專利名稱：采用絮凝法提取分離發(fā)酵液中吩嗪-1-羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥提取分離技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，該發(fā)明涉及一種利用吩嗪-I-羧酸(PCA)堿溶酸沉的特性，以及大分子絮凝劑能夠與大分子有機(jī)物結(jié)合的性質(zhì)，采用絮凝法去除雜質(zhì)從而提取分離目標(biāo)物的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的農(nóng)藥殘留問題已引起人們越來越多的關(guān)注。到目前為止，世界上化學(xué)農(nóng)藥年產(chǎn)量近200萬噸，約有1000多種人工合成化合物被用作農(nóng)藥噴灑到田間，而這些化學(xué)農(nóng)藥殘留在土壤中后通過植物的根系進(jìn)入植物體內(nèi)，由于很難降解，農(nóng)藥進(jìn)入糧食、蔬菜、水果、魚蝦蛋奶等食品中，造成嚴(yán)重的農(nóng)藥污染問題，成為對(duì)人體健康的嚴(yán)重威脅。近年 來，很多來源于微生物代謝產(chǎn)物的殺菌劑應(yīng)運(yùn)而生，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的疾病防治中發(fā)揮著越來越重要的作用。吩嗪類抗生素是近年來研究的熱點(diǎn)。PCA是一種具有廣譜抗真菌作用的微生物源抗生素，它從作物根際土壤的自生細(xì)菌中分離而成，可以抑制很多種能引起植物根腐、莖腐等病害的真菌病原體對(duì)農(nóng)作物的破壞；田間試驗(yàn)表明，其對(duì)小麥根腐病、水稻紋枯病和棉花枯黃萎病具有很強(qiáng)的防治效果。與化學(xué)農(nóng)藥相比，PCA具有對(duì)動(dòng)物毒性低、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、殘留時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。PCA的廣譜抗菌性和安全環(huán)保性使得近年來國內(nèi)外科學(xué)家投入大量精力進(jìn)行研究，目前在吩嗪產(chǎn)品領(lǐng)域的研究報(bào)道很多，也成功上市了一些藥劑，具有廣闊的市場前景和社會(huì)前景。PCA是一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，由假單胞菌(Pseudomonas)的很多亞種產(chǎn)生。它通過發(fā)酵可以產(chǎn)生兩種有效成分，一種是藤黃綠膿菌素，一種是吩嗪-I-羧酸(PCA)。由于前者含量較低，在實(shí)際生產(chǎn)中沒有應(yīng)用，常用的PCA分子式為C13H8N2O2，分子量為224。一般PCA是黃綠色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)24f242°C;溶于醇、醚、氯、仿、苯，微溶于水；在偏酸性及中性條件下穩(wěn)定。其主體結(jié)構(gòu)為吩嗪，側(cè)鏈連接有一個(gè)羧基，因此具有堿溶酸沉的特性。聚合氯化鋁絮凝劑在弱堿環(huán)境中具有很強(qiáng)的去除有機(jī)大分子的能力，通過改變膠體表面電荷，壓縮雙電層，使膠團(tuán)變性沉淀而過濾去除發(fā)酵液中的雜質(zhì)，然后在濾液中加酸使PCA沉淀析出，經(jīng)脫水干燥后，就完成了 PCA的提取分離。該工藝過程不涉及有機(jī)溶劑，安全環(huán)保，其提取成本也要比有機(jī)溶劑萃取法低得多。目前通過基因改良的方法，PCA的在發(fā)酵液中的產(chǎn)量可達(dá)到6000mg/L以上，然而很難有一種簡單有效的方法將其從發(fā)酵液中分離出來。發(fā)酵液成分復(fù)雜，多為菌絲體、蛋白質(zhì)和多糖等大分子有機(jī)物，這些物質(zhì)相互纏繞形成粘性很大的膠團(tuán)。因此在提取的過程中除大分子成為分離PCA的關(guān)鍵，目前的提取技術(shù)主要限制于實(shí)驗(yàn)室，如毛細(xì)管電泳法、高效液相分離法等，這些方法耗時(shí)費(fèi)力、成本較高且產(chǎn)量很小，不適用于工業(yè)生產(chǎn)。有些公司現(xiàn)用的提取技術(shù)是先將發(fā)酵液制成干粉，然后用氯仿或乙酸乙酯萃取蒸餾實(shí)現(xiàn)PCA的提取分離，其產(chǎn)品純度可達(dá)到80%以上，回收率達(dá)到85%，但是由于涉及有機(jī)溶劑，工業(yè)生產(chǎn)時(shí)存在很大的安全隱患，另外，其維護(hù)和運(yùn)行成本都很高，且產(chǎn)品含有一定量的有機(jī)溶劑，與安全環(huán)保的生物類農(nóng)藥理念相悖。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種簡單高效提取分離吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的方法。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。采用絮凝法提取分離發(fā)酵液中吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的方法，其中，使用聚合氯化鋁作為絮凝劑。所述的采用絮凝法提取分離發(fā)酵液中吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的方法，具體包括以下步驟
