專利名稱：一種利拉魯肽的全固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽的合成方法，特別涉及一種利拉魯肽的全固相合成方法。
背景技術(shù)：
利拉魯肽(Liraglutide)，是通過基因重組技術(shù)，利用酵母生產(chǎn)的人胰高糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物，具有降低血糖、減輕體重、促進胰島細胞再生以及心血管系統(tǒng)保護等多種效應(yīng)，臨床應(yīng)用前景廣闊?，F(xiàn)有的利拉魯肽生產(chǎn)方法及缺陷如下:1、基因工程法，由于利拉魯肽是一個具有支鏈修飾的非天然活性多肽，所以生產(chǎn)技術(shù)難度極大，設(shè)備要求高，大規(guī)模生產(chǎn)風(fēng)險大，成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。2、固液合成法，需經(jīng)過片段固相合成、全保護切割、全保護片段純化、片段縮合等幾個不同的階段，生產(chǎn)周期長。同時由于片段是全保護多肽，非常疏水，所以大大的增加了純化的難度。這就給大規(guī)模生產(chǎn)帶來了周期長，成本高的問題。3、CN102286092A的發(fā)明報道的Fmoc-Lys (Alloc)-OH方法，由于所采用的是先液相合成支鏈化合物(Palmitoyl-Glu-OtBu),同樣也需要進行反復(fù)純化的問題。選擇Fmoc-Lys (Alloc)-OH作為側(cè)鏈修飾用保護氨基酸的方法所帶來的弊端,在脫Alloc保護時對生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境帶來了更高的要求以及更長的生產(chǎn)周期，主要表現(xiàn)在以下幾個方面:1)由于脫Alloc保護基要用到的四三苯基膦鈀對空氣、光、熱等非常敏感，反應(yīng)要求在無空氣、避光的條件下才能有效的進行。2)要求對保護肽樹脂在高真空的條件下40°C加熱干燥4小時。3)試劑四三苯基膦鈀價格昂貴，所需反應(yīng)時間長(2小時)，并且需要在氬氣的保護下進行。4)由于反應(yīng)是在封閉的狀態(tài)下進行，取樣困難，不利于中控，對大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了很大的風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利拉魯肽的全固相合成方法，操作簡單，原材料成本低，合成周期短，后處理容易，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高等特點，利于利拉魯肽的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種利拉魯肽的全固相合成方法，包括如下步驟:(I)以2-Cl-Tr樹脂為固相載體，與Fmoc-Gly-OH縮合反應(yīng)獲得Fmoc-Gly-2-Cl-Trt 樹脂；(Fmoc-Gly-OH 的摩爾數(shù):樹脂取代度=2:1)(2)通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次縮合具有N端Fmoc保護且側(cè)鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fmoc-Lys (ivDde)-0H,每次縮合反應(yīng)30_35min后，再在微波條件下反應(yīng)處理；(3)脫除賴氨酸側(cè)鏈保護基iv Dde ；(4)通過固相合成法，在賴氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)Fmoc-Glu-OtBu，并在谷氨酸上連接棕櫚酸；
(5)裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽；(6)純化，凍干，轉(zhuǎn)鹽，凍干，得到利拉魯肽醋酸鹽。本發(fā)明線性肽(直鏈肽)部分采用特有的小配比(即縮合反應(yīng)時，保護的氨基酸的摩爾數(shù):樹脂取代度=2:1,而傳統(tǒng)的方法是3:1或者5:1,甚至高達10:1,反應(yīng)時間I至2小時，甚至反應(yīng)過夜。本發(fā)明的方法是保護的氨基酸的摩爾數(shù):樹脂取代度=2:1，反應(yīng)30-35分鐘再用微波照射15-20秒，反應(yīng)即可完成)微波反應(yīng)技術(shù)的Fmoc固相合成方法，以2-Cl-Trt Resin為固相載體，以DIC/HOBt為縮合劑。側(cè)鏈修飾采用新穎ivDde側(cè)鏈保護的賴氨酸。純化采用制備型反相高效液相色譜法以及本公司特 有的轉(zhuǎn)鹽技術(shù)。本發(fā)明提供的固相合成方法操作簡單，原材料成本低，合成周期短，后處理容易，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高等特點，利于利拉魯肽的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明采用的小配比微波反應(yīng)技術(shù)極大地提高了反應(yīng)效率，提高了產(chǎn)品的純度。本發(fā)明采用的Fmoc-Lys (ivDde)-OH作為側(cè)鏈修飾的保護氨基酸可以在同一個反應(yīng)器里無需做任何特殊的處理即可完成整個合成，而脫ivDde保護基的反應(yīng)時間更是只需短短的幾分鐘即可完成。反應(yīng)條件溫和。取樣方便，易于中控。同樣本發(fā)明采用了強陰離子轉(zhuǎn)鹽的工藝，對最終的產(chǎn)品用醋酸進行轉(zhuǎn)鹽，徹底清除了三氟醋酸對生物體的毒性。本方法操作簡單，合成周期短，生產(chǎn)成本低,副產(chǎn)物少,產(chǎn)品收率高,利于大規(guī)模生產(chǎn)。作為優(yōu)選，步驟(2)中，縮合反應(yīng)時，具有N端Fmoc保護且側(cè)鏈保護的氨基酸用量為:氨基酸的摩爾數(shù):樹脂取代度=2:1 ;微波條件下反應(yīng)具體為:微波輸出功率130w-195w，反應(yīng) 15-20s。作為優(yōu)選，步驟(3)采用水合肼溶液脫除ivDde，水合肼溶液用量為3_4倍樹脂體積，水合肼溶液體積配比為:水合肼:DMF=1:15-20。作為優(yōu)選，步驟(6)所述轉(zhuǎn)鹽具體為:將50_60mg凍干的利拉魯肽粗肽溶解在6-7ml體積分數(shù)為0.1-0.2%的醋酸水溶液中，然后加入到250_300mg強陰離子樹脂中，磁力攪拌器上室溫下反應(yīng)1-1.5小時，過濾，收集濾液，樹脂用l_2ml體積分數(shù)為0.1-0.2%醋酸水溶液洗滌2次，收集洗脫液，與濾液合并。本發(fā)明的有益效果是:操作簡單，原材料成本低，合成周期短，后處理容易，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高等特點，利于利拉魯肽的大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施例方式下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例:下面以Ig 2-Cl-Trt樹脂為例，來具體說明本發(fā)明的操作流程。1、實驗原料2-Cl-Trt-resin、Fmoc-His(Trt)-OH>Fmoc-Asp(OtBu)-OH>Fmoc-Arg (pbf) -OH> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr (tBu) _0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-ValOH、Fmoc-Trp (Boc) OH、Fmoc-Glu(OtBu) _0H、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)rOH、Fmoc-Asp(OtBu) -OH、
Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc-Lys(Dde) -OH、Fmoc-1le-OH、palmitic acid。2、實驗試劑N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三氮唑-N，N, N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、哌啶、二氯甲烷(DIC)、無水乙醚、二異丙基乙胺(DIEA)、乙酸酐、Boc酸酐、水合肼、三氟乙酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)、茴香硫醚、苯酹、卻三酮(5g/100ml)、苯酹(20g/150ml)、無水乙醇、甲醇、次氯酸鈉、超純水、無水CaCl2。試劑的配制脫保護試劑——哌啶:DMF=1:4(v/v)實驗前預(yù)先配好檢測試劑A—20g苯酚溶解于150ml無水乙醇中實驗前預(yù)先配好，棕色滴瓶，避光檢測試劑B—5g茚三酮溶解于IOOml無水乙醇中實驗前預(yù)先配好，棕色滴瓶，避光封頭試劑一甲醇:DIEA=1:1 (v/v )現(xiàn)用現(xiàn)配切割試劑——TFA =EDT:水:茴香硫醚:苯酚=87.5ml:2.5ml:5ml:5ml:5g現(xiàn)用現(xiàn)配3、操作規(guī)程(Ig樹脂)3.1樹脂的稱量及溶脹稱取Ig 2-Cl-Trt樹脂，加入至多肽合成反應(yīng)器中，用量筒準確量取50ml DCM加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹40min。3.2肽鏈的起始及延伸3.2.lFmoc-Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.1.1洗滌:將浸泡樹脂無水DCM抽干，用30mlDMF(N，N- 二甲基甲酰胺)，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的搖床上搖動Imin,重復(fù)操作3次，抽干；同理，用DCM洗滌樹脂I次；最后用循環(huán)水式真空泵(SHZ-DIII上海羌強儀器有限公司)將溶液抽干。