本發(fā)明涉及生物化工領域，具體涉及一種排硫硫桿菌及高活性培養(yǎng)的方法，采用本方法培養(yǎng)排硫硫桿菌能極大降低菌體死亡率，明顯提高單位菌液中活菌數(shù)。

背景技術：

傳統(tǒng)的排硫硫桿菌培養(yǎng)方法是依據(jù)化能自養(yǎng)細菌生長需求，以硫代硫酸鹽等簡單無機鹽作為碳源、氮源。排硫硫桿菌在這類培養(yǎng)基下生長緩慢，至少需要5天才會在培養(yǎng)基中看見直徑小于1毫米的圓形菌落。排硫硫桿菌在這一類培養(yǎng)基中與游離硫形成粘膜，長時間靜置，代謝產(chǎn)生的硫會在培養(yǎng)基中形成白色或淡黃色沉淀。這類由NH₄Cl、Fe²⁺等構成的培養(yǎng)基有較強鹽腐蝕性，即增加蛋白質分子表面電荷，增強蛋白質分子和水分子的作用，使蛋白質在水中溶解度增大。對排硫硫桿菌的細胞膜和細胞壁產(chǎn)生蛋白質鹽溶現(xiàn)象。在菌體培養(yǎng)過程中，一部分排硫硫桿菌因為蛋白質鹽溶而造成細胞壁破裂而死亡。最終導致菌體培養(yǎng)周期長，活菌數(shù)低等現(xiàn)象。

隨著利用微生物代謝機制凈化含硫化物的廢氣、廢水研究在學術圈逐漸展開，排硫硫桿菌培養(yǎng)周期長、活菌數(shù)低等問題使得該菌難以適應工業(yè)化的效率高、周期短、成本低的特性。如何避免排硫硫桿菌在含硫溶液中發(fā)生鹽溶現(xiàn)象，提高活菌數(shù)和菌體活力成為將微生物應用到工業(yè)的技術關鍵。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種排硫硫桿菌，本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述排硫硫桿菌進行高活性培養(yǎng)的方法。

本發(fā)明的技術方案為：一種硫桿菌，其分類名為排硫硫桿菌，菌種的拉丁學名為Thiobacillus thioparus，保藏日期是2016年7月11日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC No.12756。

本發(fā)明還提供了一種利用上述的硫桿菌進行高活性培養(yǎng)的方法，其具體步驟如下：將自養(yǎng)培養(yǎng)基和保護劑于容器中配制混合培養(yǎng)基，混合培養(yǎng)基的裝液量為容器體積容量的10％～20％；對培養(yǎng)基滅菌；按混合培養(yǎng)基體積比的2～5％接種排硫桿菌；控制溫度28～30℃，搖床轉速為160～180rpm/min，培養(yǎng)48h～72h，可清楚看見白黃色菌落。

優(yōu)選混合培養(yǎng)基中自養(yǎng)培養(yǎng)基組分為：Na₂S₂O₃ 9～10g/L、KH₂PO₄3～5g/L、K₂HPO₄4～5g/L、MgSO₄.7H₂O 0.7～0.9g/L、NH₄Cl 0.4～0.6g/L、乙二酸四乙酸二鈉0.5～0.6g/L、ZnSO₄.7H₂O 0.22～0.32g/L、CaCl₂0.05～0.08g/L、MnCl₂.4H₂O0.05～0.08g/L、FeSO₄.7H₂O 0.05～0.08g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.01～0.03g/L、CuSO₄.5H₂O 0.01～0.03g/L和CoCl₂.6H₂O 0.01～0.03g/L。

優(yōu)選混合培養(yǎng)基中保護劑的組分及各組分占自養(yǎng)培養(yǎng)基的質量百分比分別為：2～4％海藻糖，0.1～0.3％聚乙二醇4000(PEG)，0.3～0.5％蔗糖，0.2～0.4％NaCl。

優(yōu)選混合培養(yǎng)基的pH值為6.5～7.0。

對培養(yǎng)基滅菌，一般采用高壓蒸汽滅菌，其中Na₂S₂O₃和保護劑不可采用高溫滅菌法，可采用膜過濾或紫外滅菌法。

CGMCC No.12756菌株具有以下性質：

1、培養(yǎng)特征：

在固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，呈白色或淡黃色、微透明小圓點狀，有光澤，邊緣光滑整齊。

