抗纖維化肽及其在用于治療以纖維化為特征的疾病和病癥的方法中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供用于抑制和/或逆轉(zhuǎn)纖維化的方法和組合物。本發(fā)明還提供肽和多肽，其是在細(xì)胞或組織中觸發(fā)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抑制和/或逆轉(zhuǎn)EMT的BMP激動(dòng)劑。
【專利說(shuō)明】抗纖維化肽及其在用于治療以纖維化為特征的疾病和病癥的方法中的用途
[0001]優(yōu)先權(quán)和通過(guò)引用結(jié)合
[0002]本申請(qǐng)要求2011年7月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)61/509，340的較早申請(qǐng)日權(quán)益，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本申請(qǐng)還要求2012年6月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)61/662，337的較早申請(qǐng)日權(quán)益，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本文引用或參考的所有文獻(xiàn)以及本文所引用文獻(xiàn)中引用或參考的所有文獻(xiàn)，連同本文中或通過(guò)引用結(jié)合到本文中的任何文獻(xiàn)中提及的任何產(chǎn)品的任何制造商說(shuō)明書、描述、產(chǎn)品說(shuō)明書和產(chǎn)品單，都通過(guò)引用予以結(jié)合，并可用于本發(fā)明的實(shí)踐。
[0003]發(fā)明背景
[0004]1.發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及物質(zhì)的組合物、其制備方法以及用于治療纖維化和/或纖維化相關(guān)病況的方法。本發(fā)明還涉及多肽或肽的設(shè)計(jì)、制備、以及在治療纖維化和/或?qū)е吕w維化的潛在病況中的用途，所述病況包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程的逆轉(zhuǎn)和/或抑制。
[0006]2.背景
[0007]當(dāng)機(jī)體的天然愈合過(guò)程出錯(cuò)時(shí)，發(fā)生纖維化，通常的特征在于在響應(yīng)與某種潛在原因相關(guān)的慢性炎性病況時(shí)組織的極度過(guò)度生長(zhǎng)、硬化和/或瘢痕化，所述原因例如組織損傷、感染、自身免疫反應(yīng)、化學(xué)損傷、過(guò)敏反應(yīng)、毒素、輻射、機(jī)械損傷或其它各種持續(xù)刺激(TA Wynn, J.Pathol.，2008，214:199-210)。盡管臨床和病因上的表現(xiàn)范圍可以很廣泛，但是纖維化病癥在以下方面是相似的:它們一般都共有某種潛在的持續(xù)刺激，其連續(xù)不斷地促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纖維發(fā)生細(xì)胞因子的釋放，這導(dǎo)致胞外基質(zhì)成分的增加和過(guò)量積累，其逐漸破壞正常組織和改變其結(jié)構(gòu)直到功能喪失。該過(guò)程通常在多個(gè)月份和年份內(nèi)發(fā)生并且最終可`導(dǎo)致器官功能障礙或死亡。常見(jiàn)纖維化疾病的實(shí)例包括例如，糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎(nepthritis)和硬皮病(同上)。
[0008]通常，組織損傷后的天然愈合過(guò)程開(kāi)始于位于損傷部位的上皮和/或內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，這引發(fā)以血小板-誘導(dǎo)的凝血塊形成為開(kāi)始的愈合級(jí)聯(lián)和臨時(shí)的胞外基質(zhì)(ECM)的形成。血小板脫粒還導(dǎo)致血管舒張并增加血管通透性，同時(shí)活化的成肌纖維細(xì)胞和上皮和/或內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，其進(jìn)一步破壞基底膜，讓更多炎性細(xì)胞募集到損傷部位(同上)。所述細(xì)胞還產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子，其刺激額外免疫系統(tǒng)細(xì)胞向該部位的募集和增殖，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，尤其導(dǎo)致血管生成反應(yīng)和由活化的淋巴細(xì)胞分泌促纖維化細(xì)胞因子(profibrotic cytokine)和生長(zhǎng)因子,包括腫瘤生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)。這些事件進(jìn)一步活化成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞，其遷移到傷口并促使傷口收縮。在收縮傷口的部位，上皮和/或內(nèi)皮細(xì)胞分裂以再生損傷組織，從而完成自然傷口愈合過(guò)程(同上)。
[0009]纖維化不同于該過(guò)程，這是因?yàn)槌掷m(xù)性和慢性炎癥病況的存在，其觸發(fā)包括ECM材料過(guò)量積累在內(nèi)的級(jí)聯(lián)，所述ECM材料不能轉(zhuǎn)化并最終導(dǎo)致瘢痕組織的產(chǎn)生或形成和伴隨的由瘢痕化導(dǎo)致的器官或組織功能障礙(同上)。
[0010]已經(jīng)知道促纖維化蛋白例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)參與纖維化疾病。因?yàn)門GF-β誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成ECM，所以長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為該細(xì)胞因子是纖維化反應(yīng)的主要介質(zhì)(LeRoy等人，Eur.Cytokine Netw.，1:215-219)。十多年前發(fā)現(xiàn)CTGF是由人內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)(Bradman等人，J.CellBiol.，1991，114:1285-1294)，其由TGF-β誘導(dǎo)并且被認(rèn)為是TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞作用的下游介質(zhì)(Leask 等人，J.1nvest.Dermatol., 2004, 122:1-6 ；Grotendorst, G.R., Cytokine Growth Factor Rev.，1997，8:171-179)。同樣，TGF-β 誘導(dǎo)基質(zhì)蛋白纖連蛋白的ED-A形式(ED-AFN)的表達(dá)，其是通過(guò)纖連蛋白轉(zhuǎn)錄物的可變剪接而發(fā)生的一種纖連蛋白變體(Oyama 等人,Biochemistry, 1989, 28:1428-1434)。ED-AFN 的這種誘導(dǎo)是TGF-β 1-觸發(fā)的a-SMA和膠原I型表達(dá)增強(qiáng)所需要的(Serini等人，J.CellBiol.,142:873-881)。因此TGF-β被認(rèn)為是在許多組織的纖維化誘導(dǎo)中的“主要開(kāi)關(guān)”，所述組織包括例如肺(Sime 等人，Clin.1mmunol., 2001, 99:308-319)和腎(Lan, Int.J.Biol.Sc1.，2011，7:1056-1067)。在這一點(diǎn)上，在特發(fā)性肺纖維化患者的肺中或在慢性腎病患者的腎中TGF-β被上調(diào)，并且活性TGF-β在大鼠的肺或腎中的表達(dá)導(dǎo)致明顯的纖維化反應(yīng)，而對(duì)TGF-β I不能響應(yīng)提供了針對(duì)博來(lái)霉素-誘導(dǎo)的纖維化(Zhao等人，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.，2002，282:L585-L593)或腎間質(zhì)纖維化(Zeisberg 等人，NatMed, 2003，9:964-8)的保護(hù)作用。
[0011]上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程也已被廣泛認(rèn)為是受損組織經(jīng)歷纖維化反應(yīng)的常見(jiàn)機(jī)制。EMT是完全分化的上皮細(xì)胞經(jīng)歷向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)換的過(guò)程，其隨后產(chǎn)生成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞，并且其被越來(lái)越多地認(rèn)為在上皮損傷后的纖維化和瘢痕形成中起到重要作用。在肺和其它器官損傷后該過(guò)程促進(jìn)纖維化的程度是活躍的研究對(duì)象。近來(lái)，已經(jīng)證明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-P在體外和體內(nèi)在肺泡上皮細(xì)胞(AEC)中誘導(dǎo)EMT，并且上皮標(biāo)記和間充質(zhì)標(biāo)記共定位于特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者的肺組織中的增生性II型(AT2)細(xì)胞，表明AEC 可表現(xiàn)出極度可塑性并在肺纖維化中作為成纖維細(xì)胞和/或成肌纖維細(xì)胞的來(lái)源。首次描述了 TGF-β I在正常哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中作為EMT的誘導(dǎo)物(Miettinen等人，1994，127:2021-2036)并其后證明在體外在許多不同的上皮細(xì)胞中介導(dǎo)ΕΜΤ，所述上皮細(xì)胞包括腎近端小管、晶狀體和最近的肺泡上皮細(xì)胞(Fan等人，Kidney Int, 1999，56:1455-1467 ;Hales 等人，Curr Eye Res, 1994, 13:885-890 ；Kasai等人，Respir Res, 2005，6:56 ;Saika 等人，Am J Pathol, 2004, 164:651-663 ;和 Willis 等人，Am J Pathol, 2005, 166:1321-1332)。因此，EMT在纖維化中可起到常見(jiàn)的通用作用，無(wú)論潛在疾病病因如何。
[0012]盡管有關(guān)纖維化及其潛在的分子過(guò)程的知識(shí)有限(或缺乏)，但是纖維化疾病代表了缺乏有效療法的最大類別的病癥之一，并因此表現(xiàn)出嚴(yán)重不足的醫(yī)學(xué)需求。通常，對(duì)纖維化患者的唯一補(bǔ)救是器官移植。然而，因?yàn)槠鞴俟?yīng)不足以滿足需要，所以患者常常在等待接受合適器官期間死亡。僅肺纖維化可能是在硬皮病肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、放療和化療誘導(dǎo)的肺纖維化和職業(yè)性吸入塵 粒所致病況中的主要死亡原因。缺乏合適的抗纖維化治療，主要是因?yàn)閷?duì)纖維化疾病的病因?qū)W基本上還是未知的。了解如何控制正常組織修復(fù)和該過(guò)程在纖維化疾病中如何出錯(cuò)以便鑒定有效的治療方法將是至關(guān)重要的。[0013]能夠治療纖維化病況的新的治療解決方法將促進(jìn)本領(lǐng)域。具體地講，成功靶向潛在原因的治療對(duì)任何類型的纖維化疾病都通用，并且它能夠延緩、逆轉(zhuǎn)和/或消除纖維化或引起纖維化的潛在分子過(guò)程(包括EMT)。
[0014]發(fā)明概沭
[0015]本發(fā)明部分地基于本發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn):先前公開(kāi)的多肽/肽的一個(gè)亞類是BMP (骨形態(tài)發(fā)生蛋白)受體(包括I型和II型受體)的激動(dòng)劑，并且所述多肽/肽能夠抑制和/或逆轉(zhuǎn)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)和纖維化，并因此可用于治療性治療纖維化和纖維化相關(guān)的或涉及到纖維化的病況。因此，本發(fā)明涉及某些多肽/肽的設(shè)計(jì)、制備、以及在治療、抑制、逆轉(zhuǎn)和/或消除纖維化和/或?qū)е禄蛞鹄w維化病況的某些潛在病況(包括EMT)中的用途。利用本發(fā)明，具體而言是利用本發(fā)明的多肽/肽和方法，提供在機(jī)體的任何組織和/或器官中治療任何纖維化病況，包括但不限于糖尿病性腎病相關(guān)的纖維化、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎和硬皮病。
[0016]最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)，作為纖維發(fā)生的重要介質(zhì)，是EMT的誘導(dǎo)物，EMT進(jìn)而介導(dǎo)纖維化。進(jìn)一步鑒定ΒΜΡ-7逆轉(zhuǎn)TGF-β -誘導(dǎo)的ΕΜΤ，由此表明ΒΜΡ-7在抵消經(jīng)由EMT的纖維化發(fā)生中的作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)先前公開(kāi)的肽的特定亞類(如本文中進(jìn)一步描述)是BMP激動(dòng)劑，即模擬BMP或其特定亞部分并且經(jīng)由BMP受體而結(jié)合和活化BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的肽，有效抑制和/或逆轉(zhuǎn)EMT和與包括以下在內(nèi)的各種病況相關(guān)的纖維化:糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎和硬皮病。
[0017]因此，第一方面，本發(fā)明涉及某些肽或多肽(即，其可互換地稱為本發(fā)明的“化合物”、“肽”或“多肽”)，其是BMP受體(包括I型和II型受體)的激動(dòng)劑，并且其是先前公開(kāi)的肽的一個(gè)亞類。已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑化合物誘導(dǎo)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而模擬BMP對(duì)TGF- β -誘導(dǎo)的EMT和纖維化的抵消作用。在其它方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽的制備方法，包括通過(guò)生物和化學(xué)或合成方法。在再其它方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的肽或前肽(其可被切割或經(jīng)其它修飾以形成所需的本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽)，其包括用于在體外或體內(nèi)制備本發(fā)明的肽的核酸分子，例如在為了體基因轉(zhuǎn)移的目的中作為將本發(fā)明的肽遞送到有需要的受試者的手段。在又其它方面，本發(fā)明涉及物質(zhì)的藥物組合物，其包含本發(fā)明的一種或多種肽，或本發(fā)明的前肽，或編碼所述肽或前肽的一種或多種核酸分子，和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。在又一方面，本發(fā)明涉及在纖維化疾病患者中給予治療有效量的本發(fā)明的肽或藥物組合物以治療或預(yù)防(即預(yù)防性給予)纖維化或?qū)е吕w維化的相關(guān)潛在病況病癥(例如EMT)的方法，包括但不限于治療糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎和硬皮病。再一方面，本發(fā)明涉及藥盒或藥物包裝，其具有一個(gè)或多個(gè)容器、一種或多種本發(fā)明的肽或多肽或包含它們的藥物組合物、以及使用所述藥盒或藥物包裝的內(nèi)容物的說(shuō)明書。
