具有粘度改變表型的絲狀真菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了與具有變異生長特性的變異絲狀真菌相關(guān)的組合物和方法。此類變異株非常適于在深層培養(yǎng)物中生長，例如用于大規(guī)模生產(chǎn)商業(yè)應(yīng)用的酶和其他蛋白。
【專利說明】具有粘度改變表型的絲狀真菌
[0001]優(yōu)先權(quán)
[0002]本專利申請要求2011年4月22日提交的序列號(hào)為61/478，160和61/478，162的美國臨時(shí)專利申請的優(yōu)先權(quán)，所述專利申請據(jù)此全文以引用的方式并入本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明的菌株和方法涉及絲狀真菌中的基因突變，所述突變產(chǎn)生具有變異生長特性的變異菌株。此類變異菌株非常適于在深層培養(yǎng)物中生長，例如用于大規(guī)模生產(chǎn)商業(yè)應(yīng)用的酶和其他蛋白或代謝物。
【背景技術(shù)】
[0004]絲狀真菌能夠高水平表達(dá)天然和異源蛋白，因而非常適于大規(guī)模生產(chǎn)用于工業(yè)、醫(yī)藥、動(dòng)物保健以及食品和飲料應(yīng)用的酶和其他蛋白。絲狀真菌通常在生物反應(yīng)器的菌絲深層培養(yǎng)物中生長，這些生物反應(yīng)器適于將氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)引入培養(yǎng)基(即，培養(yǎng)液)并使氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)分布于其中。菌絲體的形態(tài)特征影響培養(yǎng)液的流變性，從而影響生物反應(yīng)器的性能。
[0005]通常，培養(yǎng)液的粘度越高，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的分布越不均勻，攪拌培養(yǎng)物所需的能量也越高。在一些情況下，培養(yǎng)液的粘度變得十分高，顯著妨礙了氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的溶解，從而對(duì)真菌的生長產(chǎn)生不利影響。另外，混合粘稠培養(yǎng)液并且向粘稠培養(yǎng)液中通氣所需的能量可能顯著增加生產(chǎn)成本，并且導(dǎo)致在電機(jī)和電源供應(yīng)方面的資本支出更高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明描述了涉及 絲狀真菌的菌株和方法，所述絲狀真菌具有可產(chǎn)生粘度改變表型的遺傳變異。
[0007]在一個(gè)方面，提供衍生自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，該變異菌株包含能使變異菌株的細(xì)胞與親本菌株的細(xì)胞相比產(chǎn)生改變量的功能性Sebl蛋白的遺傳變異，其中變異菌株的細(xì)胞在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持改變的溶氧量。
[0008]在一些實(shí)施例中，功能性Sebl蛋白的改變量為減少量，并且變異菌株在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持增加的溶氧量。
[0009]在一些實(shí)施例中，遺傳變異包括親本菌株中存在的sebl基因的破壞。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞是全部或部分sebl基因缺失的結(jié)果。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞是包含sebl基因的基因組DNA的部分缺失的結(jié)果。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞是sebl基因誘變的結(jié)果。[0010]在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞使用位點(diǎn)特異性重組進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與在sebl基因的基因座引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
[0011]在一些實(shí)施例中，變異菌株不產(chǎn)生功能性Sebl蛋白。在一些實(shí)施例中，變異菌株不產(chǎn)生Sebl蛋白。
[0012]在一些實(shí)施例中，變異菌株還包含編碼目的蛋白的基因。在一些實(shí)施例中，變異菌株還包含sfb3基因的破壞。在一些實(shí)施例中，變異菌株還包含mpgl基因的破壞。在一些實(shí)施例中，變異菌株還包含sfb3和mpgl基因的破壞。在一些實(shí)施例中，變異菌株還包含至少一種選自sfb3基因、mpgl基因、gasl基因、crzl基因和tps2基因的基因的破壞。在一些實(shí)施例中，變異菌株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本菌株基本等量或更多的蛋白。
[0013]在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為盤菌亞門(Pezizomycotina)菌種。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為木霉屬物種(Trichoderma spp.)、曲霉屬(Aspergillus spp.)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、足放線病菌屬(Scedosporium spp.)、青霉屬(Penicillium spp.)、金抱子菌屬(Chrysosporium spp.)、頭抱屬(Cephalosporium spp.)、籃狀菌屬(Talaromycesspp.)、白喬史密斯霉屬(Geosmithia spp.)和脈孢菌屬(Neurospora spp.)。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌可以包括(但不限于)里氏木霉(Trichoderma reesei)(之前歸類為長梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)和紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、分解烏頭酸曲霉(Aspergillusitaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、多育賽多抱(Scedosporium prolificans)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森籃狀菌(白喬史密斯霉)(Talaromyces (Geosmithia) emersonii)、產(chǎn)毒鐮刀菌(Fusarium venenatum)和勒克瑙金抱子菌(Chrysosporium Iucknowense)。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
`[0014]在另一方面，提供了產(chǎn)生絲狀真菌細(xì)胞的變異菌株的方法，該方法包括:將遺傳變異引入絲狀真菌細(xì)胞的親本菌株，其中與親本菌株的細(xì)胞相比，所述遺傳變異改變了功能性Sebl蛋白的產(chǎn)量，從而產(chǎn)生可在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)液的變異絲狀真菌細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持改變的溶氧量。
[0015]在一些實(shí)施例中，遺傳變異減少或抑制功能性Sebl蛋白的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生出可在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液的變異絲狀真菌細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)液
(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持增加的溶氧量。
[0016]在一些實(shí)施例中，遺傳變異包括使用遺傳操作來破壞親本絲狀真菌細(xì)胞中的sebl基因。在一些實(shí)施例中，遺傳變異包括使用遺傳操作使親本絲狀真菌細(xì)胞中的sebl基因缺失。在一些實(shí)施例中，遺傳變異使用位點(diǎn)特異性基因重組進(jìn)行。
[0017]在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與在sebl基因的基因座中引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，變異菌株的每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本菌株基本上等量或更多的蛋白。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與sfb3基因的破壞組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與mpgl基因的破壞組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與至少一種選自sfb3基因、mpgl基因、gasl基因、crzl基因和tps2基因的基因的破壞組合進(jìn)行。
[0018]在一些實(shí)施例中，變異菌株的每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本菌株基本上等量或更多的蛋白。
[0019]在一些實(shí)施例中，絲狀真菌是盤菌亞門物種。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為木霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、足放線病菌屬、青霉屬、金孢子菌屬、頭孢屬、籃狀菌屬、白喬史密斯霉屬和脈孢菌屬。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌可以包括(但不限于)里氏木霉(之前歸類為長梗木霉和紅揭肉座圃)、黑曲霉、煙曲霉、分解烏頭Ife曲霉、米曲霉、構(gòu)桌曲霉、土曲霉、醫(yī)油曲霉、日本曲霉、多育賽多孢、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)黃青霉、埃默森籃狀菌(白喬史密斯霉)、產(chǎn)毒鐮刀菌和勒克瑙金孢子菌。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
[0020]在一些實(shí)施例中，親本菌株還包含編碼目的蛋白的基因。在一些實(shí)施例中，在引入可減少或抑制功能性Sebl蛋白產(chǎn)生的遺傳變異之前，編碼目的蛋白的基因存在于親本菌株中。在一些實(shí)施例中，親本菌株中的目的蛋白由內(nèi)源基因或異源基因編碼。
[0021]在另一方面，提供了通過任一種上述變異菌株產(chǎn)生的目的蛋白。
[0022]在又一方面，提供了通過任一種上述方法產(chǎn)生且具有任意上述性質(zhì)的絲狀真菌。
[0023]在另一方面，提供了衍生自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，該變異菌株包含:(a)遺傳變異，所述遺傳變異使得(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌量來保持深層培養(yǎng)物中預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持深層培養(yǎng)物中增加的溶氧量；和(b)編碼目的蛋白的基因，其中編碼目的蛋白的基因在(a)中的遺傳變異之前存在于變異菌株中。
[0024]在一些實(shí)施例中，所得的變異菌株的遺傳變異包括親本菌株中存在的sebl基因的破壞。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與在sebl基因的基因座中引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與sfb3基因的破壞組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與mpgl基因的破壞組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與至少一種選自sfb3基因、mpgl基因、gasl基因、crzl基因和tps2基因的基因的破壞組合進(jìn)行。
[0025]由說明書(包括附圖)，本發(fā)明的變異菌株和方法的這些和其他方面以及實(shí)施例將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1A示出了表示包含pyr4基因的T-DNA的示意圖。
[0027]圖1B 為根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)PZP100 載體的圖譜。
[0028]圖2為比較14L發(fā)酵罐中T4T-DNA突變體F16和T4親本生長過程中的溶氧量水平的曲線圖。
[0029]圖3為比較14L發(fā)酵罐中T4T-DNA突變體F16和T4親本的生長速率的曲線圖。
[0030]圖4和5為T4AseblF16菌株(圖4)和Morph菌株(圖5)在PDA、山梨醇和氯化鈉平板上生長后的圖像。T4seblF16突變體與Morph對(duì)照物相比表現(xiàn)出受限制的生長和滲透敏感性。
[0031]圖6為sebl破壞載體的圖譜。[0032]圖7為mpgl破壞載體的圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0033]1.綜沭
[0034]本發(fā)明的菌株和方法涉及絲狀真菌細(xì)胞的變異菌株，其具有影響其形態(tài)和生長特性的遺傳修飾。當(dāng)變異細(xì)胞培養(yǎng)于深層培養(yǎng)物中時(shí)，它們產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)液與包含親本菌株細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液相比具有不同的流變性。一部分此類變異菌株適于大規(guī)模生產(chǎn)酶和其他商業(yè)上重要的蛋白質(zhì)。
[0035]IL 定義
[0036]在詳細(xì)描述本發(fā)明菌株和方法之前，為清楚起見定義了以下術(shù)語。未定義的術(shù)語應(yīng)當(dāng)與相關(guān)領(lǐng)域中使用的它們的通常含義相一致。
[0037]如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌門(Ascomycota)盤菌亞門的絲狀真菌。這種生物之前分類為長梗木霉，也分類為紅褐肉座菌。
[0038]如本文所用，短語“絲狀真菌細(xì)胞變異菌株”或類似的短語，是指例如通過遺傳操作衍生自(即，得自或可得自)屬于盤菌亞門的親本(或參考)菌株的絲狀真菌細(xì)胞菌株。在本發(fā)明的說明中，親本和變異菌株可以被描述為具有某些特性，例如遺傳修飾、表達(dá)表型、形態(tài)等等；然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)知道，親本或變異菌株的細(xì)胞在技術(shù)上具有這類特性，并且為了方便起見稱為“菌株”。
[0039]如本文所用，術(shù)語“目的蛋白”是指希望在絲狀真菌中表達(dá)的多肽。這樣的蛋白可以是酶、底物結(jié)合蛋白、表面活 性蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白等等，并且能夠以高水平表達(dá)且能夠用于商業(yè)化目的。目的蛋白相對(duì)于變異菌株和/或親本菌株可以由內(nèi)源基因或異源基因編碼。目的蛋白可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或作為分泌蛋白進(jìn)行表達(dá)。
