專利名稱：：大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及大豆開花基因ft2a-l及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
：大豆為人類提供重要的植物蛋白質(zhì)和油份。在世界范圍內(nèi)，北至高緯度的北歐瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等廣泛區(qū)域內(nèi)均有大豆栽培，但單個(gè)品種或種質(zhì)資源一般適宜種植的緯度跨度較小，這種區(qū)域適應(yīng)性與大豆光周期和生育期基因或者數(shù)量性狀位點(diǎn)(QuantitativeTraitLocus,QTL)密切相關(guān)。選育生態(tài)適應(yīng)性廣的優(yōu)良大豆品種是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效大豆產(chǎn)業(yè)的根本途徑。但常規(guī)育種在廣適應(yīng)品種選育中進(jìn)展緩慢，利用分子育種手段有望定向調(diào)節(jié)大豆光周期和生育期，加快廣適應(yīng)品種的選育。模式植物擬南芥和水稻的研究結(jié)果表明，開花素(Fl0rigen，F(xiàn)T蛋白)從葉片轉(zhuǎn)運(yùn)到莖尖誘導(dǎo)花的形成(Corbesier等，2007;Tamaki等，2007)。我們從大豆中克隆了10個(gè)FT基因，這10個(gè)基因成對(duì)的復(fù)制在大豆連鎖群上?；虮磉_(dá)分析的結(jié)果顯示，在開花誘導(dǎo)條件即短日照條件下，有兩個(gè)FT基因(GmFT2a和GmFT5a)在花芽形成期(2530天左右)，在三出復(fù)葉中大量表達(dá)，而其他基因表達(dá)量極低或者不表達(dá)。并且這兩個(gè)基因呈現(xiàn)生物鐘規(guī)律的基因表達(dá)類型，在光照開始4個(gè)小時(shí)表達(dá)強(qiáng)度最高之后逐漸減弱。在非誘導(dǎo)的長日照條件下，只有一個(gè)FT基因(GmFT5a)相對(duì)表達(dá)，從而導(dǎo)致了在此條件下大豆開花期較晚，生育期延長。利用大豆光敏色素A基因的雙突變體(Harosoy_e3e4)研究則發(fā)現(xiàn),在長日照條件下，Harosoy_e3e4的開花期與其野生型植株在短日照條件下的開花期一致。而且，在雙突變體中，在花芽形成期，GmFT2a和GmFT5a的表達(dá)被大量誘導(dǎo)而且呈現(xiàn)與短日照完全相同的生物鐘規(guī)律的基因表達(dá)。這些研究結(jié)果從分子水平上初步揭示了大豆開花期和生育期的分子機(jī)理，即(I)在誘導(dǎo)的短日照條件下，有兩個(gè)FT基因參與表達(dá)導(dǎo)致花期很短，然而在非誘導(dǎo)的長日照條件下，只有一個(gè)FT基因參與表達(dá)從而導(dǎo)致開花期變長；(2)大豆經(jīng)過自身進(jìn)化使光敏色素A基因失活來適應(yīng)在高緯度區(qū)域生存，而這一進(jìn)化過程又是最終通過調(diào)控兩個(gè)大豆中主要的FT基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的；(3)在長日照條件下，長日照植物擬南芥的光敏色素A基因誘導(dǎo)FT基因的表達(dá)，而短日照植物大豆的光敏色素A基因卻抑制FT基因的表達(dá)，說明短日照植物含有與長日照植物不同的光周期反應(yīng)調(diào)控機(jī)制(Kong等2010)。此外，通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，研究者進(jìn)一步驗(yàn)證了GmFT2a具有大豆開花促進(jìn)功能(Sun等2011)。但是，GmFT2a基因的突變?nèi)绾斡绊懼蠖股?開花期及成熟期)是一個(gè)非常重要的科學(xué)問題，目前還沒有在分子水平上的相關(guān)研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供大豆開花基因ft2a_l及其編碼蛋白。本發(fā)明的大開花基因ft2a-l的基因序列如序列表SeqIDNoI所不。本發(fā)明的大豆開花基因ft2a_l的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是在克隆出大豆開花基因GmFT2a(Kong等2010)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)GmFT2a基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。我們已證實(shí)GmFT2a基因具有促進(jìn)大豆開花的功能。本發(fā)明對(duì)不同品種中GmFT2a基因序列進(jìn)行了研究，并確定了ft2a-l基因，其對(duì)大豆生育期關(guān)系密切。ft2a-l基因與大豆開花基因GmFT2a(Kong等2010)相比，兩者的序列在DNA水平的僅有一個(gè)核苷酸(506號(hào))差異，但導(dǎo)致氨基酸序列169位從甘氨酸到天冬氨酸的錯(cuò)義突變，從而改變了原來GmFT2a基因的功能。擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的ft2a_l基因與大豆開花基因GmFT2a相比，其促進(jìn)開花的功能明顯減弱。圖1是pMDC100IG_ft2a_l質(zhì)粒表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是轉(zhuǎn)入ft2a_l基因和轉(zhuǎn)入GmFT2a基因擬南芥以及野生型擬南芥的開花時(shí)間圖；其中，Col-O為野生型擬南芥，GmFT2a-0X為轉(zhuǎn)入GmFT2a基因后的擬南芥，ft2a_l_0X為轉(zhuǎn)入ft2a-l基因后的擬南芥。具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式的大豆開花基因ft2a_l的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。本實(shí)施方式對(duì)不同品種中GmFT2a基因序列進(jìn)行了研究，并確定了ft2a_l基因，其對(duì)大豆生育期關(guān)系密切。本實(shí)施方式通過擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化手段，將GmFT2a基因和ft2a_l基因在擬南芥中表達(dá)，驗(yàn)證了本發(fā)明的ft2a-l基因與大豆開花基因GmFT2a相比，其促進(jìn)開花的功能明顯減弱。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式的大豆開花基因ft2a_l的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。