2、菌體形態(tài)特征：

在固體LB培養(yǎng)基上呈白色或淡黃色球形或橢圓型，直徑0.5～1.7微米，單細胞外通常有一層莢膜。以極生鞭毛運動。

3、生理生化性質：

表1 CGMCC No.12756菌株生理生化性質

+：為可利用；-：為不可利用。

有益效果：

本發(fā)明主要貢獻在于抗鹽溶菌體保護劑的研發(fā)。保護劑能夠在細菌外表面形成一層保護膜，在不影響離子通道的同時降低菌體內外滲透壓差，保護菌體免受鹽溶侵蝕，從而提高單位體積內活菌數(shù)。解決了細菌在高含鹽環(huán)境中細胞壁因蛋白質鹽溶而造成的破裂及失活現(xiàn)象。本發(fā)明具有操作簡單、成本低廉、效果明顯等特點。

保藏信息

上述硫桿菌其分類名為排硫硫桿菌，菌種的拉丁學名為Thiobacillus thioparus，參據(jù)的微生物(株)為：NJYH5327，該菌株是本課題組自主篩選并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，其簡稱為CGMCC，保藏日期是2016年7月11日，登記入冊的編號是CGMCC No.12756。

具體實施方式

以下結合實例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步描述。實例中所用脫硫桿菌為實驗室自主篩選獲得。

實例1

按上訴排硫硫桿菌培養(yǎng)基成分分別配制A₁、B₁兩個培養(yǎng)基，A₁：Na₂S₂O₃ 9g/L、KH₂PO₄3g/L、K₂HPO₄4g/L、MgSO₄.7H₂O 0.7g/L、NH₄Cl 0.4g/L、乙二酸四乙酸二鈉0.5g/L、ZnSO₄.7H₂O 0.22g/L、CaCl₂0.05g/L、MnCl₂.4H₂O 0.05～g/L、FeSO₄.7H₂O 0.05g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.01g/L、CuSO₄.5H₂O 0.01g/L、CoCl₂.6H₂O0.01g/L，pH6.8；B₁含有本發(fā)明的菌體保護劑，其中自養(yǎng)培養(yǎng)基組分為：Na₂S₂O₃9g/L、KH₂PO₄3g/L、K₂HPO₄4g/L、MgSO₄.7H₂O 0.7g/L、NH₄Cl 0.4g/L、乙二酸四乙酸二鈉0.5g/L、ZnSO₄.7H₂O 0.22g/L、CaCl₂0.05g/L、MnCl₂.4H₂O 0.05～g/L、FeSO₄.7H₂O 0.05g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.01g/L、CuSO₄.5H₂O 0.01g/L、CoCl₂.6H₂O0.01g/L；再加入占上述自養(yǎng)培養(yǎng)基質量百分比為：2wt％海藻糖+0.1wt％聚乙二醇4000(PEG)+0.3wt％蔗糖+0.2wt％NaCl；得混合培養(yǎng)基，其pH6.8。將排硫硫桿菌按培養(yǎng)基容積的2％分別接種于A₁、B₁兩個培養(yǎng)基，搖床轉速160rpm/min，溫度28℃條件下培養(yǎng)48h。將A₁、B₁兩個培養(yǎng)基所培養(yǎng)菌液分別吸取1ml,稀釋100倍后吸取100μl菌懸液涂布于直徑為9cm的無菌空白培養(yǎng)基A₁、B₁上，在最適條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天計算菌落數(shù)從而計算活菌數(shù)。硫離子含量采用國家環(huán)境保護總局標準，《水質硫化物的測定碘量法HJ/T60—2000》。

沒有添加本發(fā)明的培養(yǎng)基A₁活菌數(shù)為3.754×10⁹cfu/ml，添加有本發(fā)明的培養(yǎng)基B₁活菌數(shù)為5.920×10⁹cfu/ml，培養(yǎng)條件B₁較培養(yǎng)條件A₁活菌數(shù)提高了157.69％。對培養(yǎng)前后硫化物含量檢測表明，相同體積的菌液，培養(yǎng)條件B₁較培養(yǎng)條件A₁對硫化物代謝能力提高19.4％。

