專利名稱：一種生物活性多肽qepv及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種生物活性多肽QEPV及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的過程中，牛乳中的一部分蛋白質(zhì)被乳酸菌代謝利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變?yōu)槎嚯幕蛘哂坞x的氨基酸，被人體消化吸收或通過小腸上皮細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)直接進(jìn)入人體的血液循環(huán)。在這些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被稱為“生物活性肽”。 免疫活性肽是繼阿片肽發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性肽。1981年，Jolles等人首次發(fā)現(xiàn)，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一個氨基酸序列為Val-Glu-Pro-1le-Pro-Tyr的六肽，體外實驗證明該肽能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨曬細(xì)胞對綿羊血紅細(xì)胞的吞曬作用。Migliore-Samour等人發(fā)現(xiàn)來自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能夠刺激綿羊血紅細(xì)胞對小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬作用以及增強(qiáng)對于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)飼喂大鼠發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用和紅細(xì)胞相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)功能有顯著的增強(qiáng)。研究表明，免疫活性肽不僅能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放、提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且不會引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。免疫活性肽無論是作為功能食品還是藥品，其最終都要攝入人體內(nèi)被人體吸收，只有到達(dá)相應(yīng)的靶器官才能發(fā)揮其生理功能。在人體胃腸道復(fù)雜的環(huán)境下，肽極容易受到胃蛋白酶、胰蛋白酶等一系列酶的影響而發(fā)生降解，從而在體內(nèi)失去生理活性，無法達(dá)到預(yù)期目的。因此，研究免疫調(diào)節(jié)肽的抗胃腸道酶降解的能力對于其今后的應(yīng)用具有重要意義。其次，有些生物活性多肽是在動物的胃腸道里經(jīng)過各種生物酶降解后生成的新片段，被動物吸收后發(fā)揮其生活活性作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Gln-Glu-PiO-Val(QEPV) (SEQ ID NO :1)。較優(yōu)的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。本發(fā)明的生物活性多肽QEPV為乳源性，具體來源于酪蛋白，并且為酪蛋白(SEQ IDN0:3)第209 212位的氨基酸殘基。較優(yōu)的，所述生物活性多肽具有體外抗氧化活性和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能。本發(fā)明的生物活性多肽可以通過基因工程的方法和化學(xué)方法人工合成，也可以從乳制品中通過分離純化、酶降解的方法獲得。本發(fā)明還公開了編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段。β -酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列為既有技術(shù)，編碼β -酪蛋白第201Γ212位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽QEPV。進(jìn)一步的，編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段，其序列為5， -caggagcctgta-3， (SEQ IDNO:2)。本發(fā)明第二方面公開了前述生物活性多肽的制備方法，步驟如下I)發(fā)酵將瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳；2)多肽的粗提對步驟I)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進(jìn)行低溫離心分離，取上清液；
3)多肽的純化a.對步驟2)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液；b.收集的濾液采用反向?qū)游鲋鵖OURSE 5 RPC ST (4. 6X 150mm)進(jìn)行反相高效液相色譜分離，收集生物活性多肽QEPVL ；4)多肽的消化采用兩步酶解法酶解步驟3)的生物活性多肽QEPVL，獲得生物活性多肽QEPV ;第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶為胰酶。本發(fā)明所述脫脂乳為經(jīng)過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于O. 1%。較優(yōu)的，所述厭氧發(fā)酵的條件為發(fā)酵溫度36 38°C，發(fā)酵培養(yǎng)15 20h ;優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)19h。較優(yōu)的，步驟2)所述低溫離心的條件為4°C,8000 IOOOOrpm,離心15 30min。較優(yōu)的，步驟3) a所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為IOkDa和3kDa。本發(fā)明采用截留分子量分別為10kDa、3kDa的濾膜，使樣品依次通過兩張濾膜進(jìn)行超濾。