一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素a和染料木素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從降香檀葉中提取、分離和純化鷹嘴豆芽素A與染料木素的方法，所采取的技術(shù)方案是：以降香檀葉為原料，采用勻漿破碎酶誘導(dǎo)技術(shù)、溶劑提取技術(shù)、空化振蕩分散技術(shù)、大孔吸附樹(shù)脂富集技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析分離技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等得到鷹嘴豆芽素A和染料木素單體，純度均可達(dá)95%以上。由于降香檀葉資源豐富，而且本發(fā)明提取過(guò)程簡(jiǎn)單，分離成本低廉，而且省時(shí)省力，可以進(jìn)行工業(yè)上的大量生產(chǎn)，具有很高的醫(yī)學(xué)價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
【專利說(shuō)明】一種從降香擅葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從降香檀葉中提取、分離和純化中草藥活性成分鷹嘴豆芽素A、染料木素的方法，屬于天然藥物的分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]降香檀(Dalbergia odorifera T.Chen)又名花梨木，屬于豆科黃檀屬植物。作為藥用活性的部位是其樹(shù)干和根部的干燥心材，有行氣活血，止痛止血的功效，多應(yīng)用于脘腹疼痛，肝郁脅痛，跌打損傷，外傷出血，有抗炎，抗凝作用，降香檀還可以與其他活血化瘀藥配伍用于心血管疾病的治療。目前對(duì)于降香檀這種木本植物的種植比較廣泛，而有關(guān)降香檀的研究和利用主要集中在降香檀的心材，對(duì)降香檀葉這種可持續(xù)利用的資源研究較少。本發(fā)明通過(guò)對(duì)降香檀葉的研究發(fā)現(xiàn)，降香檀葉中也含有豐富的藥用活性成分，其中鷹嘴豆芽素A和染料木素的含量非常豐富，因此選用可再生降香檀葉作為原料提取鷹嘴豆芽素A和染料木素既不會(huì)影響植物整體的生長(zhǎng)發(fā)育，又使降香檀得到了有效利用
[0003]鷹嘴豆芽素A和染料木素是異黃酮類化合物，同時(shí)也是植物雌激素類化合物。在體內(nèi)代謝中，能發(fā)揮雌激素樣作用，幾乎分布到人體每個(gè)細(xì)胞中發(fā)揮作用，這是人體自身激素所達(dá)不到的；它們具有雙向的調(diào)節(jié)作用，當(dāng)人體雌激素水平高時(shí)，可抑制激素分泌，反之，當(dāng)人體雌激素水平低時(shí)，它們能提供額外的雌激素樣作用。臨床上鷹嘴豆芽素A和染料木素既被用來(lái)治療婦女體內(nèi)雌激素水平升高時(shí)的經(jīng)前期綜合癥，又被用于治療雌激素降低時(shí)的更年期綜合癥和絕經(jīng)。另外，也能治療由雌激素代謝紊亂引起的骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、老年癡呆、雌激素 依賴性腫瘤(如子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等)。此外，鷹嘴豆芽素A和染料木素還具有抗氧化、抗真菌和抗HIV病毒的作用。
[0004]鷹嘴豆芽素A和染料木素作為異黃酮類成分是一類很好的藥理活性成分，在醫(yī)藥領(lǐng)域中有良好的發(fā)展前景。目前，雖然對(duì)于染料木素的提取純化有一些研究，但是有關(guān)鷹嘴豆芽素A提取、分離和純化方面的研究很少，以往對(duì)于鷹嘴豆芽素A的提純是先用傳統(tǒng)的醇提，再進(jìn)行反復(fù)柱層析分離來(lái)獲得的。傳統(tǒng)的醇提方法耗時(shí)長(zhǎng)，提取過(guò)程繁瑣，提取不完全以及目標(biāo)化合物損失較多的缺點(diǎn)。采用柱層析分離時(shí)通常都需要經(jīng)過(guò)多次層析，才能獲得目標(biāo)化合物，分離過(guò)程漫長(zhǎng)，多次層析更增加了有機(jī)溶劑的使用量，使得提純工藝不經(jīng)濟(jì)，大大增加了有毒物質(zhì)的排放。在原料來(lái)源方面，傳統(tǒng)的工藝大多都是從豆科草本植物(如紅車軸草、鷹嘴豆)中提取純化鷹嘴豆芽素A，由于分離條件，提純工藝，原料采摘和含量等因素的限制，對(duì)于鷹嘴豆芽素A的分離難度較大，分離成本也較高。