( I)發(fā)酵液初調(diào)pH值配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 5%的NaOH溶液，緩慢加入吩嗪_1_羧酸吩嗪_1_羧酸發(fā)酵液中，6(Tl00rpm攪拌，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至8. 0^8. 5 ；(2)高速分散將步驟(I)得到的發(fā)酵液加熱到溫度35 45°C，然后用400(T8000rpm的高速分散儀分散6(Tl20s ；(3)絮凝聚合氯化鋁絮凝劑配制成8 10%的水溶液，加入到步驟(2)得到的發(fā)酵液中，其中聚合氯化鋁添加量為發(fā)酵液質(zhì)量計(jì)的1.0 1.5%，緩慢倒入發(fā)酵液中，60 100印111攪拌
2、min,然后攪拌速度調(diào)至600rpm,5"l0min ;加入與聚合氯化招絮凝劑等質(zhì)量的娃藻土，攪拌均勻；(4)微調(diào) pH 值絮凝后的發(fā)酵液pH值下降，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 5%的NaOH溶液微調(diào)pH值至7. 8 8. 2 ；(5)過濾洗滌把步驟(4 )得到的混合液通過板框過濾進(jìn)行固液分離，初濾液進(jìn)行二次過濾，待濾餅形成，濾液澄清時(shí)，收集濾液；濾餅用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5^0. 8%氫氧化鈉溶液洗滌，洗滌水量為板框容積量的3飛倍，收集洗滌用堿液；(6)濾液酸沉合并步驟(5)得到的濾液和洗滌用堿液，緩慢加f3mol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至
3.(T4. 0，使吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸沉淀析出；(7)脫水采用板框過濾或離心的方式，將步驟(6)得到的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸懸濁液脫水，液相棄用，固相保留并用自來水清洗，洗滌水量為板框容積量的3飛倍；(8)干燥步驟(7)得到的物料再通過真空干燥裝置烘干至水分含量10%以下，得到吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸產(chǎn)品。根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸發(fā)酵液的干物質(zhì)含量為2. (T2. 5%，吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸在干物質(zhì)中所占比例為6. 0 6. 5%。所述步驟(2)中高速分散后發(fā)酵液體系均一，無分層現(xiàn)象。
所述步驟(3)中絮凝攪拌均勻后的發(fā)酵液平均顆粒度為30(T500 u m。所述步驟(3)中聚合氯化鋁為食品級(jí)，Al2O3有效含量為30%。所述步驟(5)中板框過濾介質(zhì)為30(T500目的滌綸濾布，板框進(jìn)料壓力0. 4 0. 6MPa。所述步驟(7)中板框過濾介質(zhì)為400飛00目的滌綸濾布，板框進(jìn)料壓力0. 4 0. 6MPa。所述步驟(8)中，真空干燥裝置的干燥溫度為6(T80°C，真空度為0. 01-0. 03MPa,干燥時(shí)間2-5h。根據(jù)以上所述的方法，得到的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸顏色為黃綠色，其中有效成分含量> 65%，吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸回收率> 90%。 本發(fā)明所述的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸發(fā)酵液發(fā)酵液可以是任意市售產(chǎn)品，或者按照現(xiàn)有技術(shù)和方法自制的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸發(fā)酵液。(此處一段落刪除)本發(fā)明的有益效果采用絮凝法去除有機(jī)大分子雜質(zhì)，利用目標(biāo)產(chǎn)物堿溶酸沉的性質(zhì)進(jìn)行吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的分離，顛覆了傳統(tǒng)方法中有機(jī)溶劑萃取精餾的概念。發(fā)酵液中膠體物質(zhì)通過無機(jī)高分子絮凝劑架橋、吸附、聯(lián)接作用形成絮凝體而產(chǎn)生沉淀，再通過固液分離得以去除，絕大部分(96. 