更優(yōu)的，步驟3) a所述超濾過程中，壓力范圍為O. Γθ. 3MPa，濾液流速為O. 8 1.2mL/min。較優(yōu)的，步驟3 ) b反相高效液相色譜分離法中，流動相A為含有2%乙腈和O. 05%TFA的ddH20 ;流動相B為100%乙腈。較優(yōu)的，步驟3) b反相高效液相色譜分離法中，收集分子量為585. 32Da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽QEPVL。在本發(fā)明反相高效液相色譜法分離過程中，已知QEPVL的分子量，收集分子大小為585.32Da的洗脫峰，即為本發(fā)明的生物活性多肽QEPVL。具體的，本發(fā)明分子大小為585. 32Da的洗脫峰其保留時間為33min。較優(yōu)的，步驟4)所述兩步酶解法具體步驟為將QEPVL溶于滅菌去離子水中，并加入胃蛋白酶，獲得反應(yīng)液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液PH值為2. 0±0. 1，在37±0.5°C的恒溫水浴中保溫反應(yīng)60 120min，獲得第一步酶解液；將第一步酶解液的pH值調(diào)整為7. 5±0. 1，并加入胰酶，于37±0. 5°C的恒溫水浴中保溫反應(yīng)120 180°C，獲得第二步酶解液；將第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，獲得酶解產(chǎn)物；酶解產(chǎn)物冷凍干燥獲得產(chǎn)品。較優(yōu)的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶10 30mg/g底物；所述胰酶的添加量為胰酶30 50mg/g底物。更優(yōu)的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加量為胰酶40mg/g底物。較優(yōu)的，步驟4)中將QEPVL配置成450 550 μ g/mL的多肽QEPVL溶液。更優(yōu)的，配置成500 μ g/mL QEPVL溶液。
本發(fā)明第三方面公開了前述生物活性多肽在制備抗氧化和/或增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的生物活性多肽QEPV可以用于酸奶等乳制品、減少自由基對皮膚傷害的化妝品；并且由于本發(fā)明的生物活性多肽QEPV能夠通過胃腸道直接吸收不被降解，因此可以用于制備提高免疫力的保健品，或者用于制備具有抗氧化和/或增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥物。本發(fā)明第四方面公開了一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。本發(fā)明第五方面公開了一種增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥 物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；?、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。本發(fā)明生物活性多肽QEPV的有益效果為本發(fā)明的乳源性生物活性多肽QEPV具有較好的抗氧化活性和促進(jìn)機(jī)體免疫力活性；一方面能夠清除機(jī)體內(nèi)的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發(fā)明的生物活性多肽QEPV還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增殖能力，使巨噬細(xì)胞一氧化氮誘生量增加，并促巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且不會引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，對開發(fā)具有抗氧化功能及增強(qiáng)免疫功能的乳制品、和保健品和藥品具有十分重要的意義。


圖1 :瑞士乳桿菌發(fā)酵乳與未經(jīng)發(fā)酵處理的脫脂乳超濾后粗提物的質(zhì)譜對比圖(A 3000Da未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳粗提物質(zhì)譜圖，B 3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗提物質(zhì)譜圖)圖2 :3000Da未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳粗提物與3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳粗提物分子
量差異及豐度比較圖3 :反相高效液相色譜分離對照發(fā)酵乳和瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中生物活性多肽比較圖(a曲線對照發(fā)酵乳反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜；b曲線瑞士乳桿菌發(fā)酵乳3000Da上清液反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜)圖4 :質(zhì)量色譜提取圖(m/z=585. 32)圖5 :質(zhì)荷比為585. 32的片段的一級質(zhì)譜6 :質(zhì)荷比為585. 32的片段的二級質(zhì)譜7 :生物活性多肽QEPVL經(jīng)過消化酶處理前后的總離子流8 :生物活性多肽QEPVL經(jīng)消化酶處理前后b2峰的質(zhì)譜分析9 :生物活性多肽QEPVL經(jīng)消化酶處理前后bl峰的質(zhì)譜分析10 :生物活性多肽QEPVL經(jīng)消化酶處理后b3峰的質(zhì)譜分析11 :生物活性多肽QEPVL經(jīng)消化酶處理后b4峰的質(zhì)譜分析12 : [DPPH ·]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖13 :FeS04標(biāo)準(zhǔn)曲線圖14 :生物活性多肽QEPV的體外巨噬細(xì)胞增殖能力實驗結(jié)果