[0005]本發(fā)明旨在找到一種理想的生產(chǎn)原料并建立一種通過(guò)多種現(xiàn)代生物誘導(dǎo)技術(shù)和分離純化技術(shù)相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快速、綠色環(huán)保、收率高的提取、分離純化鷹嘴豆芽素和染料木素的方法，這為鷹嘴豆芽素A和染料木素在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用可以提供更廣闊的發(fā)展前景。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種以新鮮或干燥的降香檀葉為原料，通過(guò)勻漿破碎酶誘導(dǎo)技術(shù)、溶劑提取技術(shù)、空化振蕩分散技術(shù)、大孔吸附樹(shù)脂富集技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析分離技術(shù)及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)快速、大量地獲得鷹嘴豆芽素A和染料木素單體，該方法簡(jiǎn)單易行、目標(biāo)化合物損失少。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0007]新鮮或干燥降香檀葉經(jīng)過(guò)勻漿機(jī)械破碎、酶誘導(dǎo)水解，后經(jīng)70~95%乙醇溶劑提取，提取物加入40~50°C水，再空化振蕩分散提取物，靜止，所得到的分散物經(jīng)大孔樹(shù)脂法富集和一次正相硅膠中壓柱層析后得到鷹嘴豆芽素A和染料木素的粗品，純度大于80%，經(jīng)過(guò)低溫析晶和重結(jié)晶后得到純度大于95%的純品。
[0008]上述的鷹嘴豆芽素A和染料木素提取純化方法，其特征在于:
[0009](I)取一定量的新鮮或干燥的降香檀葉加入水勻漿，按固形物重量的0.2~1.5%加入復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、葡萄糖苷酶)，勻漿破碎酶誘導(dǎo)5~lOmin，抽濾，所得固形物使用70~95%乙醇超聲波輔助提取3~5次，每次40~60min，然后將酶解液及乙醇提取液合并減壓濃縮后回收乙醇。
[0010](2)將所得到的提取物加入4~8倍體積的40~50°C水，空化振蕩分散40~60min,靜止 15 ~20min。
[0011](3)將得到的分散物用進(jìn)行液液萃取，萃取所用的溶劑體積為體系的1/2，萃取次數(shù)為2~5次，所用溶劑除乙酸乙酯外還包括三氯甲烷、二氯甲烷，濃縮萃取液至干。將得到的固形物以水混懸，配置成料液濃度為10~25mg/mL混懸藥液，同時(shí)將大孔吸附樹(shù)脂采用濕法裝柱，保留液面，將混懸的藥液通過(guò)吸附柱，上樣量1.0~3.0BV,以流速為每小時(shí)6~9mL/g樹(shù)脂條件下過(guò)吸附柱。吸附后用30~50%乙醇2BV洗雜質(zhì)，然后分別用50~60%和70~90%的乙醇8~IOBV解吸附。收集解吸液，濃縮至干得到目標(biāo)化合物粗品。
[0012](4)預(yù)先稱取質(zhì)量為化合物粗品質(zhì)量的15~25倍的硅膠，采用濕法裝柱。將所得固形物用少量有機(jī)溶劑溶解，加入與目標(biāo)化合物粗品質(zhì)量比為1:1 (w/W)的層析硅膠拌勻、減壓旋干，裝入正相硅膠中壓柱。所用流動(dòng)相為正己烷或石油醚與二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一種按照體積比30:1~O:1的混合體系，以10~20BV的流速進(jìn)行連續(xù)中壓梯度洗脫，收集洗脫液。TLC監(jiān)測(cè)收集流分，合并相同部分，展開(kāi)劑為正己烷:乙酸乙酯=5:1~1:1，紫外波長(zhǎng)為254nm和365nm。分別得到鷹嘴豆芽素A和染料木素溶液，低溫析晶得到粗品，重結(jié)晶后得到純品。
[0013]上述的降香檀葉片中鷹嘴豆芽素A和染料木素的提取純化方法所用的大孔吸附樹(shù)脂為 ME-2、HPD-500、ADS-5、H103、HP-20、YWD-01、DA201 或 S8 型等。
[0014]上述的降香檀葉中鷹嘴豆芽素A和染料木素的提取純化方法所用硅膠為300~800目。中壓硅膠柱流動(dòng)相包括(正己烷、石油醚)~(二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮)的不同比例梯度。
[0015]重結(jié)晶所用的溶劑為石油醚、正己烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯，重結(jié)晶所用溶劑比例為石油醚或正己烷:乙酸乙酯、三氯甲烷或丙酮=20:1~1:1。低溫析晶溫度為-10~
4。。。
[0016]利用本發(fā)明的方法提取、分離和純化鷹嘴豆芽素A和染料木素的純度勻可達(dá)到95%以上，并且該方法首次被應(yīng)用到降香葉中鷹嘴豆芽素A的提取、分離和純化方面。[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0018]1.本發(fā)明以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或家具生產(chǎn)中大都被廢棄的新鮮或者干燥的降香檀葉片為提取原料，可以在不破壞植物生態(tài)平衡、不影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)植物資源進(jìn)行高效合理的利用。
