蔗糖上生長的野生型菌株的結(jié)果；第3道顯示在蔗糖上生長的Λ clr-1缺失菌株的結(jié)果；第4道顯示在蔗糖上生長的Λ clr-2缺失菌株的結(jié)果；第5道顯示在木聚糖上生長的野生型菌株的結(jié)果;第6道顯示在木聚糖上生長的Λ clr-1缺失菌株的結(jié)果;第7道顯示在木聚糖上生長的Λ clr-2缺失菌株的結(jié)果；第8道顯示在Avicel β上生長的野生型菌株的結(jié)果；第9道顯示在Avicel #上生長的Λ clr-1缺失菌株的結(jié)果；且第10道顯示在Avicel Φ上生長的Λ clr-2缺失菌株的結(jié)果。圖4D示出在轉(zhuǎn)移至CMM或XMM24小時(shí)的16hr SMM培養(yǎng)物的上清液中通過來自纖維素的葡萄糖釋放(Tian等人，Proc Nat AcadSci USA, 106:22157-22162(2009))而測量的總纖維素酶活性。圖4E示出通過圖4D中CMM或XMM培養(yǎng)物中由木聚糖釋 放的還原糖而測量的總木聚糖酶活性。圖4F示出圖4D中CMM或XMM培養(yǎng)物中通過Bradford檢定而測量的總蛋白。
[0091]圖5A 不出 cdr-1 (clr_l)和 cdr_2 (clr_2)的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造,不出在 Zn (2)-Cys (6)雙核集群轉(zhuǎn)錄因子之間保守的PFAM結(jié)構(gòu)域。圖5B示出天然標(biāo)記有cdr-1-GFP標(biāo)簽且異位表達(dá)cdr-1構(gòu)建體(在ccg-Ι啟動(dòng)子的調(diào)控下)的構(gòu)建體設(shè)計(jì)。圖5C示出在SMM生長的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至CMM之后cdr-Ι和cdr-2的表達(dá)圖譜。圖示出源自野生型粗糙脈孢菌vs.cdr-1或cdr-2突變體中的cdr_l和cdr_2的FPKM。注意cdr_2的表達(dá)依賴于能起作用的cdr-Ι的存在,而在cdr-2突變體中cdr_l的表達(dá)與野生型類似。圖5E示出天然GFP標(biāo)記的CDR-1 (CLR-1)的核定位。圖5F示出CMM vs.SMM上的ccgl:: cdr-Ι菌株中cbh-1(NCU07340)和cdr-2的相對表達(dá)，表明cdr_l的異位表達(dá)對cbh_l或cdr_2的表達(dá)水平?jīng)]有影響。
[0092]圖6示出cdr-1 (clr_l)和cdr_2 (clr_2)的最大似然系統(tǒng)發(fā)生樹。圖6A示出cdr-1。圖 6B 不出 cdr-2。
[0093]圖7示出cdr (clr)缺失突變體中改變了的表達(dá)圖譜。圖7A示出轉(zhuǎn)移至CMM后4hr時(shí)野生型和cdr突變菌株中預(yù)測的纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄豐度。圖7B示出轉(zhuǎn)移至CMM后4hr時(shí)在野生型和cdr突變菌株中預(yù)測的半纖維素酶基因的表達(dá)圖譜。圖7C示出在轉(zhuǎn)移至CMM4hr后的Acdr-1 ( Λ clr_l)與野生型相比的全局表達(dá)。圖7D示出在轉(zhuǎn)移至CMM4hr后的Λ cdr-2 ( Δ clr-2)與野生型相比的全局表達(dá)。圖7E示出在轉(zhuǎn)移至CMM后4hr對鑒別為在clr突變體和/或在野生型中纖維素與無碳比較中差異表達(dá)的基因的FPKM層次聚類。圖7F示出在圖7E聚類中的基因的主要類別。圖7G示出所選擇的纖維素酶和半纖維素酶的FPKM。預(yù)測表現(xiàn)出纖維素酶樣表達(dá)模式的半纖維素酶由cdr-Ι和cdr-2調(diào)節(jié)。
[0094]圖8不出cdr-1 (clr_l)和cdr_2 (clr_2)對纖維素酶調(diào)節(jié)的非限定性模式。(I)緩解葡萄糖阻遏。(2)追蹤到纖維素酶和半纖維素酶使植物細(xì)胞壁材料降解，釋放信號(hào)分子。(3，4)信號(hào)級聯(lián)激活CDR-l(CLR-l)，進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)cdr-Ι以及之后的cdr_2的表達(dá)。(5)⑶R-2 (CLR-2)以及有可能的⑶R-1驅(qū)動(dòng)纖維素酶和一些半纖維素酶的表達(dá)。(6)纖維素酶和半纖維素酶釋放更多的信號(hào)分子，使循環(huán)永續(xù)。
[0095]圖9示出基于貝葉斯推論的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖9A示出cdr-1 (clr_l)樹。圖9B示出 cdr-2 (clr-2)樹。
[0096]圖10示出在轉(zhuǎn)移至0.2%纖維二糖后4小時(shí)在三個(gè)具有或不具有clr-Ι或clr_2缺失的β -葡糖苷酶缺失突變體(ABG)中的cbh-Ι和cdt-2的轉(zhuǎn)錄豐度。
[0097]圖1lA示出培養(yǎng)物上清液中通過由Avicel ?的纖維二糖釋放而測量的纖維素酶活性。培養(yǎng)物在蔗糖上生長24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中。圖1lB示出作為clr-Ι豐度的函數(shù)的cbh-Ι的轉(zhuǎn)錄。所有測量均在自蔗糖培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換之后4小時(shí)通過RT-PCR 進(jìn)行。[0098]圖12A示出自蔗糖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移之后4小時(shí)粗糙脈孢菌菌株中cbh-Ι相對于clr_2的轉(zhuǎn)錄豐度。圖12B示出在蔗糖或Avicel詹中生長之后的WT和clr_2異位表達(dá)菌株上清液中的羧甲基纖維素酶活性。圖12C示出將蔗糖生長培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至具有2%蔗糖或2%Avicel詹的新鮮培養(yǎng)基之后clr-2異位表達(dá)菌株的羧甲基纖維素酶活性。圖12D示出將蔗糖成長培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至具有2%蔗糖或2%Avicel⑩的新鮮培養(yǎng)基之后在來自clr_2異位表達(dá)菌株的培養(yǎng)上清液中的所分泌蛋白。