3.2.1.2小配比縮合反應(yīng):(樹脂取代度:Fmoc-氨基酸的摩爾數(shù)=1:2)將118.92mgFmoc-Gly-0H和122mgH0BT放于IOml離心管中，加3mlDCM將其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s-lmin，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)1.5h。3.2.1.3封頭:配制甲醇:DIEA=1:1(體積比)的混合液2ml，將其加入到抽干的反應(yīng)器中，置于20-30r/min的搖床上搖20min。3.2.1.4洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30mL DMF，置于30r/min的搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作4次。再用15mlDCM洗3次，每次lmin。然后用甲醇洗3次，每次lmin，最后抽干20min，至樹脂為顆粒狀。稱取出部分樹脂，留作取代度測定。3.2.2Fmoc-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.2.1脫Fmoc:用量筒量取30mL 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.2.2洗滌:將用于脫保護的20%哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30mLDMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次。
3.2.2.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.2.4 縮合:將稱取的 583.9mg Fmoc-Arg-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF(因氨基酸的縮合反應(yīng)采用微波反應(yīng)法，故采用DMF，而不用DCM，以防DCM在微波反應(yīng)器中發(fā)生爆炸)將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，放入到微波反應(yīng)器(LWMC=201型微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器，南京旋光科技有限公司)中反應(yīng)，微波功率為20%微波反應(yīng)器額定輸出功率650ff,20%BP 130w)微波時間 20s。3.2.2.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.2.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30mL DMF，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作4次。3.2.3Fmoc-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.3.1脫Fmoc:向抽干的反應(yīng)器中加30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的搖床上搖20min3.2.3.2洗滌:將用于脫Fmoc的20%哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反應(yīng)器中加30mlDMF，置于30r/min的搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次。3.2.3.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.3.3.4 縮合:將 118.92mg Fmoc-Gly-OH 和 122mgH0BT 放 IOml 離心管中，力口入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加D`IC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.3.3.5檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.3.3.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，向抽干的反應(yīng)器中加30mlDMF，置于30r/min的搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作4次。3.2.4Fmoc-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.4.1脫Fmoc:向抽干的反應(yīng)器中加30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的搖床上搖20min.
3.2.4.2洗滌:將用于脫Fmoc的20%哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反應(yīng)器中加30mlDMF，置于30r/min的搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次。3.2.4.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.4.4 縮合:將 583.9mg Fmoc-Arg-OH 和 122mgH0BT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.4.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.4.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF，置于30r/min的搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作4次3.2.5Fmoc-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.5.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.5.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次。3.2.5.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.5.4 縮合:將稱取的 305.46mgFmoc-Val-0H和 122mgH0BT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.5.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.5.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.6Fmoc-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.6.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.6.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次3.2.6.3檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.6.4 縮合:將稱取的 318.06mg Fmoc-Leu-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.6.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.6.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。將反應(yīng)器兩端用保鮮膜封好，放于通風(fēng)櫥內(nèi)。3.2.7Fmoc_Trp (Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備

3.2.7.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.7.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次3.2.7.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.7.4 縮合:將稱取的 473.94mg Fmoc-Trp-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.7.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.7.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.8Fmoc-Ala_Trp (Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.8.1脫Fmoc:向抽干的反應(yīng)器中加入30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的搖床上搖20min。3.2.8.2洗滌:將用于脫Fmoc的哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反應(yīng)器中加入30mlDMF，置于30r/min的搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次。3.2.8.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.8.4 縮合:將 280.17mg Fmoc-Ala-OH 和 122mg HOBT 加入到 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC活化20s，混勻。將混合液加入到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.8.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.8.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。