[0019]2.采用大量先進(jìn)的技術(shù)(例如:勻漿破碎酶誘導(dǎo)技術(shù)、溶劑提取技術(shù)、空化振蕩分散技術(shù)、大孔吸附樹(shù)脂富集技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析分離技術(shù)及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù))來(lái)提取分離和純化降香檀葉中的鷹嘴豆芽素A和染料木素，所得產(chǎn)品得率高、純度高。
[0020]3.該方法提取過(guò)程簡(jiǎn)單易行，分離成本低廉，所用試劑毒性低、用量少，既省時(shí)又有利于環(huán)境保護(hù)且原料來(lái)源豐富，可實(shí)現(xiàn)鷹嘴豆芽素A和染料木素的廣泛生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)例I降香檀葉中鷹嘴豆芽素A和染料木素的提取，分離和純化實(shí)驗(yàn)
[0022]取1000g干燥的降香檀葉加入水，取0.2%固形物重量的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、葡萄糖苷酶)激活后的復(fù)合酶溶液加入勻漿誘導(dǎo)漿液中，連續(xù)勻漿破碎酶誘導(dǎo)8min。經(jīng)過(guò)勻漿破碎誘導(dǎo)和酶解后抽濾，所得固形物使用70%乙醇超聲波輔助提取5次，每次60min，然后將酶解液及乙醇提取液合并減壓濃縮后加入3L的40°C水中，空化振蕩分散40min，靜止20min，將得到的分散物用6.5L乙酸乙酯進(jìn)行萃取3次，萃取液減壓濃縮蒸干，得到的固形物以水混懸，配置成料液濃度為15mg/mL混懸藥液，同時(shí)將ADS-5大孔吸附樹(shù)脂采用濕法裝柱，保留液面，將混懸的藥液通過(guò)吸附柱，上樣量1BV，以流速為每小時(shí)6mL/g樹(shù)脂條件下過(guò)吸附柱。吸附后用30%乙醇2BV洗雜質(zhì)，然后用60%和90%乙醇8BV解吸。分別收集解吸液，濃縮至干后用少 量溶劑溶解，加入與浸骨質(zhì)量比為1:1 (w/w)的目數(shù)為500~800的層析硅膠拌勻、40°C減壓蒸干。預(yù)先稱取質(zhì)量為提取物質(zhì)量的15倍的硅膠，采用正己烷濕法裝柱。先后以20BV正己烷:乙酸乙酯(30:1)~乙酸乙酯連續(xù)中壓洗脫，收集洗脫液。TLC監(jiān)測(cè)收集流分，合并相同部分，紫外波長(zhǎng)為254nm和365nm。分別得到鷹嘴豆芽素A和染料木素的溶液，低溫析晶得到粗品，重結(jié)晶后分別得到純品鷹嘴豆芽素A 108.74±1.24mg和染料木素 48.21 ± 1.17mg，純度均達(dá)到 95%±0.47%, 95%±0.82%。
[0023]實(shí)例2降香檀葉中鷹嘴豆芽素A和染料木素的提取，分離和純化實(shí)驗(yàn)
[0024]取3.56kg新鮮的降香檀葉(干重為1kg)，取1.5%固形物重量的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、葡萄糖苷酶)激活后的復(fù)合酶溶液加入勻漿誘導(dǎo)漿液中，連續(xù)勻漿破碎酶誘導(dǎo)IOmin0經(jīng)過(guò)勻漿破碎誘導(dǎo)和酶解后抽濾，所得固形物使用95%乙醇超聲波輔助提取5次，每次60min，然后將酶解液及乙醇提取液合并減壓濃縮后，加入40°C水進(jìn)行空化振蕩分散30min,靜止15min，將得到的分散物用乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮蒸干，得到的固形物以水混懸，配置成料液濃度為25mg/mL混懸藥液，同時(shí)將ME-2大孔吸附樹(shù)脂采用濕法裝柱，保留液面，將混懸的藥液通過(guò)吸附柱，上樣量3.0BV,以流速為每小時(shí)8mL/g樹(shù)脂過(guò)吸附柱。吸附后用30%乙醇2BV洗雜質(zhì)，然后用70%乙醇IOBV解吸。收集解吸液，濃縮至干得到固形物。預(yù)先稱取質(zhì)量為提取物質(zhì)量的25倍的硅膠，采用正己烷濕法裝柱。將所得固形物用少量有機(jī)溶劑溶解，加入與浸膏質(zhì)量比為1:1 (w/w)的層析硅膠拌勻、減壓旋干，裝入正相硅膠中壓柱。先后以20BV正己烷:乙酸乙酯(30:1)~乙酸乙酯連續(xù)中壓洗脫，收集洗脫液。TLC監(jiān)測(cè)收集流分，合并相同部分，紫外波長(zhǎng)為254nm和365nm。分別得到鷹嘴豆芽素A和染料木素的溶液，低溫析晶得到粗品，重結(jié)晶后分別得到純品鷹嘴豆芽素A117.43 ± 1.47mg 和染料木素 53.49 ± 1.23mg,純度均達(dá)到 96%±0.32%, 95%± 1.02%。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1鷹嘴豆芽素A的分子結(jié)構(gòu)式
[0026]圖2染料木素的分子結(jié)構(gòu)式