[0099]圖13A示出WT和clr-2異位表達(dá)菌株的培養(yǎng)物上清液的SDS-PAGE凝膠。圖13B示出在轉(zhuǎn)移至Avicel⑩后在WT粗糙脈孢菌、clr-Ι和clr-2的缺失菌株；以及轉(zhuǎn)移至無碳之后在WT和clr-2異位表達(dá)菌株中的所選擇的纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄豐度(RNAseq)。
[0100]圖14以FPKM示出在另外可選的誘導(dǎo)性條件和clr突變體中粗糙脈孢菌Avicel (φ調(diào)節(jié)子的層次聚類。
[0101]圖15示出培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到各種碳源后4小時(shí)粗糙脈孢菌裂解液中標(biāo)記的和未標(biāo)記的clr-1 (NCU07705)的蛋白印跡(抗-V5抗體)。Suc是指蔗糖，Avi是指Avicel⑩，NC是指無碳，Cel是指纖維二糖,Xa是指木聚糖,Xo是指木糖。V5標(biāo)記的CLR-1的預(yù)計(jì)大小為~80kDa。每道均載入相等的總蛋白濃度。
[0102]圖16A示出對clr_l/2ChiPseq調(diào)節(jié)子與纖維素應(yīng)答RNAseq調(diào)節(jié)子進(jìn)行比較的Venn圖。圖16B示出CLR-1ChIP-Seq的圖形表示。灰色的峰表示映射到clr_l(NCU07705)和clr-2 (NCU08042)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)若干位點(diǎn)的相對讀段數(shù)目。圖16C示出映射至基因組的 CLR-1 和 CLR-2ChIP_Seq 以及 4 小時(shí) Avicel ? RNA-Seq。附圖示出 CLR-1 和 CLR-2 在調(diào)節(jié)相同基因時(shí)典型的ChIP結(jié)合模式。CLR-1和CLR-2在幾乎相同的位置與xlr_l的啟動(dòng)
子結(jié)合。[0103]圖17示出構(gòu)巢曲霉clr缺失菌株AclrA和AclrB的表型。圖17A示出在葡萄糖上生長然后轉(zhuǎn)換至Avicel ?培養(yǎng)基的Λ clrA和Λ clrB突變體的培養(yǎng)物上清液的酶活性。圖17B示出在Avicel iU:生長的培養(yǎng)物上清液中的總蛋白。圖17C示出在葡萄糖和纖維二糖(0.5%wt/vol)上培養(yǎng)的WT和clr突變體的菌絲體干重。圖17D通過定量RT-PCR示出在轉(zhuǎn)換至Avicel (S) 8hr之后在WT和clr突變體中對所選擇的纖維素酶基因的誘導(dǎo)。通過單尾非齊性方差t-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，*P<0.05，**P<0.01，*林Ρ〈(λ 001。圖17Ε示出將培養(yǎng)物暴露于Avicel ?之后構(gòu)巢曲霉Λ clrA和Λ clrB突變體中clrA和clrB的表達(dá)。將培養(yǎng)物在葡萄糖培養(yǎng)基中于37°C預(yù)生長17小時(shí)，然后轉(zhuǎn)換至Avicel遷)培養(yǎng)基。
[0104]圖18A示出clrB基因在clrB異位表達(dá)菌株中的表達(dá)。葡萄糖上O小時(shí)是指恰好將在葡萄糖上生長17小時(shí)的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換至具有其他碳源的培養(yǎng)基之前的時(shí)間。圖18B示出cbhD基因在clrB異位表達(dá)菌株中的表達(dá)。葡萄糖上O小時(shí)是指恰好將在葡萄糖上生長17小時(shí)的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換至具有其他碳源的培養(yǎng)基之前的時(shí)間。圖18C示出在纖維二糖上生長48小時(shí)的clrB異位表達(dá)菌株的生長和羧甲基纖維素酶活性。
[0105]圖19示出粗糙脈孢菌clrA異位表達(dá)菌株和粗糙脈孢菌clrB異位表達(dá)菌株在纖維二糖和Avicel._上的生長。圖19A示出clrA異位表達(dá)菌株在纖維二糖上的生物質(zhì)聚集。圖19B示出clrA異位表達(dá)菌株在Avicel ?上的生長。圖19C示出clrB異位表達(dá)菌株在纖維二糖上的生物質(zhì)聚集。圖19D示出clrB異位表達(dá)菌株在Avicel敷上的生長。
[0106]圖20A示出由染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)峰預(yù)測的Clr-1DNA-結(jié)合基序。圖20B示出由染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)峰預(yù)測的Clr-2DNA-結(jié)合基序。