3.2.9Fmoc_Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.9.1脫Fmoc:向抽干的反應(yīng)器中加入30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的搖床上搖20min。3.2.9.2洗滌:將用于脫Fmoc的哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反應(yīng)器中加入30mlDMF，置于30r/min的搖床上搖lmin.，用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操作5次。3.2.9.3檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.9.4 縮合:將 318.06mg Fmoc-1le-OH 和 122mg HOBT 加入到 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC活化20s，混勻。將混合液加入到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.9.5檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.9.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.1OFmoc-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin的制備3.2.10.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.10.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.10.3檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.10.4 縮合:將稱取的 348.66mg Fmoc-Phe-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.10.5檢測:取1 0-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.10.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.1lFmoc-Glu (OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.11.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.11.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.11.3檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.11.4縮合:將稱取的 382.923mg Fmoc-Glu (OtBu)-OH和 122mg HOBT放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.11.5檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.11.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.12Fmoc_Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.12.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.12.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.12.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.12.4 縮合:將稱取的 479.358mg Fmoc-Lys (Dde)-OH和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.12.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.12.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.13Fmoc-Ala_Lys (Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.13.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.13.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.13.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.13.4 縮合:將稱 取的 280.17mg Fmoc-Ala-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.13.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.13.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.14Fmoc-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.14.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.14.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.14.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.14.4 縮合:將稱取的 280.17mg Fmoc-Ala-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.14.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.14.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.15Fmoc_Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.15.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.15.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.15.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。
3.2.15.4 縮合:將稱取的 549.63mg Fmoc-Gln (Trt) -OH 和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.15.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.15.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.16Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.16.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.16.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.16.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.16.4 縮合:將稱取的 118.92mg Fmoc-Gly-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.16.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。

3.2.16.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.17Fmoc_Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.17.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.17.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.17.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.17.4縮合:將稱取的 382.923mg Fmoc-Glu (OtBu)-OH和 122mg HOBT放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.17.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.17.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。 3.2.18Fmoc-Leu_Glu (OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu (OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備