[0040]如本文所用，詞語“基本無活性”或類似詞語，意思是特定的活性在混合物中不能檢測到或者其存在量不會(huì)干擾混合物的預(yù)期目的。
[0041]如本文所用，術(shù)語“多肽”和“蛋白”(和/或它們各自的復(fù)數(shù)形式)可互換使用，是指通過肽鍵連接的包含氨基酸殘基的任意長度的聚合物。本文使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母代碼或三字母代碼。聚合物可以為直鏈或支鏈的，其可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸隔斷。所述術(shù)語還涵蓋天然修飾或通過干預(yù)修飾的氨基酸聚合物，所述干預(yù)為例如形成二硫鍵、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?例如與標(biāo)記組分結(jié)合)。在所述定義中還包括(例如)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)類似物的多肽，以及本領(lǐng)域中已知的其他修改形式。
[0042]如本文所用，將功能上和/或結(jié)構(gòu)上類似的蛋白視為“相關(guān)蛋白”。此類蛋白可源自不同屬和/或種的生物體、或甚至不同綱的生物體(如，細(xì)菌和真菌)。相關(guān)蛋白還涵蓋通過基本序列分析確定的、通過二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)分析確定的或通過免疫交叉反應(yīng)性確定的同源物。
[0043]如本文所用，術(shù)語“衍生的多肽/蛋白”是指這樣的蛋白，其通過將一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)處置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在該蛋白質(zhì)的一端或兩端或氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸、和/或在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自或可衍生自另一蛋白。制備蛋白衍生物可通過修飾編碼天然蛋白的DNA序列、將DNA序列轉(zhuǎn)化到合適的宿主中以及表達(dá)經(jīng)修飾的DNA序列以形成衍生的蛋白而實(shí)現(xiàn)。
[0044]相關(guān)(以及衍生的)蛋白質(zhì)包括“變體蛋白質(zhì)”。變體蛋白質(zhì)由于置換、缺失和/或插入少量的氣基酸殘基而不同于參考蛋白質(zhì)/未本蛋白質(zhì)(如，野生型蛋白質(zhì))。變體蛋白質(zhì)與親本蛋白質(zhì)之間的差異氨基酸殘基數(shù)目可為一個(gè)或多個(gè)，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、
20、30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基。變體蛋白質(zhì)與參考蛋白質(zhì)可以享有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或甚至至少約99%或更高的氨基酸序列同一性。變體蛋白質(zhì)還可以在所選的基序、結(jié)構(gòu)域、表位、保守性區(qū)域等中不同于參考蛋白質(zhì)。
[0045]如本文所用，術(shù)語“類似序列”是指在蛋白質(zhì)內(nèi)提供與目的蛋白質(zhì)(即，通常是目的原始蛋白質(zhì))類似的功能、三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守性殘基的序列。例如，在包含a-螺旋或3 -片層結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域中，類似序列中的置換氨基酸優(yōu)選地保持相同的特定結(jié)構(gòu)。所述術(shù)語還指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，開發(fā)了類似序列，使得置換氨基酸導(dǎo)致變體酶顯示類似或改進(jìn)的功能。在一些實(shí)施例中，目的蛋白質(zhì)中氨基酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守性殘基位于目的區(qū)段或片段處或其附近。因此，在目的區(qū)段或片段包含(例如)a -螺旋或P -片層結(jié)構(gòu)的情況下，置換氨基酸優(yōu)選地保持該特定結(jié)構(gòu)。
[0046]如本文所用，術(shù)語“同源蛋白質(zhì)”是指與參考蛋白質(zhì)具有相似活性和/或結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。這并不意味著各同源物一定在進(jìn)化上相關(guān)。因此，該術(shù)語的意圖是涵蓋得自不同生物體的相同、類似或相應(yīng)的酶(即，在結(jié)構(gòu)和功能方面)。在一些實(shí)施例中，期望鑒定與參考蛋白質(zhì)具有類似的四級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源物。在一些實(shí)施例中，同源蛋白質(zhì)引起與參考蛋白質(zhì)相似的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，同源蛋白質(zhì)被工程化以制備具有所需活性的酶。
[0047]序列之間同源性的程度可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法確定(參見例如，Smith and Waterman (1981) Adv.App1.Math.2:482( Smith和 Waterman, 1981 年，《高等應(yīng)用數(shù)學(xué)》，第 2 卷，第 482 頁)`;Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol., 48:443(Needleman和ffunsch, 1970年，《分子生物學(xué)雜志》，第48卷，第443頁)；Pearson and Lipman (1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444 (Pearson 和 Lipman, 1988 年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第85卷,第2444頁);程序,例如在威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage,得自美國威斯康星州麥迪遜市的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(Genetics ComputerGroup, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;以及 Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Resl2:387-95 (Devereux 等人，1984 年，《核酸研究》,第 12 卷,第 387-395頁))。
[0048]例如，PILEUP是可用于測定序列同源程度的程序。PILEUP使用漸進(jìn)式逐對(duì)比對(duì)從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多個(gè)序列比對(duì)。其還能夠繪制顯示聚類關(guān)系(用于產(chǎn)生比對(duì))的樹形圖。PILEUP使用 Feng和 Doolittle 的簡化漸進(jìn)式比對(duì)方法(Feng and Doolittle (1987) J.Mol.Evo1.35:351-60 (Feng 和 Doolittle, 1987 年，《分子演化雜志》，第 35 卷，第 351-360 頁))。所述方法與Higgins和Sharp描述的方法類似((1989) CAB10S5:151-53 (1989年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》，第5卷，第151-153頁))。可用的PILEUP參數(shù)包括:默認(rèn)間隙權(quán)重
3.00、默認(rèn)間隙長度權(quán)重0.10，以及加權(quán)末端間隙?？捎玫乃惴ǖ牧硪粋€(gè)例子是Altschul等人((1990) J.Mol.Biol.215:403-10 (1990 年，《分子生物學(xué)雜志》，第 215 卷，第 403-410頁))以及 Karlin 等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-87( 1993 年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第90卷，第5873-5887頁))描述的BLAST算法。一種尤其可用的BLAST程序?yàn)閃U-BLAST-2 程序(參見例如 Altschul et al.(1996)Meth.Enzymol.266:460-80 (Altschul等人，1996年，《酶學(xué)方法》，第266卷，第460-480頁))。參數(shù)“W”、“T”和“X”決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序使用默認(rèn)值:字長(W) 1UBL0SUM62記分矩陣(參見例如HenikofTand Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (Henikoff和 Henikoff,1989 年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第89卷，第10915頁))比對(duì)⑶為50、期望值(E)為10，M’ 5，N’ -4，以及對(duì)兩條鏈的比較。
[0049]如本文所用，在至少兩條核酸或多肽的情況下，短語“基本上類似”和“基本上相同”通常意味著多核苷酸或多肽包含的序列與參考(即，野生型)序列相比具有至少約70%的同一性、至少約75%的同一性、至少約80%的同一性、至少約85%的同一性、至少約90%的同一性、至少約91%的同一性、至少約92%的同一性、至少約93%的同一性、至少約94%的同一性、至少約95%的同一性、至少約96%的同一性、至少約97%的同一性、至少約98%的同一性、或甚至至少約99%的同一性或更高的同一性。序列同一性可以使用例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之類的已知程序，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測定。(參見，例如Altschul，et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 (Altschul等人，1990年，《分子生物學(xué)雜志》，第215卷，第403-410頁)；Henikoff et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (Henikoff 等 A, 1989年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第86卷，第10915頁)；Karin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90:5873 (Karin等人，1993年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第90卷，第5873頁);以及 Higgins et al.(1988)Gene73:237-244 (Higgins 等人，1988 年，《基因》，第 73 卷，第237-244頁))。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公開獲得。另外,可使用FASTA對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索(Pearson et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444-48 (Pearson 等人，1988 年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第8 5卷，第2444-2448頁))。兩條多肽實(shí)質(zhì)上相同的一個(gè)指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。通常，因保守氨基酸置換而不同的多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。因此，一種多肽與第二多肽實(shí)質(zhì)上一致，例如，在此情況下兩種多肽僅因保守置換而不同。兩種核酸序列實(shí)質(zhì)上一致的另一個(gè)指示是兩種分子在嚴(yán)格的條件(如，在中至高嚴(yán)格度的范圍內(nèi))下彼此雜交。
[0050]如本文所用，術(shù)語“基因”與術(shù)語“等位基因”在指代編碼并指導(dǎo)蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)的核酸時(shí)是同義的。絲狀真菌繁殖體通常為單倍體，因而單拷貝的特定基因(即，單個(gè)等位基因)足夠賦予特定表型。
[0051]如本文所用，術(shù)語“野生型”與“天然”可互換使用，是指天然存在的基因、蛋白質(zhì)或菌株。
[0052]如本文所用，“基因缺失”是指其從宿主細(xì)胞基因組中移除。當(dāng)基因包含與基因編碼序列并未緊挨著的控制元件(如，增強(qiáng)子元件)時(shí)，基因缺失是指刪除了編碼序列，以及任選的相鄰增強(qiáng)子元件，包括(但不限于)例如啟動(dòng)子和/或終止子序列。
[0053]如本文所用，“基因破壞”廣義上是指在宿主細(xì)胞中進(jìn)行的任何基本上防止細(xì)胞產(chǎn)生功能基因產(chǎn)物(如，蛋白質(zhì))的遺傳或化學(xué)操作(即，突變)?；蚱茐牡氖纠苑椒òㄍ耆虿糠秩笔Щ虻娜魏尾糠?，包括多肽編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或另一個(gè)調(diào)控元件，或誘變上述元件，其中誘變包括置換、插入、缺失、倒位以及它們的組合和變化，它們中的任何一種突變基本防止了功能基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。還可以使用RNA1、反義或消除基因表達(dá)的任何其他方法來破壞基因。
[0054]如本文所用，術(shù)語“遺傳操作”和“遺傳變異”可互換使用，是指核酸序列的變異/改變。該變異可以包括(但不限于)核酸序列中至少一種核酸的置換、缺失、插入或化學(xué)修飾。
[0055]如本文所用，“有氧發(fā)酵”是指有氧氣存在下的生長。
[0056]如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)液”統(tǒng)一指液體/深層培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基和細(xì)胞。
[0057]如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞群”是指液體/深層培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞成分(包括完整和裂解細(xì)胞)?？捎酶芍鼗驖裰乇硎炯?xì)胞群。
[0058]如本文所用，術(shù)語“流變學(xué)”是指研究物質(zhì)變形和流動(dòng)的物理學(xué)分支。
[0059]如本文所用，“粘度”是液體對(duì)機(jī)械應(yīng)力(例如剪切應(yīng)力或拉伸應(yīng)力)下變形的抗性的量度。在本發(fā)明上下文中，粘度還可以指含有絲狀真菌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)機(jī)械應(yīng)力(如，由轉(zhuǎn)子/葉輪提供)的抗性。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)液的粘度難以直接測量，可使用間接測量粘度的方式，例如預(yù)選攪拌量下發(fā)酵液的溶氧量、維持預(yù)選溶氧量所需的攪拌量、維持預(yù)選溶氧量所需的攪拌細(xì)胞培養(yǎng)液的功率大小、或甚至固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