8%)有機(jī)雜質(zhì)形成濾餅而90%以上的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸溶解在濾液中，收集濾液和洗滌液，加入鹽酸使其沉淀析出；采用過濾或離心的方式，將酸沉得到的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸懸濁液脫水，液相棄用，固相保留并用自來水清洗，通過真空干燥裝置烘干至水分含量10%以下，便得到所述的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸粗品。產(chǎn)品中吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸含量> 65%，回收率> 90%。提取成本較現(xiàn)有的提取技術(shù)有很大幅度的下降，而且簡便快捷、安全性高，為后續(xù)純化提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施方式
更詳細(xì)地描述本發(fā)明。(I)發(fā)酵液初調(diào)pH值配制一定濃度的NaOH溶液，緩慢加入到發(fā)酵液中，低速攪拌，將pH值調(diào)至8. 0 8. 5 ；本發(fā)明使用的原料發(fā)酵液為自制。熒光假單胞菌購自中國科學(xué)院微生物研究所；菌種培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸發(fā)酵使用PDA培養(yǎng)基，pH自然。發(fā)酵完成后干物質(zhì)在發(fā)酵液中所占比例為2. (T2. 5%，吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸量為干物質(zhì)量的6. 0^6. 5%。原料發(fā)酵液在低溫(4°C )保存，以防變質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸具有堿溶酸沉的性質(zhì)，常溫、pH值7. 75時(shí)其溶解度為90mg/ml，溫度升高后溶解度更大，同時(shí)考慮絮凝過濾后發(fā)酵液的雜質(zhì)去除率和吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的回收率，最佳pH值為8. (T8. 5。如果所述原料的pH值小于8. 0時(shí)，則會(huì)造成絮凝后PH值下降嚴(yán)重導(dǎo)致吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸酸沉析出，降低回收率；如果所述料液的PH值大于8. 5，則會(huì)造成蛋白等大分子在堿性環(huán)境中水解，導(dǎo)致不能充分絮凝去除雜質(zhì)，降低產(chǎn)品的純度。
(2)高速分散將步驟(I)得到的發(fā)酵液加熱到溫度35 45°C，然后用400(T8000rpm的高速分散儀分散6(Tl20s ；高速分散器可用于動(dòng)物、植物組織勻漿粉碎，細(xì)胞分散。高速分散機(jī)的工作原理是利用鋸齒狀圓形分散盤在容器內(nèi)高速分散完成固液分散、濕潤、解聚、穩(wěn)定的過程，是對(duì)多種混合液體、固體進(jìn)行攪拌分散、調(diào)和、溶解的高效設(shè)備。首先，它使?jié){液呈滾動(dòng)環(huán)狀流，產(chǎn)生強(qiáng)漩渦，漿液表面粒子呈螺旋狀下降到渦流底部，然后在分散盤湍流處形成湍流區(qū)，漿料及粒子受到強(qiáng)烈剪切和沖擊，區(qū)域外形成上下兩個(gè)束流，漿料得到充分循環(huán)及翻動(dòng)。加熱會(huì)使吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸在堿溶液中的溶解度提高，增加吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的回收率。在發(fā)酵過程中，菌絲體成簇生長，其代謝產(chǎn)物蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)圍繞其間，形成了具有很高粘性的膠團(tuán)，這樣，粘性膠團(tuán)與水溶液構(gòu)成了非均相體系。分散的作用 是使膠團(tuán)組織破碎，一方面，束狀菌絲體被打亂，溶脹性增加，發(fā)酵液的粘性下降，便于與絮凝劑反應(yīng)；另一方面，吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸在分散作用下充分溶出，增加了目標(biāo)物的回收率。(3)絮凝在步驟(2)得到的發(fā)酵液中加入以發(fā)酵液質(zhì)量計(jì)I. (Tl. 5%的聚合氯化鋁，絮凝劑預(yù)先配制成8 10%左右的水溶液,緩慢倒入發(fā)酵液中，6(Tl00rpm攪拌2 5min,然后攪拌速度調(diào)至600rpm, 5 10min ;加入與絮凝劑等量的娃藻土,攪拌均勻；本實(shí)驗(yàn)所用聚合氯化鋁絮凝劑由無錫博耐丹化工科技有限公司提供，食品級(jí)，Al2O3含量為30%。絮凝指使水或液體中懸浮微粒積聚變大，或形成絮團(tuán)，從而加快離子的聚沉，達(dá)到固液分離的目的。一方面，有機(jī)物成分極其復(fù)雜，且多為大分子物質(zhì)，形成膠體顆粒；另一方面，膠體物質(zhì)表面帶有負(fù)電荷，由于雙電層的存在，微粒呈擴(kuò)散型分布，穩(wěn)定地分散在體系中。