3.2.18.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.18.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.18.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.18.4 縮合:將稱取的 318.06mg Fmoc-Leu-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.18.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.18.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.19Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu) -Phe-1le-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.19.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.19.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.19.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.19.4 縮合:將稱取的 413.55mg Fmoc-Tyr (tBu) -OH 和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.19.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.19.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.20Fmoc-Ser (tBu)-Tyr (tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.20.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.20.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.20.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.20.4 縮合:將稱取的 345.06mg Fmoc-Ser (tBu)—0H和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.20.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.20.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.2IFmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys (Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin的制備3.2.21.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.21.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.21.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.21.4 縮合:將稱取的 345.06mg Fmoc-Ser (tBu)—0H和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.21.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.21.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵`將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.22Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys (Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.22.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.22.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.22.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.22.4 縮合:將稱取的 305.46mg Fmoc-Val-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.22.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.22.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.23Fmoc_Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.23.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.23.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.23.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.23.4 縮合:將稱取的 303.66mg Fmoc-Asp (OtBu) -OH和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.23.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.23.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.24Fmoc-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.24.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.24.2洗 滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.24.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.24.4 縮合:將稱取的 345.06mg Fmoc-Ser (tBu) -OH 和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.24.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.24.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.25Fmoc-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu (OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.25.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.25.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.25.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。
3.2.25.4 縮合:將稱取的 357.75mg Fmoc-Thr (tBu) -OH 和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.25.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.25.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.26Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.26.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.26.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.26.3檢測:取10_20顆樹脂于 試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.26.4 縮合:將稱取的 348.66mg Fmoc-Phe-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.26.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.26.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.27Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr (tBu)-Leu-Glu (OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1Ie-AIa-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.27.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.27.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.27.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.27.4 縮合:將稱取的 357.75mg Fmoc-Thr (tBu) -OH 和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.27.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.27.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。