[0060]如本文所用，“粘度改變”絲狀真菌細(xì)胞變異菌株是指產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)液相比于親本菌株產(chǎn)生的等同細(xì)胞培養(yǎng)液具有降低或增加的粘度(即，對(duì)剪切或拉伸應(yīng)力的抗性降低或增加)的變異菌株。通常，等同細(xì)胞培養(yǎng)液具有類似的細(xì)胞群。優(yōu)選地，變異的粘度改變菌株和親本菌株之間在任何直接或間接粘`度測量方面的差異為至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。比較絲狀真菌細(xì)胞培養(yǎng)液粘度的方法在本文中有所描述。通常，類似的(或等同的)細(xì)胞培養(yǎng)液具有類似的細(xì)胞群。
[0061]如本文所用，“粘度降低”絲狀真菌細(xì)胞變異菌株是指產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)液相比于親本菌株產(chǎn)生的等同細(xì)胞培養(yǎng)液粘度降低(，即對(duì)剪切或拉伸應(yīng)力的抗性降低)的變異菌株。優(yōu)選地，變異的粘度改變菌株和親本菌株之間在任何直接或間接粘度測量方面的差異為至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。
[0062]如本文所用，“溶解氧” (DO)是指以體積/體積為單位測量的存在于液體培養(yǎng)基中的氧氣(O2)的量。溶解氧含量在整個(gè)發(fā)酵過程中可以維持在高水平，例如，介于170-100%和20%之間、介于100-80%和20%之間、介于70%和20%之間、介于65%和20%之間、介于60%和20%之間、介于55%和20%之間、介于50%至20%、介于45%和20%之間、介于44%和20%之間、介于43%和20%之間、介于42%和20%之間、介于41%和20%之間、介于40%和20%之間、介于35%和20%之間、介于30%和20%之間以及介于25%和20%之間。具體地講，在發(fā)酵開始的時(shí)候可以具有高的溶解氧含量，并且隨著發(fā)酵進(jìn)行溶解氧含量可以下降?？梢酝ㄟ^攪拌(如攪動(dòng))發(fā)酵的速率和/或通過加入空氣或氧氣的速率而控制溶解氧含量。能夠(如)以介于400和700rpm之間的轉(zhuǎn)速攪動(dòng)而攪拌培養(yǎng)物，并且可以通過改變空氣或氧氣流速和葉輪轉(zhuǎn)速而將溶解氧含量維持在20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上和55%以上或更高。
[0063]如本文所用，“主要遺傳決定因素”是指無其他基因或其遺傳操作時(shí)足以賦予特定表型所必需的基因或其遺傳操作。然而，足以賦予特定表型所必需的特定基因不排除能夠通過另外的基因操作獲得表型的附加效應(yīng)的可能性。
[0064]如本文所用，“功能多肽/蛋白”是指具有活性例如酶活性、結(jié)合活性、表面活性性質(zhì)等，且未進(jìn)行誘變、截短或以其他方式修飾以去除或降低其活性的蛋白質(zhì)。功能多肽可以為耐熱性的或不耐熱的，如具體說明的。
[0065]如本文所用，“功能基因”是指能夠被細(xì)胞成分所用以產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物(通常為蛋白質(zhì))的基因。功能基因與被破壞基因相反，后者被修飾，因此不能被細(xì)胞成分所用以產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物，或具有降低的被細(xì)胞成分所用以產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物的能力。
[0066]如本文所用，相比于親本菌株，若變異菌株與親本菌株之間的蛋白表達(dá)量差異低于約20%、低于約15%、低于約10%、低于約7%、低于約5%、或甚至低于約3%，則變異細(xì)胞“維持或保持高水平的蛋白表達(dá)和/或分泌”。
[0067]如本文所用，宿主細(xì)胞“被修飾以抑制特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生”，前提條件是宿主細(xì)胞進(jìn)行了遺傳或化學(xué)改變以抑制產(chǎn)生功能性蛋白/多肽，該蛋白/多肽具有野生型蛋白的活性特征，特別是促進(jìn)菌絲延長或以其他方式增加液體培養(yǎng)中絲狀真菌粘度的活性。此類修飾包括(但不限于)編碼蛋白(如本文所述)的基因缺失或破壞、使得所編碼的多肽缺乏上述活性的基因修飾、影響翻譯后加工或穩(wěn)定性的基因修飾以及它們的組合。
[0068]如本文所用，“目的蛋白”是期望在絲狀真菌細(xì)胞的深層培養(yǎng)中產(chǎn)生的蛋白。通常，目的蛋白在工業(yè)、醫(yī)藥、動(dòng)物保健以及食品和飲料用途方面具有重要商業(yè)價(jià)值，因此希望大規(guī)模生產(chǎn)。要將目的蛋白與絲狀真菌細(xì)胞表達(dá)的大量其他蛋白區(qū)分開，后者通常不是目的產(chǎn)物并且主要被視為背景蛋白污染物。
`[0069]如本文所用，若相比于親本菌株產(chǎn)生的蛋白量，變異菌株產(chǎn)生的蛋白量減少不超過20%、減少不超過15%、減少不超過10%或甚至減少不超過5%，其中蛋白量被歸一化為測定了蛋白產(chǎn)量的細(xì)胞的生物質(zhì)總量，其中生物質(zhì)可用濕重(如，細(xì)胞團(tuán)塊)或干重方式表示，則變異菌株每單位量的生物質(zhì)產(chǎn)生與親本菌株“基本上等量”的蛋白質(zhì)。
[0070]如本文所用，若相比于親本菌株，變異菌株產(chǎn)生的蛋白量增加至少5%、增加至少10%、增加至少15%或更多，其中蛋白量被歸一化為測定了蛋白產(chǎn)量的細(xì)胞的生物質(zhì)總量，其中生物質(zhì)可用濕重(如，細(xì)胞團(tuán)塊)或干重方式表示，則變異菌株較之親本菌株“每單位量的生物質(zhì)產(chǎn)生基本上更多的蛋白質(zhì)”。
[0071]如本文所用，“熒光物”為熒光染料。優(yōu)選的熒光物與真菌細(xì)胞壁的纖維素和/或甲殼質(zhì)結(jié)合。
[0072]如本文所用，單數(shù)冠詞“一個(gè)”、“一種”和“該”涵蓋多個(gè)指代物，除非上下文明確地另有所指。本文引用的全部參考文獻(xiàn)均據(jù)此全文以引用方式并入本文。除非另外指明，否則以下縮寫/首字母縮略詞具有下列含義:
[0073]CFU菌落形成單位
[0074]EC酶學(xué)委員會(huì)
[0075]kDa千道爾頓
[0076]kb千堿基[0077]MW分子量
[0078]w/v重量/體積
[0079]w/w重量/重量
[0080]v/v體積/體積
[0081]wt%重量百分比
[0082]V攝氏度
[0083]H2O水
[0084]H2O2過氧化氫
[0085]dH20或DI去離子水
[0086]dIH20Mill1-Q過濾的去離子水
[0087]DO溶解氧
[0088]g 或 gm克
[0089]V- g微克
[0090]mg毫克
[0091]kg千克
[0092]Ib磅
[0093]ii L 和 ii I微升
[0094]mL 和 ml毫升
[0095]mm毫米
[0096]u m微米
[0097]mol摩爾
[0098]mmol毫摩爾
[0099]M摩爾濃度
[0100]mM毫摩爾濃度
[0101]UM微摩爾濃度
[0102]nm納米
[0103]U單位
[0104]ppm份每一百萬份
[0105]sec和，，秒
[0106]min 和’分鐘
[0107]hr和h小時(shí)
[0108]EtOH乙醇
[0109]eq.當(dāng)量
[0110]N垂直
[0111]PCR聚合酶鏈反應(yīng)
[0112]DNA脫氧核糖核酸
[0113]FOA氟乳清酸
[0114]UV紫外線
[0115]A540540nm波長處測得的吸光度[0116]CMC羧甲基纖維素
[0117]rpm轉(zhuǎn)每分鐘
[0118]A與缺失相關(guān)
[0119]CERCO2 釋放率
[0120]bp堿基對(duì)
[0121]II1.Sebl蛋白產(chǎn)暈改變的絲狀真菌菌株
[0122]在一個(gè)方面，提供了源自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，該變異菌株包含遺傳變異，導(dǎo)致了變異菌株細(xì)胞與親本菌株細(xì)胞相比產(chǎn)生改變量的功能性Sebl蛋白。相比于親本菌株細(xì)胞，變異菌株細(xì)胞隨后在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生需要改變的攪拌量來保持預(yù)選溶氧量的細(xì)胞培養(yǎng)液，或在預(yù)選攪拌量下保持改變的溶氧量的細(xì)胞群。
[0123]在一些情況下，遺傳變異造成變異菌株細(xì)胞產(chǎn)生與親本菌株細(xì)胞相比含量下降的功能性Sebl蛋白，并且與親本菌株細(xì)胞相比，所得的細(xì)胞培養(yǎng)液需要減少的攪拌來保持預(yù)選溶氧量，或在預(yù)選的攪拌量下保持更高的溶氧量。在這種情況下，據(jù)信變異菌株細(xì)胞群與親本菌株細(xì)胞群相比表現(xiàn)出粘度降低，這也解釋了有關(guān)溶氧量和攪拌的觀察結(jié)果，如實(shí)例中所述。
[0124]功能性Sebl蛋白含量下降可能是親本菌株中存在的sebl基因被破壞所引起的。因?yàn)閟ebl基因的破壞是賦予變異菌株粘度降低表型的主要遺傳決定因素，所以此類變異菌株僅需要包含被破壞的sebl基因，而所有其他基因可以保持完整。在一些情況下，與其來源親本菌株相比，變異菌株可以任選地包含另外的遺傳變異。此類另外的遺傳變異并非實(shí)現(xiàn)粘度降低所必需的，但可以 進(jìn)一步降低粘度或賦予變異菌株其他優(yōu)勢。
[0125]破壞sebl基因可以使用任何合適的基本防止功能性sebl基因產(chǎn)物(即，Sebl蛋白)表達(dá)的方法完成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的示例性破壞方法包括(但不限于):完整或部分缺失sebl基因，包括完整或部分缺失(如)Sebl編碼序列、啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子或另一個(gè)調(diào)控元件；以及完整或部分缺失包含sebl基因的任何部分的染色體的一部分。破壞sebl基因的具體方法包括在sebl基因的任何部分(如Sebl編碼序列、啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子或另一個(gè)調(diào)控元件)進(jìn)行核苷酸置換或插入。優(yōu)選地，采用序列特異性分子生物學(xué)技術(shù)，通過遺傳操作進(jìn)行缺失、插入和/或置換(統(tǒng)稱為突變)，這不同于化學(xué)誘變，后者通常不能靶向特定核酸序列。然而，化學(xué)誘變可以用于破壞sebl基因。
[0126]sebl基因中的突變可以降低sebl啟動(dòng)子的效率，降低sebl增強(qiáng)子的效率，干擾seb ImRNA的剪接或編輯，干擾seb ImRNA的翻譯，在Sebl編碼序列中弓丨入終止密碼子以抑制全長Sebl蛋白的翻譯,改變Sebl蛋白的編碼序列以產(chǎn)生較低活性或失活蛋白或降低Sebl與其他核酸蛋白組分的相互作用，改變Sebl蛋白的編碼序列以產(chǎn)生穩(wěn)定性較低的蛋白或靶向該蛋白使其被破壞，造成Sebl蛋白錯(cuò)誤折疊或不正確修飾(如，通過糖基化)，或干擾Sebl蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0127]在一個(gè)實(shí)施例中，這些以及其他遺傳操作的目標(biāo)是降低或抑制功能性Sebl蛋白的表達(dá)，或者降低或抑制Sebl蛋白的正常生物活性，從而產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致粘度降低表型的細(xì)胞內(nèi)形態(tài)改變。
[0128]在其他情況下，遺傳變異增加或恢復(fù)功能性Sebl蛋白的表達(dá)，或增加Sebl蛋白的正常生物活性，從而產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致粘度增加或恢復(fù)表型的細(xì)胞內(nèi)形態(tài)改變。增加或恢復(fù)Sebl功能的示例性遺傳變異是以下的那些遺傳變異:將額外的sebl基因拷貝引入到細(xì)胞中，增加sebl啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他控制元件的效率，增加編碼Sebl蛋白的mRNA的翻譯，增加編碼Sebl蛋白的mRNA的穩(wěn)定性，在sebl基因中引入增加Sebl蛋白活性或穩(wěn)定性的改變，在sebl基因中引入調(diào)控與其他蛋白或細(xì)胞壁成分相互作用的改變等等。其他增加或恢復(fù)Sebl功能的遺傳變異是使降低或抑制功能性Sebl蛋白表達(dá)的遺傳變異效應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn)的那些遺傳變異。
[0129]按照所述方法操作和使用的絲狀真菌細(xì)胞通常源自子囊菌門盤菌亞門，尤其是處于營養(yǎng)菌絲狀態(tài)且包含sebl基因同源物的真菌。此類生物體包括用于生產(chǎn)具有重要商業(yè)價(jià)值的工業(yè)和藥用蛋白質(zhì)的絲狀真菌細(xì)胞，包括(但不限于)木霉屬物種、曲霉屬、鐮刀菌屬、足放線病菌屬、青霉屬、金孢子菌屬、頭孢屬、籃狀菌屬、白喬史密斯霉屬和脈孢菌屬。具體的生物體包括(但不限于)里氏木霉(之前歸類為長梗木霉和紅褐肉座菌)、黑曲霉、煙曲霉、分解烏頭Ife曲霉、米曲霉、構(gòu)桌曲霉、土曲霉、醫(yī)油曲霉、日本曲霉、多育賽多抱、粗糖脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)黃青霉、埃默森籃狀菌(白喬史密斯霉)、產(chǎn)毒鐮刀菌和勒克瑙金孢子菌。
[0130]如Peterbauer, C.等人((2002)Molecular Genetics and Genomics268:223-31(2002年，《分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)》，第268卷，第223-231頁))所述，來自深綠木霉(Trichoderma atroviride)的Sebl為STRE兀件結(jié)合蛋白，并且據(jù)信sebl基因?yàn)榻湍竚sn2/4基因和構(gòu)巢曲霉msnA基因的同源物。要注意的是，sebl基因不能與酵母中的msn2/4基因互補(bǔ)，因此可能不是功能性同源物。Sebl參與(但并非必需)滲透脅迫響應(yīng)，但在此前尚未被描述為與形態(tài)改變(特別是導(dǎo)致低粘度表型的那些)有關(guān)。本發(fā)明提供了 Sebl與形態(tài)改變有關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
[0131]使用深綠木霉Sebl氨基酸序列(SEQID NO:1)作為查詢序列，對(duì)里氏木霉的已公布基因組DNA序列進(jìn)行BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)里氏木霉基因組包含與sebl同源性接近的單個(gè)基因。沒有鑒定出另外的同源物或類似序列，表明sebl為獨(dú)特的單拷貝基因。Sebl蛋白的同源物存在于如棒曲霉(Aspergillus clavatus) (SEQ ID NO: 2)、煙曲霉Af93 (SEQ ID NO:3)和費(fèi)氏新薩托菌(Neosartorya fi`scheri)NRRL181 (SEQ ID NO:4)中。里氏木霉的預(yù)測Sebl氨基酸序列不于SEQ ID N0:5中。
[0132]深綠木霉Sebl蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:1所示:
[0133]MDGMMSQAMGQQAFYFYNHNHDHKMARQAIFAQQMAAYQMVPTLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSRKHMMLDAEFGDNPYFPSTPPLSTSGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAMKEAVDTTESLVVDWASIVSPPLSPVYFQSQVSRVPSPTSSPSDILSTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLTGLAEDLKGEQLSTAQHTFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSNLVNLGEVNPIDISRPRACTGSSVVSLGHGSFI⑶EELSFEDNDAFGFNSLPSPTSSIDFSDVHQDKRRKKEKKDIKPMNTAASGSPSGNEQIGATPAASAASDSNASSASEDPSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHAGGAIVMNLIEDGSEVPAFDGSMMTGPVGDDYNTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEE⑶QSKKKRKRSD
[0134]棒曲霉Sebl蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID N0:2所示:
[0135]MDTTYTMVGTPVQGQPSFAYYTTNDSQSRQQHFTSHPSEMQAFYGQMQPYPQQQQQTCMPDQQSIYAAQPMLNMHQMATANAFRGALSMTPIVSPQPTHLKPTIIVQQDSPMLMPLDTRFVSSDYYAFPSTPPLSTSGSTISSPPSSGRSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHSELLANADWSRSDSPPLTPVFIHPPSLTASQSSDLLSAHSSCPSLSPSPSPVSSTFIAPPHSGLSVEPSGTDFCDPRQLTVESSVDSSTELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHESLSPAYTSSTEDPLGSLPTFDSFTDLDSEDEFVNNLVDFHPGGNPYFLGDKRQRLGSYLLEEDEFLSDRSFDDLDDHEAFAHSGLPSLEPSELISVQ⑶VAEVSEEMRSKKRTTSRRTLKRTNSSDSSSESLATSGKRTQASANGRSGHSEATSSSAQQSTTPSRQNSTANASSSSEAPSAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCTLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNASLQASYEEREPRLLGAALYEAANAAANKSTTSDSSDGTISDTSSVEGRPIKKRRREDHA
[0136]煙曲霉Af93Sebl蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO: 3所示:
[0137]MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPFEMQYYGQVSSYPQQQAQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQDSPALMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTDWSRSDSPPLTPVFIQPQSLTASQSSDLLSAQIPCPSLSPSPSPDSATFISHPQSILSAEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFQGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESTDFLAVEGDATQSTEEMSSKKRVTSRRSLKKASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSDTTSTVQQSTASSRQNSTANTSNSESPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNSSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV
[0138]費(fèi)氏新薩托菌NRRL181Sebl蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID N0:4所示:
[0139]MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPSEMQYYGQVPPYPQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQQDSPVLMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTGWSRSDSPPLTPVFIQPPSLTASQSSDLLSAHMSCPSLSPSPSPDSTTFISHPQSVLSAEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFLGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESSDFLAAE⑶ATQNTEEMSSKKRVTSRRSLKRASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSETTSTVQQSTASSRQNSTANTSSSGSPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNGSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV
[0140]里氏木霉Sebl蛋白的預(yù)計(jì)氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:5所示:
[0141]MDGMMSQPMGQQAFYFYNHEHKMSPRQVIFAQQMAAYQMMPSLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSSRKPMLVDTEF⑶NPYFPSTPPLSASGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAIKDSIDATESLVLDWASIASPPLSPVYLQSQTSSGKVPSLTSSPSDMLSTTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLLADDIKGEPLPTAAQPSFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSSLVNLGEINPVDISRPRACTGSSVVSLGHGSFI⑶EDLSFDDEAFHFPSLPSPTSSVDFCDVHQDKRQKKDRKEAKPVMNSAAGGSQSGNEQAGATEAASAASDSNASSASDEPSSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHSGGAIVMNLIEESSEVPAYDGSMMAGPVGDDYSTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEEGEQGKKKRKRSD
[0142]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，產(chǎn)量改變的Sebl蛋白的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的氨基酸序列具有特定程度的總體氨基酸序列同一性，如，與SEQID NO: 1、2、3、4或5具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或甚至至少約99%的同一性。編碼每種氨基酸序列的核苷酸序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的針對(duì)每種對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的BLAST搜索進(jìn)行識(shí)別。
[0143]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，被破壞的sebl基因編碼與SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的氨基酸序列具有特定程度的總體氨基酸序列同一性的Seb I蛋白，如，與SEQ IDNO: 1、2、3、4或5具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或甚至至少約99%的同一性。
[0144]本文提供的氨基酸序列信息使技術(shù)人員易于辨識(shí)任何絲狀真菌中的Sebl蛋白和編碼Sebl蛋白的核酸序列，并在sebl基因中進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠茐囊杂绊慡ebl蛋白的產(chǎn)量。編碼SEQ ID NO: 1、2、3、4的多核苷酸序列可存在于本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的GenBank或JGI數(shù)據(jù)庫中。
[0145]在另一方面，提供了一種改變絲狀真菌細(xì)胞形態(tài)的方法。變異絲狀真菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)出生長形態(tài)改變，并且在深層培養(yǎng)物中生長時(shí)與親本細(xì)胞生長和細(xì)胞培養(yǎng)液的粘度相比產(chǎn)生具有不同粘度的細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0146]在一些情況下，該方法包括使用合適的遺傳方法破壞親本菌株的sebl基因，其中被破壞的sebl變異菌株在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)液，與親本菌株細(xì)胞相t匕，所述細(xì)胞培養(yǎng)液需要減少的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，或在預(yù)選的攪拌量下保持增加的溶氧量?？梢圆捎蒙衔囊约氨绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他地方所述的任何方式，使用此類方法來破壞sebl基因。優(yōu)選地，使用序列特異性分子生物學(xué)技術(shù)，通過遺傳操作進(jìn)行sebl基因的破壞，這不同于化學(xué)誘變，后者通常不能靶向特定核酸序列。然而，可以使用化學(xué)誘變獲得令人滿意的結(jié)果。
[0147]在一些實(shí)施例中，向親本菌株中弓丨入粘度降低表型所形成的粘度降低菌株已經(jīng)包含旨在高水平表達(dá)的目的基因。這樣，本發(fā)明的方法不必再將目的基因引入到預(yù)先存在的粘度降低菌株中用來生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的方法可用于從已含目的基因的親本菌株生產(chǎn)絲狀真菌細(xì)胞的粘度降低變異菌株。
[0148]IV.改變Sfb3產(chǎn)暈所產(chǎn)生的累加效應(yīng)
[0149]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，影響Sebl產(chǎn)量或Mpgl和Sebl產(chǎn)量的遺傳變異與影響Sfb3產(chǎn)量的遺傳變異結(jié)合。Sfb3基因(也稱為Lstl)此前在出芽酵母(即，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中進(jìn)行表征,其中它編碼的蛋白質(zhì)與圍繞將蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體的運(yùn)輸小泡的COPII衣殼蛋白相關(guān)。Sfb3和Sfb2是Sec24的同源物，其所有基因參與將特定貨物蛋白包裝到小泡內(nèi)。
[0150]雖然Sec24是酵母的必需基因，但Sfb3和Sfb2卻并不是，盡管已知酵母中Sfb3的缺失會(huì)影響質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Pmalp)及參與細(xì)胞壁合成的葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(Gaslp)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0151]使用釀酒酵母Sec24p、Sfb3p或Sfb2p氨基酸序列作為查詢序列，通過BLAST搜索里氏木霉的已公布基因組序列，發(fā)現(xiàn)里氏木霉具有與酵母Sec24同源性最接近的單個(gè)基因以及與酵母Sfb3同源性最接近的單個(gè)基因。沒有鑒別出其他同源物，表明里氏木霉不具有等同于Sfb2的基因。此外，Sfb3蛋白的同源物存在于如里氏木霉(SEQ ID N0:6)、米曲霉(SEQ ID NO:7)、黑曲霉(SEQ ID NO:8)、繩狀青霉(SEQ ID NO:9)、產(chǎn)黃青霉(SEQ IDNO: 10)、粗糙脈孢菌(SEQ ID NO: 11)和尖孢鐮刀菌(F.0xysporum) (SEQ ID NO: 12)中:[0152]里氏木霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:6):
[0153]MDYTQYHALGHGEVLDPNDPNKTSAPAAPQFQPPSSPYVPPGSPYGAPPYHGGHQAPPMAMPPPSTPGYGPPQGQSFPGSPMPSQDAGLAAQFGGMSLGADAGGAAARKKKKDRHAYHSVEPTGSSQAFNGLPPGTPAEQFLNVNNPQGIPALGGQFGSPLASPMGTPHMANPGQFPAPTSPFTPSAPVSPAEFASRFGSPDAATSIGSAGPSQVSPDDMPSIPASRDAIQEHFFKNVYPTFERHVPPPATVSFVAFDQGNASPKFTRLTLNNIPTTAEGLHATGLPLGMLIQPLAPLQAGEAEIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMMFRSGGNKFVCNLCSYPNETPPEYFCAVSPQGVRLDRDQRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFVIDVTQESYNKGFMETFCEGILAALYGGNDEENDEDGEPKRRIPKGAKVGFITYDKDIHFYNINPHLDQAHMMIMPDLEDPFLPLGEGLFVDPYESKAIITSLLTRLPEMFSTIKNPEPALLATLNAAVAALEATGGKVVCSCSTLPTWGPGRLFMRDDGNHPGGELDKKLYTTEHPAWKKVSEKMASSGIGVDFFLAAPSGGYLDIATIGHVAATTGGETFYYPNFIAPRDGARLSMEITHAITRETGFQALMKVRCSTGLQVAAYHGNFVQHTFGADLEIGVIDADKALGVSFSHDGKLDPKLDAHFQTALLYTTASGQRRVRCSNVIASVSDTSKESNTKELAIRQCLKFVDQDAVVGIFAKEASTKLATTSANLQDVRNWLTERTIDIMAYYKKHSANQFPPSQLVMPERLKEFCMYMLGMLKCRAFKGGIENSDRRVHELRMVRSMGPLELSLYLYPRMIALHNLQPEEGFADPETGHLKMPPSVRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHAQTSPNLITDLFGEGHDSLKGLDPYTSTLPVLETHLSAQVRNIIEFLKSMRGSKGMTIQLARQGIDGAEYEFARMLVEDRNNEAKSYVDWLVHIHRGVQLELSGQRKKE⑶GEATAVMANFAGLRPAYW
[0154]米曲霉RIB40Sfb3 氨基酸序列(G1: 83766074; SEQ ID NO: 7):