由于絮凝劑所帶電荷的電負(fù)性與膠體物質(zhì)相反，膠體表面的正電荷被中和，物理吸附力超過排斥力，從而引發(fā)膠體物質(zhì)的凝聚。對(duì)于不易從水中分離的細(xì)小顆粒，可通過絮凝使它們變?yōu)橐子诜蛛x的絮體，從而從水中分離出來。(4)微調(diào) pH 值絮凝后的發(fā)酵液pH值會(huì)下降，用配制的NaOH溶液微調(diào)pH值至7. 8 8. 2，氫氧化鈉溶液濃度不宜過高，2^5%為宜；聚合氯化鋁絮凝劑表面帶正電荷，其溶液本身pH值為3. 5，加入到發(fā)酵液中后pH值會(huì)下降至7. 0左右，在此情況下，部分吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸會(huì)沉淀析出，包裹在絮體中，若此時(shí)過濾會(huì)影響吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的回收率。微調(diào)絮凝體混合液的pH值時(shí)，所配NaOH溶液的濃度不能過高，一般2 5%為宜。膠體的穩(wěn)定性與膠體表面電荷有密切關(guān)系，根據(jù)DLVO理論，正的合能會(huì)造成顆粒間相互排斥，而負(fù)的合能則造成顆粒相互吸引，導(dǎo)致體系不穩(wěn)定。原料發(fā)酵液中加入絮凝劑正是克服了能壘而使膠體顆粒與絮凝劑架橋吸引，形成絮體而去除；如果此時(shí)加入濃度過大的NaOH溶液會(huì)使絮體局部堿度過高，造成絮凝劑與膠體顆粒已形成的架橋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而斷開，降低產(chǎn)品的純度。
(5)過濾洗滌把步驟(4)得到的混合液通過板框壓濾機(jī)進(jìn)行固液分離，初濾液進(jìn)行二次過濾，待濾餅形成，濾液澄清時(shí)，收集濾液；過濾結(jié)束后，用0. 5^0. 8%的NaOH溶液洗滌濾餅，洗水量為板框容積量的3飛倍。板框壓濾是利用輸送泵的機(jī)械動(dòng)力在管道和過濾機(jī)的腔室內(nèi)形成高壓，濾布將固體物質(zhì)阻攔而液體可通過的方式達(dá)到固液分離的目的。絮體混合液在濾布表面形成濾餅層，濾液穿過濾布并沿濾板溝槽流至板框邊角通道，集中排出。本發(fā)明中板框過濾濾布材質(zhì)要求為滌綸，300^500目，板框進(jìn)料壓力0. 6MPa。過濾完成后，還有10%左右的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸殘留在濾餅中，此時(shí)須用0. 5 0. 8%的NaOH溶液洗滌，洗水量為板框容積量的3 5倍。(6)濾液酸沉 收集步驟(5)得到的堿液，緩慢加入f 3mol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至3. 0^4. 0，使吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸沉淀析出；吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸具有堿溶酸沉的性質(zhì)，pH值3. 5時(shí)其溶解度只有50 u g/ml，而pH值2. 5時(shí)其溶解度為48 ii g/ml ;當(dāng)溶液過酸(H+濃度> 4mol/L)時(shí)吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸能夠重新溶解，證明這種物質(zhì)能溶于強(qiáng)酸。本發(fā)明使用2mol/L的鹽酸溶液，調(diào)酸時(shí)攪拌，避免局部過酸吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(7)脫水采用過濾或離心的方式，將步驟(6)得到的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸懸濁液脫水，液相棄用，固相保留并用自來水清洗，洗水量為板框容積量的3飛倍；所述的板框壓濾脫水是一種采用板框壓濾機(jī)脫水的方法，本發(fā)明使用的板框壓濾機(jī)是目前市場上銷售的各種板框壓濾機(jī)，例如杭州貝特過濾機(jī)有限公司商品名XAM1500-UBK型板框式壓濾機(jī)。由于懸濁液具有酸性且顆粒度較小,所用濾布為滌綸材質(zhì)，600 目。(8)真空干燥步驟(7)得到的物料再通過真空干燥裝置烘干至水分含量10%以下，得到所述的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸產(chǎn)品。真空干燥，又名解析干燥，是一種將物料置于負(fù)壓條件下，并適當(dāng)通過加熱達(dá)到負(fù)壓狀態(tài)下的沸點(diǎn)或，者通過降溫使得物料凝固后通過溶點(diǎn)來干燥物料的干燥方式。物料內(nèi)水分在負(fù)壓狀態(tài)下溶點(diǎn)沸點(diǎn)都隨著真空度的提高而降低，同時(shí)輔以真空泵間隙抽濕降低水汽含量，使得物料內(nèi)的水獲得足夠的動(dòng)能脫離物料表面。真空干燥由于處于低溫下使得在干燥過程容易高溫變質(zhì)的物料更好的保持原有的特性。發(fā)明所述的真空干燥箱設(shè)定干燥溫度為6(T80°C，真空度為0. 