[0018]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽可包含具有選自SEQ IDNO: 1-77(如表1或下文的他處所示)的氨基酸序列的肽。在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽可包含具有與SEQ ID NO: 1-77的那些肽相似的序列的肽，并且其特別可包含這樣的肽，所述肽具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少99%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少95%或更大的序列同一性，或與SEQID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少90%或更大的序列同一性，或與SEQ ID ΝΟ:1_77的任一個(gè)具有至少85%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少80%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少75%或更大的序列同一性，或與SEQ IDNO: 1-77的任一個(gè)具有至少70%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1_77的任一個(gè)具有至少65%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少60%或更大的序列同一I"生。
[0019]在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽可包含本發(fā)明的肽(和/或前肽，視情況而定)的任何合適的變體、類似物、同源物或片段，和與之相關(guān)的小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽調(diào)節(jié)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽調(diào)節(jié)纖維化。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽(其可包括其任何合適的變體、類似物、同源物或片段)模擬BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在其它具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽(其可包括其任何合適的變體、類似物、同源物或片段)將抵消、抑制和/或逆轉(zhuǎn)TGF-β-誘導(dǎo)的EMT。在再其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽(其可包括其任何合適的變體、類似物、同源物或片段)將抑制、逆轉(zhuǎn)或以其它方式消除纖維化。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含編碼表1的SEQ ID NO: 1-77的那些肽或并非表1的那些具體實(shí)施方案而在本發(fā)明范圍內(nèi)的任何肽或前肽的核苷酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子可以是DNA表達(dá)或克隆載體，并且所述載體可以任選地包括可與所述核酸操作性連接的啟動(dòng)子序列，其中啟動(dòng)子引發(fā)編碼本發(fā)明的肽或前肽的核苷酸序列的表達(dá)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，可將所述載體轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中，所述細(xì)胞例如原核或真核細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或更優(yōu)選人體細(xì)胞。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體可以是能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并導(dǎo)致SEQ ID NO: 1-77的多肽在感染所述病毒的動(dòng)物中表達(dá)的病毒載體。在仍其它實(shí)施方案中，所述核酸分子包含用于實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)的任何合適的和/或有利的元件，無(wú)論所述宿主細(xì)胞是原核還是真核宿主細(xì)胞，無(wú)論表達(dá)是在體外還是在體內(nèi)進(jìn)行。在再其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子可包含體基因轉(zhuǎn)移載體，以將編碼本發(fā)明的肽或其任何變體、類似物、同源物或片段(包括其任何有用的前肽)的核酸序列引入，用于通過(guò)體基因轉(zhuǎn)移將本發(fā)明的肽給予有需要的受試者。
[0021]就前肽而言，所述前肽是本發(fā)明的肽的無(wú)活性形式，其可在某些條件下被激活。制備前體藥物或前抗體的方法是已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述前肽可包含與目標(biāo)肽連接的一個(gè)或多個(gè)額外的多肽序列。在一種形式中，所述前肽是包括完整多肽序列的前導(dǎo)序列或末端部分的單一的多肽翻譯產(chǎn)物，所述前導(dǎo)序列或末端部分最初隨產(chǎn)物表達(dá)而存在，并且其降低或消除或掩蔽目標(biāo)肽的活性。前導(dǎo)序列或末端部分，一旦被去除(例如通過(guò)蛋白酶切割)，導(dǎo)致肽重獲其BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。
[0022]在本發(fā)明的藥物組合物的實(shí)施方案中，所述組合物可包含本發(fā)明的肽或多肽，有或無(wú)藥學(xué)上可接受的載體 。
[0023]在本發(fā)明的藥物組合物的其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含一種或多種另外的活性劑。一種或多種另外的活性劑可包括其它抗纖維化療法。一種或多種另外的活性劑還可包括涉及到導(dǎo)致或參與或涉及纖維化病況的潛在疾病或病況的其它療法。例如,在纖維化是糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎和硬皮病的組成部分的某些實(shí)施方案中，所述另外的一種或多種活性劑可包括有效針對(duì)治療不同于纖維化本身的這些潛在病況的其它癥狀或方面的藥劑。
[0024]在涉及到本發(fā)明肽的生產(chǎn)和/或制備方面，本發(fā)明涉及有關(guān)方法的某些實(shí)施方案，所述方法包括在提供表達(dá)所述肽的條件下培養(yǎng)含有編碼SEQ ID NO: 1-77的核酸分子的細(xì)胞；和回收所表達(dá)的肽。在某些其它實(shí)施方案中，所述核酸分子可編碼SEQ ID NO: 1-77或本發(fā)明的任何其它BMP-激動(dòng)劑肽的合適變體、類似物、同源物或片段。
[0025]在涉及到藥盒的方面，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥盒包括一個(gè)或多個(gè)容器、本文所述的肽或藥物組合物以及使用其中內(nèi)容物的說(shuō)明書。在某些實(shí)施方案中，所述肽可以是SEQ ID NO: 1-77或本發(fā)明的任何其它BMP-激動(dòng)劑肽的合適的變體、類似物、同源物或片段。在其它實(shí)施方案中，所述藥盒可包含一種或多種其它活性劑，例如可對(duì)于治療導(dǎo)致或包括纖維化要素的病況具有活性的那些，例如用于治療糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎或硬皮病的第二藥劑。在仍其它實(shí)施方案中，所述藥盒還可包含分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽或者SEQ ID NO: 1-77或本發(fā)明的任何其它BMP-激動(dòng)劑肽的變體、類似物、同源物或片段。在有需要的受試者中治療纖維化的方法中，藥盒的核酸分子可以適用于體基因轉(zhuǎn)移。
[0026]在涉及到本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明的肽的核酸分子在治療纖維化或者治療涉及或引起纖維化病況的病況中的用途的方面，在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在治療下的纖維化涉及糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎或硬皮病。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療慢性腎病(CKD)相關(guān)的纖維化、即CKD相關(guān)的腎纖維化的方法。在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及治療特發(fā)性肺纖維化。在仍其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療肝硬化相關(guān)的纖維化的方法。在再其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療心纖維化的方法。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的纖維化的方法。在再其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療硬皮病相關(guān)的纖維化的方法。
[0027]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通`過(guò)經(jīng)由合適方式給予受試者治療有效量的本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽或其變體、類似物、同源物或片段(包括表1中如SEQ ID NO: 1-77所確定的肽中的任一個(gè)或多個(gè))以治療、抑制和/或逆轉(zhuǎn)以下的疾病過(guò)程相關(guān)的纖維化的方法:例如，與糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎或硬皮病相關(guān)的纖維化。本發(fā)明的肽的給予可通過(guò)合適方式進(jìn)行，包括口服、胃腸外、輸注、注射、吸入或經(jīng)由皮膚或通過(guò)任何可行的方式。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以核酸分子的形式遞送本發(fā)明的肽(包括本發(fā)明的肽的任何前肽、或任何變體、類似物、同源物或片段)，所述核酸分子經(jīng)設(shè)計(jì)以編碼并在宿主體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的肽。
[0028]在本發(fā)明的方法中，給予的本發(fā)明的BMP-激動(dòng)劑肽可包含具有與SEQ ID NO: 1-77的那些肽相似的序列的肽，并且其特別可包含這樣的肽，所述肽具有的氨基酸序列與任何SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少99%或更大的序列同一性，或與SEQ ID N0:l_77的任一個(gè)具有至少95%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少90%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少85%或更大的序列同一性，或與SEQID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少80%或更大的序列同一性，或與SEQ ID N0:l_77的任一個(gè)具有至少75%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少70%或更大的序列同一性，或與SEQ ID NO: 1-77的任一個(gè)具有至少65%或更大的序列同一性，或與SEQ IDNO: 1-77的任一個(gè)具有至少60%或更大的序列同一性。
[0029]根據(jù)以下詳述，這些和其它實(shí)施方案被公開(kāi)或者是顯而易見(jiàn)的，并包含在以下詳述中。
[0030]附圖簡(jiǎn)沭
[0031]結(jié)合附圖，可以最大限度地理解以下詳述，所述詳述是以舉例方式給出，不得視為將本發(fā)明僅限于所述的具體實(shí)施方案中。
[0032]圖1描繪了對(duì)兩種濃度(100μΜ和200μΜ)的所鑒定的肽SEQ ID Ν0:1_11的E-鈣粘蛋白熒光的定量比色分析。通過(guò)熒光水平所示的E-鈣粘蛋白表達(dá)的損失是上皮表型的損失的指示?？梢杂蒙掀け硇偷膿p失的其它標(biāo)記進(jìn)行類似分析，所述其它標(biāo)記包括細(xì)胞角蛋白和頂端肌動(dòng)蛋白-結(jié)合跨膜蛋白-1(MUC-1)的損失。E-鈣粘蛋白表達(dá)的損失是EMT的普遍特征,無(wú)論起始刺激物如何(Hay E D, Acta Anat., 1995, 154:8-20)?？赏ㄟ^(guò)增加E-鈣粘蛋白產(chǎn)量而觀察間充質(zhì)表型的逆轉(zhuǎn)(Vanderburg CR, Acta Anat, 1996, 157:87-104)。
[0033]圖2 - 16是熒光顯微圖，顯示所測(cè)試的化合物(SEQ ID NO: 1-11)對(duì)E-鈣粘蛋白(上皮表型的標(biāo)記)水平的影響。圖2顯示了因在僅暴露給培養(yǎng)基的HK-2細(xì)胞上表達(dá)的E-鈣粘蛋白的免疫熒光染色的熒光，而圖3 (在IOOmMD-葡萄糖存在時(shí)的細(xì)胞)顯示了 D-葡萄糖-誘導(dǎo)的E-鈣粘蛋白表達(dá)的損失(經(jīng)細(xì)胞的免疫熒光染色而觀察)。圖4 - 16顯示了分別用IOOmMD-葡萄糖和IOOuM化合物SEQ ID NO:1 (TFA鹽、乙酸鹽和氯化物鹽)以及IOOuM化合物SEQ ID NO: 2 - 11處理的HK-2細(xì)胞的免疫熒光。因?yàn)椴磺宄谒星闆r下如何根據(jù)熒光顯微圖來(lái)評(píng)價(jià)化合物的作用，所以開(kāi)發(fā)了比色分析方法(參見(jiàn)實(shí)施例1-4的方法與材料，部分C)，并且分析結(jié)果見(jiàn)表3和圖1。
[0034]圖17描繪了支持實(shí)施例2所論述的研究的STZ實(shí)驗(yàn)方案。在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物養(yǎng)殖條件下維持正常飲食的遠(yuǎn)系繁殖(o ut-bred)CDl小鼠上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠接受單次腹膜內(nèi)注射在檸檬酸鈉緩沖液(PH4.5)中的鏈脲霉素(STZ)，劑量200mg/kg。通過(guò)尾靜脈采樣，使用葡萄糖氧化酶的酶促試驗(yàn)(Medisense glucometer, Abbott Laboratories, Bedford, MA)測(cè)定血糖。在STZ注射后5或6個(gè)月結(jié)束時(shí)(溶媒對(duì)照組)或6個(gè)月結(jié)束時(shí)(THR123或BMP-7組)處死的動(dòng)物組中評(píng)價(jià)糖尿病性腎病。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見(jiàn)圖17。從STZ注射后第5個(gè)月至第6個(gè)月，一組經(jīng)STZ注射小鼠接受每天口服給予劑量為5mg/kg體重的Thrasos化合物達(dá)一個(gè)月。從第I個(gè)月至第6個(gè)月，腹膜內(nèi)給予劑量為300 μ g/kg體重的ΒΜΡ-7。