[0155]MADQSMYNTLGQGTSPAEDPSNPNRMAHQVPPQSQPAAGFPPGPYPPQPGAYYGNPPPNQYDAPAAAPPTQQLQSPPPRGLAPSPQLAYGTETQTHMGAPADPMAGLASQMSGLGIMGDSGARPGKKKHRHAHHEIGGATASAPQQFAGMPQAGMQPSSQFLNTGLNQAPRPISPAAGVPPAGIVPQPGVPAPGSGSVPTQGKIDPEQIPSIPQSRDIPTMYYFDHIYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKHARLTLNNIPTTSDFLSSTALPLGMVLQPLARLDPGEPEVPVLDFGEMGPPRCRRCRAYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVAPEYFAPLDMSGARVDRLQRPELMIGTVEFMVPKEYWNKEPVGLQRLFLIDVSQESVNRGFLKGVCKGITEALYGAPDASEEDAAARRVPEGSKIGIVTYDREVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDIITSLLHRIPKIFSHIKKPEPALLPALNAAMSALQATGGKIFASICSLPTWGPGALHMRDDPKVHGTDAERKLFTTDNQAWRTTAGKMAEHGIGVDMFVAAPGGTYVDVATIGHVAEVSGGETFFYPNFHAPRDILKLSQEFAHAVTRET GYQAMMKVRCSNGLQVSAYHGNFIQHALGADLEIGSIDADKAIGVMFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTTAEGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFIDQDCWSIMAKEAAAKTVDKSLKDIRASITEKTVDIFSGYRKVFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLALIKSRAFKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGATELALYLYPRVIPIHNMQPEDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQICLLWLHSRVSPNLLEDLLGPGQSSLQGLNPQTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYFSTMRGSKSVAIQLARQGLDGAEYEFARLLVEDRNNEAQSYVDffLVHIHRQINLELAGHRKREDTSAEGSLTSLAGLRAPYff
[0156]黑曲霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
[0157]MADPNMYHTYGQAPVPGENPSDPNQMAYQVPPQGYPAAGIPPGPSPPQPGAAYGVPAPNQQWPAYGSPPPAQQPLQQPPSQFAHQADPQAAMGAPVDPGMAGLASQMSGLGIMGGEGGAARSSKKKHRHAHHEIAGASASVAQPFAAAPQDPMQPTSQFLNTGLNQAPRPISPAASIPAPVNPAFGGGAGAVPTQGKVDPEQIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKYARLTLNNIPSTSDFLSSTGLPLGMVLQPLARLDGEQPIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMSFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPLDPSGSRIDRMQRPELMMGTVEFLVPKDYWNKEPVGLQWLLLIDVSQESVNKGFLKGVCKGIMEALYSEETENPEDEAPARRIPEGAKIGIVTYDKEVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLQRIPSIFSHVKNPQPALLPALNAALSALRPTGGKIVGTIASLPTWGPGALSLRDDPKVHGTDAERKLFTTEHAGWRETAGHLAEAGIGLDMFIAAPSGTYMDVATIGHIPEVTGGETFFYPNFHAPRDIRKLSKELAHAITRETGYQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFVQHTFGADLEIGAIDADKAIGVVFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSANGQRRVRCINTVAAVNEGGMETMKFVDQDAVVAMVAKDAASKTLDKSLKDIRAGVSEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLIKSRAIKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGCTELSLYLYPRIIPIHNMQPTDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQQCLLWLHSHVSPNLLEDLFGEGQTSLQGLSPQISTIPVLETHLNAQVRNLLQYFSTIRGSKAVTIQLARQGLDGAEYEFARMLVEDRNNEAQSSVDffLVHIHRQINLELAGHRKREDTAGEGGLTSLAGLRAPYff
[0158]繩狀青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
[0159]MADYSTYHSSGYAGAPGEDPNRQQPAVPAPYHSPNAPPGQAIQQPGITPYGAAQPPQFPGQPGVGYGVAPVPSPPQALGGPDV⑶LATRIGGLGIISDAGTRSHKKKHRHAYHDIGGPNAQGLNTFPSQTNLQSQFLNTGLNQPEQQPAAPAAFPGAPVGQVPANVAPGAAPEVGGVGSVPTQGKIDPEQIPSVPRSRDLPAQYYFNNVYPTMERHVPPPASIPFIAHDQGNSSPKVARLTLNNIPSSSDFLQSTGLPLGMILQPLAKLDAGEQPVPVIDFGDIGPPRCRRCRTYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPVDPSGVRVDRLQRPELMLGTVEFTVPKEYWVKEPAGLHQLFLIDVSQESVNRGFLKGVCDGIINALYGEEEPVEGAEPETRKVPEGSKIGIVTFDREIHFYNLLPRLDKAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLEQLPSLFARVKSPESTLLPTIKAAISALQATGGKIICCLTSLPTYGPGKLVMKDKSQAPDGENKLFAIDNPDYKAAATKLTEAGVGIDFFVAAPGGSFMDLTTIGYTAAISGGECFFYPNFHSPRDSLKLAQEISHTVTRETGYQALMKVRCSNGLQVSAYYGNFLQHTFGADLEIGTIDADKALGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTAANGQRRVRCINIVAGVNEGGIETMKCIDQDAVVAIIAKEAASKA⑶KTLKDIRASITEKTVDIFSGYRKNFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLGLLKSRAFKGGSETADRRVHDLRMLRSIGCLELSLYLYPRIIPIHNMSAEDGFANEQGQLQVPPALRASFSRVEEGGAYLIDNGQGILLWIHSFVSPNLLEDLFGPGITSLQALDPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKAVTIQLARQGIDGAEYEFARSLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEDSATSSGEGALSSLAGIRAPYff
[0160]產(chǎn)黃青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)
[0161]MADSSMYNTMGQGSSEDPSNPQYMAQVPPQQYPAGYPPTAAPLQPGAPYANPAPNQWPAYGSPQQPGMASPGIAYNAPQQPMGAAVDPGMAGLASQMGGLDIAADAGARTHRKKHRHAHHDIGGGAAPPAQGFNTGMDQGGLQQPQPQQQSQFLNTGLNQHADRPVSPAVGLV`SGQSVAAIPGIQSGAGSVPTSGRIDPEHIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMDQHLPPPAAIPFVAQDQGNSSPKYARLTLNNIPSASDFLTSTGLPLGMILQPLAPLDPGEQPIPVLDFGDVGPPRCRRCRTYINPFMSFRSGGSKFVCNMCTFPNDTPPEYFAPLDPSGARVDRMQRPELLMGTVEFTVPKEYffNKEPVGLQTLFLIDVSRESVHRGFLKGVCAGIKDALY⑶DDKASEGTEGDGSSRKLPVGAKVGIVTYDKEVHFYNLAAALDQAQMMVMTDLDEPFVPLSEGLFVDPYESKSVITSLLSRIPKIFSSIKNPESALLPTLNSALSALQATGGKIVCAVASLPTCGPGHLAIREDPKVHGTDAERKLFTTENPAWKKTASKLAEAGVGLDLFMAAPGGTYLDVATIGHVSSLTGGETFFYPNFHAPRDLLKLRKEIAHAVTRETGYQTLMKVRCSNGLQVSAYHGNFVQHTLGADLEIAGVDADKAVGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSADGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFVDQDAVVSVIAKEAASKTLDKNLKDIRASISEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLVKSRAFKAGPESSDRRIHDMRLIRSMGCTEMALYLYPRIIPVHNMQPEDGFANEHGQLQIPPTMRASYSRIEDGGVYIVDNGQAILLWIHAQVSPNLLEDLFGPGHNSLQGLNPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKSVTIQLARQGLDGAEYEFARLLLEDRNNEAQSYVDffLVHIHRQINLELAGHRKKEEGGEGALASLSAMRTPYff
[0162]粗糙脈孢菌Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)
[0163]MADYTMYHALGQGETLDPNDPNRTTQPAPPQFQPPVAPNPYHPGAEYNAPGQQQQQQQQYGQQYGQQYGQQYGQQQYGQEYGHQQQQQQQQQYGAPSPYGAPPAHSPVSPMDDVGLAAQMGGMSLGAGAGAADHHGRKKKKDRHAFHTVEAPAGSSQPFNGMPPAGIPATQFLNADPSLAGRIPGPGHGQFPMPASPAFGPVPTSAADFAARDATQGVGSGVFAAGGPQGGKPSPDDTPSVPLSRDAVQPYFHTNVYPTFERLVPPPAVTSFVALDQGNSSPKFARLTMTNLPASAEGLKSTGLPLGLLLQPLAETQPGELPIPVLDFGEQGPPRCHRCRAYMNPFMMFKAGGNKFVCNLCTYANDTPPEYFCALSPQGVRVDRDQRPELTRGTVEFVVPKEYWTKEPVGMRYLFVIDVTQESYNKGFLESFCEGILSALYGGSEEGEDQDETGEPKRKIPAGAKVGFVTFDQEIHFYNVSPALEQAQMIVMPDIEDPFLPLSDGLFVDPYESKAVISSLLTRLPQMFSNIKNPEPALLSALNSAVAALEKTGGKVFCSLAALPTWGPGRLFMRDDGKHPGGEPDKKLFTTEHPGWRKLAEKMVSLGVGADFFMASPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFFYPNFVVQRDSTKLSLEIHHAVRRETGYAALMKVRCSNGLQVNAYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKALAVTFGYDGKLDSKLDAHFQAALLYTTASGQRRVRCINVIAGVSDLARDCMKYIDQDAIVSILAKEASTKLSTTSANLKEVRSSLTEKTIDILALYRKNHLAVPHPPQQLVMPERLKEFTMYVLGMLKCRAFKGGNETTDRRVHDMRLIRSMGARELSLYLYPRIIPLHSLQPEDGYPDATTGHLRMPSTMRASFARVEPGGVYLVDNGQVCLLWMHAQTAPALIQDLFGEDKTTLQSLDPYTSTIPVLETHLNAQTRNIIEYMRTVRGSKGLTIQLARQGIDGAEFEFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHVHKGVQLELAGQRKREDGESHSALGSFTGLRPAYW
[0164]尖孢鐮刀菌Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)
[0165]MADYAQYHALGQGEVIDPNDPNRTSQPSAQQFQPPIAPSPYQQQASPYGAPQYLGGQQAPPPMTGSPAPAPGYGYAPPQAQAPPGQAPPSQDATLAAQLGGMNLGDGHGTARRKKKDRHAYHTVEPTGSSQAFNGMPPQGTSATQFLDSVPGGPGFGGQFGSPQGTPQMQSQSQFSAPVNPAFGPGPVAGTPGVGEGLGTASVSTSGPKGVSPDDMPSVPASRDAIQQYYLKNVYPTFERHVPPPSTVSFVAYDQGNSSPKYTRLTLNNIPTTQDALQATGLSLGLLLQPLAPLQAGEAEIPVLDFGEAGPPRCRRCRAYMNPFMMFRSGGNKFVCNLCAYPNDTPPEYFSATNPQGVRVDRDTRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFLIDVTQESYNKGYVEAFCEGIRVALYGGEDQELDENGEPKRRIPEGAKVGFVTYDKDIHFYNVNPALDQAQMMIMPDLEDPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLTRLPDMFSTIKNPEPALLAALNSALAALEATGGKVVASCSALPTWGPGRLFMRDNGNHPGGEIDKKLYTTEHPAWKKVAEKMAASGVGADFFLAAPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFYYPNFIAARDSRKLSLEISHAVTRETGFQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKAMGVSFSYDGKLDPKLDAHFQSALLYTTASGERRVRCSNVIASVTETSKESGAREQGIRECLKFVDQDAVIGMLAKEASTKLATTSSNLKDIRHWLSEKAIDVLACYRKHAAQQHPPGQLVMPERLKEYCMYLLGLLKCRALKGGVENSDRRVHEMRMLRSMGALELSLYLYPRMIPIHNLAPEEGFADPETGHLKMPPAIRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHSQTSPNLISDLFGEDKDSLKSLDPYTSALPL LETHLNAQVRNIIEFLRTMRGSKGLTIQLARQGIDGAEFDFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHKGVQLELSGQRKKEGEEHTAASLSNFAGLRPAYW
