專利名稱：反膠團法分離萃取魚精蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用反膠團法分離萃取魚精蛋白的方法以及萃取工藝的優(yōu)化改進(jìn)。
背景技術(shù)：
魚精蛋白又稱精蛋白(Protamine)是一種多聚陽離子天然肽類，是一種存在于魚 類成熟精巢中的堿性蛋白，與DNA以非共價鍵緊密結(jié)合在一起，以核精蛋白的形式存在。魚精蛋白是一種小而簡單的球形堿性蛋白質(zhì)，其分子量較小，從幾千到一萬多道爾頓。一般由30個左右氨基酸組成，其中2/3以上是精氨酸。它能溶于水或稀酸中，不易溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，穩(wěn)定性好，加熱不凝固，熱穩(wěn)定性較好，120°C 30min也能維持活性，等電點在10 — 12之間，帶正電荷。根據(jù)堿性氨基酸組成的種類和數(shù)量的不同，可將魚精蛋白分為單魚精蛋白、雙魚精蛋白和三魚精蛋白。其中，單魚精蛋白僅含一種組分精氨酸，如鮭、鯡和虹鱒精蛋白等；雙魚精蛋白含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸，如鯉精蛋白；三魚精蛋白含有三種堿性氨基酸，如鰱、鱘精蛋白。研究表明常見的魚精蛋白并不是單一組分，通常是由幾種相互非常類似的組分組成的混合物。魚精蛋白在魚類精巢中的含量極不穩(wěn)定，隨性腺的成熟度而變化很大。魚精蛋白存在于雄性個體的精巢組織中，是在精子成熟過程中代替組氨酸的。從研究報道的資料看，各國對魚精蛋白的研究，多以鮭魚為對象。目前，我國學(xué)者已經(jīng)成功的從鯪魚、羅非魚、鰱魚、鯉魚等淡水魚精巢中提取了魚精蛋白。魚精蛋白的提取基本上以硫酸或鹽酸為主要提取劑，以檸檬酸或有機溶劑為純化劑，其獲得的是魚精蛋白粗品，還含有其他物質(zhì)如核酸、雜蛋白等，需要進(jìn)一步純化，一般采用葡聚糖凝膠柱層析法純化，再利用等電聚焦電泳和生物質(zhì)譜的方法對其等電點和分子量進(jìn)一步測定。傳統(tǒng)的魚精蛋白分離純化工藝都比較復(fù)雜，純化周期也較長，有待于新的純化工藝的使用。反膠團萃取是近年發(fā)展起來的分離和純化生物物質(zhì)的新方法。反膠團是表面活性劑溶于有機溶劑中形成的納米級聚集體，是一種透明、穩(wěn)定的熱力學(xué)體系。反膠團中表面活性劑非極性尾基向外與有機溶劑接觸，極性頭基向內(nèi)形成極性核，極性核溶入水后形成微“水池”，當(dāng)反膠團與含蛋白質(zhì)的水相接觸時，蛋白質(zhì)在表面活性劑核蛋白質(zhì)所帶電荷間的靜電相互作用以及疏水作用等作用力下進(jìn)入微“水池”中，使蛋白質(zhì)避免和有機溶劑接觸，不致失活。反膠團萃取蛋白質(zhì)技術(shù)包含兩個過程一個過程是蛋白質(zhì)從水相轉(zhuǎn)移到反膠團中(正萃取過程)，第二個過程是目標(biāo)蛋白質(zhì)從反膠團相轉(zhuǎn)移到一個新的水相(反萃取過程)，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離與純化。反膠團萃取具有選擇性高、萃取過程簡單，且正向萃取和反向萃取可同時進(jìn)行，并能有效防止大分子失活、變性等優(yōu)良特性，因此，在制藥、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域等到了極大的研究和應(yīng)用。專利ZL200810079320. 5利用反膠團法直接從魚精蛋白粗體液中分離純化出魚精蛋白，克服了目前純化工藝復(fù)雜、步驟多、周期長的問題，但是該方法獲得的純化魚精蛋白酶活回收率僅達(dá)到96%，純化因子也只有2.1。鑒于現(xiàn)有的反膠團萃取魚精蛋白所存在的酶活回收率、純化因子較低的問題，本申請針對影響萃取工藝的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，以提高魚精蛋白的酶活回收率和純化因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在于需要提供一種反膠團法分離萃取魚精蛋白的方法，并對其蛋白提取、前萃取和反萃取工藝進(jìn)行改進(jìn)，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)中存在的酶回收率和純化因子低的問題。本發(fā)明所述的反膠團法是利用表面活性劑在非極性有機溶劑中超過一定濃度后自發(fā)形成的一種親水性基團向內(nèi)、內(nèi)含微小水滴的納米級集合性膠體實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的分離