[0035]圖18 - 22是在圖17所概述的和實(shí)施例2和3以及圖24_29所討論的研究中的代表性的小鼠組織顯微照片。更具體地講，這些是來(lái)自以下小鼠的腎切片的代表性顯微照片:對(duì)照小鼠、在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5個(gè)月的小鼠、在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后6個(gè)月的小鼠、在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后6個(gè)月并在誘導(dǎo)后I至6個(gè)月用ΒΜΡ7治療的小鼠、以及在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后6個(gè)月并在誘導(dǎo)后I至6個(gè)月用THR-123化合物(SEQ ID Ν01)治療的小鼠。
[0036]圖18:對(duì)照小鼠(無(wú)STZ，η=5)的腎切片的代表性組織學(xué)。
[0037]圖19:根據(jù)圖17所概述的和實(shí)施例2和3以及圖24_29所討論的研究，STZ-誘導(dǎo)的糖尿病性腎病后5個(gè)月的小鼠(η=6)的腎切片的代表性組織學(xué)。
[0038]圖20:根據(jù)圖17所概述 的和實(shí)施例2和3以及圖24_29所討論的研究，糖尿病性腎病誘導(dǎo)后6個(gè)月的小鼠(η=10)腎切片的代表性組織學(xué)。[0039]圖21:根據(jù)圖17所概述的和實(shí)施例2和3以及圖24_29所討論的研究，在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后6個(gè)月并在誘導(dǎo)后I至6個(gè)月用BMP-7治療的小鼠(n=4)的腎切片的代表性組織學(xué)。
[0040]圖22:根據(jù)圖17所概述的和實(shí)施例2和3以及圖24_29所討論的研究，在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后6個(gè)月并在誘導(dǎo)后5至6個(gè)月用THR-123(SEQ ID N01)治療的小鼠(n=9)的腎切片的代表性組織學(xué)。
[0041]圖23描繪了圖18-22中鑒定的腎切片的H&E (蘇木精和曙紅)和馬松三色(Masson’s trichrome)染色的定量測(cè)定。馬松三色-染色切片用于分析在間質(zhì)組織中的膠原蓄積。用該染色，膠原被染成藍(lán)色，細(xì)胞呈紅色。圖顯示了在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5和
6個(gè)月在小鼠腎中的間質(zhì)纖維化的明顯增加。然而，在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后用THR-123(SEQID N01)治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)后的小鼠中，表明間質(zhì)纖維化的膠原蓄積明顯減少。該分析方法在實(shí)施例1-4的方法C中討論。用THR-123在最后一個(gè)月的治療效果類似于BMP-7治療最后5個(gè)月所觀察到的效果，并且效果足夠大以表明纖維化逆轉(zhuǎn)。
[0042]圖24描繪了與正常動(dòng)物所觀察到的相比，在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5和6個(gè)月時(shí)FSP-1 (成纖維細(xì)胞分泌蛋白-1，一種間充質(zhì)標(biāo)記)表達(dá)凈增加分別為27和29倍。這樣的增加在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后用THR-123(SEQ ID N01)治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)的小鼠中被明顯降低。經(jīng)I個(gè)月治療之后，THR-123使標(biāo)記濃度降低至小于在5和6個(gè)月時(shí)水平的1/10。
[0043]圖25描繪了與正常動(dòng)物相比，在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5和6個(gè)月，小鼠表現(xiàn)出高百分率的損傷小管。然而，小管損傷在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后用THR-123 (SEQ ID N01)治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)的小鼠中明顯減少。因此，暴露給STZ導(dǎo)致了腎皮層中的完整小管的持續(xù)損失。I個(gè)月后開(kāi)始給予BMP終止了該進(jìn)展，并且在研究的最后一個(gè)月期間給予THR-123表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)小管的損失。
`[0044]圖26描繪了腎的相對(duì)間質(zhì)體積在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5和6個(gè)月的小鼠中明顯增加，而在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后用THR-123(SEQ ID N01)治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)或用BMP-7治療(從第I個(gè)月到第6個(gè)月)的小鼠中明顯減少。因此，在第一個(gè)月后開(kāi)始用BMP7治療終止了間質(zhì)體積增加的進(jìn)展，并且用THR-123(SEQ ID NO:1)治療表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)該進(jìn)展。
[0045]圖27描繪了腎小球表面在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5和6個(gè)月的小鼠中明顯增加，而在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后用THR-123(SEQ ID N01)治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)或用BMP-7治療(從第I個(gè)月到第6個(gè)月)的小鼠中明顯減少。因此，用BMP7治療表現(xiàn)出減慢腎小球的惡化，但THR-123(SEQ ID NO:1)表現(xiàn)出無(wú)效果。
[0046]圖28描繪了在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5和6個(gè)月的小鼠中腎小球膜基質(zhì)(mesangial matrix)增加。這種增加在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后用THR-123 (SEQ ID N01)治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)或用BMP-7治療(從第I個(gè)月到第6個(gè)月)的小鼠中被明顯降低。在6個(gè)月，用SEQ ID NO:1的治療使該水平降低至37%。
[0047]圖29描繪了在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后5和6個(gè)月的小鼠中BUN水平增加。然而，在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后用THR-123(SEQ ID N01)治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)或用BMP-7治療(從第I個(gè)月到第6個(gè)月)的小鼠中，BUN水平降至對(duì)照動(dòng)物的水平，表明在THR-123治療后腎功能的明顯改善。因此，在研究的最后5個(gè)月中給予BMP7，使BUN水平增加至2%，而用THR-123(SEQ ID NO:1)在處死前的最后一個(gè)月進(jìn)行治療，將BUN的增加從5個(gè)月時(shí)的85%降低至12%。
[0048]圖30提供了描述本發(fā)明的肽(稱為THR-123)的結(jié)構(gòu)的圖。該化合物對(duì)應(yīng)于表1的SEQ ID NO:1。該圖進(jìn)一步包括左邊的hBMP7結(jié)構(gòu)的三維stick模型并顯示了 hBMP7中的保守環(huán)的位置，其被THR-123至少部分地通過(guò)位置I的半胱氨酸和殘基11的半胱氨酸之間的二硫鍵的策略性安置所模仿。
[0049]圖31提供了一個(gè)表格，顯示出對(duì)于與I型和II型BMP受體結(jié)合，THR_123(SEQ IDNO:1)和 BMP-7 的比較。如同 BMP-7，THR-123 與 ALK2 和 ALK3 (I 型)BMP 受體和 BMPR-1I (II型)BMP受體兩者結(jié)合。然而，BMP-7，而非THR-123與ALK6(I型)受體結(jié)合。值得特別注意的是，與BMP7不同，THR-123不與ALK6BMP I型受體ECD結(jié)合。
[0050]圖32顯示了 THR-123(SEQ ID NO:1)誘導(dǎo)Smadl/5/8磷酸化和核易位，表明所述化合物是BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激動(dòng)劑。將人腎近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)在THR-123存在(右圖)和不存在(左圖)時(shí)孵育。細(xì)胞經(jīng)洗滌后，與針對(duì)phospho Smadl/5/8的第一抗體一起孵育，然后用熒光標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行免疫染色。在腎纖維化中pSmadl/5/8的顯著性依賴于TGF- β -依賴性促纖維化途徑的ΒΜΡ7抑制，所述途徑對(duì)腎纖維化損傷至關(guān)重要。具體地講，這樣的TGF- β -依賴性促纖維化途徑的ΒΜΡ7抑制，部分地由下游BMP靶蛋白Smadl、5 和 8 的活化而介導(dǎo)。(Manson SR 等人，J.Urol.85:2523-30，2011)。
[0051]圖33顯示了單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)后間質(zhì)體積的增加在圖中是明顯的。UUO動(dòng)物顯示出間質(zhì)空間擴(kuò)大3倍。在接受ΒΜΡ-7或THR-123(SEQ ID NO:1)的動(dòng)物中，間質(zhì)空間的擴(kuò)大被明顯減少，表明Thrasos化合物阻止了間質(zhì)纖維化。 [0052]圖34顯示了通過(guò)分析膠原沉積(纖維化的指標(biāo))進(jìn)一步檢查了單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)后腎間質(zhì)組織的擴(kuò)大。與假手術(shù)的腎相比，在經(jīng)溶媒治療的UUO腎中，羥脯氨酸含量(總膠原的度量)增加了 3倍。THR-123 (SEQ ID NO:1)和BMP-7有效地降低了 UUO-誘導(dǎo)的羥脯氨酸含量的增加，表明THR-123改善了 UUO-誘導(dǎo)的腎纖維化。
[0053]圖35提供柱狀圖，顯示在人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中，THR-123 (SEQ ID NO:1或“THR-C”)和特定抑制劑SB203580對(duì)p38MAPK的磷酸化水平的作用的比較。p38MAPK的重要性在于該蛋白涉及對(duì)TGF- β -依賴性EMT的非Smad-依賴性途徑。涉及TGF- β -依賴性EMT的其它非Smad-依賴性途徑包括RhoA、Ras、PI3激酶、Notch和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。所述結(jié)果顯示THR-123在HK-2細(xì)胞中有效地抑制了基礎(chǔ)p38磷酸化。用作陽(yáng)性對(duì)照的特定抑制劑SB203580和BMP-7，正如所料地抑制了 p38磷酸化。在測(cè)定中，IuM的較低濃度的THR-123與IOuM的所述特定抑制劑效力相同。
[0054]圖36提供柱狀圖，顯示THR-123(SEQ ID NO:1或“THR-C”)和特定抑制劑SB203580對(duì)TNF- α刺激所致的ρ38ΜΑΡΚ磷酸化水平的作用的比較。已經(jīng)證實(shí)促炎因子對(duì)ρ38ΜΑΡΚ活性的調(diào)節(jié)與纖維化有關(guān)。結(jié)果表明TNFa在冊(cè)-2細(xì)胞中誘導(dǎo)？38磷酸化，并且了即(！所誘導(dǎo)的磷酸化受到單獨(dú)的THR-123或THR-123與SB203580組合的有效抑制。
[0055]圖37提供柱狀圖，顯示在人腎小管上皮細(xì)胞(ΗΚ-2)中，THR-123 (或“THR-1405”)和特定抑制劑SB203580對(duì)TNF- a -誘導(dǎo)的IL-6 ( 一種炎性標(biāo)記)產(chǎn)生的水平的作用比較。結(jié)果表明TNF a在HK-2細(xì)胞中刺激IL-6產(chǎn)生。THR-123或SB203580單獨(dú)添加，明顯減少了由HK-2細(xì)胞產(chǎn)生的TNFa-誘導(dǎo)的IL-6。與單獨(dú)THR-123相比，添加這兩者的組合導(dǎo)致了 IL-6產(chǎn)量的更大減少。這些結(jié)果表明，通過(guò)THR-123阻斷p38活化，抑制了作為腎纖維化進(jìn)展的重要決定因素的細(xì)胞炎癥。
[0056]圖38:經(jīng)由p38促分裂原-激活的蛋白激酶(MAPK)的腫瘤壞死因子_a(TNF_a)的產(chǎn)生是由腎毒性劑順鉬所致的AKI的發(fā)展中的一個(gè)關(guān)鍵性機(jī)制(Ramesh，G和Reeves, WB.Am J Physiol Renal Physiol289:F166_F174，2005)。因此進(jìn)一步檢查 THR-123 以確定所述化合物是否能夠在動(dòng)物中抑制順鉬-誘導(dǎo)的腎毒性。圖中上方的右圖和左圖顯示了對(duì)于ICAM-1表達(dá)免疫染色的腎切片，下方的右圖和左圖顯示了對(duì)于巨噬細(xì)胞存在而言的免疫染色。左欄中的腎切片為僅用順鉬治療，右欄的圖為用順鉬和THR-123治療。上方的圖中的箭頭指示被THR-123減少的ICAM-1表達(dá)。下方的圖中的箭頭指示經(jīng)Mac CD-68染色測(cè)定的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，THR-123減少這種浸潤(rùn)。結(jié)果表明在受損的腎PTEC中能夠抑制p38MAPK的THR-123，能夠抑制巨噬細(xì)胞的小管浸潤(rùn)，并由此在大鼠中抑制順鉬-誘導(dǎo)的腎毒性的炎癥。
[0057]圖39證明了腎近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)中的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)受到THR-123的阻止。將HK-2細(xì)胞暴露給高葡萄糖，導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達(dá)的顯著損失(下圖)，這表明EMT被誘導(dǎo)。THR-123在腎PTEC中能有效阻止D-葡萄糖(50mM)誘導(dǎo)的上皮表型的損失(通過(guò)E-鈣粘蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià))。這些結(jié)果表明在血糖過(guò)多病況(糖尿病病況)下Thrasos化合物能阻止上皮-間充質(zhì)-轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程，該過(guò)程是涉及小管-間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制。
