專利名稱：一種繼發(fā)性干燥綜合征抗原表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種繼發(fā)性干燥綜合征抗原表位及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干燥綜合征是ー種主要累及外分泌腺的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，臨床上以ロ眼干燥，腮腺腫大為主要表現(xiàn)。干燥綜合征可單獨(dú)發(fā)生，也繼發(fā)于其他自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA),系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupuserythematosus, SLE)等。有報道證明繼發(fā)性干燥綜合征(sSS)與原發(fā)性干燥綜合征(pSS)不同，二者有不同的臨床、血清學(xué)和遺傳學(xué)特征，但目前為止，繼發(fā)性干燥綜合征的發(fā)生機(jī)制仍然未明。 由于sSS患者病程中往往出現(xiàn)器官受累，如彌漫性間質(zhì)性肺病，腎小管酸中毒，肌炎等，而這些并發(fā)癥使得sSS死亡率大大增加，所以sSS的早期診治至關(guān)重要。但目前sSS仍然缺乏理想的血清標(biāo)記物，我們?nèi)圆磺宄SS與pSS的抗體譜是否相同。雖然自身抗體如抗SSA、SSB以及a-胞襯蛋白抗體已用于sSS的臨床診斷,但這些標(biāo)記物均缺乏較好的特異性和敏感性，并且部分患者血清中缺乏抗SSA、SSB抗體。大量自身抗體的出現(xiàn)是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，難以直接利用自身抗原檢測抗體?？乖砦?epitope)是抗原分子中識別、結(jié)合抗體的基礎(chǔ)，因此是檢測抗體的實(shí)際有效組分。以抗原表位肽或其模擬肽(mimotope)作為診斷工具有以下幾個優(yōu)勢1)可以提高診斷的靈敏度和特異性，避免了生物大分子易產(chǎn)生的非特異性結(jié)合(Deroo S et al (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4: 75 - 115)；
2)擴(kuò)大疾病診斷的范圍，對于研究較少或難以體外應(yīng)用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、脂類抗原，以模擬肽作為天然抗原的替代物進(jìn)行診斷，也可以獲得與天然抗原表位一致的結(jié)果(Bruce G (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:1955 - I960; Jinaping Q et al(1999) Hyridoma 18(1):103 - 109);3)多肽制備、應(yīng)用的成本低、易于質(zhì)控。因此，自身抗原表位肽或其模擬肽(Meloen RH et al (2000) J Mol Recognit 13: 352 - 359 )的獲得是制備自身抗體的多肽檢測試劑的基礎(chǔ)?；谑删w肽庫技術(shù)的抗原表位確定技術(shù)，僅需要以患者血清樣本為靶標(biāo)，而無需天然的自身抗原信息，可以實(shí)現(xiàn)快速和簡便篩選，并且成本低、結(jié)果可信度高。噬菌體肽庫技術(shù)的另ー個突出特點(diǎn)是，通過篩選可以同時獲得某一疾病特異性的多個抗原表位肽，它們可能代表了天然抗原的主要免疫顯性基團(tuán)。天然生物大分子抗原通常由多個抗原表位組成，其中有ー些在免疫反應(yīng)中起著主要作用，被稱為“免疫顯性基團(tuán)”，針對完整抗原的抗體主要是針對這些表位的多種“單克隆抗體”組成。以sSS患者血清樣品為靶標(biāo)，通過噬菌體肽庫篩選，獲得sSS特異性的抗原表位肽，是獲得新型診斷試劑的基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位。本發(fā)明的目的還在于提供上述抗原表位的核苷酸序列。本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測繼發(fā)性干燥綜合征的試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位在制備診斷繼發(fā)性干燥綜合征的藥物中的用途。發(fā)明人從10例sSS患者血清中制備和純化得到IgG，然后以線性十二肽庫與抗體孵育，經(jīng)篩選獲得了與抗體特異結(jié)合的噬菌體克隆。之后通過ELISA確定陽性噬菌體克隆，測定陽性噬菌體克隆展示肽序列?；瘜W(xué)合成其中的ー個表位肽，命名為sSSP，通過ELISA檢測與患者血清的反應(yīng)情況，表明其能特異的與患者血清中的IgG結(jié)合，而不與健康人血清反應(yīng)。—種繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位,該抗原表位為多肽，其氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO: I 所示。編碼上述繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位的核苷酸序列。一種檢測繼發(fā)性干燥綜合征的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求I所述多肽，權(quán)利要求I所述多肽的抗體，固相酶標(biāo)板，牛血清白蛋白，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，四