[0027]圖3降香檀葉中鷹嘴豆芽素A和染料木素的提取、分離和純化流程圖。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明涉及一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其步驟如下:降香檀葉經(jīng)勻漿破碎酶誘導(dǎo)后，將酶解液抽濾，所得固形物用乙醇提取，合并酶解液及乙醇提取液，濃縮后加入40~50°C水，空化振蕩分散、靜止，所得到的分散物經(jīng)液液萃取、大孔吸附樹(shù)脂富集和一次正相硅膠中壓柱層析分離后分別得到鷹嘴豆芽素A和染料木素粗品，再經(jīng)過(guò)低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)得到純度95%以上的鷹嘴豆芽素A和染料木素單體，最后通過(guò)MTT法測(cè)定鷹嘴豆芽素A和染料木素的抗腫瘤細(xì)胞活性。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其特征在于:所述的勻漿破碎酶誘導(dǎo)所用的酶為纖維素酶、果膠酶或葡萄糖苷酶中的任意兩種或三種以等質(zhì)量比混合所組成的復(fù)合酶，復(fù)合酶用量為材料質(zhì)量的0.2~1.5%，酶誘導(dǎo)溶劑為40~50°C的溫水，溶劑用量為5~IOml/g材料，誘導(dǎo)時(shí)間為5~IOmin。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其特征在于:所述的乙醇提取所用的溶劑為70~95%的乙醇，提取所用的溶劑體積為固體質(zhì)量的8~15倍，提取方法包括超聲波輔助提取、浸泡提取、負(fù)壓空化提取和微波輔助提取。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其特征在于:所述的空化振蕩分散是在提取物濃縮物中加入40~50°C水的體積為濃縮物的4~8倍，空化振蕩時(shí)間為40~60min，靜止時(shí)間為15~20mino
5.按照權(quán)利要求1所述的一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其特征在于:所述的液液萃取所用溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，萃取所用溶劑體積為體系的1/2，萃取次數(shù)為2~5次，回收有機(jī)溶劑所得固形物為目標(biāo)物。`
6.按照權(quán)利要求1所述的一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其特征在于:所述的大孔吸附樹(shù)脂富集所用的樹(shù)脂為ME-2、HPD-500、ADS-5、H103、HP-20、YffD-O 1、DA201或S8，大孔吸附樹(shù)脂采用濕法裝柱，保留液面，將萃取所得到的固形物用水配制成料液濃度為10~25mgmL混懸液，上樣量1.0~3.0BV,以流速為每小時(shí)6~9mL/g樹(shù)脂條件下過(guò)吸附柱，吸附后用20~40%乙醇2BV洗雜質(zhì)，然后分別用50~60%和70~90%的乙醇8~IOBV解吸，分別收集解吸液，濃縮至干，所得固形物為目標(biāo)化合物粗品。
7.按照權(quán)利要求1所述的一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其特征在于:所述的正相硅膠中壓柱層析所用樣品為樹(shù)脂富集后所得的目標(biāo)化合物粗品，所用硅膠為300~800目的正相硅膠，所用硅膠量為樣品質(zhì)量的15~25倍，所用流動(dòng)相為正己烷或石油醚與二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一種按照體積比30:1~O:1混合體系，采用濕法裝柱；將樣品用少量有機(jī)溶劑溶解，加入與浸膏質(zhì)量比為1:1 (w/w)的層析硅膠拌勻、減壓蒸干，加在預(yù)先裝好的硅膠柱中，以10~20BV的流速進(jìn)行連續(xù)中壓梯度洗脫，收集洗脫液；用硅膠薄層層析檢測(cè)洗脫成分，合并相同部分，展開(kāi)劑為正己烷:乙酸乙酯=5:1~1:1，紫外波長(zhǎng)為254nm。
8.按照權(quán)利要求1所述的一種從降香檀葉中提取、分離和純化異黃酮活性成分鷹嘴豆芽素A和染料木素的方法，其特征在于:所述的重結(jié)晶所用的溶劑為石油醚、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷和丙酮，所用溶劑比例為石油醚或正己烷:乙酸乙酯、三氯甲烷或丙酮=20:1~1山低溫析晶的溫度條件為-10~4°C。
【文檔編號(hào)】C07D311/40GK103773820SQ201210403109
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月22日
【發(fā)明者】付玉杰, 王微, 馬飛躍, 羅猛, 顧成波, 李吉, 魏作富 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 付玉杰