萃取。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，具體步驟如下第一步制備鰱魚魚精蛋白粗提液，第二步進(jìn)行微濾、超濾，第三步調(diào)整濾液PH值和離子強度，第四步配制反膠團溶液和反萃取水相溶液，第五步經(jīng)萃取和反萃取步驟獲得酶活回收率高于98. 5%的魚精蛋白純品。其中，所述鰱魚魚精蛋白粗體液的制備方法為取2400g鰱魚魚白組織勻漿，加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后5100g離心30min，收集上清液加入濃度為30%的NaOH調(diào)節(jié)pH值為8. 5，繼續(xù)5100g離心30min，收集的上清即為魚精蛋白粗提液。其中，所述微濾、超濾步驟為將收集的上清液加入IN HCl置于(TC過夜處理，進(jìn)行真空抽濾(Whatman # 2)，收集上清，再使用Millipore TFF IOKDa NMWL進(jìn)行超濾處理。其中，所述超濾液用O. 2mol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)pH值為8. 5，使用2 mol/LKCl調(diào)節(jié)溶液的離子強度為O. 15 mol。其中，所述反膠團溶液的配制方法為，將表面活性劑二 - (2 —乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)和聚氧乙烯基壬基酚醚(0PE4)按6:4的配比加入正己烷中，并添加4%正丁醇作為助溶劑，用含I mol/LKCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，即得透明澄清的反膠團溶液。其中，所述反萃取水相的配制方法為，配置含有I m0l/LKCl、15%異丙醇的反萃取水相溶液，添加正戊醇和蔗糖，使其濃度分別為3%和O. 75mol/L。其中，所述萃取步驟為將調(diào)節(jié)過pH值和離子強度的魚精蛋白粗體液與反膠團溶液以重量份1:1加入到三角瓶中，振蕩IOmin, 8000rpm/min離心5分鐘,使兩相分離。其中所述反萃取步驟為將負(fù)載魚精蛋白的反膠團溶液與反萃取水溶液以1:1體積混合，45°C下振蕩IOmin,8000rpm/min離心5分鐘,使兩相分離,水相中即含所提純的魚精蛋白。有益效果通過上述步驟，獲得酶活回收率高于98. 5%，純化因子為3的鰱魚魚精蛋白純品。本發(fā)明在已有的反膠團法提取魚精蛋白萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上，改良萃取工藝通過控制反膠團中表面活性劑的比例、PH值、離子強度、反萃取溫度以及添加適當(dāng)?shù)闹軇┖吞岣呙富钚缘幕瘜W(xué)組分，達(dá)到高效萃取酶活蛋白的目的。同已有的反膠團法相比，它具有純化率高，酶活性保留好等特點。


圖1表示pH為8. 5條件下魚精蛋白萃取率和反膠團含水率隨KCl和NaCl變化的情
況；
圖2表示水相pH值對魚精蛋白萃取率的影響；
圖3表示溫度對反萃取率和酶活回收率的影響。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，具體步驟如下第一步制備鰱魚魚精蛋白粗提液，第二步進(jìn)行微濾、超濾，第三步調(diào)整濾液pH值和離子強度，第四步配制反膠團溶液和反萃取水相溶液，第五步經(jīng)萃取和反萃取步驟獲得酶活回收率高于98. 5%的魚精蛋白純品。所述鰱魚魚精蛋白粗體液的制備方法為取2400g鰱魚魚白組織勻楽,加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后5100g離心30min，收集上清液加入濃度為30%的NaOH調(diào)節(jié)pH值為8. 5，繼續(xù)5100g離心30min，收集的上清即為魚精蛋白粗提液。