[0166]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，產(chǎn)量改變的Sfb3蛋白的氨基酸序列與SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11或12的氨基酸序列具有特定程度的總體氨基酸序列同一性，如，與SEQ ID N0:6、7、8、9、10、ll或12具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或甚至至少約99%的同一性。編碼每種氨基酸序列的核苷酸序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的針對(duì)每種對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的BLAST搜索進(jìn)行識(shí)別。
[0167]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，sfb3基因被破壞，其中sfb3基因編碼Sfb3蛋白，該蛋白與SEQ ID N0:6、7、8、9、10、ll或12的氨基酸序列具有特定程度的總體氨基酸序列同一性，如，與SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11或12具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或甚至至少約99%的同一性。
[0168]來自大約40個(gè)盤菌亞門物種的Sfb3蛋白的氨基酸序列比對(duì)顯示了一段特定氨基酸序列，即 IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO: 13，其中 X 為任何氨基酸殘基)，其靠近Sfb3蛋白的C端，但不存在于Sec24蛋白中。這段共有序列可用來鑒定盤菌亞門其他成員中的Sfb3蛋白及其變體。
[0169]技術(shù)人員將會(huì)知道，影響Sfb3產(chǎn)量的遺傳變異可以與本文詳細(xì)敘述的影響Mpgl和/或Sebl產(chǎn)量的遺傳變異以同樣的方式進(jìn)行。Sfb3蛋白中導(dǎo)致粘度改變的變異在公開于2012年3月I日的PCT專利公布N0.W02012/027580A1中進(jìn)行了詳細(xì)的描述，該專利公布作為國際專利申請N0.PCT/US2011/049164提交于2011年8月25日，并以引用的方式并入本文。
[0170]V.改變MpgI產(chǎn)暈所產(chǎn)生的累加效應(yīng)
[0171]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，影響Sebl產(chǎn)量或Sebl和Sfb3產(chǎn)量的遺傳變異與影響Mpgl產(chǎn)量的遺傳變異結(jié)合。如Kruszewska et al.(1998)Cur.Genet.33:445-50 (Kruszewska 等人，1998 年，《當(dāng)代遺傳學(xué)》，第 33 卷，第 445-450 頁)和 Zakrzewska et al.(2003)Applied and Enviromnetal Microbiology69:4383-89(Zakrzewska等人,2003年，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》,第69卷,第4383-4389頁)所述,源自里氏木霉的Mpgl(PID122551)編碼GTP: a-D-甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶。mpgl基因的過表達(dá)增加了 GDP-甘露糖的含量，其能夠在蛋白質(zhì)糖基化的早期起到重要的調(diào)節(jié)作用。然而，Mpgl迄今尚未與形態(tài)改變相關(guān)，特別是未與導(dǎo)致低粘度表型的形態(tài)改變相關(guān)。
[0172]里氏木霉Mpgl蛋白(PID122551)的氨基酸序列如下面的SEQ ID N0:36所示:
[0173]MKGLILVGGFGTRLRPLTLTLPKPLVEFCNKPMIVHQIEALVAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKFLAEYEEKYNINIEFSVESEPLDTAGPLKLA ERILGKDDSPFFVLNSDVICDYPFKELLEFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVEFVGNRINAGMYIFNPSVLKRIELRPTSIEKETFPAMVADNQLHSFDLEGFWMDVGQPKDFLSGTCLYLSSLTKKGSKELTPPTEPYVHGGNVMIHPSAKIGKNCRIGPNVTIGPDVVVGDGVRLQRCVLLKGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGRWARLENVTVLGDDVTI⑶EIYVNGGSVLPHKSIKANVDVPAIM
[0174]粗糙脈孢菌Mpgl蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO: 37所示:
[0175]MKALILVGGFGTRLRPLTLTMPKPLVEFGNKRMILHQIEALAAAGVTDIVLAVNYRPE MEKYLAEYEKQFGINITISIESEPLGTAGPLKLAEDVLRKDDTPFFVLNSDVTCEYPFKELAAFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVQFVGNRINAGLYIFNPSVIDRVELRPTSIEQETFPAMVRDGQLHSFDLEGFWMDIGQPKDFLTGTCLYLSSLTKKGSKELAPTTLPYIHGGNVLIDPSAKIGKNCRIGPNVTIGPNVVVGDGVRLQRCVLLEGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGKWARLENVTVLGDDVTIOTEIYVNGGSILPHKTIKANVDVPAnM
[0176]米曲霉甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:38所示:
[0177]MKGVGGGTRRTTKVCNKMVHAVAAGVTDVAVNYRMKAYKMKAVGGGTRRTTKVGNRMHVSAAAGVTDVAVNYRDVMVSAKKYYNNSVSDTAGKARGKDDSVNSDVCDYKHKAHGDGTVVTKVYNVKSVSGTAGKAKGKDDSVNSDVCDYKAHKKHGDGTVVTKVDSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGMYNSVKRRTSKTAMVADNHSSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGYMNSVNRRTSTACKDGHSDGWMDVGKDSGTCYSSTKKGSKTTYVHGGNVMHSAKGKNCRGNVTCDGWMDVGKDSGTCYTSAKRNSKANSYVYGGNVMVDSAKGKNCRGNVVGDVVV⑶GVRRCVKGSKVKDHAWVKSTVGWNSTVGRWARNVTVGDDVTCDYVNGGSVHNVVVGDGVRRCVNSKVKDHAWVKSTVGWNSSVGRWARNVTVGDDVTADVYVNGGSHKSKANVDVAMKSKNVDVAM
[0178]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，產(chǎn)量改變的Mpgl蛋白的氨基酸序列與SEQ ID N0:36、37或38中至少一者的氨基酸序列具有特定程度的總體氨基酸序列同一性，如，與SEQ ID NO: 36、37或38具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或甚至至少約99%的同一性。編碼每種氨基酸序列的核苷酸序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的針對(duì)每種對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的BLAST搜索進(jìn)行識(shí)別。
[0179]在本發(fā)明組合物和方法的一些實(shí)施例中，被破壞的mpgl基因編碼與SEQ IDNO: 36、37或38中至少一者的氨基酸序列具有特定程度的總體氨基酸序列同一性的Mpgl蛋白，如，與SEQ ID NO: 36、37或38中的至少一者具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或甚至至少約99%的同一性。
[0180]本文提供的氨基酸序列信息使技術(shù)人員易于識(shí)別任何絲狀真菌中的Mpgl蛋白和編碼Mpgl蛋白的核酸序列，并在mpgl基因中進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠茐囊杂绊慚pgl蛋白的產(chǎn)量。編碼SEQ ID NO: 36、37或38的多核苷酸序列可存在于本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的GenBank或JGI數(shù)據(jù)庫中。
[0181]技術(shù)人員將會(huì)知道，影響Mpgl產(chǎn)量的遺傳變異可以與本文詳細(xì)敘述的影響Sebl和/或Sfb3產(chǎn)量的遺傳變異以同樣的方式進(jìn)行。Mpgl蛋白中導(dǎo)致粘度改變的變異在2011年4月22日提交的臨時(shí)專利申請N0.61，478，162中進(jìn)行了詳細(xì)的描述，其以引用的方式并入本文。
[0182]VL實(shí)用件
[0183]眾所周知，使用絲狀真菌粘度降低菌株能夠提高深層培養(yǎng)物中氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的分布，降低攪拌深層培養(yǎng)物所需的能量大小，并增加培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞群，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。此外，本發(fā)明的絲狀真菌變異菌株明顯優(yōu)于前述粘度降低菌株。
`[0184]首先，本發(fā)明的變異菌株可能具有清晰界定的基因組，從而非常適合后續(xù)遺傳操作、互補(bǔ)、配對(duì)等等。其次，本發(fā)明的菌株不會(huì)例如通過導(dǎo)致粘度伴隨改變的操作而在產(chǎn)生蛋白的過程中受到不利影響。第三，粘度降低菌株可產(chǎn)自基本上任何親本菌株，包括這樣的親本菌株:已產(chǎn)生旨在高水平表達(dá)的蛋白(即，目的蛋白)、已編碼選擇性標(biāo)記或已包括其他在生產(chǎn)宿主中期望的特征。因此，本發(fā)明的菌株和方法消除了將編碼目的蛋白的基因轉(zhuǎn)移到預(yù)先存在的粘度降低生產(chǎn)菌株中的需要。
[0185]本發(fā)明的菌株和方法可用于經(jīng)絲狀真菌深層培養(yǎng)來生產(chǎn)具有商業(yè)價(jià)值的蛋白質(zhì)。具有商業(yè)價(jià)值的蛋白質(zhì)包括(例如)纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、裂解酶、蛋白酶、激酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、脂肪酶、酯酶、過水解酶、轉(zhuǎn)移酶、漆酶、過氧化氫酶、氧化酶、還原酶、葉綠素酶、疏水蛋白、凝乳酶、碳酸酐酶、胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶、酪氨酸激酶、多種藥物抗性蛋白(如，ABC P-gp蛋白)、CAD (氨基甲酰-P合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、二氫乳清酸酶)、拓?fù)洚悩?gòu)酶、核糖核苷酸還原酶和抗體以及其他酶，以及能夠在絲狀真菌中表達(dá)的非酶蛋白。這類蛋白能夠適用于工業(yè)、醫(yī)藥、動(dòng)物保健以及食品和飲料應(yīng)用。
[0186]下列編號(hào)段落還描述了本發(fā)明組合物和方法的多個(gè)方面和實(shí)施例。如所指出的那樣，各個(gè)編號(hào)段落的主題可以單獨(dú)地使用或與任何其他編號(hào)段落的主題一起使用。
[0187]1.在一個(gè)方面，提供了衍生自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，該變異菌株包含能夠使變異菌株的細(xì)胞與親本菌株的細(xì)胞相比產(chǎn)生改變量的功能性Sebl蛋白的遺傳變異，其中變異菌株的細(xì)胞在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液
(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持改變的溶氧量。
[0188]2.在段落I的變異菌株的一些實(shí)施例中，功能性Sebl蛋白的改變量為減少量，并且變異菌株在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持增加的溶氧量。
[0189]3.在段落I或2的變異菌株的一些實(shí)施例中，遺傳變異包括破壞親本菌株中存在的sebl基因。
[0190]4.在段落3的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞是缺失全部或部分sebl基因的結(jié)果。
[0191]5.在段落3的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞是缺失包含sebl基因的基因組DNA的部分的結(jié)果。
[0192]6.在段落3的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞是sebl基因誘變的結(jié)果。
[0193]7.在段落3-6中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞使用位點(diǎn)特異性重組進(jìn)行。
[0194]8.在段落3-7中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與在sebl基因的基因座引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn) 行。
[0195]9.在段落1-8中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，變異菌株不產(chǎn)生功能性Sebl蛋白。
[0196]10.在段落1-8中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，變異菌株不產(chǎn)生Sebl蛋白。
[0197]11.在段落1-10中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，變異菌株還包含編碼目的蛋白的基因。
[0198]12.在段落1-11中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，還包含sfb3基因的破壞。
[0199]13.在段落1-12中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，變異菌株還包含至少一種選自sfb3基因、mpgl基因、gasl基因、crzl基因和tps2基因的基因的破壞。
[0200]14.在段落1-13中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，變異菌株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本菌株基本等量或更多的蛋白。
[0201]15.在段落1-14中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，絲狀真菌為盤菌亞門物種。
[0202]16.在段落1-15中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，絲狀真菌為木霉屬物種。