02MPa。在本發(fā)明中，吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸提取率的計(jì)算方法如下吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸提取率(％)=分離提取得到的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸/原料中純吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸X100%采用本發(fā)明的方法，吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸提取率可以達(dá)到90%以上，純度可以達(dá)到65% 70%，現(xiàn)有技術(shù)可以達(dá)到的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸提取純度是80%，雖然本發(fā)明的產(chǎn)品純度比現(xiàn)有技術(shù)稍低，但是本發(fā)明的提取成本比有機(jī)溶劑萃取法低的多(約為萃取法的1/4)，而且該方法直接用發(fā)酵液進(jìn)行分離，省去了制成干粉的繁瑣步驟；另外，本方法簡便快捷、不涉及有機(jī)溶劑、安全性大大提高。根據(jù)本發(fā)明方法分離得到的吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸可用于0. 1%和1%吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸懸濁液的制備，廣泛用于小麥根腐病、水稻紋枯病和棉花枯黃萎病等的防治。實(shí)施例I本發(fā)明的絮凝法提取分離發(fā)酵液中吩嗪-I-羧酸吩嗪-I-羧酸的方法，該方法的步驟如下(I)發(fā)酵液初調(diào)pH值先按發(fā)酵液量的1%稱量食品級(jí)氫氧化鈉，并將其配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的溶液存儲(chǔ)于堿罐中。吩嗪-I-羧酸發(fā)酵罐有效容積為10m3，發(fā)酵完成后，開啟進(jìn)堿閥門進(jìn)行堿液添加， 堿液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察發(fā)酵罐中的PH值，升至8. 5時(shí)關(guān)閉進(jìn)堿閥門，第一次添加完畢，計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣并分別測pH值，當(dāng)上下PH值之差不超過0. I時(shí)表示攪拌均勻。然后根據(jù)上下料液平均pH值實(shí)際情況適當(dāng)添加堿液，終點(diǎn)PH值8. 47。⑵高速分散吩嗪-I-羧酸發(fā)酵液用4000rpm的高速攪拌器攪拌8min。分別從罐上部和下部取樣閥取樣并測定粘度，當(dāng)罐中上下粘度數(shù)值相當(dāng)時(shí)停止攪拌，表示發(fā)酵液已分散均勻。(3)絮凝將步驟(2)得到的發(fā)酵液加熱到溫度40°C，然后加入以發(fā)酵液質(zhì)量計(jì)1.5% (BP150kg)聚合氯化鋁，絮凝劑預(yù)先配制成8%左右的水溶液并存儲(chǔ)于絮凝液罐中。攪拌槳速度60rpm，開啟進(jìn)液閥門，緩慢將絮凝劑漿液加入發(fā)酵液中，漿液添加速度以剛好呈線型為最佳。添加完成后，將攪拌速度調(diào)至600rpm, IOmin ;在攪拌槳的剪切力下絮體被破碎分散。加入與絮凝劑干物質(zhì)等量的娃藻土，攪拌5min ；(4)微調(diào) pH 值絮凝后的發(fā)酵液pH值會(huì)下降，用配制的NaOH溶液微調(diào)pH值至8. 5 ;開啟進(jìn)堿閥門進(jìn)行堿液添加，堿液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察發(fā)酵罐中的PH值，升至8. 5時(shí)關(guān)閉進(jìn)堿閥門，計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣并分別測pH值，當(dāng)上下PH值之差不超過0. I時(shí)表示攪拌均勻，若差值查過此范圍則需要繼續(xù)攪拌Imin左右，直到上下料液pH之差在0. I內(nèi)，最終pH值為8. 38。(5)過濾洗滌把步驟(4)得到的混合液通過濾布進(jìn)行固液分離，絮體漿液經(jīng)過板框過濾，由于開始過濾時(shí)未形成濾餅層，濾布空隙大，一些顆粒絮體不可避免的穿過濾布隨濾液流出，因此初濾液需返回調(diào)漿罐繼續(xù)過濾避免損失，待濾液澄清后方能關(guān)閉回流閥，開啟出水閥，將濾液收集至酸沉罐中。濾餅用0. 5%的堿水洗滌，洗滌水量約為500kg，濾餅用壓縮空氣吹干。(6)濾液酸沉收集步驟(5)得到的堿液，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值。將食品級(jí)濃鹽酸配制成3mol/L的溶液存儲(chǔ)于酸罐中，開啟進(jìn)酸閥門進(jìn)行酸液添加，酸液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察調(diào)漿罐中的PH值，降至3. 