所述微濾、超濾步驟為將收集的上清液加入IN HCl置于0°C過夜處理，進(jìn)行真空抽濾(Whatman # 2)，收集上清，再使用Millipore TFF IOKDa NMWL進(jìn)行超濾處理。所述超濾液用O. 2mol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)pH值為8. 5，使用2 mol/LKCl調(diào)節(jié)溶液的離子強度為O. 15 mol。所述反膠團溶液的配制方法為，將表面活性劑二 - (2 —乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)和聚氧乙烯基壬基酚醚(0PE4)按6:4的配比加入正己烷中，并添加4%正丁醇作為助溶劑，用含I mol/LKCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，即得透明澄清的反膠團溶液。所述反萃取水相的配制方法為，配置含有I m0l/LKCl、15%異丙醇的反萃取水相溶液，添加正戊醇和蔗糖，使其濃度分別為3%和O. 75mol/L。所述萃取步驟為將調(diào)節(jié)過pH值和離子強度的魚精蛋白粗體液與反膠團溶液以重量份1:1加入到三角瓶中，振蕩IOmin, 8000rpm/min離心5分鐘,使兩相分離。所述反萃取步驟為將負(fù)載魚精蛋白的反膠團溶液與反萃取水溶液以1:1體積混合，45°C下振蕩10min，8000rpm/min離心5分鐘，使兩相分離，水相中即含所提純的魚精蛋白。以下將結(jié)合附圖及實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。材料與設(shè)備
鰱魚魚白，水產(chǎn)加工廠提供；A0T、0PE4均購自Sigma公司；考馬斯亮蘭G-250購自北京華美生物工程公司；WA-1C型水分測定儀，購自江蘇電分析儀器廠；紫外可見分光光度計，752型，上海光譜儀器有限公司；搖瓶柜，HYG-1IB型，上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；高速臺式離心機，H1650型，長沙緗儀離心機儀器有限公司，其他常規(guī)實驗室儀器，其他藥品均為國產(chǎn)分析純試劑，水為去離子水。分析方法
反膠團含水率Wtl用Karl-Fischer法測定，含水量定義為水的摩爾濃度與表面活性劑摩爾濃度的比值；魚精蛋白抗菌活性采用瓊脂擴散法進(jìn)行檢測；魚精蛋白粗提液中蛋白濃度用Bradford法測定。
實施例1
制備鰱魚魚精蛋白粗體液，取2400g鰱魚魚白組織勻漿，加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后5100g離心30min，收集上清液加入濃度為30%的NaOH調(diào)節(jié)pH值為8. 5，繼續(xù)5100g離心30min，收集的上清中加入IN HCl置于0°C過夜處理，進(jìn)行真空抽濾(Whatman # 2)，收集上清，再使用Millipore TFF IOKDa NMWL進(jìn)行超濾處理，獲取的上清采用Bradford法測定的蛋白濃度為9. 1±0. 32g/L。實施例2
表面活性劑配比對反膠團含水率的影響。含水率Wtl直接影響反膠團的大小和反膠團內(nèi)微水相的物理化學(xué)性質(zhì)，同時也影響被萃取物質(zhì)的活性。表I中顯示了在不同A0T/0PE4配比下，含水率Wtl和魚精蛋白萃取率E%的變化，0PE4為非離子型表面活性劑，在反膠團體系中加入少量的0PE4可引起反膠團膠束形態(tài)的改變，從而導(dǎo)致含水率的升高，同時由于0PE4 的乳化作用，其比重較大時(2/8)會引起乳化現(xiàn)象，從表I中可以看出當(dāng)配比由10/0-6/4改變時，魚精蛋白萃取率變化不大，結(jié)合上述配比時的酶活進(jìn)行分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)配比為6/4時，酶活性最大，因此，在反膠團體系中選取A0T/0PE4配比為6/4。表1:表面活性劑配比對反膠團含水率的影響
權(quán)利要求
1.一種反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其特征是包括如下步驟制備鰱魚魚精蛋白粗提液，進(jìn)行微濾、超濾，調(diào)整濾液pH值和離子強度，配制反膠團溶液和反萃取水相溶液，經(jīng)萃取和反萃取步驟獲得酶活回收率高于98. 5%的魚精蛋白純品。