圖15 :不同濃度QEPVL和QEPV對一氧化氮誘生量的比較(正常組)圖16 :不同濃度QEPVL和QEPV對一氧化氮誘生量的比較(炎癥組)圖17 =TNF-Y標(biāo)準(zhǔn)曲線圖18 :添加生物活性多肽QEPV的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時間與IFN- Y分泌量的關(guān)系圖19 :不同濃度的生物活性多肽QEPV在有分裂原(ConA)存在和沒有分裂原存情況下在對細(xì)胞因子IFN-Y分泌的促進(jìn)作用
具體實施方式
在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實施方式
之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1活性肽QEPVL的制備一、發(fā)酵乳的制備I)瑞士乳桿菌發(fā)酵乳采用脫脂奶粉(新西蘭NZMP牌脫脂奶粉)與水配置12wt%的脫脂乳(12wt%的脫脂乳的制備為將12g脫脂奶粉加入到88g水中，下同)。在無菌條件下，挑取瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus,CICC6024)菌落三環(huán)，將其加入已滅菌的12wt%的脫脂乳中，攪拌均勻。接種完成后，用鋁箔封口，以防止污染。置于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)19小時。培養(yǎng)結(jié)束后，在無菌條件下將凝乳攪拌均勻，即完成瑞士乳桿菌的活化，制得用于制備瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵劑。取IOmL已制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵劑接種到500mL已滅菌的12wt%脫脂乳中(接種率為2v/v%)，37°C發(fā)酵19小時后，在無菌條件下攪開凝乳，在4°C條件下保存，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳。2)對照發(fā)酵乳采用同樣方法，使用保加利亞乳桿菌(Lactobacillus Bulgaricus,LB340)和嗜熱鏈球茵(Streptococcus Thermophilus, TA40)作為發(fā)酵菌種制作對照發(fā)酵乳。具體方法為在無菌條件下，分別挑取保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球茵菌落三環(huán)，將其分別加入已滅菌的12wt%的脫脂乳中，在無菌條件下攪拌均勻。接種完成后，用鋁箔封口，以防止污染。置于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)19h。培養(yǎng)結(jié)束后，在無菌條件下將凝乳攪拌均勻，即完成保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球茵的活化，制得用于制備對照發(fā)酵乳的兩種發(fā)酵劑。取5mL已制備的保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑和5mL嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑，共同接種到500mL已滅菌的12被％脫脂乳中(接種率為2v/v%)，37°C發(fā)酵19h后，在無菌條件下攪開凝乳，在4°C條件下保存，得到對照發(fā)酵乳。二、生物活性多肽的確認(rèn)1.實驗方法I)樣品處理分別將前一步驟制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和對照發(fā)酵乳，以及12wt%的脫脂乳裝入離心管中進(jìn)行低溫離心，離心條件為9000rpm/min，4°C，20min。離心后棄沉淀，取上清液。將上清液分別倒入超濾杯中，為了防止生物活性多肽被氧化，打開氮氣罐壓力閥充氮，同時打開磁力攪拌裝置，以防止溶液出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象。使樣品分別通過截留分子量為10kDa、3kDa的濾膜，待有濾液流出時進(jìn)行收集。超濾過程中，應(yīng)保持流速穩(wěn)定，濾液清澈。流速控制在lmL/min左右，壓力為O. Γ0. 3MPa，分別收集瑞士乳桿菌發(fā)酵乳、對照發(fā)酵乳，以及未發(fā)酵的12wt%脫脂乳的濾液作為實驗樣、對照樣以及空白對照，于-4V冷凍保存。2)質(zhì)譜分析將前一步驟收集的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳超濾后的濾液(實驗樣)和脫脂乳超濾后的濾液(空白對照)進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件如下離子方式ES+ 質(zhì)量范圍(m/z):100-1500毛細(xì)管電壓(Capillary)(kV) 3. O采樣錐(V):35· O離子源溫度(°C)) :100去溶劑溫度(°C ):350去溶劑氣流(L/hr)600. O碰撞能量(eV):6. O掃描時間(sec):0. 3內(nèi)掃描時間(sec):0. 022.實驗結(jié)果瑞士乳桿菌發(fā)酵乳超濾后的濾液(實驗樣)和脫脂乳超濾后的濾液(空白對照)的質(zhì)譜對比結(jié)果見圖1 2。圖1中的A曲線為3000Da未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳(空白對照)粗提物樣品，圖1中的B曲線為3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗提物樣品(實驗樣)。經(jīng)過比較可以看出，經(jīng)過瑞士乳桿菌發(fā)酵后，3000Da未經(jīng)發(fā)酵乳粗提物和3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳粗提物的組分上發(fā)生很大變化，且這些組分由于疏水性不同保留時間亦有所差異。此質(zhì)譜質(zhì)量范圍為100Da-1500Da，因此可知脫脂乳在1500Da以下、210nm處有吸收的小分子物質(zhì)相對較少；而經(jīng)過瑞士乳桿菌發(fā)酵后，在這一分子量范圍內(nèi)的物質(zhì)明顯增多，說明了這些多肽并不存在于未經(jīng)發(fā)酵處理的脫脂乳中，而是經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵后才產(chǎn)生的。