[0107]圖21示出粗糙脈孢菌clr-Ι與顯示出保守基序的22種clr_l同源物的氨基酸序列比對。保守的PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域以突出的框表示。序列比對包括以下序列:玉蜀黍赤霉 _PH-1 (SEQ ID 勵(lì):193)、鞭毛藻叢赤殼菌_11^^1_77-13-4 (SEQ ID NO: 194)、NCU07705 (SEQ ID NO: 2)、四孢脈孢菌 _FGSC_2508 (SEQ ID NO: 195)、大孢糞殼菌 _k_hell(SEQ ID 勵(lì):196)、球毛殼菌」^5_148.51 (SEQ ID NO: 197)、四孢柄孢殼 _S_mat+(SEQ ID勵(lì):198)、黃萎輪枝孢_(dá)￥&]\^.102(SEQ ID NO: 199)、禾生小叢殼 _ML 001 (SEQ ID N0:200)、金龜子綠僵菌 _ARSEF_23(SEQ ID NO:201 )、富氏葡萄孢盤菌 _B05.10(SEQ ID N0:202)、核盤菌 _1980 (SEQ ID NO: 203), Grosmannia_cIavigera_kw 1407 (SEQ ID NO: 204)、AN5808(SEQ ID 勵(lì):205)、煙曲霉_六€293 (SEQ ID NO:206)、米曲霉 _RIB40 (SEQ ID NO:207)、產(chǎn)黃青霉_胃丨8(:0118丨11_54-1255 (SEQ ID NO: 208)、黑曲霉(SEQ ID NO: 209)、圓核腔菌 _f._teres_0-l (SEQ ID NO: 210)、十字花科小球腔菌 _JN3 (SEQ ID NO:211)、柄籃狀菌 _ATCC_10500 (SEQ ID NO: 212)、NCU00808 (SEQ ID NO: 213)和里氏木霉 _clr_l_ 蛋白(SEQID NO:182)。
[0108]圖22示出粗糙脈孢菌clr-1與顯示出保守基序的21種clr_2同源物的氨基酸序列比對。保守的PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域以突出的框表示。序列比對包括以下序列:AN6832 (SEQ ID N0:214) 、馬爾尼菲青霉 _ATCC_18224 (SEQ ID N0:215)、柄籃狀M _ATCC_10500 (SEQ ID NO: 216)、AN3369 (SEQ ID NO: 217)、黑曲霉 _CBS_513.88 (SEQID N0:218)、米曲霉 _RIB40 (SEQ ID NO:219)、產(chǎn)黃青霉 _Wisconsin_54_1255 (SEQ IDNO: 220 )、厭酷球孢子菌 _RS (SEQ ID NO: 221)、普賽德斯球抱子菌 _C735_deIta_S0ffgp (SEQID N0:222)、NCU08042 (SEQ ID NO:4)、四孢脈孢菌 _FGSC_2508 (SEQ ID NO: 223)、大孢糞殼菌 _k-hell(SEQ ID NO: 224)、四孢柄孢殼 _S_mat+(SEQID NO: 225)、禾生小叢殼 _Μ1.0Ol(SEQ ID N0:226)、稻瘟病菌_70-15(SEQ ID NO:227)、鞭毛藻叢赤殼菌_mpVI_77-13_4(SEQID NO:228)、里氏木霉(SEQ ID NO:229)、黃萎輪枝孢 _VaMs.102 (SEQ ID N0:230)、偃麥草核腔菌 _Pt-1C-BFP (SEQ ID NO: 231 )、圓核腔菌 _f._teres_0_l (SEQ ID NO: 232)、十字花科小球腔菌 _JN3 (SEQ ID NO:233)和 NCU07007 (SEQ ID NO: 234)。
【具體實(shí)施方式】
[0109]本文提供與細(xì)胞對纖維素的應(yīng)答有關(guān)的多肽。本文還提供對與細(xì)胞對纖維素的應(yīng)答有關(guān)的多肽進(jìn)行編碼的核酸。本文還提供含有對與細(xì)胞對纖維素的應(yīng)答有關(guān)的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸的宿主細(xì)胞，以及含有與細(xì)胞對纖維素的應(yīng)答有關(guān)的重組多肽的宿主細(xì)胞。在一些方面，本文提供多肽clr-Ι和clr-2，以及編碼clr_l和clr_2多肽的核酸。
[0110]本文還提供使用clr-ι和clr-2多肽的方法,使用編碼clr_l和clr_2多肽的核酸的方法，以及使用含有重組clr-Ι和/或clr-2多肽或編碼clr_l和/或clr_2多肽的核酸的宿主細(xì)胞的方法。在一些方面，clr-Ι和clr-2促進(jìn)纖維素酶和其他基因在應(yīng)答于纖維素時(shí)的表達(dá)。因此，在一些方面，宿主細(xì)胞中重組clr-Ι和/或clr-2的表達(dá)增加宿主細(xì)胞在含有纖維素的介質(zhì)中的生長速率，增加由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的纖維素酶，和/或增加宿主細(xì)胞降解纖維素的速率。
[0111]此外,本文提供天然地產(chǎn)生clr-ι和/或clr-2多肽的細(xì)胞,其被修飾成clr_l和/或clr-2的表達(dá)降低。天然地產(chǎn)生clr-Ι和/或clr_2多肽但被修飾成clr_l和/或clr-2的表達(dá)降低的細(xì)胞可以用于，例如，研究纖維素酶以及細(xì)胞對纖維素的應(yīng)答。
[0112]如本文所用，術(shù)語“Cdr-1 ”和“Clr-1 ”可互換地使用，且是指起到調(diào)節(jié)多種基因在真菌細(xì)胞中應(yīng)答于細(xì)胞對纖維素的暴露時(shí)的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的作用的多肽或編碼多肽的基因。clr-Ι編碼基因的一個(gè)非限制性實(shí)例為粗糙脈孢菌基因NCU07705。
[0113]如本文所用，術(shù)語“cdr-2”和“clr-2”可互換地使用，且是指起到調(diào)節(jié)多種基因在真菌細(xì)胞中應(yīng)答于細(xì)胞對纖維素的暴露時(shí)的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的作用的多肽或編碼多肽的基因。clr-2編碼基因的一個(gè)非限制性實(shí)例為粗糙脈孢菌基因NCU08042。