2.如權(quán)利要求1所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中所述鰱魚魚精蛋白粗體液的制備方法為取2400g鰱魚魚白組織勻漿，加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后 5100g離心約30min，收集上清液加入濃度為30%的NaOH調(diào)節(jié)pH值為8. 5，繼續(xù)5100g離心約30min，收集的上清即為魚精蛋白粗提液。
3.如權(quán)利要求1所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中所述微濾、超濾步驟為將收集的上清液加入IN HCl置于(TC過夜處理，進(jìn)行真空抽濾，收集上清，再使用截留分子量為IOKDa分子篩進(jìn)行超濾處理。
4.如權(quán)利要求1至3任一所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中所述超濾液用O. 2mol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)pH值為8. 5，使用2 mol/LKCl調(diào)節(jié)離子強度為O.15 molo
5.如權(quán)利要求1至4任一所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中所述反膠團溶液的配制方法為，將表面活性劑二- (2—乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)和聚氧乙烯基壬基酚醚(0PE4)按6:4的配比加入正己烷中，并添加4%正丁醇作為助溶劑，用含I mol/LKCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，即得透明澄清的反膠團溶液。
6.如權(quán)利要求1至5任一所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中所述反萃取水相的配制方法為，配置含有I m0l/LKCl、15%異丙醇的反萃取水相溶液，添加正戊醇和蔗糖。
7.如權(quán)利要求6所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中添加的正戊醇的濃度為3%，蔗糖的濃度為O. 75mol/L。
8.如權(quán)利要求1至6任一所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中所述萃取步驟為將調(diào)節(jié)過PH值和離子強度的魚精蛋白粗體液與反膠團溶液以重量份1:1加入到三角瓶中，振蕩IOmin, 8000rpm/min離心5分鐘,使兩相分離。
9.如權(quán)利要求1至7任一所述的反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其中所述反萃取步驟為將負(fù)載魚精蛋白的反膠團溶液與反萃取水溶液以1:1體積混合，45°C下振蕩 IOmin, 8000rpm/min離心5分鐘，使兩相分離，水相中即含所提純的魚精蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種反膠團法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其特征是包括如下步驟制備鰱魚魚精蛋白粗提液，進(jìn)行微濾、超濾，調(diào)整濾液pH值和離子強度，配制反膠團溶液和反萃取水相溶液，萃取和反萃取步驟，通過改進(jìn)反膠團法中反膠團體系的配比、萃取水相中離子種類和離子強度、pH值、反萃取溫度以及在反萃取水相中附加物質(zhì)，提高了反膠團法的純化效率，使得鰱魚魚精蛋白的酶活回收率高于98.5%，純化因子達(dá)到3，克服了現(xiàn)有技術(shù)中反膠團萃取魚精蛋白酶活回收率和純化因子不高的缺陷。
文檔編號C07K1/14GK102993290SQ20121053226
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者張永勤, 張春革 申請人:青島亞博生物科技有限公司