而且我們發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，多肽的豐度明顯增多，進(jìn)一步證實了通過瑞士乳桿菌的發(fā)酵，脫脂乳中原有的大分子蛋白被分解，從單一的大分子蛋白變?yōu)榱慷嗲覐?fù)雜的小分子多肽。圖2是3000Da未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳(空白對照)粗提物與3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳(實驗樣)粗提物不同分子量物質(zhì)豐度差異的比較結(jié)果。縱向軸表明在脫脂乳粗提物中所含物質(zhì)對應(yīng)的分子量，橫向軸表明發(fā)酵乳粗提物中所含物質(zhì)對應(yīng)的分子量。通過比較，可以得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳中，因為發(fā)酵所帶來的差異較大的物質(zhì)的分子量，從而選擇這些質(zhì)荷比的母離子通過二級質(zhì)譜進(jìn)行進(jìn)一步的分析。如圖1所示，分子量397. 07Da，保留時間6. 72分鐘的物質(zhì)在脫脂乳粗提物中含量較高(圖1-A圖譜中的峰)，而對照發(fā)酵乳中幾乎沒有。而分子量為232. lOTa，保留時間為
3.61min的物質(zhì)在發(fā)酵乳和脫脂乳中的含量均比較高。因此，我們選擇了在發(fā)酵乳中含量較高而在未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳中含量較低的組分進(jìn)行了差異比較，比較結(jié)果見表I。根據(jù)MarkerLynx軟件分析，得到具有顯著性差異的(p>0. 05)分子量片段如表I所示，根據(jù)豐度和質(zhì)荷比情況，選擇585. 3251Da，保留時間為16. 20min的多肽進(jìn)行二級質(zhì)譜的測序分析。表1:3000Da發(fā)酵乳粗提物與3000Da脫脂乳粗提物差異比較
權(quán)利要求
1.一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Gln-Glu-PiO-Val。
2.編碼權(quán)利要求1所述生物活性多肽的核苷酸片段。
3.權(quán)利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQID NO2所示。
4.權(quán)利要求1所述生物活性多肽的制備方法，步驟如下O發(fā)酵將瑞士乳桿菌添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳；2)多肽的粗提對步驟I)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進(jìn)行低溫離心分離，取上清液；3)多肽的純化a.對步驟2)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液；b.收集的濾液采用反向?qū)游鲋鵖OURSE5RPC ST進(jìn)行反相高效液相色譜分離，收集生物活性多肽QEPVL ；4)多肽的消化采用兩步酶解法酶解步驟3)的生物活性多肽QEPVL，獲得生物活性多肽QEPV ;第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶,第二步酶解所采用的酶為胰酶。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述厭氧發(fā)酵的條件為發(fā)酵溫度36 38°C，發(fā)酵時間15 20h。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟3)a所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為IOkDa和3kDa ;所述超濾過程中，壓力范圍為O.1 O. 3MPa，濾液流速為O.8 L 2mL/min。
7.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述兩步酶解法為將生物活性多肽QEPVL溶于滅菌去離子水中，并加入胃蛋白酶，獲得反應(yīng)液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為2.0±0. 1，在37±0. 5°C的恒溫水浴中保溫反應(yīng)60 120min，獲得第一步酶解液；將第一步酶解液的PH值調(diào)整為7. 5±0. 1，并加入胰酶，于37±0. 5°C的恒溫水浴中保溫反應(yīng)120 180°C，獲得第二步酶解液；將第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，獲得酶解產(chǎn)物；酶解產(chǎn)物冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
8.權(quán)利要求1所述生物活性多肽在制備抗氧化和/或增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。
9.一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。
10.一種增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種具有體外抗氧化活性和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的乳源性生物活性多肽，其氨基酸序列為Gln-Glu-Pro-Val。經(jīng)過體外抗氧化實驗、體外免疫功能促進(jìn)實驗，驗證了多肽QEPV具有較好的抗氧化生物學(xué)活性和促進(jìn)細(xì)胞免疫的活性，一方面能夠清除機(jī)體內(nèi)的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發(fā)明的生物活性多肽QEPV還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增殖能力，使巨噬細(xì)胞一氧化氮誘生量增加，并促巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，對開發(fā)具有抗氧化功能及增強(qiáng)免疫功能的乳制品、保健品和藥品具有十分重要的意義。
文檔編號C07K5/103GK103012552SQ201210536588
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者張少輝, 盧姍姍, 馬鎏镠, 孫冠華, 崔磊, 金贏凱, 徐海紅 申請人:上海交通大學(xué)