[0058]圖40證明了口服給予的THR-123對(duì)小鼠慢性腎病的晚期糖尿病性腎病模型的作用。當(dāng)在糖尿病性腎病誘導(dǎo)后小鼠用口服THR123治療I個(gè)月(從第5個(gè)月到第6個(gè)月)時(shí)，所述化合物減少了腎纖維化(右下圖)并減少了間質(zhì)體積(柱狀圖)。
[0059]圖41證明了 THR-123不能誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(C3H10T1/2)的成骨細(xì)胞性分化。將用單獨(dú)介質(zhì)、BMP-7或THR-123處理的鼠多能間充質(zhì)干細(xì)胞(C3H10T1/2)針對(duì)堿性磷酸酶活性(一種骨發(fā)生標(biāo)記)染色。當(dāng)用單獨(dú)介質(zhì)(對(duì)照，圖A)或用THR-123(圖B)處理時(shí)未見(jiàn)細(xì)胞染色。作為陽(yáng)性對(duì)照的BMP-7，2ug/mL (圖C)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的成骨細(xì)胞性分化，如針對(duì)堿性磷酸酶活性染色所示。細(xì)胞用蘇木精復(fù)染色。
[0060]圖42.在腎小管中的內(nèi)源Alk-3表達(dá)對(duì)腎纖維化的作用。A.定量實(shí)時(shí)PCR。在腎毒性血清腎炎誘導(dǎo)之前(第O天)和之后(免疫后I周、3周、6周和9周)，自C57BL/6小鼠腎中分離總RNA。使用針對(duì)指定基因的特定引物組進(jìn)行定量RT PCR0本圖顯示了在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)針對(duì)18sRNA的相對(duì)表達(dá)。B-D.對(duì)照或腎毒性血清處理的腎的馬松三色染色的代表性的圖。放大倍數(shù)xlOO。E-G.用對(duì)磷酸化Smadl (活性BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的標(biāo)志)具有特異性的抗體標(biāo)記的相應(yīng)的腎(B-D)的代表性的圖。放大倍數(shù)x200。H.示意圖。將表達(dá)處于YGT啟動(dòng)子控制之下的Cre-重組酶的小鼠培育成這樣的小鼠:其中通過(guò)floxed STOP盒將LacZ報(bào)道基因與Rosa26啟動(dòng)子分開(kāi)，產(chǎn)生yGT-Cre ；R26R-ST0P-LacZ報(bào)道小鼠。1-J.β-半乳糖苷酶染色。對(duì)照R26R-ST0P-LacZ小鼠(I)和Y GT-Cre ;R26R-ST0P_LacZ報(bào)道小鼠(J)的腎經(jīng)酶促染色，以檢測(cè)用曙紅復(fù)染色的β_半乳糖苷酶活性(藍(lán)色沉淀)。圖中的箭頭指示代表性的LacZ染色。放大 倍數(shù)χ400。K.示意圖。通過(guò)將YGT-Cre小鼠與攜帶floxed Alk-3等位基因的小鼠雜交，產(chǎn)生在腎小管上皮細(xì)胞U GT-Cre，Alk-3fWfl°x)中條件性地缺乏Alk-3的小鼠。L-M.Alk-3免疫組織化學(xué)分析。Alk_3在對(duì)照Alk_3fl°x/fl°x小鼠中穩(wěn)健表達(dá)(L)。在YGT-Cre ;Alk_3fWfl°x小鼠(M)中未檢出小管Alk_3蛋白表達(dá)。N-U.組織病理學(xué)。Y GT-Cre ;Alk_3fWfl°x小鼠和同窩對(duì)照小鼠(Alk_3fl°x/fl°x)用腎毒性血清進(jìn)行攻擊。放大倍數(shù)x200的馬松三色染色腎的代表性的圖。V.在NTN腎中的纖維化的定量測(cè)定。通過(guò)imagej軟件分析馬松三色染色圖并定量測(cè)定纖維化面積。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析4-6只小鼠。W.在NTN60天，在Y G-Cre ;Alk_3fWflox小鼠(n=5)和同窩對(duì)照小鼠(n=3)中測(cè)定血液尿素氮。X，Y.對(duì)照(Alk3fl°x/fl°x)和YGTCre ;Alk3fl°x/fl°x小鼠的腎的E-鈣粘蛋白/FSPl免疫標(biāo)記。Z.通過(guò)計(jì)數(shù)雙重標(biāo)記的小管數(shù)量,評(píng)價(jià)E-1丐粘蛋白/FSPl雙重陽(yáng)性小管的百分率，每玻片500小管，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值土s.e.m.。
[0061]圖43.在 YGT-Cre ;Alk3fWflra￡ 小鼠中增加的小管 p_smad2 蓄積。A，B.Alk3fWflra￡和gGTCre ;Alk3fl°x/fl°x小鼠的腎的phospho-smad2(p-smad2)免疫標(biāo)記。C.在小管中評(píng)價(jià)p-smad2陽(yáng)性小管的百分率，每玻片500小管，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值 ± s.e.m.。
[0062]圖44.在YGT-Cre ；Alk3flox/flox小鼠中的巨噬細(xì)胞蓄積。使用Mac-1抗體標(biāo)記冷凍切片的巨噬細(xì)胞并通過(guò)熒光顯微鏡術(shù)進(jìn)行免疫熒光分析。在無(wú)病的腎中(A和B)發(fā)現(xiàn)少量巨噬細(xì)胞。在Alk3fWfl°x小鼠的NTN腎中，巨噬細(xì)胞蓄積(C)，這樣的巨噬細(xì)胞蓄積在YGT-Cre;Alk3fl°x/fl°x小鼠⑶的NTN腎中是明顯的。顯示了來(lái)自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性的圖。
[0063]圖45.THR-123的藥代動(dòng)力學(xué)。A.BMP7結(jié)構(gòu)圖，其殘基量來(lái)自對(duì)其作圖的分析。B, C.對(duì)單個(gè)I型受體、Alk-3 (B)和Alk-6(C)具有特異性的放射性_配體受體結(jié)合測(cè)定。Alk-3或Alk-6的高度純化的胞外域伍⑶)(作為與Fe結(jié)構(gòu)域的融合蛋白表達(dá))作為受體。在每次測(cè)定中，將純化受體固定在各孔并加入肽類似物或未標(biāo)記的BMP7，然后加入1251-標(biāo)記的BMP7。在自動(dòng)Y計(jì)數(shù)器上對(duì)放射性標(biāo)記的BMP7復(fù)合物計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為平均值土s.e.m.。在兩次測(cè)定中作為陽(yáng)性對(duì)照的未標(biāo)記的BMP7，給出線性的劑量相關(guān)的反應(yīng)曲線。D, E.在經(jīng)由尾靜脈iv注射THR-123 (1251-Tyr)之后在Wistar大鼠體循環(huán)中的THR-123的濃度，其通過(guò)總放射性測(cè)量法來(lái)測(cè)定。α期(D)為大約90%注射劑量并具有非常短的半壽期。β期(E)為注射劑量的剩余的10%并具`有長(zhǎng)得多的半壽期，為55 - 58min。F.125I_THR_123的組織分布。大鼠經(jīng)靜脈內(nèi)給予劑量為6.25mg/kg-體重的125I標(biāo)記-THR-123后6小時(shí)，收獲組織并通過(guò)自動(dòng)Y孔計(jì)數(shù)器分析。大部分放射性位于腎和膀胱內(nèi)。G.口服給予THR-123和THR-123從體內(nèi)的清除?？诜o予劑量為5mg/kg體重的125I標(biāo)記-THR-123的放射性在給予后1-6小時(shí)之間定位于腎內(nèi)，峰值在大約3小時(shí)。125I標(biāo)記-THR-123的放射性在給予后24小時(shí)從腎中完全清除。
[0064]圖46.THR-123的體外穩(wěn)定性。將THR-123以0.lmg/mL的終濃度加入到新鮮收獲的大鼠血液(雄性Sprague-Dawley，0.35kgBff)和血漿以及PBS-甘露醇緩沖液中。將血液、血漿和緩沖液的母管在37°C孵育至多6h并在0、7.5、15、30、60、120、240和360min收集雙份樣品的500 μ I (血液)和250 μ I (血漿和血液)用于分析。使用檢測(cè)限為I μ g/ml的LC-MS-MS方法分析樣品中的THR-123。THR-123在血漿中緩慢降解，半壽期為358min，而在血液中降解較快，半壽期僅為70min。在PBS-甘露醇緩沖液中，超過(guò)400min未觀察到降解。
[0065]圖47.THR-123的抗炎活性。將PTEC-衍生的HK_2 (HK-2)細(xì)胞培養(yǎng)在24-孔板(30，OOO細(xì)胞/孔)上。將細(xì)胞暴露給單獨(dú)的K-SFM培養(yǎng)基或TNF-a (5ng/ml)。TNF-α孵育后20小時(shí)，細(xì)胞用預(yù)加溫的培養(yǎng)基洗滌2次，隨后將細(xì)胞與不同濃度的THR-123或ΒΜΡ7孵育60小時(shí)。在孵育結(jié)束時(shí)，收獲培養(yǎng)基并進(jìn)行ELISA分析。A:1L-6，B:1L-8和C=ICAM-1結(jié)果已給出。一式三份地進(jìn)行分析，圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土 s.e.m.。
[0066]圖48.THR-123在NP-1細(xì)胞中抑制TGF-β-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在指定分子存在時(shí)將NP-1細(xì)胞與TGF-β (3ng/ml) 一起孵育24h。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記(Roche)分析細(xì)胞凋亡。單用 TGF- β (A)、用 TGF- β +ΒΜΡ-7 (I μ g/ml)⑶、TGF- β +THR-123 (10 μ Μ) (C)和TGF-P+ctrl肽⑶處理的細(xì)胞的代表性的合并圖(綠色:膜聯(lián)蛋白V和明視場(chǎng)圖像)。TGF-β增加細(xì)胞凋亡，而ΒΜΡ-7和THR-123減少細(xì)胞凋亡。
[0067]圖49.THR-123在ΝΡ-1細(xì)胞中抑制缺氧-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在指定分子存在時(shí)將NP-1細(xì)胞在缺氧(2.5%02)時(shí)孵育24h。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記(Roche)分析細(xì)胞凋亡。單用缺氧(A)、用缺氧 +BMP-7 (I μ g/ml) (B)、缺氧 +THR-123 (10 μ M) (C)和缺氧 +ctrl 肽(D)處理的細(xì)胞的代表性的合并圖(綠色:膜聯(lián)蛋白V和明視場(chǎng)圖像)。缺氧增加細(xì)胞凋亡；BMP-7和THR-123減少細(xì)胞凋亡。
[0068]圖50.THR-123在人近端小管上皮細(xì)胞(HK2)中抑制順鉬_誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。將永生化的人近端小管上皮-衍生的HK-2 (人腎-2)細(xì)胞在24-孔板上傳代(~25，000至30，000細(xì)胞/孔)。將細(xì)胞暴露給單獨(dú)的K-SFM培養(yǎng)基或者含有THR-123的K-SFM培養(yǎng)基。BMP7作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。孵育后2小時(shí)，將細(xì)胞暴露給順鉬60小時(shí)(A-C)。D.將細(xì)胞暴露給順鉬6小時(shí)，然后將THR-123加入到培養(yǎng)基中。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TACS膜聯(lián)蛋白V-FITC) (R&D Systems)染色，然后通過(guò)熒光顯微鏡術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡。終濃度:THR-123250 μ Μ、ΒΜΡ-71 μ g/ml、順鉬 10 μ Μ。
[0069]圖51.THR-123在NP-1細(xì)胞中抑制上皮_間充質(zhì)轉(zhuǎn)換。A-E:明視場(chǎng)圖像。暴露給TGF- β (各3ng/ml在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中)和EGF達(dá)48h的細(xì)胞經(jīng)歷EMT，顯示出細(xì)胞形狀與對(duì)照細(xì)胞相比明顯拉長(zhǎng)(A、B)。BMP-7 (1 μ g/ml)或THR-123 (10 μ Μ)的共孵育阻止這些表型變化(C、D)。對(duì)照肽顯示出對(duì)TGF- β -誘導(dǎo)的EMT無(wú)效果(E)。F-J.E-鈣粘蛋白免疫熒光標(biāo)記。NP-1細(xì)胞在細(xì)胞邊緣表達(dá)E-鈣粘蛋白(F)。暴露給TGF-β達(dá)48h的細(xì)胞表現(xiàn)出E-鈣粘蛋白水平與對(duì)照細(xì)胞相比明顯下降(F、G)。BMP-7 (1 μ g/ml)或THR-123 (10 μ Μ)的共孵育阻止E-鈣粘蛋白的損失(Η、Ι)。對(duì)照肽顯示出對(duì)TGF-β-誘導(dǎo)的EMT無(wú)效果(J)。顯示了代表性結(jié)果。
[0070]圖52.THR-123在MCT細(xì)胞中抑制上皮_間充質(zhì)轉(zhuǎn)換。THR-123抑制ΕΜΤ。暴露給TGF- β (各2.5ng/ml在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中)達(dá)48h的細(xì)胞經(jīng)歷EMT，顯示出細(xì)胞形狀明顯拉長(zhǎng)⑶。THR-123(10yM)的共孵育阻止了這些表型變化(C)。D、E.間充質(zhì)標(biāo)記CTGF(D)和Snaill (E)的qPCR分析。從細(xì)胞中提取總RNA。IygS RNA用于產(chǎn)生互補(bǔ)cDNA，然后進(jìn)行qPCR。N=3。圖中的數(shù)據(jù)表示為平均值土 s.e.m.。
[0071]圖53.THR-123在NP-1細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)EMT。A-E:倒置顯微鏡圖。A.NPl細(xì)胞的基底多邊形上皮性質(zhì)。B.與TGF-β和EGF孵育48h誘導(dǎo)EMT并顯示出拉長(zhǎng)的紡錘形細(xì)胞。C、D.將BMP7(lμg/ml) (C)或THR-123 (10 μ M) (D)加入到經(jīng)TGF-β和EGF誘導(dǎo)的間充質(zhì)樣細(xì)胞中再過(guò)48小時(shí)。細(xì)胞顯示出形態(tài)學(xué)的逆轉(zhuǎn)并再次顯示出多邊形上皮性質(zhì)(Cd)15E.Ctrl肽不逆轉(zhuǎn)EMT。F.在逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中計(jì)算長(zhǎng)寬比。通過(guò)使用倒置顯微鏡，得到孔中不同區(qū)域的細(xì)胞的5個(gè)代表性圖。分析了總共100個(gè)細(xì)胞(每圖20個(gè)細(xì)胞)。上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征在于較低比例，而間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為較高比例。圖中的數(shù)據(jù)表示為平均值+s.e.m.。G.NP-1細(xì)胞的基礎(chǔ)長(zhǎng)寬比為1.4+0.2 (平均值土 SD)。平均值加上一個(gè)SD被估計(jì)為上皮特征并估計(jì)了各實(shí)驗(yàn)設(shè)置中的上皮特征的百分率。18%BMP7和24%THR-123處理的NP-1細(xì)胞重新得到上皮特征。H-L.E-鈣粘蛋白的免疫熒光圖。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，TGF-β孵育降低了E-鈣粘蛋白水平(H、I)。BMP-7(J)和THR-123(K)在TGF-β -孵育的NP-1細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)了E-鈣粘蛋白表達(dá)。Ctrl肽顯示對(duì)E-鈣粘蛋白水平無(wú)影響(L)。顯示了 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。