實例2

分別配制A₂、B₂兩個培養(yǎng)基，A₂：Na₂S₂O₃ 10g/L、KH₂PO₄4g/L、K₂HPO₄5g/L、MgSO₄.7H₂O 0.8g/L、NH₄Cl 0.5g/L、乙二酸四乙酸二鈉0.6g/L、ZnSO₄.7H₂O0.32g/L、CaCl₂0.07g/L、MnCl₂.4H₂O 0.06g/L、FeSO₄.7H₂O 0.06g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.02g/L、CuSO₄.5H₂O 0.02g/L、CoCl₂.6H₂O 0.02g/L，pH6.9，B₂含有本發(fā)明的菌體保護劑，其中自養(yǎng)培養(yǎng)基組分為：Na₂S₂O₃10g/L、KH₂PO₄4g/L、K₂HPO₄5g/L、MgSO₄.7H₂O 0.8g/L、NH₄Cl 0.5g/L、乙二酸四乙酸二鈉0.6g/L、ZnSO₄.7H₂O 0.32g/L、CaCl₂0.07g/L、MnCl₂.4H₂O 0.06g/L、FeSO₄.7H₂O 0.06g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.02g/L、CuSO₄.5H₂O 0.02g/L、CoCl₂.6H₂O 0.02g/L；再加入占上述自養(yǎng)培養(yǎng)基質量百分比為3wt％海藻糖+0.2wt％聚乙二醇4000(PEG)+0.4wt％蔗糖+0.3wt％NaCl；得混合培養(yǎng)基，其pH6.9。將排硫硫桿菌按培養(yǎng)基容積的3％分別接種于A₂、B₂兩個培養(yǎng)基，搖床轉速為170rpm/min,溫度29℃條件下培養(yǎng)60h。將A₂、B₂兩個培養(yǎng)基所培養(yǎng)菌液分別吸取1ml,稀釋100倍后吸取100μl菌懸液涂布于直徑為9cm的無菌空白培養(yǎng)基A₂、B₂上，在最適條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天計算菌落數(shù)從而計算活菌數(shù)。硫離子含量采用國家環(huán)境保護總局標準，《水質硫化物的測定碘量法HJ/T60—2000》。

沒有添加本發(fā)明的培養(yǎng)基A₂活菌數(shù)為3.533×10⁹cfu/ml，添加有本發(fā)明的培養(yǎng)基B₂活菌數(shù)為7.458×10⁹cfu/ml，培養(yǎng)條件B₂較培養(yǎng)條件A₂活菌數(shù)提高了211.09％。對培養(yǎng)前后硫化物含量檢測表明，相同體積的菌液，培養(yǎng)條件B₂較培養(yǎng)條件A₂對硫化物代謝能力提高32.8％。

實例3

分別配制A₃、B₃兩個培養(yǎng)基，A₃：Na₂S₂O₃ 10g/L、KH₂PO₄5g/L、K₂HPO₄5g/L、MgSO₄.7H₂O 0.9g/L、NH₄Cl 0.6g/L、乙二酸四乙酸二鈉0.6g/L、ZnSO₄.7H₂O0.32g/L、CaCl₂0.08g/L、MnCl₂.4H₂O 0.08g/L、FeSO₄.7H₂O 0.08g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.03g/L、CuSO₄.5H₂O 0.03g/L、CoCl₂.6H₂O 0.03g/L，pH7.0，B₃含有本發(fā)明的菌體保護劑，其中自養(yǎng)培養(yǎng)基組分為：Na₂S₂O₃10g/L、KH₂PO₄5g/L、K₂HPO₄5g/L、MgSO₄.7H₂O 0.9g/L、NH₄Cl 0.6g/L、乙二酸四乙酸二鈉0.6g/L、ZnSO₄.7H₂O 0.32g/L、CaCl₂0.08g/L、MnCl₂.4H₂O 0.08g/L、FeSO₄.7H₂O 0.08g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.03g/L、CuSO₄.5H₂O 0.03g/L、CoCl₂.6H₂O 0.03g/L；再加入占上述自養(yǎng)培養(yǎng)基質量百分比為：4wt％海藻糖+0.3wt％聚乙二醇4000(PEG)+0.5wt％蔗糖+0.4wt％NaCl；得混合培養(yǎng)基，其pH7.0。將排硫硫桿菌按5％分別接種于A₃、B₃兩個培養(yǎng)基，搖床轉速180rpm/min，溫度30℃條件下培養(yǎng)72h。將A₃、B₃兩個培養(yǎng)基所培養(yǎng)菌液分別吸取1ml,稀釋100倍后吸取100μl菌懸液涂布于直徑為9cm的無菌空白培養(yǎng)基A₃、B₃上，在最適條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天計算菌落數(shù)從而計算活菌數(shù)。硫離子含量采用國家環(huán)境保護總局標準，《水質硫化物的測定碘量法HJ/T60—2000》。

沒有添加本發(fā)明的培養(yǎng)基A₃活菌數(shù)為3.607×10⁹cfu/ml，添加有本發(fā)明的培養(yǎng)基B₃活菌數(shù)為6.273×10⁹cfu/ml，培養(yǎng)條件B₃較培養(yǎng)條件A₃活菌數(shù)提高了177.55％。對培養(yǎng)前后硫化物含量檢測表明，相同體積的菌液，培養(yǎng)條件B₃較培養(yǎng)條件A₃對硫化物代謝能力提高24.8％。

最終結果表明，該排硫硫桿菌培養(yǎng)方法具有明顯可行性，該發(fā)明具有操作簡單、成本低廉、效果明顯等特點。