甲基聯(lián)苯胺。所述繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位在制備診斷繼發(fā)性干燥綜合征的藥物中的用途。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明獲得的繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位多肽，通過ELISA檢測與患者血清的反應(yīng)情況，表明其能特異的與sSS患者血清中的IgG結(jié)合，而不與RA、SLE> pSS患者及健康人血清反應(yīng)。


圖I為陽性噬菌體克隆的ELISA結(jié)果。圖2為sSSP與患者血清樣品、健康人血清樣品的結(jié)合。圖3為RAP抗體檢測的ROC曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步說明。以下實(shí)施例并不限定本發(fā)明，實(shí)施例中未詳細(xì)說明的操作步驟請參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版相應(yīng)部分(J.薩姆布魯克E.F.弗里奇等，科學(xué)出版社)或參閱所用試劑盒的說明書。實(shí)施例I sSS患者血清總IgG制備和純化取適量Protein A樹脂懸液(GE公司產(chǎn)品)，裝入層析柱，用10倍柱體積的PBS緩沖液洗滌平衡層析柱。將繼發(fā)性干燥綜合征患者血清高速離心后，加入1/10體積10XPBS緩沖液混合，調(diào)整PH以及離子濃度后，緩慢加入層析柱。用10倍柱體積以上的PBS洗滌，至流出液無蛋白檢出。加入6倍柱體積0.1 M甘氨酸(pH 3. O)洗脫，收集穿出液，以1/10體積的IM Tris-HCl (pH 9. O)中和。將得到抗體對PBS透析，定量抗體濃度后加入50%甘油，分裝并保存在_20°C。
實(shí)施例2 噬菌體展示肽庫篩選sSS特異性的抗體結(jié)合肽Ph.D.-12肽庫試劑盒購自NEB公司，庫容量為2. 7X109，滴度為1.5X1013/μ .。Escherichia coli ER2537為肽庫的宿主菌。篩選過程參見噬菌體展示肽庫試劑盒使用說明書。每輪篩選以sSS患者血清中的總IgG包被(每孔10 μ g)，每孔投入I X IO11噬菌體。噬菌體富集程度通過“投入/產(chǎn)出比”計(jì)算。經(jīng)過三輪篩選，挑取陽性克隆測序。陽性噬菌體克隆與總IgG抗體的特異性結(jié)合通過ELISA測定?？侷gG抗體(每孔10 μ g)包被96孔板(Nunc公司)4で過夜。傾去不結(jié)合的抗體，3% BSA 37°C封閉I小時。每孔投入I X IO9噬菌體37°C孵育2小時。洗滌液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分鐘。HRP標(biāo)記的抗M13單抗(1:1000稀釋，Amersham Biosciences公司)37°C孵育I小時。洗漆方法同上，以TMB (Sigma)為底物檢測結(jié)合的抗M13單抗，450 nm檢測光吸收，結(jié)果見圖I。由圖I可知，這14個克隆均為陽性克隆。序列測定結(jié)果表明，這些序列具有良好的一致性，其中一條序列出現(xiàn)頻率高、保守性好。申請人據(jù)此合成了該肽段，其具體的氨基酸序列為FKSGTGPQQYSY (SEQ ID NO 1),命名為 sSSP。
實(shí)施例3 sSSP與sSS患者血清IgG結(jié)合檢測合成肽sSSP (姆孔O. 5 μ g)包被96孔板(Nunc公司)4で過夜。傾去不結(jié)合的肽，3% BSA 37°C封閉I小時。sSS患者或健康人血清樣品1:400稀釋，加入不同孔中，37°C孵育I小時。洗滌液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分鐘。1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 37°C孵育I小吋。洗滌方法同上，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma)為底物檢測結(jié)合的抗M13單抗,450 nm檢測光吸收。結(jié)果見圖2，sSS患者血清中sSSP抗體水平明顯高于RA、SLE、pSS患者及健康人，利用One-way ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示二者具有顯著性差異(P〈0. 001)。實(shí)施例4 sSSP抗體檢測的靈敏度及特異性測定將化學(xué)合成的sSSP多肽與SulfoLink偶聯(lián)樹脂偶聯(lián)，裝入層析柱，用10倍柱體積的PBS緩沖液洗滌平衡層析柱。將繼發(fā)性干燥綜合征患者血清高速離心后，加入1/10體積10XPBS緩沖液混合，調(diào)整pH以及離子濃度后，緩慢加入層析柱。用10倍柱體積以上的PBS洗滌，至流出液無蛋白檢出。加入6倍柱體積O. I M甘氨酸(pH 3.0)洗脫，收集穿出液，以1/10體積的IM Tris-HCl (pH 9. O)中和。將得到抗體對PBS透析，定量抗體濃度后加入50%甘油，分裝并保存在_20°C。合成肽sSSP (每孔O. 5 μ g)包被96孔板(Nunc公司)4で過夜。傾去不結(jié)合的肽，3% BSA 37°C封閉I小時。