[0114]因此，在某些方面，本公開內(nèi)容涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)或至少四個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的多肽序列；以及b)將真菌宿主細(xì)胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細(xì)胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。
[0115]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)或至少四個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及(b)將宿主細(xì)胞在足以支持該至少一個(gè)重組核酸的表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少該至少一個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。
[0116]本公開內(nèi)容的其他方面涉及一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，通過使預(yù)處理的生物質(zhì)材料與含有至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料，其中轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸
(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)或至少四個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列。
[0117]公開內(nèi)容的多肽
[0118]本公開內(nèi)容涉及參與到與纖維素代謝有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄中的多肽。在一些方面，本公開內(nèi)容涉及clr-Ι多肽。在一些方面，本公開內(nèi)容涉及clr-2多肽。
[0119]如本文所用，“多肽”是包括多個(gè)連續(xù)聚合的氨基酸殘基(例如，至少約15個(gè)連續(xù)聚合的氨基酸殘基)的氨基酸序列。如本文所用，“多肽”是指氨基酸序列、寡肽、肽、蛋白或其部分，術(shù)語“多肽”和“蛋白”可互換地使用。
[0120]Clr-1
[0121]在一些方面，本公開內(nèi)容涉及clr-Ι多肽。clr-Ι多肽起到轉(zhuǎn)錄因子的作用，其調(diào)節(jié)多種基因在真菌細(xì)胞中應(yīng)答于細(xì)胞對纖維素的暴露時(shí)的轉(zhuǎn)錄。在一些方面，基因的表達(dá)在應(yīng)答于clr-Ι表達(dá)時(shí)增加。在一些方面，基因的表達(dá)在應(yīng)答于clr-Ι表達(dá)時(shí)降低。
[0122]clr-Ι是真菌特異性鋅雙核集群超家族的一員，該超家族是真菌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的較大較多樣的超級家族。該超家族中的轉(zhuǎn)錄因子的例子包括gal-4、ace-1和xlnR(xyr-1)(Strieker 等人,App.Micr0.Biotech., 78:211-220 (2008) )。clr-2 也是該超家族中的一員。
[0123]該多肽超家族的成員典型地含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:A)鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群PFAM00172結(jié)構(gòu)域，其協(xié)調(diào)多肽與DNA的結(jié)合，和B)中央結(jié)構(gòu)域，其大致對應(yīng)于稱作“中央同源區(qū)”者(Campbell RN, Biochemical J.，414:177-187，(2008))，是鋅指轉(zhuǎn)錄因子中的保守結(jié)構(gòu)域。在clr-Ι中，保守的中央結(jié)構(gòu)域具有真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域PFAM04082。
[0124]如本文所用，“鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域”是指真菌特異性鋅雙核集群超家族的保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，典型地為釀酒酵母Gal4，其含有雙核鋅集群，其中兩個(gè)鋅離子通過六個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合(PFAM00172)。本公開內(nèi)容的clr_l多肽及其同源物含有包括以下保守序列的“鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域” =C-E-V-C-R-S-R-K-S-R-C-D-G-T-K-P-K-C-K-L-C-T-E-L-G-A-E-C-1-Y-R-E (SEQ ID NO:235)(圖 21)。本公開內(nèi)容的 clr_2 多月太及其同源物含有包括以下保守序列的“鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域” =C-A-E-C-R-R-R-K-1-R-C-D-G-E-Q-PC-G-Q-C-X-W-Y-X-K-P-K-R-C-F-Y-R-V-X-P-S-R-K (SEQ ID NO:236)，其中X可以是任意氨基酸殘基(圖22)。