[0072]圖54.THR-123在MCT細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)TGF- β -誘導(dǎo)的ΕΜΤ。Α-Ε.細(xì)胞通過(guò)TGF- β和EGF 孵育 48h 而誘導(dǎo) EMT (E)。EMT 誘導(dǎo)后，將細(xì)胞與 BMP-7 (I μ g/ml) (C)、THR-123 (10 μ Μ)
(D)或?qū)φ针?E)再孵育48h。觀察到EMT逆轉(zhuǎn)(C、D)。Ctrl肽表現(xiàn)出無(wú)效果(E)。F.在逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中計(jì)算長(zhǎng)寬比。通過(guò)使用倒置顯微鏡，得到孔well中不同區(qū)域的細(xì)胞的5個(gè)代表性圖。分析了總共100個(gè)細(xì)胞(每圖20個(gè)細(xì)胞)。上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征在于較低比例，而間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為較高比例。圖中的數(shù)據(jù)表示為平均值土 s.e.m.。G:在MCT細(xì)胞中長(zhǎng)寬比為3或以下被估計(jì)為上皮特征，并估計(jì)了各實(shí)驗(yàn)設(shè)置中的上皮特征的百分率。52%BMP7和41%THR-123處理的MCT細(xì)胞重新得到上皮特征。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0073]圖55.THR-123對(duì)缺血再灌注損傷所致的急性小管損傷的影響。通過(guò)將左腎蒂鉗制25分鐘誘導(dǎo)缺血再灌注損傷(IRI)。缺血再灌注損傷后，小鼠接受THR-123 口服(5mg/kg/天)或PBS直到處死之日。A.缺血再灌注后在磷酸鹽緩沖鹽水處理的小鼠中的腎組織學(xué)顯示了嚴(yán)重急性小管壞死。箭頭指示壞死的小管。B.缺血再灌注程序后，同時(shí)給予THR-123治療的小鼠中的腎組織學(xué)顯示了輕度小管壞死。C.在THR-123處理的小鼠中的腎小管壞死百分率顯著地小于經(jīng)磷酸鹽緩沖液處理的小鼠。分析了每組的10個(gè)視場(chǎng)。D.在第7天IRI通過(guò)quantichrome比色尿素測(cè)定法估計(jì)血液尿素氮。所有組都無(wú)差異。分析了 PBS組(n=5)和THR-123-處理組(n=4)。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土 s.e.m.。
[0074]圖56.THR-123對(duì)單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)小鼠的影響。在UUO之日，開(kāi)始BMP-7 (300 μ g/Kg/每隔一天，腹膜內(nèi)給予)或THR-123 (5mg/Kg/天，口服或腹膜內(nèi)給予)。A-D:正常腎、第5天UUO腎的馬松三色染色。A.正常腎切片。B.第5天UUO小鼠腎顯示正常腎小球、小管萎縮、小管擴(kuò)張和間質(zhì)性炎癥。C、D.用5mg/kg(C)或15mg/kg(D)的THR-123口服治療的UUO小鼠腎顯示了較少的小管萎縮、小管擴(kuò)張和間質(zhì)性炎癥。E.相對(duì)間質(zhì)體積的形態(tài)測(cè)量分析。通過(guò)點(diǎn)計(jì)數(shù)法計(jì)算間質(zhì)體積。F-1.正常腎、第7天UUO腎的馬松三色染色。與用PBS治療(F)的小鼠相比，用BMP7-腹膜內(nèi)(G)或THR-123-腹膜內(nèi)⑶/ 口服(I)治療的UUO小鼠顯示了較少的腎間質(zhì)體積。1.相對(duì)間質(zhì)體積的形態(tài)測(cè)量分析。通過(guò)點(diǎn)計(jì)數(shù)法計(jì)算間質(zhì)體積。對(duì)于小管-間質(zhì)損傷的定量測(cè)定，在每只小鼠中分析每個(gè)腎的8視場(chǎng)。正常小鼠(n=4)、第5天UUO無(wú)治療(n=4)、第5天UUO并用5mg/kg THR-123治療(n=4)、第5天UUO并用15mg/kgTHR-123治療(n=4)、第7天UUO并用PBS治療(n=8)、第7天UUO并用BMP治療(n=8)和第7天UUO并用THR-123治療的小鼠(同時(shí)對(duì)于1.P.和口服，n=7)。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土s.e.m.。
[0075]圖57.THR-123對(duì)單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)小鼠的影響(H&E染色)。在UUO進(jìn)行之日，開(kāi)始BMP7治療(300μ g/Kg/每隔一天，腹膜內(nèi)給予)或THR-123治療(5mg/Kg/天，口服或腹膜內(nèi)給予)。A.正常腎切片。B.第5天UUO小鼠。C、D.用5mg/kg(C)或15mg/kg(D)的THR-123 口服治療的UUO小鼠腎。E-H.第7天UUO腎組織學(xué)。當(dāng)與在第7天的PBS治療
(E)的UUO腎相比時(shí)，用BMP7-腹膜內(nèi)(F)或THR-123-腹膜內(nèi)(G)/ 口服(H)治療的UUO小鼠在腎中表現(xiàn)出維持的小管。正常小鼠(n=4)、第5天UUO無(wú)治療(n=4)、第5天UUO并用5mg/kg THR-123 治療(n=4)、第 5 天 UUO 并用 15mg/kg THR-123 治療(n=4)、第 7 天 UUO 并用PBS治療(n=8)、第7天UUO并用BMP治療(n=8)和第7天UUO并用THR-123治療的小鼠(1.p.和口服兩者，n=7)。
[0076]圖58.在UUO小鼠中對(duì)纖維化標(biāo)記進(jìn)行基因表達(dá)分析。在正常腎和第7天UUO腎(有或無(wú)指定治療)中對(duì)于纖連蛋白-EIII和膠原I型進(jìn)行定量RT-PCR分析。
[0077]圖59.AA-123在腎毒性血清腎炎小鼠中逆轉(zhuǎn)腎纖維化。A_D.來(lái)自以下小鼠腎切片的代表性馬松三色染色圖:未治療的對(duì)照小鼠㈧；6周NTN(B) ;NTN后9周(C);和在6周NTN開(kāi)始給予THR-123的9周NTN(D)，原始放大倍數(shù)x200。E_G.以下小鼠的形態(tài)測(cè)量分析:對(duì)照小鼠(O周)(n=5)，在NTN誘導(dǎo)后I周(n=6)、3周(n=8)和6周(n=6)的小鼠，以及在6周NTN開(kāi)始給予THR-123的9周NTN小鼠(THR-123 (6-9W) (n=6))，評(píng)價(jià)腎小球硬化癥評(píng)分百分率(E)、小管萎縮指數(shù)(F)和纖維化指數(shù)(G)。H.對(duì)以下小鼠進(jìn)行血液尿素氮測(cè)量:6 周 NTN(n=3)、9 周 NTN(n=5)和在 6 周 NTN 開(kāi)始給予 THR-123 的 9 周 NTN(n=5)。1-L.來(lái)自以下小鼠的腎的E-鈣粘蛋白/FSPl免疫標(biāo)記:對(duì)照未治療小鼠(I)、6周NTN(J)、9周NTN(K)、和在6周NTN開(kāi)始給予THR-123的9周NTN(L)。顯示了代表性結(jié)果。M.通過(guò)統(tǒng)計(jì)雙重標(biāo)記的小管數(shù)量，評(píng)價(jià)E-鈣粘蛋白/FSPl雙重陽(yáng)性小管的百分率，每玻片500小管，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值土s.e.m.。
[0078]圖60.腎毒性血清腎炎小鼠的腎的光學(xué)顯微鏡(H&E)分析。來(lái)自以下小鼠的腎的代表性的組織學(xué)H&E染色:未治療的對(duì)照小鼠㈧；6周NTN(B)、9周NTN(C);和在NTN誘導(dǎo)后6周開(kāi)始給予THR-123的9周NTN(D)，放大倍數(shù)x200。
`[0079]圖61.在腎毒性血清腎炎小鼠中對(duì)纖維化標(biāo)記進(jìn)行基因表達(dá)分析。經(jīng)由定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)定，對(duì)在以下小鼠的腎中的纖連蛋白(FN-EIII)和I型膠原(COL-1)進(jìn)行Fold基因表達(dá):對(duì)照小鼠(O周NTS) (n=5)，I周(n=6)、3周(n=8)和6周(n=6) NTN后的小鼠以及在NTN 誘導(dǎo)后 6 周給予 THR-123 的 9 周 NTN 的小鼠(THR-123 (6-9W) (n=6))。
[0080]圖62.在腎毒性血清腎炎小鼠中的巨噬細(xì)胞分析。A-C.來(lái)自以下小鼠的腎的Mac-1免疫標(biāo)記:未治療的對(duì)照小鼠(A)、6周NTN(B);和9周NTN(C)、以及在NTN誘導(dǎo)后6周開(kāi)始給予THR-123治療的9周NTN(D)，放大倍數(shù)x400。E.通過(guò)統(tǒng)計(jì)每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中的陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每個(gè)視場(chǎng)(x400放大倍數(shù))的巨噬細(xì)胞數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。
[0081 ] 圖63.在NTN中的phospho-smadl/5標(biāo)記。A-C.指定動(dòng)物組的冷凍腎切片用phospho-smadl/5 (p-smadl/5)抗體標(biāo)記，然后用FITC-綴合的第二抗體。通過(guò)突光顯微鏡術(shù)分析P_smadl/5水平。圖(C)中的箭頭指示核蓄積的p-smadl/5。D.p-smadl/5水平的定量測(cè)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中的陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的p-smadl/5數(shù)量(x400放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土 s.e.m.。
[0082]圖64.AA-123在C0L4A3缺陷型小鼠中抑制腎纖維化。A_C.來(lái)自以下小鼠的腎小球的代表性組織學(xué)PAS染色:16周齡野生型(A) ； 16周齡C0L4A3-/- (B)、和用THR-123治療的16周齡C0L4A3-/-小鼠(C)，原始放大倍數(shù)x400。D-F.來(lái)自以下小鼠的腎的代表性的組織學(xué)馬松三色染色:16周齡野生型(D) ；16周齡C0L4A3-/-(E)，和用THR-123治療的16周齡C0L4A3-/-小鼠(F)，原始放大倍數(shù)xlOO。G_1.以下小鼠的形態(tài)測(cè)量分析:16周齡野生型(n=5)、⑶L4A3-/-(n=5)和用THR-123治療的C0L4A3-/-小鼠(n=5)，評(píng)價(jià)正常腎小球百分率(G)、小管損傷指數(shù)(H)、相對(duì)間質(zhì)體積(I)。J.以下小鼠的血液尿素氮測(cè)量:20周齡野生型(n=5)、16 周齡 C0L4A3-/-(n=5)和用 THR-123 治療的 C0L4A3-/-小鼠(n=5)。K-M.腎的FSP1/E-鈣粘蛋白免疫標(biāo)記。顯示了代表性結(jié)果。N.E-鈣粘蛋白/FSPl雙重陽(yáng)性小管的百分率，每玻片500小管，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。
[0083]圖65.在C0L4A3缺陷型小鼠中的巨噬細(xì)胞分析。A-C.來(lái)自以下小鼠的腎的Mac-1免疫標(biāo)記:16周齡野生型(A)、⑶L4A3-/-(B)和用THR-123治療的C0L4A3-/-小鼠(C)。原始放大倍數(shù)為x400。D.通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的巨噬細(xì)胞數(shù)的形態(tài)測(cè)量分析(x400放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土 s.e.m.。圖中的野生型小鼠被稱為C0L4A3+/+。
[0084]圖66.在C0L4A3缺陷型小鼠中的phospho-smadl/5染色。A、B.指定動(dòng)物組的冷凍腎切片用phospho-smadl/5 (p-smadl/5)抗體標(biāo)記,然后用FITC-綴合的第二抗體。通過(guò)突光顯微鏡術(shù)分析p-smadl/5水平。圖(B)中的箭頭指示核蓄積的p-smadl/5。C.p-smadl/5水平的定量測(cè)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的p-smadl/5數(shù)量(x400放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值+ s.e.m.ο
[0085]圖67.THR-123逆轉(zhuǎn)了小鼠糖尿病性腎病的進(jìn)程。鏈脲霉素_誘導(dǎo)的糖尿?、莀1小鼠用BMP7治療(300 μ g/kg每隔一天，IP,糖尿病誘導(dǎo)后1-6月)或THR-123治療(5mg/kg/天，口服，糖尿病誘導(dǎo)后5-6月)。來(lái)自以下小鼠的代表性的腎切片組織學(xué)PAS染色(A-E)和馬松三色染色(F-J):未治療的對(duì)照小鼠(A, F) ;5個(gè)月糖尿病性腎病(DN) (B, G)；6個(gè)月DN(C，H) ；BMP7處理的6個(gè)月DN(D，I);和THR-123處理的6個(gè)月DN(E，J)。放大倍數(shù)x400(A-E)和xlOO (F-J )。K-N:腎小球和小管-間質(zhì)組織的形態(tài)測(cè)量分析。分析了腎小球表面積(K)、腎小球膜基質(zhì)(L)、小管萎縮(M)和相對(duì)間質(zhì)體積(N)。對(duì)于腎小球的定量測(cè)定，在每只小鼠中分析了 20個(gè)腎小球。對(duì)于小管-間質(zhì)損傷的定量測(cè)定，在每只小鼠中分析了每個(gè)腎的8個(gè)視場(chǎng)。O:在糖尿病小鼠中，THR-123對(duì)血液尿素氮水平的影響。P-T:正常(Q)或用BMP7(S)或THR-123 (T)治療的糖尿病(Q-T)小鼠腎的免疫熒光分析(放大倍數(shù)x200)，用于檢測(cè)FSPl和E-鈣粘蛋白。圖(Q)和(R)中的箭頭指示FSPl和E-鈣粘蛋白雙重陽(yáng)性小管。U.提供了 FSPl+細(xì)胞的百分率的定量分析(U)。對(duì)每只小鼠分析了 10個(gè)視場(chǎng)。在所有分析中，分析了對(duì)照(n=5)、糖尿病5個(gè)月(n=6)、糖尿病6個(gè)月(n=10)、BMP7_治療的糖尿病(n=4)和THR-123治療的糖尿病(n=9)。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。
[0086]圖68.在糖尿病小鼠中的腎的PAS染色。顯示了以下的PAS染色(x200):對(duì)照⑷、5個(gè)月糖尿病性腎病(DN)⑶、6個(gè)月DN(C)、用BMP7⑶或THR-123 (E)治療的DN。分析了對(duì)照(n=5)、糖尿病5個(gè)月(n=6)、糖尿病6個(gè)月(n=10)，用BMP-7治療的糖尿病(300 μ g/kg每隔一天，IP,糖尿病誘導(dǎo)后1-6個(gè)月，n=4),用THR-123治療的糖尿病(5mg/kg/天，口服，糖尿病誘導(dǎo)5-6個(gè)月，n=9)。顯示了代表性的圖。
