一種純化硫代寡核苷酸的工業(yè)化方法
【專利摘要】一種純化硫代寡核苷酸的工業(yè)化方法，包括自動液相層析儀和離子交換純化柱，流動相自動切換系統(tǒng)、在線紫外監(jiān)測器和pH監(jiān)測器；純化層析體系選擇；步驟包括：原料液處理，在線監(jiān)測，上樣、分離、洗脫，目的組分收集，純化柱為直徑100mm，裝填層析填料1000ml；流動相組成：A：20mM氫氧化鈉水溶液；B：20mM氫氧化鈉+2.5M氯化鈉水溶液；步驟(2)選擇紫外波長為290nm；步驟(3)上樣量為上樣原料液150ml；其分步驟為：①A液平衡層析柱；②用80%-60%A液、20％-40％的B液洗脫；③用60%-20%A液、40％-80％的B液進行洗脫；④用20%A液、80％的B液洗脫；步驟（4）純度＞95％以上的樣品組分進入后續(xù)脫鹽工序，產(chǎn)率達70％，純度大于95％。
【專利說明】一種純化硫代寡核苷酸的工業(yè)化方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及寡核苷酸加工方法，特別是一種純化硫代寡核苷酸的工業(yè)化方法。
【背景技術】:
[0002]現(xiàn)有純化硫代寡核苷酸方法多處于實驗室生產(chǎn)或小規(guī)模生產(chǎn)，其方法為:
[0003]1、本工藝采用中低壓離子交換層析法純化目的物。純化系統(tǒng)由自動液相層析儀和離子交換純化柱組成。自動液相層析儀配有多元梯度泵、流動相自動切換系統(tǒng)、在線紫外監(jiān)測器和PH監(jiān)測器；純化柱是體積Iml的預裝陰離子交換柱，柱填料為強陰離子交換材料季銨化的聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物。
[0004]原理:在離子交換層析中，溶質(zhì)依據(jù)所帶電荷的不同及其與離子交換填料靜電作用力的差異而獲得分離。硫代寡核苷酸分子骨架上的硫代磷酸基團帶有負電荷，鏈長度不同則所帶電荷數(shù)不同。基于這種特點，可以使用陰離子交換色譜柱將不同長度的硫代寡核苷酸分離。
[0005]2、對上道合成硫代寡核苷酸工序的中間產(chǎn)品需要進行純化，中間產(chǎn)品作為原料液進行過濾，去除固體基質(zhì)，取清液作為上樣原料液；
[0006]3、純化層析體系選擇:硫代寡核苷酸將使用10%乙腈一氯化鈉溶液進行濃度梯度洗脫。
[0007]原理:隨著氯離子濃度的增大，不同電荷數(shù)的硫代寡核苷酸從強陰離子交換樹脂上依次洗脫，得到分離純化。本方法的主要不足在于整個洗脫過程溶液的PH值偏低，過程中會產(chǎn)生核酸鏈自身互補形成二級結構的可能，并有核酸聚集成團，從而造成目的組分損失。
[0008]4、上樣和分離、洗脫:起動純化儀，開始在線監(jiān)測。每次純化上樣量1ml，含目的物約lmg。具體層析純化操作如下:10%乙腈水溶液一10%乙腈+2mol氯化鈉溶液作為流動相，線性梯度洗脫，流速:0.5ml/min。
[0009]5、在線監(jiān)測260nm處紫外吸收峰。收集最大吸收峰處的組分。洗脫時，當主組分峰上升到90%時開始收集，下降到80%時停止收集，可以得到純度較高的產(chǎn)物。
[0010]原理:寡核苷酸在260nm處有最大吸收峰。
[0011]6、完成一次純化過程，可得到Ug量級的目的物，純度>90%，得率約30%。
[0012]上述生產(chǎn)方法的缺陷在于:不能大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，目的物純度低，得率低。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0013]本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，提供一種純化硫代寡核苷酸的工業(yè)化方法。