以親和純化的sSSP抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，系列稀釋濃度分別為0,10, 25, 50,100 μ g/ml，加入不同孔中，37°C孵育I小吋。洗滌液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分鐘。1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 37°C孵育I小吋。洗滌方法同上，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma)為底物檢測結(jié)合，450 nm檢測光吸收，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時，將sSS、RA、SLE、pSS患者或健康人血清樣品1:100稀釋，也加入已包被的孔內(nèi)，方法同上。將檢測結(jié)果利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同樣品中sSSP抗體含量，并利用SPSS16軟件繪制ROC曲線。結(jié)果見圖3，sSSP抗體的檢測具有高特異性(96. 0%)和高敏感性(90. 0%)。RA-SS與RA患者相比，sSSP抗體檢測的敏感性及特異性分別是90%和96%，見圖3 A ; RA-SS與PSS患者相比，sSSP抗體檢測的敏感性及特異性分別是92. 5%和96. 36%，見圖3 B ；SLE-SS與SLE患者相比，sSSP抗體檢測的敏感性及特異性分別是100%和91. 7%，見圖3 C ；SLE-SS與pSS患者相比，sSSP抗體檢測的敏感性及特異性分別是100%和91. 7%，見圖3 C。因此，sSSP抗體可以作為sSS患者的一個檢測指標(biāo)。實(shí)施例5檢測繼發(fā)性干燥綜合征的試劑盒設(shè)計(jì)檢測繼發(fā)性干燥綜合征的試劑盒，該試劑盒包括sSSP多肽I. O mg, sSSP抗體I. Omg,陰性對照血清100 μ 1，陽性對照血清100 μ 1,96孔固相酶標(biāo)板10板，牛血清白蛋白
10.O mg,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG 100 μ I,顯色液100 ml (含四甲基聯(lián)苯胺)，終止液50ml。應(yīng)用上述試劑盒的操作步驟如下[l]sSSP多肽?？譕. 5 μ g)包被96孔板(Nunc公司)，4 °C過夜;[2]3% BSA 37°C封閉 I 小時; [3]sSSP抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，濃度分別為0，10，25，50，100 μ g/ml ;陰性對照血清、陽性對照血清及待測血清1:100稀釋，加入不同孔中；37°C孵育I小時；[4]洗滌液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板 5 次，共 3 分鐘；[5]羊抗人IgGl :1000稀釋，37°C孵育I小時；[6]重復(fù)步驟[4]；[7]姆孔加入顯色液100 μ 1，室溫避光反應(yīng)20分鐘；[8]姆孔加入終止液50 μ I,室溫靜置5分鐘；[9]酶聯(lián)儀檢測450nm吸收值；[10]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出每個待測樣品的sSSP抗體含量，結(jié)果高于陰性對照三倍判定為陽性。
權(quán)利要求
1.一種繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位，其特征在于，該抗原表位為多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示。
2.編碼上述繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位的核苷酸序列。
3.—種檢測繼發(fā)性干燥綜合征的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括權(quán)利要求I所述多肽，權(quán)利要求I所述多肽的抗體，固相酶標(biāo)板，牛血清白蛋白，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，四甲基聯(lián)苯胺。
4.權(quán)利要求I所述繼發(fā)性干燥綜合征的抗原表位在制備診斷繼發(fā)性干燥綜合征的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于免疫學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域的一種繼發(fā)性干燥綜合征抗原表位及其應(yīng)用。該抗原表位為多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。該抗原表位多肽，通過ELISA檢測與患者血清的反應(yīng)情況，表明其能特異的與患者血清中的IgG結(jié)合，而不與健康人血清反應(yīng)。該抗原表位多肽可制備診斷繼發(fā)性干燥綜合征的藥物。
文檔編號C07K7/08GK102816210SQ201210320969
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者楊光, 栗占國, 高亞萍, 李玉慧, 柳川, 穆榮, 董潔, 劉玉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 北京大學(xué)人民醫(yī)院