[0087]圖69.THR-123在糖尿病性腎病小鼠中減少了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。正常㈧和用溶媒、BMP7或THR-123治療的糖尿病性腎病(DN) (B至D)的Mac-1免疫熒光研究。放大倍數(shù)x400。巨噬細(xì)胞在正常腎的皮質(zhì)區(qū)中少見(jiàn)(A)。DN5個(gè)月或6個(gè)月后，巨噬細(xì)胞在萎縮的小管周圍常見(jiàn)(B，C)。BMP7 (D)和THR-123(E)顯著地減少了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。顯示了代表性的圖。F.通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的巨噬細(xì)胞數(shù)(x400放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值土 s.e.m.。在圖中，糖尿病性腎病被稱為DN。
[0088]圖70.THR-123在DN中增加了 phospho-smadl/5標(biāo)記。A-D.指定動(dòng)物組的冷凍腎切片用phospho-smadl/5 (p-smadl/5)抗體標(biāo)記,然后用FITC-綴合的第二抗體。通過(guò)突光顯微鏡術(shù)分析p-smadl/5水平。圖(C)和(D)中的箭頭指示核蓄積的p-smadl/5。(E)P-smadl/5水平的定量測(cè)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的p-smadl/5數(shù)量(x400放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。在圖中，糖尿病性腎病被稱為DN。
[0089]圖71.卡托普利和THR-123的組合抑制了晚期糖尿病性腎病相關(guān)的纖維化進(jìn)程。鏈脲霉素-誘導(dǎo)的糖尿病CD-1小鼠用卡托普利治療(p.ο.50mg/Kg/天，糖尿病誘導(dǎo)后7-8個(gè)月)或用卡托普利和THR-123(p.ο.5mg/kg/天，糖尿病誘導(dǎo)后7-8個(gè)月)的組合治療。以下的代表性的腎切片的組織學(xué)PAS染色(A-D)和馬松三色染色(E-H):7個(gè)月DN(A，E) ；8個(gè)月DN (B，F(xiàn)) ;8個(gè)月DN用卡托普利治療(C，G) ;8個(gè)月DN用卡托普利和THR-123的組合治療(D，H)。放大倍數(shù)x400 (A-D)和xlOO (E-H)。1-L:腎小球表面積(I)、腎小球膜基質(zhì)(J)、小管萎縮(K)和相對(duì)間質(zhì)體積(L)的形態(tài)測(cè)量分析。對(duì)于腎小球的定量測(cè)定，在每只小鼠中分析了 20個(gè)腎小球。對(duì)于小管-間質(zhì)損傷的定量測(cè)定，在每只小鼠中分析了每個(gè)腎的8個(gè)視場(chǎng)。M:在糖尿病小鼠中，THR-123對(duì)血液尿素氮水平的效果。N-Q:免疫熒光分析(放大倍數(shù)x200)，用于檢測(cè)E-鈣粘蛋白/FSP1。圖(N)和(O)中的箭頭指示E-鈣粘蛋白/FSPl雙重陽(yáng)性小管。R.提供了 E-鈣粘蛋白/FSPl雙重陽(yáng)性小管百分率的定量分析。對(duì)每個(gè)腎分析了 10個(gè)視場(chǎng)。對(duì)以下 糖尿病小鼠進(jìn)行所有分析:7個(gè)月(n=2)、8個(gè)月無(wú)治療(n=3)、卡托普利治療的8個(gè)月糖尿病(n=3)以及卡托普利和THR-123在8個(gè)月糖尿病中的聯(lián)合治療(n=4)。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。
[0090]圖72.THR-123和卡托普利在糖尿病性腎病小鼠中減少了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。顯示了7個(gè)月糖尿病性腎病(DN) (A)、8個(gè)月DN(B)、卡托普利治療的8個(gè)月DN(C)以及卡托普利和THR-123的組合治療的8個(gè)月DN(D)的Mac-1免疫熒光研究。在DN小鼠中，小管蓄積的巨噬細(xì)胞從7到8個(gè)月DN被明顯增加?？ㄍ衅绽糠值匾种屏司奘杉?xì)胞浸潤(rùn)，卡托普利與THR-123的組合完全地抑制了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。顯示了代表性的圖。E.通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中的陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每個(gè)視場(chǎng)(x400放大倍數(shù))的巨噬細(xì)胞數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。在圖中，糖尿病性腎病被稱為DN。
[0091]圖73.糖尿病小鼠中的血糖水平和體重。血糖水平(A，B)和體重(C，D)測(cè)量。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值土 s.e.m.。
[0092]圖74.在DN中卡托普利/THR-123細(xì)胞凋亡。A_C.通過(guò)TUNEL染色，在指定動(dòng)物組的冷凍腎切片中分析小管細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。圖㈧中的箭頭指示TUNEL陽(yáng)性小管細(xì)胞。(D)TUNEL陽(yáng)性小管細(xì)胞的定量測(cè)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的TUNEL陽(yáng)性小管數(shù)量(x200放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。在圖中，糖尿病性腎病被稱為DN。
[0093]圖75.卡托普利 /THR-123 在 DN 中增加了 phospho-smadl/5 標(biāo)記。A-C.指定動(dòng)物組的冷凍腎切片用phospho-smadl/5 (p-smadl/5)抗體標(biāo)記，然后用FITC-綴合的第二抗體。通過(guò)突光顯微鏡術(shù)分析phospho-smadl/5水平。圖(C)中的箭頭指示核蓄積的phosho-smadl/5。(D)p-smadl/5水平的定量測(cè)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的p-smadl/5數(shù)量(x400放大倍數(shù)),每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。在圖中，糖尿病性腎病被稱為DN。[0094]圖76.在腎病模型中，THR-123作為受體作用于小管AlkStjA-D, THR-123對(duì)Alk3fWflox和gGTCre ；Alk3flox/flox小鼠中IRI模型腎損傷的影響。缺血再灌注損傷后，小鼠接受THR-123 口服(5mg/kg/天)直到處死之日。A-C，顯示了指定小鼠組的代表性的H&E染色圖。D.1RI中的腎小管壞死的百分率。每組分析了 10個(gè)視場(chǎng)。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土s.e.m.。E-T, THR-123 對(duì) Alk3fWfl°x 和 gGTCre ；Alk3flox/flox 小鼠中 NTN 模型腎損傷的影響。NTN引入指定小鼠組后6周，小鼠用PBS或THR-123 口服治療。E-H,顯示了指定小鼠組的代表性的MTS染色圖。I，在指定組中的9周NTN模型的形態(tài)測(cè)量分析。J-N，在Alk3fl°x/fl°x和gGTCre ;Alk3fWfl°x小鼠中的NTN模型的腎的巨噬細(xì)胞蓄積分析。J-M,指定小鼠組的Mac-1免疫熒光研究。N，通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每個(gè)視場(chǎng)(x400放大倍數(shù))的巨噬細(xì)胞數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土s.e.m.。0-S，EMT 分析，0-R，在 NTN-誘導(dǎo)的并經(jīng)過(guò) PBS 或 THR-123 治療的 Alk3fWfl°x和GTCre ；Alk3flox/flox小鼠的腎的E-鈣粘蛋白/FSPl免疫標(biāo)記。S.E-鈣粘蛋白/FSPl雙重陽(yáng)性小管的百分率。每玻片500小管，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分析5個(gè)玻片。圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值土 s.e.m.。T，在指定小鼠組(所有n=4)中的NTN的6周和9周的血液尿素氮測(cè)量。
[0095]圖77.THR-123在Alk-3缺失小鼠的IRI腎中不抑制巨噬細(xì)胞蓄積。通過(guò)將左腎蒂鉗制25分鐘誘導(dǎo)缺血再灌注損傷(IRI)。缺血再灌注損傷后，小鼠接受THR-123 口服(5mg/kg/天)或PBS，直到處死之日。A-C.在指定組中的Mac-1免疫熒光研究。D.通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每個(gè)視場(chǎng)(x400放大倍數(shù))的巨噬細(xì)胞數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。
[0096]圖78.THR-123在Alk_3缺失小鼠的IRI腎中不抑制細(xì)胞凋亡。通過(guò)將左腎蒂鉗制25分鐘誘導(dǎo)缺血再灌注損傷(IRI)。缺血再灌注損傷后，小鼠接受THR-123 口服(5mg/kg/天)或PBS，直到處死之日。A-C.通過(guò)TUNEL染色，在指定動(dòng)物組的冷凍腎切片中分析小管細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。D.TUNEL陽(yáng)性小管細(xì)胞的定量測(cè)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的TUNEL陽(yáng)性小管數(shù)量(x200放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。
[0097]圖79.THR-123在Alk-3缺失小鼠的NTN腎中不抑制細(xì)胞凋亡。A-D.通過(guò)TUNEL染色，在指定動(dòng)物組的冷凍腎切片中分析小管細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。顯示了代表性的圖。D.TUNEL陽(yáng)性小管細(xì)胞的定量測(cè)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)在每個(gè)玻片的5個(gè)隨機(jī)視場(chǎng)中陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞，評(píng)價(jià)每一視場(chǎng)的TUNEL陽(yáng)性小管數(shù)量(x200放大倍數(shù))，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組5個(gè)玻片。圖中的數(shù)據(jù)顯示為平均值+s.e.m.。
[0098]圖80描繪了熒光顯微圖的RGB圖的定量分析的幾何學(xué)基礎(chǔ)。
[0099]圖81顯示了使用來(lái)自Photoshop的RGB分析直方圖分析用于測(cè)試化合物的突光顯微圖的實(shí)例。圖81A是用IOOmM D-葡萄糖處理的細(xì)胞視場(chǎng)并對(duì)應(yīng)于0%的E-鈣粘蛋白信號(hào)；圖81B是僅暴露給培養(yǎng)基的細(xì)胞視場(chǎng)并對(duì)應(yīng)于100%的信號(hào)；和圖81C是暴露給IOOmMD-葡萄糖和IOOuM試驗(yàn)肽兩者的細(xì)胞視場(chǎng)。根據(jù)分析，60%的評(píng)分被指定給該圖像，也就是說(shuō)，試驗(yàn)肽的作用為維持在單用培養(yǎng)基中所觀察到的60%的E-鈣粘蛋白信號(hào)，盡管存在IOOmM D-葡萄糖。
[0100]不希望以任何方式限制本發(fā)明或限制以上附圖所提供的公開(kāi)內(nèi)容，所述附圖共同證明了 THR-123(SEQ ID NO:1)通過(guò)Smad和p38MAPK BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩者起作用，并抑制腎炎癥、高葡萄糖(高血糖)誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)和腎纖維化。上圖提供的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明靶向BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(例如Smad和p38MAPK)而不誘導(dǎo)骨發(fā)生的本發(fā)明化合物對(duì)腎病可提供新的藥理學(xué)干預(yù)。
[0101]發(fā)明詳沭
[0102]近來(lái)，TGF-β超家族蛋白的肽激動(dòng)劑已描述于化7，482，329、冊(cè)2007/035872和W02006/009836，其各自通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。本發(fā)明根據(jù)以下發(fā)現(xiàn):這些化合物的一個(gè)亞類能夠經(jīng)由BMP受體(包括I型和II型受體)誘導(dǎo)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此引起對(duì)TGF-β 1-誘導(dǎo)的EMT和由此導(dǎo)致的纖維化的抑制和/或逆轉(zhuǎn)。近來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)，作為纖維發(fā)生的重要介質(zhì)，誘導(dǎo)ΕΜΤ，其進(jìn)而介導(dǎo)纖維化。還知道ΒΜΡ-7逆轉(zhuǎn)TGF- β -誘導(dǎo)的ΕΜΤ，因此表明了 ΒΜΡ-7在抵消經(jīng)由EMT所致的纖維化發(fā)生中的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的肽(正如本文進(jìn)一步描述的那樣)能有效抑制和/或逆轉(zhuǎn)EMT和包括以下在內(nèi)的各種病況相關(guān)的纖維化:糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎和硬皮病。
[0103]術(shù)語(yǔ)的定義和使用
[0104]參考以下本發(fā)明實(shí)施方案和其中所包括的實(shí)施例的詳述，可以更容易地理解本發(fā)明。在公開(kāi)和描述現(xiàn)有方法和技術(shù)之前，應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明不限于具體的分析方法或合成方法，這些當(dāng)然可以改變。還要知道本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的而并非限制性的。除非另有說(shuō)明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的含義。
[0105]如本文和所附權(quán)利要求書所用，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確另有說(shuō)明。因此，例如，對(duì)于“基因”是指一個(gè)或多個(gè)基因并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。