[0014]本發(fā)明的方案是:生產(chǎn)設備包括自動液相層析儀和離子交換純化柱，自動液相層析儀配有多元梯度泵、流動相自動切換系統(tǒng)、在線紫外監(jiān)測器和pH監(jiān)測器；包括純化層析體系選擇；生產(chǎn)步驟包括:⑴原料液處理，⑵在線監(jiān)測，⑶上樣、分離、洗脫，⑷目的組分收集，其特征在于:自動液相層析儀器的純化柱為直徑IOOmm的不銹鋼柱，裝填層析填料1000ml ;流動相組成:A:20mM氫氧化鈉水溶液、B:20mM氫氧化鈉+2.5M氯化鈉水溶液；
[0015]生產(chǎn)步驟(2)起動純化儀，開始在線監(jiān)測，選擇紫外監(jiān)測器的紫外波長為290nm ；
[0016]步驟(3)上樣、分離、洗脫:每次純化上樣量為上樣原料液150ml ；
[0017]其分步驟為:
[0018]分步驟①用液量為I個層析柱體積的流動相A液平衡層析柱，然后以100ml/min快速上樣；
[0019]分步驟②用80%_60%流動相A液、20% — 40%的流動相B液進行洗脫，液量為6個層析柱體積，洗脫過程流速為120ml/min ；
[0020]分步驟③用60%_20%流動相A液、40 % — 80 %的流動相B液進行洗脫，液量為4個層析柱體積，同時開始分段收集紫外最大吸收峰處的洗脫液，洗脫過程流速為120ml/min ；[0021 ] 分步驟④用20%流動相A液、80%的流動相B液進行洗脫，液量為I個層析柱體積，洗脫過程流速為120ml/min ；
[0022]步驟(4)生產(chǎn)中分段收集的各組分，經(jīng)高效液相色譜測定，純度> 95%以上的樣品組分可混合進入后續(xù)脫鹽工序，最終得到目的產(chǎn)物。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0024]1、現(xiàn)有純化條件下，一次可以完成約10克目的產(chǎn)物的純化，產(chǎn)率可達理論量的70%。
[0025]2、多批純化脫鹽樣品，經(jīng)反相高效液相色譜法檢測，純度均大于95%。
[0026]3、經(jīng)核磁共振法測定磷譜，樣品未全硫代物均未檢出(表明產(chǎn)物全硫代率高，未全硫代的失敗物被完全分離去除)。
【具體實施方式】:
[0027]本工藝采用中低壓離子交換層析法純化目的物。純化系統(tǒng)由自動液相層析儀和離子交換純化柱組成。自動液相層析儀配有多元梯度泵、流動相自動切換系統(tǒng)、在線紫外監(jiān)測器和pH監(jiān)測器；純化柱為大不銹鋼柱，直徑100mm，裝填層析填料1000ml ;層析分離用柱填料為強陰離子交換材料聚苯乙烯二乙烯基苯的季銨鹽化合物。
[0028]原理:在離子交換層析中，溶質(zhì)依據(jù)所帶電荷的不同及其與離子交換填料靜電作用力的差異而獲得分離。硫代寡核苷酸分子骨架上的硫代磷酸基團帶有負電荷，鏈長度不同則所帶電荷數(shù)不同?；谶@種特點，可以使用陰離子交換色譜柱將不同長度的硫代寡核苷酸分離。
[0029]純化層析液體系選擇:合成粗產(chǎn)物進行過濾，去除固體基質(zhì)，溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入少量氫氧化鈉溶液溶解。選擇氫氧化鈉一氯化鈉水溶液體系作為純化層析的流動相。緩沖液是20mM的氫氧化鈉溶液,硫代寡核苷酸使用氯化鈉溶液進行濃度梯度洗脫。
[0030]原理:選用氫氧化鈉作為緩沖液，是因為它可以層析液系統(tǒng)的pH控制在> 12，使核酸鏈變性，從而減小了核酸鏈自身互補形成二級結構的可能，并防止核酸聚集成團，大大改善分離效果。對某些寡核苷酸，在緩沖液系統(tǒng)中加入適當有機溶劑似乎可以提高產(chǎn)物的回收率，但對純度無任何改變。加入有機溶劑可能出現(xiàn)較大問題，例如:導致緩沖液粘稠度加大，鹽溶解困難。特別是大規(guī)模純化樣品需要大量的流動相，加入大量有機溶劑還需要額外的溶液處理，并且還帶來環(huán)保的問題。基于以上原因，我們不在緩沖液中加入任何有機溶劑。
[0031]上樣和分離、洗脫:每次純化上樣量約150ml，含目的物約8 — 10克。
[0032]流動相組成:
[0033]A:20mM氫氧化鈉水溶液
[0034]B:20mM氫氧化鈉+2.5M氯化鈉水溶液
[0035]具體層析純化操作梯度如下:
[0036]首先用則^的八液’平衡層析柱丄個體積似^^丨/^化快速上樣名著用]。1^ —40%的B液，洗脫6個體積；而后用40%— 80% B液，洗脫4個體積，同時開始收集目的組分；最后用80% B液洗脫I個體積；洗脫過程流速均為120ml/min.[0037]原理:本DNA純化儀使用雙泵,流速可達200ml/min,且柱填料亦可耐受高壓。使用較高流速可縮短純化時間，但降低純化效果。通過實際測試，確定純化過程中流速保持在100 — 120ml/min。強陰離子交換材料聚苯乙烯二乙烯基苯交換介質(zhì)離子具有較大的容量。大量上樣未發(fā)現(xiàn)組分在梯度上升前有穿透現(xiàn)象，但會因組分擴散等作用影響到樣品分離效果，上樣體積不宜過大，對1000ml離子交換柱通常保持每柱上樣體積為150ml左右，而且采用純化泵大流速(lOOml/min)快速進樣。
[0038]通過對包括組合步驟和梯度在內(nèi)的不同線形和梯度的試驗，我們發(fā)現(xiàn)要實現(xiàn)目的組分和N-1失敗序列片斷雜質(zhì)的分離需要一個相當平緩的濃度梯度。而在其它部分，梯度斜率可以加大，甚至可以直接實行梯度跳躍。為了實現(xiàn)雜質(zhì)更徹底的去除，在純化前期可以使用一個較陡的梯度，這可以保證目的序列洗脫之前較短的合成序列被充分去除。之后，目的物被洗脫
[0039]目的組分在線監(jiān)測和收集:在線快速聯(lián)機紫外監(jiān)測器設定290nm波長監(jiān)測目的組分出峰位置，分段收集紫外最大吸收峰處的洗脫液，綜合考慮生產(chǎn)成本和產(chǎn)品質(zhì)量兩方面因素，生產(chǎn)中分段收集的各組分，經(jīng)高效液相色譜測定，純度> 95%以上的樣品組分可混合進入后續(xù)脫鹽工序，最終得到目的產(chǎn)物。
[0040]原理:寡核苷酸在260nm處有最大吸收峰,但在大規(guī)模純化中，由于上樣量較大，若在260nm處監(jiān)測，由于過高的濃度使紫外吸收過載，在峰開始和下降時都處于飽和，導致差的層析分離。而寡核苷酸在290nm有相對小的吸光系數(shù)，在較大的載樣時，仍能產(chǎn)生清楚的色譜峰，有利于目的組分的收集。
【權利要求】
1.一種純化硫代寡核苷酸的工業(yè)化方法，生產(chǎn)設備包括自動液相層析儀和離子交換純化柱，自動液相層析儀配有多元梯度泵、流動相自動切換系統(tǒng)、在線紫外監(jiān)測器和PH監(jiān)測器；包括純化層析體系選擇；生產(chǎn)步驟包括:⑴原料液處理，⑵在線監(jiān)測，⑶上樣、分離、洗脫，⑷目的組分收集，其特征在于:自動液相層析儀器的純化柱為直徑100_的不銹鋼柱，裝填層析填料1000ml ;流動相組成:A:20mM氫氧化鈉水溶液、B:20mM氫氧化鈉+2.5M氯化鈉水溶液； 生產(chǎn)步驟(2)起動純化儀，開始在線監(jiān)測，選擇紫外監(jiān)測器的紫外波長為290nm; 步驟(3)上樣、分離、洗脫:每次純化上樣量為上樣原料液150ml ； 其分步驟為: 分步驟①用液量為1個層析柱體積的流動相A液平衡層析柱，然后以100ml/min快速上樣； 分步驟②用80%-60%流動相A液、20% — 40%的流動相B液進行洗脫，液量為6個層析柱體積，洗脫過程流速為120ml/min ； 分步驟③用60%-20%流動相A液、40 %-80%的流動相B液進行洗脫，液量為4個層析柱體積，同時開始分段收集紫外最大吸收峰處的洗脫液，洗脫過程流速為120ml/min ； 分步驟④用20%流動相A液、80 %的流動相B液進行洗脫，液量為I個層析柱體積，洗脫過程流速為120ml/min ； 步驟(4)生產(chǎn)中分段收集的各組分，經(jīng)高效液相色譜測定，純度> 95%以上的樣品組分可混合進入后續(xù)脫鹽工序，最終得到目的產(chǎn)物。
【文檔編號】C07H1/06GK103833797SQ201210488577
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月26日 優(yōu)先權日:2012年11月26日
【發(fā)明者】陳希中, 林英略, 翟培彬, 蔡燕峰, 柯軍騰, 陳秀斌 申請人:福建金山生物制藥股份有限公司