3.2.28Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Tyr (tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-1Ie-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.28.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.28.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。3.2.28.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.28.4 縮合:將稱取的 118.92mg Fmoc-Gly-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.28.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.28.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.29Fmoc_Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys (Dde)-Glu(OtBu) -Phe-1le-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.29.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.29.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次3.2.29.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.29.4縮合:將稱取的 382.923mg Fmoc-Glu(OtBu)-Oi^P 122mg HOBT放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.29.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.29.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.30Fmoc-Ala_G lu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-GIu (OtBu) -Phe-1le-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resin 的制備3.2.30.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.30.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次
3.2.30.3檢測:用取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.30.4 縮合:將稱取的 280.17mg Fmoc-Ala-OH 和 122mg HOBT 放于 IOml 離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.30.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.30.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.2.3IFmoc-His (Trt) -Ala-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu (OtBu)-Phe-1le-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg—Gly-2-Cl-Trt-Resiη的制備3.2.31.1脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。3.2.31.2洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次3.2.31.3檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。3.2.31.4 縮合:將稱取的 557.73mg Fmoc-His (Trt) -OH 和 122mg HOBT 放于 IOml離心管中，加入3mlDMF將其溶解， 再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)30min后，微波20s (與3.2.2.4微波條件相同)。3.2.31.5檢測:取10_20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂呈無色。3.2.31.6洗滌:將反應(yīng)液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖lmin，用真空泵將溶液抽干。重復(fù)操作4次。3.3多肽側(cè)鏈的連接3.3.1連接側(cè)鏈前的脫保護多肽連接至最后一個氨基酸縮合成功后，洗滌4次后，按上所述進行氨基酸脫保護一脫保護洗滌一脫保護檢測(脫Fmoc:用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖20min。洗滌:將用于脫保護的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反應(yīng)器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脫色搖床上搖lmin。用真空泵將溶液抽干，重復(fù)操5次。檢測:取10-20顆樹脂于試管中，分別滴入檢測試劑A、B各兩滴，置于100°C加熱20S，樹脂顯色。)，檢測為陽性，則進行下一步反應(yīng)。3.3.2接Boc酸酐(用于保護N-端氨基)Boc酸酐按照樹脂取代度的三倍物質(zhì)的量(即摩爾量)計，DIEA:DCM=1:4溶液3ml，混合均勻，加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)直至樹脂檢測無色，即Boc已連接上。3.3.3 脫 ivDdeBoc接上后用DMF洗4遍后脫ivDde，按照水合肼:DMF=1:15配置溶液16ml，溶液分3次脫Dde，每次震蕩反應(yīng)5min，用DMF洗滌3次；第3次混合溶液脫ivDde時，DMF洗滌5次，樹脂檢測有色，說明ivDde已被成功脫下，可進行側(cè)鏈連接。3.3.4側(cè)鏈氨基酸的連接脫ivDde完成后，按下述縮合方法,投入側(cè)鏈氨基酸Fmoc-Glu-OtBu,洗檢、脫保護、洗檢，樹脂有色；再投入棕櫚酸(樹脂取代度的3倍量計算加入量)進行連接反應(yīng)，樹脂檢測無色，確認連接成功后，用DMF洗5次，抽干反應(yīng)器?？s合方法:按樹脂取代度的兩倍量稱量所需的氨基酸及HOBT的質(zhì)量，加入3mlDMF使之完全溶解，并加入相 應(yīng)體積的DIC，迅速混勻后(約30s-lmin)，加入至合成反應(yīng)器中，中速震搖50min (若室溫低于25°C，將反應(yīng)器置于恒溫震蕩箱中，溫度控制在25_30°C )?？s合時間快到時，取10-20顆樹脂，置于15ml玻璃試管中，分別加入兩滴檢測試劑A、B，輕輕震搖使檢測試劑與樹脂充分接觸后，置于100°C加熱60s。樹脂呈現(xiàn)無色或淡黃透明等樹脂自身的顏色，視為縮合反應(yīng)成功。鑒于無游離氨基存在的樹脂為無色的半透明狀態(tài)，通常，有顯色反應(yīng)的縮合步驟，都視為縮合不完全，采用微波處理，如檢測仍有顏色則選擇重新投料(氨基酸:HBTU =DIEA=1:1:1)，直至反應(yīng)完全；如樹脂完全無色，則視為縮合反應(yīng)成功，進行下一步驟操作。檢測無顏色后，用DMF洗滌4次，每次30ml，置于脫色搖床上搖動Iminji干。3.3.5樹脂的干燥向抽干的反應(yīng)器中加入40mlDCM溶液，置于脫色搖床上搖動3min，用真空水泵將DCM抽掉，重復(fù)操作4次。最后一次抽干時，保持真空條件干燥至樹脂呈顆粒狀，等待切割。3.4多肽從樹脂上的切割3.4.1配置切割試劑20ml配方為:17.5mlTFA+lml茴香硫醚+Iml水+0.5mlEDT+lg苯酚，置于棕色試劑瓶中。3.4.2沉降的準備無水乙醚置于_20°C低溫預(yù)冷預(yù)冷時間彡2h。乙醚用量為Iml切割試劑8ml乙
醚沉降。3.4.3多肽的切割向反應(yīng)器中加入20ml切割試劑，置于搖床搖動90min，速度20r/min。切割結(jié)束后，加入約35ml冰乙醚至50ml離心管中，將反應(yīng)器中溶液經(jīng)砂芯過濾到冰乙醚中，向反應(yīng)器中再加入備用的洗漆用切割試劑，離心，3000r/min, 3min,離心沉淀去上清,重復(fù)操作3次得到多肽粗產(chǎn)品。3.5取代度的測定取4份干燥的2-Cl-Trt樹脂作平行樣，每份5mg.