[0106]如本文所用的“芳族氨基酸”，是指具有側(cè)鏈的疏水性氨基酸，其側(cè)鏈含有具有共軛電子體系的至少一個(gè)環(huán)(芳基)。芳基還可以被取代基進(jìn)一步取代，所述取代基例如烷基、烯基、炔基、羥基、硫烷基、硝基和氣基以及其它基團(tuán)。遺傳編碼的芳族氣基酸的實(shí)例包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常見(jiàn)的非遺傳編碼的芳族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β ~2~噻吩基丙氨酸、1, 2, 3, 4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
[0107]如本文所用的“脂族氨基酸”，是指具有飽和或不飽和直鏈、支鏈或環(huán)狀烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼的脂族氨基酸的實(shí)例包括丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。非編碼的脂族氨基酸的實(shí)例包括正亮氨酸(Nle)。
[0108]如本文所用的“酸性氨基酸”，是指?jìng)?cè)鏈PK值小于7的親水性氨基酸。酸性氨基酸在生理pH時(shí)因?yàn)槭潆x子，典型地具有帶負(fù)電荷側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸的實(shí)例包括天冬氨酸(天冬氨酸鹽)和谷氨酸(谷氨酸鹽)。
[0109]如本文所用的“堿性氨基酸”，是指?jìng)?cè)鏈PK值大于7的親水性氨基酸。堿性氨基酸在生理pH時(shí)因?yàn)榕c水合氫離子締合，典型地具有帶正電荷側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的堿性氨基酸的實(shí)例包括非環(huán)狀氨基酸鳥(niǎo)氨酸、2，3- 二氨基丙酸、2，4- 二氨基丁酸和高精氨酸。
[0110]如本文所用的“極性氨基酸”，是指具有在生理pH時(shí)不帶電荷的側(cè)鏈的親水性氨基酸，但其具有一個(gè)鍵，其中由兩個(gè)原子共享的電子對(duì)更靠近這兩個(gè)原子中的一個(gè)。遺傳編碼的極性氨基酸的實(shí)例包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遺傳編碼的極性氨基酸的實(shí)例包括瓜氨酸、N-乙酰基賴氨酸和甲硫氨酸亞砜。
[0111]正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的那樣，以上分類并非絕對(duì)一若干氨基酸顯示超過(guò)一種特征性性能，并且因此可包括在超過(guò)一個(gè)類別中。例如，酪氨酸具有芳環(huán)和極性羥基兩者。因此，酪氨酸具有雙重性質(zhì)并且可包括在芳族類別和極性類別中。
[0112]如本文所用的“受試者”，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，例如人，但也可以是動(dòng)物，例如家養(yǎng)動(dòng)物(例如狗、貓等)、家畜(例如牛、羊、豬、馬等)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
[0113]如本文所用的化合物的“有效量”，是足以達(dá)到所需治療和/或預(yù)防效果的量，例如，足以達(dá)到預(yù)防或減少所治療疾病(例如與以上列舉的TGF-β超家族多肽相關(guān)的疾病)的相關(guān)癥狀的量。給予受試者的化合物的量取決于疾病的類型和嚴(yán)重程度并取決于個(gè)體的特征，例如一般健康、年齡、性別、體重和藥物耐受力。它還取決于疾病的程度、嚴(yán)重性和類型。技術(shù)人員能夠根據(jù)這些和其它因素確定合適劑量。典型地，足以達(dá)到治療或預(yù)防效果的本發(fā)明的化合物的有效量范圍為大約0.00000lmg/千克體重/天至大約10，000mg/千克體重/天。優(yōu)選地，劑量范圍為大約0.000lmg/千克體重/天至大約100mg/千克體重/天。本發(fā)明的化合物還可彼此組合給予，或與一種或多種另外的治療用化合物組合給予。
[0114]“分離的”或“純化的”多肽或多肽或其生物活性部分基本不含組織分化因子-相關(guān)多肽所來(lái)源的細(xì)胞或組織來(lái)源的細(xì)胞物質(zhì)或其它污染多肽，或基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物(當(dāng)經(jīng)化學(xué)合成時(shí))。
[0115]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體”，是指不同于本發(fā)明的化合物、但保留其基本性質(zhì)的化合物。其非限制性實(shí)例是對(duì)于參考化合物而言具有保守取代的多核苷酸或多肽化合物，統(tǒng)稱為簡(jiǎn)并變體。變體的另一非限制性實(shí)例是與本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)不同、但保留其相同活性結(jié)構(gòu)域的化合物。變體包括N-末端或C-末端延伸、加帽的氨基酸、反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈官能團(tuán)的修飾(例如從賴氨酸殘基支化)、聚乙二醇化和/或截短的多肽化合物。通常，變體與本發(fā)明化合物在總體上非常相似并在許多區(qū)域中相同。因此，變體可含有在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或這兩者中的改變。
[0116]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“局部的”或“局部地”，當(dāng)在一種或多種治療藥的局部給予或共給予時(shí)，是指將治療藥遞送到臨近或接近損傷部位、Btt鄰或緊鄰損傷部位、在損傷部位周圍或接觸到損傷部位、或在損傷的組織或器官內(nèi)部或里面的身體部位。局部給藥通常不包括系統(tǒng)給藥途徑。
[0117]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)有效方案”是指給予一種或多種治療藥的系統(tǒng)計(jì)劃，其包括例如藥物濃度、量或水平、時(shí)間安排和重復(fù)、及其在給藥過(guò)程中進(jìn)行的任何變化等方面，在給予所述藥物時(shí)其有效治療纖維化。技術(shù)人員，通常包括治療纖維化病況患者的開(kāi)業(yè)醫(yī)師，將會(huì)知道和理解如何確定藥學(xué)有效方案，無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。
[0118]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“共給予(co-administering) ”或“共給予(co-administration) ”等是指同時(shí)或大致同時(shí)給予兩種或更多種作用劑、治療藥、化合物、療法等的行動(dòng)。給予本發(fā)明的不同作用劑(例如化療藥、抗纖維化療法或免疫治療藥)的順序或次序可以不同，不限于任何特定順序。共給予還可指將兩種或更多種作用劑給予機(jī)體的不同區(qū)域或經(jīng)由不同的遞送計(jì)劃的情況，例如其中將第一種作用劑系統(tǒng)給予，而第二種作用劑在組織損傷或正在進(jìn)行纖維化的部位經(jīng)局部給予，或其中將第一種作用劑經(jīng)局部給予，而第二種作用劑經(jīng)系統(tǒng)給予到血液中。
[0119]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上逆轉(zhuǎn)纖維化”是指其中在治療之下的在靶組織或器官中的纖維化材料或成分減少或完全消除?；旧夏孓D(zhuǎn)纖維化優(yōu)選地是指這樣的情況:其中與治療前相比，至少大約10%、或大約25%、或大約50%、或更優(yōu)選地至少大約75%、或更優(yōu)選地大約85%、或還更優(yōu)選地大約90%、或更優(yōu)選地大約95%、或更優(yōu)選地99%或更多的纖維化成分或物質(zhì)已被除去。
[0120]如本文所用，提及“基本上抑制纖維化”是指這樣的情況:在所需的目標(biāo)纖維化位點(diǎn)的纖維化的凈含量或水平不隨時(shí)間增加。
[0121]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”，是指材料(例如載體或稀釋劑)，其不破壞本文所述化合物的生物活性或性質(zhì)，并且是相對(duì)無(wú)毒的(即所述材料給予個(gè)體不會(huì)引起不想要的生物效應(yīng)或不會(huì)以有害方式與其包含于其中的組合物中所含有的任何成分相互作用)。
[0122]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“選擇性地”是指在一個(gè)群體中比另一群體中傾向于以更高頻率發(fā)生。
[0123]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)”`，當(dāng)涉及“偶聯(lián)”在一起的兩種或更多種作用劑時(shí)，是指兩種或更多種作用劑之間的共價(jià)或其它穩(wěn)定的締合。例如，可將本發(fā)明的治療用肽(BMP激動(dòng)劑肽)經(jīng)由共價(jià)鍵、共價(jià)連接的接頭部分或通過(guò)離子相互作用與第二抗纖維化作用劑偶聯(lián)。優(yōu)選地，偶聯(lián)在一起的一種或多種作用劑保留其基本相同的獨(dú)立功能和特征。例如，當(dāng)治療藥與另一作用劑偶聯(lián)時(shí)可保留與其獨(dú)立時(shí)的相同活性。
[0124]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶向部分”是能夠增強(qiáng)治療藥或本發(fā)明的其它作用劑(例如本發(fā)明的BMP激動(dòng)劑肽)靶向、結(jié)合或進(jìn)入本發(fā)明靶細(xì)胞(例如具有損傷和正經(jīng)歷纖維化的組織)的能力的部分。在某些實(shí)施方案中，靶向部分是多肽、碳水化合物或脂質(zhì)。任選地，革巴向部分是抗體、抗體片段或納米抗體(nanobodies)。示例性的祀向部分包括腫瘤祀向部分，例如生長(zhǎng)抑素(sst2)、鈴蟾肽/GRP、促黃體激素-釋放激素(LHRH)、神經(jīng)肽Y (NPY/Y1)、神經(jīng)降壓肽(NTl)、血管活性腸多肽(VIP/VPAC1)和縮膽囊素(CCK/CCK2)。在某些實(shí)施方案中，靶向部分與本發(fā)明的作用劑非共價(jià)締合。
[0125]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“方案”是指表征藥物或試劑如何給予的各種參數(shù)，包括劑量水平、時(shí)間安排和重復(fù)、以及不同的藥物或作用劑之間的比例。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)有效方案”是指提供所需的治療結(jié)果或效果(包括基本上抑制或逆轉(zhuǎn)EMT和/或纖維化)的特定方案。術(shù)語(yǔ)“重復(fù)”是指重復(fù)多次給予一種或多種試劑的一般概念。例如，在第一天，以劑量Z，將藥物X和藥物Y的組合給予(同時(shí)或大致同時(shí)和以任何順序共給予)患者。然后，在第二天，以劑量Z或另一劑量，再次給予藥物X和Y(同時(shí)或大致同時(shí)和以任何順序共給予)。第一和第二天之間的時(shí)間安排可以是一天或至多若干天、或一周或若干周，或若干個(gè)月。重復(fù)給予也可發(fā)生在同一天，相隔指定的分鐘數(shù)(例如10分鐘、20分鐘、30分鐘或更長(zhǎng))或小時(shí)數(shù)(例如I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí))。有效的給藥方案可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員例如處方醫(yī)師使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐來(lái)確定。
[0126]纖維化疾病
[0127]纖維化疾病的特征在于成纖維細(xì)胞的活化、膠原和纖連蛋白產(chǎn)量增加、和轉(zhuǎn)分化為收縮性的成肌纖維細(xì)胞。該過(guò)程通常發(fā)生超過(guò)多個(gè)月份和年份并且最終可導(dǎo)致器官功能障礙或死亡。纖維化疾病的實(shí)例包括糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化和硬皮病(系統(tǒng)性硬化??；SSc)。纖維化疾病代表了無(wú)有效治療的最大類別的病癥之一，并因此表現(xiàn)出嚴(yán)重不足的醫(yī)學(xué)需求。通常，對(duì)纖維化患者的唯一補(bǔ)償是器官移植；然而，因?yàn)槠鞴俟?yīng)不足以滿足需要，所以患者常常在等待接受合適器官期間死亡。在硬皮病肺病、特發(fā)性肺纖維化、放療和化療誘導(dǎo)的肺纖維化和職業(yè)性吸入塵粒所致病癥中單單肺纖維化可以是主要的死亡原因。缺乏合適的抗纖維化療法，主要是因?yàn)閷?duì)纖維化疾病的病因?qū)W還是未知的。對(duì)于如何控制正常組織修復(fù)和該過(guò)程在纖維化疾病中如何出錯(cuò)的理解將是至關(guān)重要的。
[0128]TGF-β及其在纖維化中的作用
[0129]已經(jīng)知道促纖維化蛋白例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)參與纖維化疾病。因?yàn)門GF-β誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成和收縮(contract)ECM，所以長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為該細(xì)胞因子是纖維化反應(yīng)的主要介質(zhì)(I)。十多年前作為由人內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)而發(fā)現(xiàn)的CTGF(2)，由TGF-β誘導(dǎo)并且被認(rèn)為是TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞作用的下游介質(zhì)(3，4)。同樣，TGF-β誘導(dǎo)基質(zhì)蛋白纖連蛋白的ED-A形式(ED-AFN)的表達(dá)，這種形式是通過(guò)纖連蛋白轉(zhuǎn)錄物的可變剪接而產(chǎn)生的一種纖連蛋白變體(5)。ED-AFN的這種誘導(dǎo)是TGF-β 1-觸發(fā)的a -SMA和膠原I型表達(dá)增強(qiáng)所需要的(6)。因此TGF-β被認(rèn)為是在許多組織中的纖維化誘導(dǎo)中的“主要開(kāi)關(guān)”，所述組織包括例如肺(7)和腎(ref)。在這一點(diǎn)上，在IPF患者的肺中或在CKD患者的腎中TGF- β被上調(diào)，并且活性TGF- β在大鼠的肺或腎中的表達(dá)導(dǎo)致明顯的纖維化反應(yīng)，而在響應(yīng)TGF-β I時(shí)無(wú)反應(yīng)提供了針對(duì)博來(lái)霉素-誘導(dǎo)的纖維化(8)或腎間質(zhì)纖維化(30)的保護(hù)作用。
[0130]上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)及其在纖維化中的作用
[0131]EMT (完全分化的上皮細(xì)胞經(jīng)歷向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞的過(guò)程)，被越來(lái)越多地認(rèn)為在上皮損傷后的修復(fù)和瘢痕形成中起到重要作用。在肺和其它器官中，該過(guò)程在損傷后促進(jìn)纖維化的程度，是活躍的研究對(duì)象。近來(lái)，已經(jīng)證明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-P在體外和體內(nèi)在肺泡上皮細(xì)胞(AEC)中誘導(dǎo)ΕΜΤ，并且上皮和間充質(zhì)標(biāo)記共定位于特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者的肺組織中的增生性II型(ΑΤ2)細(xì)胞，表明AEC可表現(xiàn)出極度可塑性并在肺纖維化中作為成纖維細(xì)胞和/或成肌纖維細(xì)胞的來(lái)源。首次描述了 TGF-β I在正常哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中作為EMT的誘導(dǎo)物(9)并證明在體外在許多不同的上皮細(xì)胞系中介導(dǎo)ΕΜΤ，所述上皮細(xì)胞包括腎近端小管、晶狀體和最近的肺泡上皮細(xì)胞(10-14)。