8時(shí)關(guān)閉進(jìn)酸閥門，第一次添加完畢，計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從調(diào)漿罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣分別測pH值，當(dāng)上下pH值誤差不超過O. I時(shí)表示攪拌均勻，若誤差超過此范圍則需要繼續(xù)攪拌Imin左右，直到上下料液pH值誤差在O. I內(nèi)。最終罐中懸濁液的pH值為3. 52.(7)脫水采用過濾的方式，將步驟(6)得到的吩嗪-I-羧酸懸濁液脫水，液相棄用，固相保留并用自來水清洗，洗水量為500kg，選用600目滌綸濾布，過濾壓差O. 6MPa ；(8)真空干燥步驟(7)得到的物料再通過真空干燥裝置烘干至水分含量3%以下，物料內(nèi)水分在負(fù)壓狀態(tài)下溶點(diǎn)沸點(diǎn)都隨著真空度的提高而降低，同時(shí)輔以真空泵間隙抽濕降低水汽含量，使得物料內(nèi)的水獲得足夠的動(dòng)能脫離物料表面。真空干燥由于處于低溫下使得在干燥過程容易高溫變質(zhì)的物料更好的保持原有的特性。發(fā)明所述的真空干燥箱設(shè)定干燥溫度為75°C，真空度為O. 02MPa，干燥時(shí)間3h。最終產(chǎn)品水分含量6. 7%，干物質(zhì)量24. 5kg，吩 嗪-I-羧酸純度70. 3%，回收率91. 5%。實(shí)施例2本發(fā)明的絮凝法提取分離發(fā)酵液中吩嗪-I-羧酸的方法，該方法的步驟如下(I)發(fā)酵液初調(diào)pH值稱取足量的食品級(jí)氫氧化鈉并將其配制成5%的溶液存儲(chǔ)于堿罐中。吩嗪-I-羧酸發(fā)酵罐有效容積為10m3，發(fā)酵完成后，開啟進(jìn)堿閥門進(jìn)行堿液添加，堿液添加速度以剛好呈線型為最佳。添加完畢，60rpm計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣并分別測PH值，當(dāng)上下pH值之差不超過O. I時(shí)表示攪拌均勻。然后根據(jù)上下料液平均pH值實(shí)際情況適當(dāng)添加堿液，最終測得PH值為8. 35。(2)高速分散調(diào)節(jié)至pH值8. 5的吩嗪-I-羧酸發(fā)酵液用6000rpm的高速攪拌器攪拌5min。分別從罐上部和下部取樣閥取樣并測定粘度，當(dāng)罐中上下粘度數(shù)值相當(dāng)時(shí)停止攪拌，表示發(fā)酵液已分散均勻。(3)絮凝將步驟(2)得到的發(fā)酵液加熱到溫度40°C，然后加入140kg聚合氯化鋁，絮凝劑預(yù)先配制成8%的水溶液并存儲(chǔ)于絮凝液罐中。攪拌槳速度80rpm，開啟進(jìn)液閥門，緩慢將絮凝劑漿液加入發(fā)酵液中，漿液添加速度以剛好呈線型為最佳。添加完成后，將攪拌速度調(diào)至400rpm, IOmin ;在攪拌槳的剪切力下絮體被破碎分散。加入與絮凝劑干物質(zhì)等量的娃藻土，攪拌5min ；(4)微調(diào) pH 值絮凝后的發(fā)酵液pH值會(huì)下降，用配制的NaOH溶液微調(diào)pH值至8. 4 ;開啟進(jìn)堿閥門進(jìn)行堿液添加，堿液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察發(fā)酵罐中的PH值，當(dāng)上下pH值之差不超過O. I時(shí)表示攪拌均勻，若差值查過此范圍則需要繼續(xù)攪拌Imin左右，直到上下料液PH之差在O. I內(nèi)。(5)過濾洗滌把步驟(4)得到的混合液通過濾布進(jìn)行固液分離，絮體漿液經(jīng)過板框過濾，由于開始過濾時(shí)未形成濾餅層，濾布空隙大，一些顆粒絮體不可避免的穿過濾布隨濾液流出，因此初濾液需返回調(diào)漿罐繼續(xù)過濾避免損失，待濾液澄清后方能關(guān)閉回流閥，開啟出水閥，將濾液收集至酸沉罐中。濾餅用O. 8%的堿水洗滌，洗滌水量為400kg，濾餅用壓縮空氣吹干。(6)濾液酸沉收集步驟(5)得到的堿液，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值。將食品級(jí)濃鹽酸配制成3mol/L的溶液存儲(chǔ)于酸罐中，開啟進(jìn)酸閥門進(jìn)行酸液添加，酸液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察調(diào)漿罐中的PH值，降至3. 9時(shí)關(guān)閉進(jìn)酸閥門，第一次添加完畢，計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從調(diào)漿罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣分別測PH值，當(dāng)上下pH值誤差不超過O. I時(shí)表示攪拌均勻，若誤差超過此范圍則需要繼續(xù)攪拌Imin左右，直到上下料液pH值誤差在O. I內(nèi)。最終罐中懸濁液的pH值為3. 68.