[0125]如本文所用，“PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域”是指與鋅指或鋅雙核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域相關(guān)的真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域。本公開內(nèi)容的clr-Ι多肽及其同源物含有包括以下保守序列的 “PFAM04082 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域”:1-E-A-Y-F-E-R-V-N-V-ff-Y-A-C-V-N-P-Y-T-ff-R-S-H-Y-R-T-A-L-S-N-G-F-R-E-G-P-E-S-C-1-V-L-L-V-L-A-L-G-Q-A-S-L-R-G-S-1-S-R-1-V-P-X-E-D-P-P-G-L-Q-Y-F-T-A-A-W-X-L-L-P-G-M-M-T-X-N-S-V-L-A-A-Q-C-H-L-L-A-A-A-Y-L-F-Y-L-V-R-P-L-E-A-W-N-L-L-C-T-T-S-T-K-L-Q-L-L-L-M-A-P-N-R-V-P-P-X-Q-R-E-L-S-E-R-1-Y-W-N-A-L-L-F-E-S-D-L-L-A-E-L-D-L-P-H-S-G-1-V-Q-F-E-E-N-V-G-L-P-G-G-F-E-G-E-E-D-E-X-D-E-E-A-D-X-D-Q-E-1-A-X-V-T-A-V-G-R-D-E-L-W-Y-F-L-A-E-1-A-L-R-R-L-L-N-R-V-S-Q-L-1-Y-S-K-D-T-P-Y-S-K-G-P-S-M-A-S-T-T-S-L-E-P-1-V-A-E-L-D-F-
【權(quán)利要求】
1.一種使含有纖維素的材料降解的方法，所述方法包括: a)使含有纖維素的材料與包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，其中所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及 b)將所述真菌宿主細(xì)胞和所述含有纖維素的材料在足以使所述真菌宿主細(xì)胞降解所述含有纖維素的材料的條件下孵育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少兩個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少三個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含SEQ ID NO: 184、185、186和187。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述真菌宿主細(xì)胞在足以使所述真菌宿主細(xì)胞表達(dá)所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白的條件下孵育。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少所述至少一個(gè)重組核酸的真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述含有纖維素的材料包括生物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中， 所述生物質(zhì)在與所述真菌宿主細(xì)胞接觸之前進(jìn)行預(yù)處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中， 所述預(yù)處理包括選自氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機(jī)溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理的一種或多種處理。
11.根據(jù)權(quán)利要求8~10中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述生物質(zhì)包括植物材料。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中， 所述植物材料選自芒草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜秸桿、燕麥秸、玉米秸桿、大豆秸桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘蔗。
13.根據(jù)權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述真菌宿主細(xì)胞還包含一個(gè)或多個(gè)對參與到至少一種生物燃料的產(chǎn)生的生化通路中的多肽進(jìn)行編碼的重組核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，還包括: 將所述真菌宿主細(xì)胞與所降解的含有纖維素的材料在足以使所述真菌宿主細(xì)胞將含有纖維素的材料轉(zhuǎn)化成至少一種生物燃料的條件下孵育。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中， 所述生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
16.根據(jù)權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 將所降解的含有纖維素的材料與發(fā)酵微生物在足以從所降解的含有纖維素的材料產(chǎn)生至少一種發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)。