稱量干燥的Fmoc-AA-Resin 5 (W) mg于IOml離心管中。然后，加入5(X)ml 20%哌啶/DMF脫保護20min。用移液槍取Iml 20%哌啶/DMF，加甲醇稀釋至IOml，做為空白對照。Absblank在30Inm測定。歸零后，取I (Y)ml 20%哌啶/DMF脫保護液用甲醇稀釋至10 (Z)ml。各取2.5ml稀釋后的脫保護液和2.5ml稀釋后的20%哌啶/DMF溶液于2個石英比色皿中，用空白調(diào)零后，在301nm處測定吸光度值，記為Abs3(llmi。重復(fù)測定4次。計算公式如下:
權(quán)利要求
1.一種利拉魯肽的全固相合成方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)以2-Cl-Trt樹脂為固相載體，與Fmoc-Gly-OH縮合反應(yīng)獲得Fmoc-Gly-2-Cl-Trt樹脂； (2)通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次縮合具有N端Fmoc保護且側(cè)鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fmoc-Lys (ivDde)-0H,每次縮合反應(yīng)30_35min后,再在微波條件下反應(yīng)處理； (3)脫除賴氨酸側(cè)鏈保護基ivDde； (4)通過固相合成法，在賴氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)Fmoc-Glu-OtBu，并在谷氨酸上連接棕櫚酸； (5)裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽； (6)純化，凍干，轉(zhuǎn)鹽，凍干，得到利拉魯肽醋酸鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利拉魯肽的全固相合成方法，其特征在于:步驟(2)中，縮合反應(yīng)時，具有N端Fmoc保護且側(cè)鏈保護的氨基酸用量為:氨基酸的摩爾數(shù):樹脂取代度=2:1 ;微波條件下反應(yīng)具體為:微波輸出功率130w-195w，反應(yīng)15_20s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利拉魯肽的全固相合成方法，其特征在于:步驟(3)采用水合肼溶液脫除ivDde，水合肼溶液用量為3-4倍樹脂體積，水合肼溶液體積配比為:水合肼:DMF=1:15-20ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利拉魯肽的全固相合成方法，其特征在于:步驟(6)所述轉(zhuǎn)鹽具體為:將50-60mg凍干的利拉魯肽粗肽溶解在6-7ml體積分數(shù)為0.1-0.2%的醋酸水溶液中，然后加入到250-300mg強陰離子樹脂中，磁力攪拌器上室溫下反應(yīng)1-1.5小時,過濾,收集濾液,樹脂用l_2ml體積分數(shù)為0.1-0.2%醋酸水溶液洗滌2次，收集洗脫液，與濾液合并。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利拉魯肽的全固相合成方法，以2-Cl-TrtResin為固相載體，以DIC/HOBt為縮合劑，經(jīng)過微波反應(yīng)技術(shù)的處理，縮短了反應(yīng)時間，提高了縮合效率。側(cè)鏈修飾采用新穎ivDde側(cè)鏈保護的賴氨酸，進行側(cè)鏈修飾合成，期間采用20%哌啶脫Fmoc保護，直至直鏈多肽合成完畢。其次采用水合肼脫ivDde保護后，進行側(cè)鏈修飾反應(yīng)。得到的在固相載體上的全保護利拉魯肽通過三氟醋酸的處理得到利拉魯肽粗品，并經(jīng)過C18柱的純化凍干，得到純品利拉魯肽，經(jīng)過強陰離子轉(zhuǎn)鹽并凍干后得到醋酸利拉魯肽醋酸鹽。本發(fā)明操作簡單，合成周期短，生產(chǎn)成本低，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/04GK103145828SQ201210533759
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者周耐明 申請人:寧波盛泰生物醫(yī)藥科技有限公司