(7)脫水采用過濾方式將步驟(6)得到的吩嗪-I-羧酸懸濁液脫水，液相棄用，固相保留并用自來水清洗，洗水量為500kg ； (8)真空干燥步驟(7)得到的物料再通過真空干燥裝置烘干至水分含量10%以下，物料內(nèi)水分在負(fù)壓狀態(tài)下溶點(diǎn)沸點(diǎn)都隨著真空度的提高而降低，同時(shí)輔以真空泵間隙抽濕降低水汽含量，使得物料內(nèi)的水獲得足夠的動(dòng)能脫離物料表面。真空干燥由于處于低溫下使得在干燥過程容易高溫變質(zhì)的物料更好的保持原有的特性。發(fā)明所述的真空干燥箱設(shè)定干燥溫度為65°C，真空度為O. 02MPa，干燥時(shí)間5h。最終產(chǎn)品水分含量7. 8%，干物質(zhì)量25. 3kg，吩嗪-I-羧酸純度65. 3%，回收率92. 4%。實(shí)施例3本發(fā)明的絮凝法提取分離發(fā)酵液中吩嗪-I-羧酸的方法，該方法的步驟如下(I)發(fā)酵液初調(diào)pH值稱取足夠質(zhì)量的食品級(jí)氫氧化鈉，并將其配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的溶液存儲(chǔ)于堿罐中。吩嗪-I-羧酸發(fā)酵罐有效容積為10m3，發(fā)酵完成后，開啟進(jìn)堿閥門進(jìn)行堿液添加，堿液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察發(fā)酵罐中的PH值，升至8.0時(shí)關(guān)閉進(jìn)堿閥門，第一次添加完畢，計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣并分別測pH值，當(dāng)上下pH值之差不超過O. I時(shí)表示攪拌均勻。然后根據(jù)上下料液平均pH值實(shí)際情況適當(dāng)添加堿液。最終pH值8. 33.(2)高速分散調(diào)節(jié)至pH值8. O的吩嗪-I-羧酸發(fā)酵液用4000rpm的高速攪拌器攪拌lOmin。分別從罐上部和下部取樣閥取樣并測定粘度，當(dāng)罐中上下粘度數(shù)值相當(dāng)時(shí)停止攪拌，表示發(fā)酵液已分散均勻。⑶絮凝將步驟(2)得到的發(fā)酵液加熱到溫度40°C，然后加入140kg聚合氯化鋁，絮凝劑預(yù)先配制成8%的水溶液并存儲(chǔ)于絮凝液罐中。攪拌槳速度60rpm，開啟進(jìn)液閥門，緩慢將絮凝劑漿液加入發(fā)酵液中，漿液添加速度以剛好呈線型為最佳。添加完成后，將攪拌速度調(diào)至300rpm, 5min ;在攪拌槳的剪切力下絮體被破碎分散。加入與絮凝劑干物質(zhì)等量的娃藻土，攪拌2min ；(4)微調(diào) pH 值
絮凝后的發(fā)酵液pH值會(huì)下降，用配制的NaOH溶液微調(diào)pH值至8. 5 ;開啟進(jìn)堿閥門進(jìn)行堿液添加，堿液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察發(fā)酵罐中的PH值，升至8. O時(shí)關(guān)閉進(jìn)堿閥門，計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣并分別測pH值，當(dāng)上下PH值之差不超過O. I時(shí)表示攪拌均勻，若差值查過此范圍則需要繼續(xù)攪拌Imin左右，直到上下料液PH之差在O. I內(nèi)。最終pH值為8. 16.(5)過濾洗滌把步驟(4)得到的混合液通過濾布進(jìn)行固液分離，絮體漿液經(jīng)過板框過濾，由于開始過濾時(shí)未形成濾餅層，濾布空隙大，一些顆粒絮體不可避免的穿過濾布隨濾液流出，因此初濾液需返回調(diào)漿罐繼續(xù)過濾避免損失，待濾液澄清后方能關(guān)閉回流閥，開啟出水閥，將濾液收集至酸沉罐中。濾餅用O. 5%的堿水洗滌，洗滌水量為500kg，濾餅用壓縮空氣吹干。(6)濾液酸沉收集步驟(5)得到的堿液，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值。將食品級(jí)濃鹽酸配制成3mol/L的 溶液存儲(chǔ)于酸罐中，開啟進(jìn)酸閥門進(jìn)行酸液添加，酸液添加速度以剛好呈線型為最佳。觀察調(diào)漿罐中的PH值，降至3. 7時(shí)關(guān)閉進(jìn)酸閥門，第一次添加完畢，計(jì)時(shí)攪拌5min，分別從調(diào)漿罐上部和下部取樣閥同時(shí)取樣分別測PH值，當(dāng)上下pH值誤差不超過O. I時(shí)表示攪拌均勻，若誤差超過此范圍則需要繼續(xù)攪拌Imin左右，直到上下料液pH值誤差在O. I內(nèi)。最終罐中懸濁液的pH值為3. 20.(7)脫水采用過濾的方式，將步驟(6)得到的吩嗪-I-羧酸懸濁液脫水，液相棄用，固相保留并用自來水清洗，洗水量為300kg ；(8)真空干燥步驟(7)得到的物料再通過真空干燥裝置烘干至水分含量3%以下，物料內(nèi)水分在負(fù)壓狀態(tài)下溶點(diǎn)沸點(diǎn)都隨著真空度的提高而降低，同時(shí)輔以真空泵間隙抽濕降低水汽含量，使得物料內(nèi)的水獲得足夠的動(dòng)能脫離物料表面。真空干燥由于處于低溫下使得在干燥過程容易高溫變質(zhì)的物料更好的保持原有的特性。發(fā)明所述的真空干燥箱設(shè)定干燥溫度為50°C，真空度為O. 02MPa,干燥時(shí)間6h。最終產(chǎn)品水分含量5. 9%，干物質(zhì)量25. 3kg，吩嗪-I-羧酸純度66. 4%,回收率90. 3%ο