17.一種增加由真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的方法，所述方法包括: (a)提供包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及 (b)將所述宿主細(xì)胞在足以支持所述至少一個(gè)重組核酸的表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中所述真菌宿主細(xì)胞比對應(yīng)的缺少所述至少一個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生更大量的一種或多種纖維素酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中， 所述真菌宿主細(xì)胞在不存在纖維素的條件下培養(yǎng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1~18中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述至少一個(gè)重組核酸是SEQ ID N0:5。
20.根據(jù)權(quán)利要求1~19中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述至少一個(gè)重組核酸與選自ccg-1和gpdA的啟動(dòng)子可操作地連接。
21.根據(jù)權(quán)利要求1~20中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述真菌宿主細(xì)胞還包含至少一個(gè)編碼額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸，其中所述額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 188、189、190、191和192的多肽序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少兩個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少三個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少四個(gè)選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含SEQ ID N0:188、189、190、191和192。
27.根據(jù)權(quán)利要求21~26中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 至少一個(gè)編碼所述額外轉(zhuǎn)錄因子蛋白的額外重組核酸是SEQ IDN0:2。
28.根據(jù)權(quán)利要求21~27中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述至少一個(gè)額外重組核酸與選自ccg-1和gpdA的啟動(dòng)子可操作地連接。
29.根據(jù)權(quán)利要求1~28中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述真菌宿主細(xì)胞還包含至少一個(gè)編碼半纖維素酶的重組核酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述真菌宿主細(xì)胞選自粗糙脈孢菌、金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻痕病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產(chǎn)黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側(cè)孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費(fèi)希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質(zhì)霉、短芽孢腐質(zhì)霉、灰腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、Monotospora lanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節(jié)菌(Talaromycesduponti1、杜邦青霉)和勒克瑙金孢菌。
31.一種降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的粘度的方法，所述方法包括: 使經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料與包含至少一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細(xì)胞接觸，以產(chǎn)生粘度降低的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料，其中所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)選自SEQ IDNO: 184、185、186和187的多肽序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少兩個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含至少三個(gè)選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中， 所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含SEQ ID NO: 184、185、186和187。
36.根據(jù)權(quán)利要求31~35中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 所述至少一個(gè)重組核酸是SEQ ID N0:5。
【文檔編號(hào)】C07K14/37GK103917653SQ201280046328
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月21日
【發(fā)明者】田朝光, T·肖克, N·L·格拉斯, S·科拉代蒂, J·克雷格 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)