通過以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果(I)基因ft2a_l序列的獲得—、以大豆品種K3的葉片為材料,用購買自Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的操作手冊(cè)提取葉片總RNA;二、采用DNaseI處理步驟一提取的總RNA;三、取Iμg步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照購買自BDBiosciencesClontech公司的BDSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit試劑盒的使用手冊(cè)進(jìn)行，獲得cDNA;四、以獲得的cDNA為模板通過Fl與Rl引物擴(kuò)增ft2a-l基因，PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性5min,94°C變性30s,56°C退火30s,72°C延伸lmin,共35循環(huán)，再72°C延伸IOmin,將PCR產(chǎn)物在ABI3130測序儀(ABI公司)上進(jìn)行測序；其中，引物Fl的序列為5‘-ccatgcctagtggaagtagg;引物Rl的序列為gagtgtgggagattgccaat-3，。測序結(jié)果表明大豆開花基因ft2a_l具有序列表中SeqIDNo:1的核苷酸序列，序列表中的SeqIDNo1由622個(gè)核苷酸組成，并編碼具有序列表中SeqIDNo2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。(2)大豆開花基因ft2a_l的功能驗(yàn)證—、以大豆品種K3的葉片為材料,用購買自Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的操作手冊(cè)提取葉片總RNA;二、采用DNaseI處理步驟一提取的總RNA;三、取Iμg步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照購買自BDBiosciencesClontech公司的BDSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit試劑盒的使用手冊(cè)進(jìn)行，獲得cDNA;四、分別以ft2a-l基因F2與R2為引物，對(duì)步驟三獲得的cDNA通過PCR進(jìn)行5’與3’擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸5min，共35循環(huán)，再72°C延伸lOmin，獲得含有Xba1-SacI雙酶酶切位點(diǎn)的大豆開花基因ft2a_l;五、將獲得的含有酶切位點(diǎn)的大豆開花基因ft2a-l克隆到pMDClOOIG質(zhì)粒中，獲得pMDC100IG-ft2a-l質(zhì)粒，以擬南芥(Col-O)為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)ft2a-l基因擬南芥，將轉(zhuǎn)ft2a-l基因擬南芥、轉(zhuǎn)GmFT2a基因擬南芥和野生型擬南芥(Col-O)在16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗條件下種植，觀察它們的開花狀態(tài)；其中，pMDClOOIG質(zhì)粒和轉(zhuǎn)GmFT2a基因擬南芥，我們?cè)?010年《PlantPhysiology》中刊登的名稱為"TwoCoordinatelyRegulatedHomologsofFLOWERINGLOCUSTAreInvolvedintheControlofPhotoperiodicFloweringinSoybean”的文章中公開；大豆品種K3屬泰國的一個(gè)栽培品種，在2006年《KasetsartJ》“Molecularmarkeranalysisofdaystofloweringinvegetablesoybean(Glycmemax)”中刊登，由北海道大學(xué)Abe教授惠贈(zèng)。其中，引物F2的序列為5‘-gctctagaccatgcctagtggaagtagg;引物R2的序列為gcgagctcgagtgtgggagattgccaat-3’。步驟五獲得的pMDC100IG_ft2a_l質(zhì)粒過表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示；轉(zhuǎn)入ft2a_l基因和轉(zhuǎn)入GmFT2a基因以及野生型擬南芥的開花時(shí)間圖如圖2所示，其中，Col-O為野生型擬南芥，GmFT2a-0X為轉(zhuǎn)入GmFT2a基因后的擬南芥，ft2a_l_0X為轉(zhuǎn)入ft2a-l基因后的擬南芥。從圖2可以看出，Col-O的開花時(shí)間為31天，GmFT2a_0X的開花時(shí)間為24.8天，表明轉(zhuǎn)入GmFT2a基因后的擬南芥開花時(shí)間比野生型擬南芥的開花時(shí)間早于6天，從而說明GmFT2a基因具有促進(jìn)開花的功能；而ft2a_l_0X的開花時(shí)間與野生型擬南芥的開花時(shí)間基本相同，從而說明本發(fā)明的ft2a-l基因與大豆開花基因GmFT2a相t匕，其促進(jìn)開花的功能明顯減弱或功能喪失。權(quán)利要求1.大豆開花基因ft2a-l，其特征在于大豆開花基因ft2a_l的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。2.如權(quán)利要求1所述的大豆開花基因ft2a-l的編碼蛋白，其特征在于大豆開花基因ft2a-l的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。全文摘要大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白，本發(fā)明涉及大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白。本發(fā)明的目的是提供大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白。本發(fā)明大豆開花基因ft2a-1的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。本發(fā)明大豆開花基因ft2a-1的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。本發(fā)明通過擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，表明ft2a-1基因與FT2a基因相比，其促進(jìn)開花的功能明顯減弱。本發(fā)明應(yīng)用于大豆基因工程領(lǐng)域。文檔編號(hào)C07K14/415GK102994516SQ20121053497公開日2013年3月27日申請(qǐng)日期2012年12月12日優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日發(fā)明者孔凡江,劉寶輝申請(qǐng)人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所