權(quán)利要求
1.一種采用絮凝法提取分離發(fā)酵液中吩嗪-I-羧酸的方法，其特征在于，使用聚合氯化鋁作為絮凝劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟 (O發(fā)酵液初調(diào)PH值 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 5%的NaOH溶液，緩慢加入吩嗪_1_羧酸發(fā)酵液中，6(Tl00rpm攪拌，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至8. (Γ8. 5 ; (2)高速分散 將步驟(I)得到的發(fā)酵液加熱到溫度35 45 °C，然后用400(T8000rpm (優(yōu)選5000-7000rpm)的高速分散儀分散6(Tl20s ； (3)絮凝 聚合氯化鋁絮凝劑配制成8 10%的水溶液，加入到步驟(2)得到的發(fā)酵液中，其中聚合氯化鋁添加量為發(fā)酵液質(zhì)量計(jì)的I. (Tl. 5%，緩慢倒入發(fā)酵液中，6(Tl00rpm攪拌2 5min，然后攪拌速度調(diào)至600rpm，5 10min ;加入與聚合氯化鋁絮凝劑等質(zhì)量的硅藻土，攪拌均勻； (4)微調(diào)pH值 絮凝后的發(fā)酵液PH值下降，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 5%的NaOH溶液微調(diào)pH值至7. 8 8. 2 ； (5)過濾洗滌 把步驟(4 )得到的混合液通過板框過濾進(jìn)行固液分離，初濾液進(jìn)行二次過濾，待濾餅形成，濾液澄清時(shí)，收集濾液；濾餅用質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 5^0. 8%氫氧化鈉溶液洗滌，洗滌水量為板框容積量的3飛倍，收集洗滌用堿液； (6)濾液酸沉 合并步驟(5)得到的濾液和洗滌用堿液，緩慢加入f3mol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至3.(Γ4. O,使吩嗪-I-羧酸沉淀析出； (7)脫水 采用板框過濾或離心的方式，將步驟(6)得到的吩嗪-I-羧酸懸濁液脫水，液相棄用，固相保留并用自來水清洗，洗滌水量為板框容積量的3飛倍； (8)干燥 步驟(7)得到的物料再通過真空干燥裝置烘干至水分含量10%以下，得到吩嗪-I-羧Ife粗品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中吩嗪-I-羧酸發(fā)酵液的干物質(zhì)含量為2. (Γ2. 5%，吩嗪-I-羧酸在干物質(zhì)中所占比例為6. (Γ6. 5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中高速分散后發(fā)酵液體系均一，無分層現(xiàn)象。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中絮凝攪拌均勻后的發(fā)酵液平均顆粒度為30(Γ500 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中聚合氯化鋁為食品級(jí)，Al2O3有效含量為30%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中板框過濾介質(zhì)為30(Γ500目的滌綸濾布，板框進(jìn)料壓力O. 4^0. 6MPa。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(7)中板框過濾介質(zhì)為40(Γ600目的滌綸濾布，板框進(jìn)料壓力O. 4^0. 6MPa。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(8)中，真空干燥裝置的干燥溫度為6(T80°C，真空度為O. 01 O. 03MPa，干燥時(shí)間2 5h。
10.根據(jù)權(quán)利要求I、之任一項(xiàng)所述方法，其特征在于，得到的吩嗪-I-羧酸顏色為黃綠色，其中雜質(zhì)含量< 35%，吩嗪-I-羧酸回收率> 90%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用絮凝劑去除發(fā)酵液中大分子有機(jī)物雜質(zhì)，利用目標(biāo)代謝物吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid，PCA)堿溶酸沉的性質(zhì)進(jìn)行該物質(zhì)初步分離的方法，所述方法包括發(fā)酵液初調(diào)pH值、高速分散、絮凝、微調(diào)pH值、過濾、加酸等電、脫水和干燥等步驟。最后得到黃綠色的PCA粗品，純度≥65%，回收率≥90%，可用于PCA生物農(nóng)藥的配制，抑制很多種能引起植物根腐、莖腐等病害的真菌病原體對(duì)農(nóng)作物的破壞。
文檔編號(hào)C07D241/46GK102827089SQ20121035985
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者于秋生, 陳正行, 馮偉, 張壘賓 申請人:江南大學(xué)