[0203]17.在段落1-16中任一者的變異菌株的一些實(shí)施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
[0204]18.在另一方面，提供了產(chǎn)生絲狀真菌細(xì)胞的變異菌株的方法，該方法包括:將遺傳變異引入絲狀真菌細(xì)胞的親本菌株，其中與親本菌株的細(xì)胞相比，該遺傳變異改變了功能性Sebl蛋白的產(chǎn)量，從而產(chǎn)生可以在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)液的變異絲狀真菌細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持改變的溶氧量。
[0205]19.在段落18的方法的一些實(shí)施例中，遺傳變異減少或抑制功能性Sebl蛋白的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生出可在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液的變異絲狀真菌細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持增加的溶氧量。
[0206]20.在段落18或19的方法的一些實(shí)施例中，遺傳變異包括在親本絲狀真菌細(xì)胞中采用遺傳操作來破壞sebl基因。
[0207]21.在段落18-20任一段的方法的一些實(shí)施例中，遺傳變異包括使用遺傳操作來缺失親本絲狀真菌細(xì)胞中的sebl基因。
[0208]22.在段落18-21任一段的方法的一些實(shí)施例中，遺傳變異使用位點(diǎn)特異性基因重組進(jìn)行。
[0209]23.在段落18-22任一段的方法的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與在sebl基因的基因座引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
[0210]24.在段落18-23任一段的方法的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與sfb3基因的破壞組合進(jìn)行。
[0211]25.在段落18-24任一段的方法的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與至少一種選自sfb3基因、mpgl基因、gasl基因、crzl基因和tps2基因的基因的破壞組合進(jìn)行。
[0212]26.在段落18-25任一段的方法的一些實(shí)施例中，變異菌株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本菌株基本等量或更多的蛋白。
[0213]27.在段落18-26任一段的方法的一些實(shí)施例中，絲狀真菌為盤菌亞門物種。
[0214]28.在段落18-27任一段的方法的一些實(shí)施例中，絲狀真菌為木霉屬物種。
`[0215]29.在段落18-28任一段的方法的一些實(shí)施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
[0216]30.在段落18-29任一段的方法的一些實(shí)施例中，親本菌株還包含編碼目的蛋白的基因。
[0217]31.在段落30的方法的一些實(shí)施例中，其中在引入會(huì)減少或抑制功能性Sebl蛋白的產(chǎn)生的遺傳變異之前，編碼目的蛋白的基因存在于親本菌株中。
[0218]32.在另一方面，提供了由段落11的變異菌株產(chǎn)生的目的蛋白。
[0219]33.在另一方面，提供了通過段落18-31中任一段的方法產(chǎn)生的絲狀真菌變異菌株。
[0220]34.在另一方面，提供了衍生自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，該變異菌株包含:
[0221](a)遺傳變異，所述遺傳變異使得(i)與親本菌株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌量來保持深層培養(yǎng)物中預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持深層培養(yǎng)物中增加的溶氧量，和
[0222](b)編碼目的蛋白的基因，其中編碼目的蛋白的基因在(a)中所述遺傳變異之前存在于變異菌株中。
[0223]35.在段落34的變異菌株的一些實(shí)施例中，遺傳變異包括破壞親本菌株中存在的sebl基因。
[0224]36.在段落35的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與在sebl基因的基因座引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
[0225]37.在段落35或36的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與至少一種選自sfb3基因、mpgl基因、gasl基因、crzl基因和tps2基因的基因的破壞組合進(jìn)行。[0226]38.在段落35-37任一段的變異菌株的一些實(shí)施例中，sebl基因的破壞與mpgl基因的破壞組合進(jìn)行。
[0227]根據(jù)本說明書，本發(fā)明的菌株和方法的這些和其他方面以及實(shí)施例對(duì)于技術(shù)人員將顯而易見。以下實(shí)例旨在進(jìn)一步說明(但不限于)所述菌株和方法。
[0228]SM
[0229]實(shí)例1:識(shí)別作為絲狀真菌形態(tài)改變的原因的sebl基因
[0230]A.綜沭
[0231]采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，通過轉(zhuǎn)化示例性的具有含pyr4基因的核酸的絲狀真菌(即里氏木霉)而制備絲狀真菌破壞庫。這樣，pyr4基因不僅充當(dāng)選擇性標(biāo)記還充當(dāng)基因標(biāo)簽。所用的具體根瘤農(nóng)桿菌菌株為EHA105，其被認(rèn)為是高毒性的(Hood等人，1993年)。然而，其他根瘤農(nóng)桿菌菌株(如，A136和EHA101)在里氏木霉中產(chǎn)生類似的轉(zhuǎn)化頻率。也可以使用發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)菌株，如ATCC43057。具體的破壞庫包含約50，000種轉(zhuǎn)化株。
[0232]B.制各 DNA
[0233]根據(jù)PZP100載體選擇用于破壞的載體，其包括左側(cè)和右側(cè)的T-DNA邊界區(qū)、用于從大腸桿菌(E.coli)轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的pBR322bom位點(diǎn)、分別用于在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制的ColEl和pVSl質(zhì)粒起點(diǎn)以及賦予氯四環(huán)素抗性的細(xì)菌標(biāo)記(Hajdukiewiez, 0.等人，1994年)。代表性的載體在圖1B中示出，同時(shí)T-DNA破壞盒的示意圖在圖1A中示出。
[0234]通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué) 技術(shù)制備包含pyr4基因的表達(dá)盒，并在BamHI位點(diǎn)處將其結(jié)合到PZP載體中。所得載體在大腸桿菌XL-Gold細(xì)胞(美國加利福尼亞州卡爾斯巴德英杰公司(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))中增殖。使用具有25ppm氯四環(huán)素的LA瓊脂平板(10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉，10g/L瓊脂)來選擇大腸桿菌轉(zhuǎn)化株。約1-10%的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株具有所需的載體。包含載體的大腸桿菌在LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉)加25ppm氯四環(huán)素中生長。使用標(biāo)準(zhǔn)方法分離載體DNA。
[0235]C.農(nóng)桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
[0236]感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞的制備如下所示。簡而言之，農(nóng)桿菌細(xì)胞通過在28°C的LA培養(yǎng)基中生長約3天而從超低溫保存中恢復(fù)。然后選擇菌落并在28°C的250ml凹底燒瓶中于體積為50ml的包含0.1%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中生長直至生長明顯?；蛘?，菌落開始在5ml培養(yǎng)管中生長并當(dāng)生長明顯時(shí)被轉(zhuǎn)移至250ml燒瓶。然后將250ml燒瓶的體積的約10%轉(zhuǎn)移至具有相同培養(yǎng)基的新鮮燒瓶中，使其生長至OD (600nm;0D6CICI)為約0.4-0.8 (生長約5_6小時(shí))。通過在冷的離心機(jī)中以10，OOOrpm離心10分鐘而使細(xì)胞恢復(fù)，然后將細(xì)胞置于冷的pH為7.0的IM HEPES中洗滌三次。接下來，將細(xì)胞置于冷的含有10%甘油的ImM HEPES中洗滌一次，并將等分試樣在_70°C冷凍。測定細(xì)胞活力(通常在冷凍后為約I X 109CFU/ml)。
[0237]使用載體DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞。將感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞置于冰上解凍，然后將約40 ill細(xì)胞與0.2cm電穿孔細(xì)胞(在冰上)中的約Iiig DNA混合。使用Buchler3-150電穿孔儀以2.5伏特(2000hms，以25 u F)將細(xì)胞電穿孔。電穿孔后立即將SOC培養(yǎng)基(英杰公司(Invitrogen))添加到電穿孔細(xì)胞中。或者,可以使用連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，從而不再需要在大腸桿菌中增殖載體DNA。在可供選擇的方法中，將約I U I的連接混合物用于轉(zhuǎn)化。在將SOC添加到電穿孔混合物中后，將混合物的稀釋物涂布到LA培養(yǎng)基加250ppm氯四環(huán)素的培養(yǎng)平板上并在28°C下溫育四天。獲得I X 107CFU/ml農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化株，并且約90-100%的轉(zhuǎn)化株包含載體DNA，如通過PCR分析所確定?？梢允褂蒙僦?5ppm氯四環(huán)素以在較短的時(shí)間范圍內(nèi)獲得菌落，但是必須篩選大量的菌落以識(shí)別真正的轉(zhuǎn)化株。[0238]D.農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的早.氏木霉轉(zhuǎn)化
[0239]用載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的凍存儲(chǔ)液或直接來自新鮮LA平板的載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種 250ml 燒瓶中的 25ml 基本培養(yǎng)基(2.05g/L K2HPO4U.45g/L KH2P04、0.15g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7.H20、0.lg/L CaCl2.6.H20、0.0025g/L FeSO4 ? 7.H20、0.5g/L (NH4) 2S04 和 2g/L葡萄糖，消毒后加入25ppm氯四環(huán)素)。然后將該基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)物在28°C下伴隨振搖溫育直至渾濁(過夜至數(shù)天)。將IOml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至250ml燒瓶中的50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(2.05g/L K2HPO4U.45g/L KH2PO4、0.15g/L NaCl、0.5g/L MgSO4 ? 7 ? H20,0.lg/L CaCl2 ? 6 ? H2O,
0.0025g/L FeSO4 ? 7.H2CK0.5g/L (NH4) 2SO4U.8g/L 葡萄糖、5g/L 甘油，在 pH 為 5.3 的 40mMMES中制備，消毒后加入200 u LlM乙酰丁香酮)中。起始OD6tltl為約0.1，并且載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞生長至OD6tltl為約0.4 - 0.8。
[0240]通過將孢子重懸在IOml的無菌水中而制備里氏木霉T4Apyr4細(xì)胞(衍生自QM6A NRRL3652的全纖維素酶突變菌株，美國馬里蘭州貝茨維爾的美國農(nóng)業(yè)研究所(Agricultural Research Service, Beltsville, MD, USA))的新鮮培養(yǎng)物。里氏木霉T4Apyr4細(xì)胞的轉(zhuǎn)化按如下步驟進(jìn)行:將約100 ill農(nóng)桿菌完全培養(yǎng)液(0D_=0.4 - 0.8)與IOOiU真菌孢子(107sfu/ml)在管中混合(農(nóng)桿菌細(xì)胞與真菌孢子的其他比率也將產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果)。將約0.1-1.0ml的該混合物涂布到具有嵌入式硝化纖維濾器的誘導(dǎo)瓊脂平板上(具有15g/L瓊脂和0.25mg/mL尿苷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。將平板在約18_28°C溫育約24-48小時(shí)，以允許里氏木霉細(xì)胞生長。然后，將硝化纖維濾器轉(zhuǎn)移至Vogel培養(yǎng)基(Vogel, Microbiol.Genet.Bull.13:42-43，1956 (Vogel，《微生物學(xué)遺傳學(xué)通報(bào)》，第 13 卷，第42-43頁，1956年))，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了 250ppm羧芐青霉素以殺滅農(nóng)桿菌/抑制其生長。然后將培養(yǎng)物在28°C溫育，直至絲狀真菌(代表破壞庫的轉(zhuǎn)化株)在濾器上的生長明顯為止。
[0241]E.篩選形態(tài)突變株
[0242]使用光學(xué)顯微鏡在破壞庫中篩選在固體和液體培養(yǎng)物中改變形態(tài)的轉(zhuǎn)化株。轉(zhuǎn)化后，使用菌落挑選儀從硝化纖維濾器中挑選單獨(dú)的轉(zhuǎn)化株，并將其轉(zhuǎn)移至裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂的96-孔微量滴定板(CP-700，美國西弗吉尼亞州費(fèi)爾里的諾冠系統(tǒng)有限責(zé)任公司(Norgren Systems LLC, Fairlea, WV, USA))中?；蛘?，將來自轉(zhuǎn)化株的孢子合并、使其萌發(fā)，然后使用細(xì)胞分選器將單獨(dú)的孢子添加到微量滴定板的孔中。通過使用細(xì)胞推刮器將來自Vogel轉(zhuǎn)化平板的孢子懸浮在20ml無菌蒸餾水中而收集孢子。將孢子接種到裝有50ml基本培養(yǎng)基的250mL燒瓶中，然后在28°C伴隨攪拌而溫育24小時(shí)直至獲得幼殖體。使用高速分選器(MoFlo分選器，美國科羅拉多州柯林斯堡的Cytomation公司(Cytomation, Fort Collins, CO, USA),其米用 70 u m 噴嘴和 60psi),以 15，000 事件每秒的事件率將單獨(dú)的幼殖體分離到裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂(美國密歇根州底特律的Difco公司(Difco, Detroit, MI, USA))的微量滴定板的孔中。將通過上述任一種方法獲得的包含轉(zhuǎn)化株的微量滴定板在28°C溫育7天。將單個(gè)的萌發(fā)孢子重復(fù)接種到裝有YEG (每IL水中含5g酵母提取物，20g葡萄糖)的384孔黑色玻璃底微孔板SensoPlate中(德國葛萊娜公司(Greiner Bio-one, Germany)),并在20°C溫育24小時(shí)。通過顯微鏡檢查單個(gè)轉(zhuǎn)化株的形態(tài)。