[0132]TGF- β 1-誘導(dǎo)的EMT和纖維化的逆轉(zhuǎn)[0133]已經(jīng)證明許多介入導(dǎo)致EMT的逆轉(zhuǎn)。BMP_7(骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7)在成人小管上皮細(xì)胞中通過(guò)直接抵消TGF- β -誘導(dǎo)的Smad3-依賴性EMT而逆轉(zhuǎn)TGF- β 1-誘導(dǎo)的ΕΜΤ，并且在體內(nèi)已經(jīng)顯示了經(jīng)由EMT發(fā)生腎纖維化逆轉(zhuǎn)的證據(jù)(20)。ΒΜΡ-7能夠延遲晶狀體上皮中的EMT并伴有Smad2下調(diào)，而抑制性Smad7的過(guò)量表達(dá)阻止EMT并減少Smads2和-3的核轉(zhuǎn)位(21)。EMT在Smad3敲除小鼠中得到改善(15，16)，而且Smad7 (TGF- β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑)或以Smad-依賴性方式起作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (ΒΜΡ-7)，可在腎和晶狀體上皮細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)或延遲纖維化(21，22)。此外，HGF通過(guò)上調(diào)Smad轉(zhuǎn)錄輔阻遏物SnoN而在人腎上皮細(xì)胞中阻斷ΕΜΤ，這導(dǎo)致形成轉(zhuǎn)錄無(wú)活性的SnoN/Smad復(fù)合物，因此阻斷了 TGF-β I的效應(yīng)(23)。這些研究表明調(diào)節(jié)Smad活性作為用于抵消TGF-β誘導(dǎo)EMT的作用的策略的可行性。有關(guān)介導(dǎo)TGF-β -誘導(dǎo)的EMT的準(zhǔn)確分子機(jī)制及其與其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用的知識(shí)，對(duì)于開(kāi)發(fā)抑制/逆轉(zhuǎn)EMT而不破壞TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的有益效果的策略而言是重要的。
[0134]骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)
[0135]骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)超家族的成員，其控制細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活。BMP通過(guò)兩種不同類型的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(稱為I型和II型)起作用。II型受體一旦被BMP占據(jù)，經(jīng)歷磷酸化，然后使I型受體(也稱為ALK)磷酸化。磷酸化的I型受體進(jìn)而介導(dǎo)特定的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和因此決定下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性。已經(jīng)鑒定了在結(jié)構(gòu)上類似的3種I型受體:ALK2、ALK3 (BMPR-1A)和ALK6 (BMPR-1B)。重要的是，I型受體和II型受體兩者都形成同聚和異聚復(fù)合物。靶細(xì)胞的BMP-刺激導(dǎo)致受體復(fù)合物在細(xì)胞表面重排，其影響了 2種下游BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(典型的Smad-依賴性途徑(Smadl/5/8途徑)和非典型的Smad-非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(例如p38促分裂原-激活蛋白激酶途徑，MAPK))的活化。Smadl/5/8途徑已知在阻塞誘導(dǎo)的腎損傷之后能促進(jìn)腎修復(fù)(MansonSR, Niederhoff RA, Hruska KA, AustinPF., JUrol.85:2523-30, 2011)。相反證據(jù)顯示P38MAPK途徑在促進(jìn)糖尿病和缺血/再灌注相關(guān)的腎損傷中起重要作用(EvansJ 等人.(2002) E ndocrinRev5:599 - 622，2002 ;Furuichi K 等人.Nephrol DialTransplants:399 - 407, 2002)。這樣，誘導(dǎo)Smadl/5/8信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抑制p38MAPK磷酸化的化合物是強(qiáng)有力的抗炎和抗纖維化靶標(biāo)，具有廣泛治療潛力。
[0136]BMP還是胞外形態(tài)發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其在胚胎發(fā)生和骨形成中起到重要作用。在胚胎發(fā)生期間，BMP刺激上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，其對(duì)中胚層和神經(jīng)管形成而言是必不可少的。然而，EMT(其特征在于細(xì)胞粘附的損失和增加的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性)，在癌癥形成和轉(zhuǎn)移中也受到刺激，并且也已證明BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在某些種類的癌細(xì)胞中增加了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和侵襲力(LangenfeId,等人，0ncogene25:685-692，2006 ;Kang,等人，Exp.CellRes.316:24-37, 2010)。目前有超過(guò)20種已知的BMP，已經(jīng)證明這些蛋白質(zhì)中的若干與腫瘤生長(zhǎng)和從原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移(尤其是轉(zhuǎn)移到骨的乳腺腫瘤和前列腺腫瘤)相關(guān)(Alarmo和 Kallioniemi, Endocrine-Related Cancerl7:R123-R139, 2010 ；Dai 等人，CancerRes.65:8274-8285, 2005)。
[0137]如上所述，BMP與膜結(jié)合的高親和力I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，通過(guò)Smad途徑和其它胞內(nèi)效應(yīng)子而引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，其刺激了形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞功能，例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、骨發(fā)生、神經(jīng)形成和胚胎發(fā)生(Walsh等人，Trends in CellBiology20:244-256, 2010)。作為形態(tài)發(fā)生素，BMP已經(jīng)證明可用于再生醫(yī)學(xué)，尤其是在刺激骨形成和治療骨折方面(Rider和Mulloy，Biochem.J.429:1-12, 2010)。細(xì)胞BMP活性受到許多生物的BMP拮抗劑的高度調(diào)節(jié)，所述拮抗劑與BMP結(jié)合并阻止BMP受體活化，因此阻止7 BMP-引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Rider 和 Mulloy, Biochem.J.429:1-12，2010)。這些 BMP-拮抗劑的表達(dá)或活性上的改變可促進(jìn)人類疾病例如纖維化和癌癥的發(fā)展(Walsh等人，Trends inCell Biology20:244-256, 2010)。
[0138]除了這些BMP-結(jié)合拮抗劑以外，近來(lái)已描述了 BMP受體拮抗劑，例如小分子抑制劑dosomorphin和dosomorphin衍生物。已經(jīng)知道BMP受體拮抗劑可證明用于BMP受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的突變所導(dǎo)致的臨床病癥，例如癌癥、骨骼疾病和血管病(Miyazono，等人，J.Biochem.147:35-51，2010)。
[0139]本發(fā)明的一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)先前公開(kāi)的肽的一個(gè)亞類是BMP激動(dòng)劑，可用于并有效觸發(fā)或誘導(dǎo)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其就纖維化而言，導(dǎo)致對(duì)EMT的抑制和/或逆轉(zhuǎn)，以及因此對(duì)至少部分地由EMT所致的任何纖維化病況的纖維化的抑制和/或逆轉(zhuǎn)。
[0140]BMP激動(dòng)劑狀
[0141]一方面，本發(fā)明提供用于抑制EMT過(guò)程的肽和包含所述肽的藥物組合物，用于抑制纖維化和治療與EMT過(guò)程和/或纖維化例如腎纖維化相關(guān)的疾病和病癥。
[0142]這些肽的變體、類似物、同源物或片段，例如物種同源物，也包括在本發(fā)明中，其簡(jiǎn)并形式亦是如此?？稍贜-端或C-端或同時(shí)在N-端和C-端對(duì)本發(fā)明的肽加帽。本發(fā)明的肽可經(jīng)聚乙二醇化或經(jīng)修飾，例如在含有反應(yīng)性側(cè)鏈的任何氨基酸殘基例如賴氨酸殘基上支化。本發(fā)明的肽可以是線狀的或環(huán)化或以其它方式限制。所述肽的尾序列的長(zhǎng)度可以不同。
[0143]所述肽可含有天然氨基酸、非天然氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸及其任何組合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可包含常見(jiàn)的氨基酸，其并非是遺傳編碼的。這些非遺傳編碼的氨基酸包括但不限于β-`丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸例如3-氨基丙酸(Dap)、2，3- 二氨基丙酸(Dpr)、4_氨基丁酸等；α -氨基異丁酸(Aib) ; ε -氨基己酸(Aha) ; δ-氨基戊酸(Ava) ；Ν-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly);鳥(niǎo)氨酸(Orn);瓜氨酸(Cit);叔丁基丙氨酸(t-BuA);叔丁基甘氨酸(t-BuG) ；N-甲基異亮氨酸(MeIle);苯基甘氨酸(Phg);環(huán)己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(Nle) ;2_萘基丙氨酸(2_Nal) ;4-氯苯丙氨酸(Phe(4_Cl)) ;2_氟苯丙氨酸(Phe (2-F)) ;3_氟苯丙氨酸(Phe (3-F)) ;4_氟苯丙氨酸(Phe(4-F));青霉胺(Pen) ; 1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic) ; β _2_噻吩基丙氨酸(Thi);甲硫氨酸亞砜(MSO);高精氨酸(hArg) ；N-乙?；嚢彼?AcLys) ;2，3-二氨基丁酸(Dab) ;2，3-二氨基丁酸(Dbu) ;p_氨基苯丙氨酸(Phe (pNH.sub.2)) ；N-甲基繳氨酸(MeVal);高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。
[0144]如本文所述，專利公布例如US7, 482，329、W02007/035872 和 W02006/009836 中近來(lái)已經(jīng)公開(kāi)了大量BMP-7激動(dòng)劑。如本文所述，本申請(qǐng)的發(fā)明人已經(jīng)鑒定了這些肽的一個(gè)亞類，其對(duì)抑制和/或逆轉(zhuǎn)纖維化而言特別有效，因此，對(duì)于治療纖維化所致的疾病和病癥而言特別有效。
[0145]在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的肽具有SEQ ID NO:55所示的通用結(jié)構(gòu):
[0146](H) -CY [YF] [DN] [ND] [SN] S [SNQ] V [LI] CK [RK] YRS- (OH)。
[0147]在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的代表性的肽概述于表1。[0148]表1
【權(quán)利要求】
1.治療患有以纖維化為特征的疾病或病癥的受試者的方法，包括給予受試者有效量的SEQ ID NO: 1-77所示的肽，從而治療所述受試者。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽與SEQID NO:1具有至少90%同一性。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽經(jīng)口服給予所述受試者。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽經(jīng)局部、腸內(nèi)或胃腸外給予所述受試者。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病或病癥是糖尿病性腎病、肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、系統(tǒng)性硬化病、腎炎和硬皮病。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病或病癥是慢性腎病(CKD)。
9.權(quán)利要求1的方法,其中每天將0.0001至10，000 mg/kg體重的劑量給予所述受試者。
10.權(quán)利要求11的方法，其中所述給予劑量為1-100mg/kg體重/天。
11.用于治療以纖維化為特征的疾病或病癥的肽，包含SEQID NO:55所示的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的肽，包含SEQID NO: 1-77中任一個(gè)所示的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求11的肽，由SEQID NO: 1-54中任一個(gè)所示的氨基酸序列組成。
14.藥物組合物，包含權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的肽和藥學(xué)上可接受的載體。
15.藥盒，包含權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的肽和使用說(shuō)明書。
16.藥盒，包含權(quán)利要求14的藥物組合物和使用說(shuō)明書。
【文檔編號(hào)】C07K7/00GK103890003SQ201280045650
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月19日
【發(fā)明者】D.博蘇康達(dá), P.C.克克 申請(qǐng)人:特拉索斯創(chuàng)新公司