[0243]F.早.氏木霉T4突變株的分離與表征F16
[0244]觀察到得自上述工序的突變株F16在平板上具有形態(tài)改變，隨后將其置于液體培養(yǎng)物中。在PDA平板上，突變株F16與T4親本相比生長受限。在液體培養(yǎng)物中，F(xiàn)16與T4親本相比，表現(xiàn)出具有較短的菌絲。使菌株T4和F16在相同條件下在深層(液體)培養(yǎng)物中生長，并比較它們的生長表型。簡而言之，將每個(gè)菌株的孢子單獨(dú)添加到帶有側(cè)面和底面擋板的3L燒瓶內(nèi)的500ml培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)物在搖床培養(yǎng)箱中在34 °C下于基本培養(yǎng)基中生長48小時(shí)。
[0245]48小時(shí)后，將每個(gè)燒瓶中的內(nèi)容物單獨(dú)添加到含有9.5L培養(yǎng)基的14L發(fā)酵罐中，所述培養(yǎng)基含有 4.7g/L KH2PO4U.0g/L MgSO4 ? 7 ? H20,4.3g/L (NH4) 2S04 和 2.5mL/L 的相同微量元素溶液。將這些成分在121°C下一起高溫滅菌30分鐘。單獨(dú)將含有60%葡萄糖和
0.48%CaCl2 ? 2 ? H2O的溶液進(jìn)行高壓滅菌、冷卻并添加至發(fā)酵罐至最終濃度為75g/L葡萄糖和0.6g/L CaCl2 ? 2 ? H20。用28%的NH3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至3.5，整個(gè)生長過程溫度保持在34°C。一旦葡萄糖被耗盡，使溫度降低至28°C，并用葡萄糖-槐糖填充培養(yǎng)物。
[0246]頂部空間未加壓(即表壓為0巴，絕對(duì)壓為I巴)時(shí)，溶解氧(DO)探頭校準(zhǔn)為100%。然后將頂部空間壓力設(shè)置為0.7巴(表壓)，之后在添加種菌培養(yǎng)物前氧探頭讀數(shù)為170%。發(fā)酵罐含有兩個(gè)四葉渦輪機(jī)，其通過最初設(shè)定在500rpm的變速馬達(dá)進(jìn)行混合。
[0247]隨著培養(yǎng)物生長，DO含量水平下降，至少部分原因是由于絲狀真菌菌絲增殖導(dǎo)致培養(yǎng)液粘度增加。當(dāng)葡萄糖被完全消耗時(shí)，測量每一個(gè)發(fā)酵罐中產(chǎn)生的生物量大小，發(fā)現(xiàn)兩種菌株基本上一樣。每個(gè)發(fā)酵罐中`給定攪拌水平下的DO含量水平為衡量不同菌株生長表型導(dǎo)致的不同細(xì)胞培養(yǎng)液粘度的間接指標(biāo)。
[0248]sebl基因的核酸序列得自JGI數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)ID =76505,名稱:estExt_GeneffisePlus.C_50617, 可得自 http://genome.jg1-psf.0rg/cgi_bin/dispGeneModeI?db=Trire2&id=76505 (美國能源部聯(lián)合基因組研究所的基因組門戶網(wǎng)站(The Genome Portal of the Department of Energy Joint Genome Institute),
1.V.Grigoriev, H.Nordberg, 1.Shabalov, A.Aerts, M.Cantor, D.Goodstein, A.Kuo, S.Minovitsky, R.Nikitin, R.A.0hm, R.0tillar, A.Poliakov, 1.Ratnere, R.Riley, T.Smirnova, D.Rokhsar, and 1.Dubchak.Nucleic Acids Res20110:gkr947vl_gkr947(1.V.Grigoriev、H.Nordberg、1.Shabalov、A.Aerts、M.Cantor、D.Goodstein、A.Kuo、S.Minovitsky> R.Nikitin、R.A.0hm、R.0tillar、A.Poliakov、1.Ratnere、R.Riley、T.Smirnova、D.Rokhsar 和 1.Dubchak,《核酸研究》，2011 年，第 0 卷，第 gkr947vl-gkr947頁))，如下所公開。非翻譯區(qū)用斜體表示，編碼區(qū)用粗體表示，并且內(nèi)含子用小寫字母表示(SEQ ID NO:39):
[0249]GTTCTGCGCAACAAACCACCCTTCGCAAACATCCCCTCCTCTTCCTCCTCCATCACCCTTACCATTACCAAAGACCGCCATCCATTCTTTCACCCGGAGCCGAAGACGACCCTCACCACTCTTTACTCTCTGCCTCTTCTTACAACAACCTGATTGCCTGGGCAATTGTATAATACGGACTACTACTTCTACTATACAACAAACCAATAACGCTTAATATCTA
【權(quán)利要求】
1.一種衍生自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，所述變異菌株包含遺傳變異，與所述親本菌株的細(xì)胞相比，所述遺傳變異使得所述變異菌株的細(xì)胞產(chǎn)生改變量的功能性Sebl蛋白，其中所述變異菌株的所述細(xì)胞在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或Qi)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持改變的溶氧量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變異菌株，其中功能性Sebl蛋白的所述改變量為減少量，并且所述變異菌株在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持增加的溶氧量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的變異菌株，其中所述遺傳變異包括所述親本菌株中存在的所述sebl基因的破壞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的變異菌株，其中所述sebl基因的破壞是缺失所述sebl基因的全部或部分的結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的變異菌株，其中所述sebl基因的破壞是缺失包含所述sebl基因的基因組DNA的部分的結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的變異菌株，其中所述sebl基因的破壞是所述sebl基因誘變的結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中使用位點(diǎn)特異性重組來進(jìn)行所述sebl基因的破壞。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任 一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述sebl基因的破壞與在所述sebl基因的所述基因座引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述變異菌株不產(chǎn)生功能性Sebl蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述變異菌株不產(chǎn)生Sebl蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述變異菌株還包含編碼目的蛋白的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的變異菌株，還包含所述sfb3基因的破壞。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的變異菌株，還包含至少一種選自所述sfb3基因、所述mpgl基因、所述gasl基因、所述crzl基因和所述tps2基因的基因的破壞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述變異菌株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與所述親本菌株基本等量或更多的蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述絲狀真菌為盤菌亞門物種。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述絲狀真菌為木霉屬物種。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述絲狀真菌為里氏木霉。
18.—種產(chǎn)生絲狀真菌細(xì)胞的變異菌株的方法，包括:將遺傳變異引入絲狀真菌細(xì)胞的親本菌株，其中與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，所述遺傳變異改變了功能性Sebl蛋白的產(chǎn)量，從而產(chǎn)生可在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)液的變異絲狀真菌細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)液(i)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或Qi)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持改變的溶氧量。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述遺傳變異減少或抑制功能性Sebl蛋白的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生出可在深層培養(yǎng)有氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞培養(yǎng)液的變異絲狀真菌細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)液Q)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，需要減少的攪拌量來保持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持增加的溶氧量。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述遺傳變異包括使用遺傳操作在親本絲狀真菌細(xì)胞中破壞所述sebl基因。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述遺傳變異包括使用遺傳操作來缺失親本絲狀真菌細(xì)胞中的所述sebl基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述遺傳變異使用位點(diǎn)特異性基因重組來進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述sebl基因的破壞與在所述sebl基因的所述基因座引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
24.根據(jù)權(quán)利要求18至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述sebl基因的破壞與所述sfb3基因的破壞組合進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求18至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述sebl基因的破壞與至少一種選自所述sfb3基因、所述mpgl基因、所述gasl基因、所述crzl基因和所述tps2基因的基因的破壞組合進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求18至25中任一`項(xiàng)所述的方法，其中所述變異菌株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與所述親本菌株基本等量或更多的蛋白。
27.根據(jù)權(quán)利要求18至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲狀真菌為盤菌亞門物種。
28.根據(jù)權(quán)利要求18至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲狀真菌為木霉屬物種。
29.根據(jù)權(quán)利要求18至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲狀真菌為里氏木霉。
30.根據(jù)權(quán)利要求18至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述親本菌株還包含編碼目的蛋白的基因。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中在引入所述減少或抑制功能性Sebl蛋白的產(chǎn)生的遺傳變異之前，編碼所述關(guān)注的蛋白的所述基因存在于所述親本菌株中。
32.一種目的蛋白，其通過權(quán)利要求11所述的變異菌株產(chǎn)生。
33.一種絲狀真菌變異菌株，其通過權(quán)利要求18至31中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。
34.一種衍生自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，所述變異菌株包含: (a)遺傳變異，所述遺傳變異使得(i)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，需要減少的攪拌量來保持深層培養(yǎng)物中預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本菌株的所述細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量下保持深層培養(yǎng)物中增加的溶氧量，以及 (b)編碼目的蛋白的基因， 其中編碼所述目的蛋白的所述基因在(a)中所述遺傳變異之前存在于所述變異菌株中。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的變異菌株，其中所述遺傳變異包括所述親本菌株中存在的所述sebl基因的破壞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的變異菌株，其中所述sebl基因的破壞與在所述sebl基因的所述基因座引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的變異菌株，其中所述sebl基因的破壞與至少一種選自所述sfb3基因、所述mpgl基因、所述gasl基因、所述crzl基因和所述tps2基因的基因的破壞組合進(jìn)行。
38.根據(jù)權(quán)利要求35至37中任一項(xiàng)所述的變異菌株，其中所述sebl基因的破壞與所述mpgl基因的破壞組合進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C07K14/37GK103502431SQ201280019678
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月22日
【發(fā)明者】E·A·博迪, R·J·普萊特二世 申請人:丹尼斯科美國公司