專利名稱：一種抗氧化肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種抗氧化肽的制備方法。
背景技術(shù)：
自從英國Harman于1956年提出自由基理論以來,人們逐步認(rèn)識到人體許多慢性 疾病如糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)組織退化紊亂、癌癥及衰老都與體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基有 關(guān)，因而抗氧化劑的研究越來越被人們所關(guān)注。傳統(tǒng)使用的抗氧化劑大多為合成抗氧化劑， 如ニ叔丁基羥基甲苯(BHT)，叔丁基羥基茴香醚(BHA)，由于廉價(jià)而且具有很強(qiáng)的抗氧化能 カ而被廣泛使用，但是由于其對人體健康構(gòu)成潛在的危害而被限制使用。因此，尋找和開發(fā) 安全、無毒的天然抗氧化劑，已成為當(dāng)今社會的研究熱點(diǎn)。天然抗氧化肽是存在于動(dòng)植物體中具有抗氧化活性的肽類，它具有清除自由 基、螯合金屬離子、猝滅單線態(tài)氧、分解過氧化物及抑制脂質(zhì)過氧化等功效，易被人體吸 收，無毒副作用，營養(yǎng)和加工特性良好，因此在人類食品和藥品中具有巨大的開發(fā)前景。 目前也有很多學(xué)者采用酶解的技術(shù)從植物或者動(dòng)物組織中制備得到活性很強(qiáng)的抗氧化 肽。發(fā)明申請專利(申請?zhí)?01010141974. 3)公開了 一系列的膠原蛋白抗氧化肽，具有 如下之一的氨基酸序列(I) Hyl-Cys ； (2) Gln-Gly-Ala-Arg ； (3) Leu-Gln-Gly-Met ； (4) Leu-Gln-Gly-Met-Hyp,該產(chǎn)品抗氧化作用很強(qiáng)，不僅可以替代BHT等用作食品的添加劑， 而且可以作為活性功能性成分，而且具有分子量小的特點(diǎn)，易被消化道直接吸收。發(fā)明申 請專利(申請?zhí)?00510009423.0)公開了通過將蜂王漿用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶進(jìn)行酶 處理，可以獲得具有和維生素E同等強(qiáng)度的強(qiáng)抗氧化能力的三種抗氧化肽，氨基酸序列為 (I)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu ； (2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile -Leu-His-Glu-Trp?；ㄉ厥腔ㄉ式?jīng)過榨油后的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)，但由于在榨油過程中 經(jīng)歷了高溫壓榨和溶劑浸提的過程，導(dǎo)致花生蛋白嚴(yán)重變性，色澤和氣味惡化，目前主要用 作飼料或肥料。但是我國毎年有幾百萬噸的花生柏，來源廣泛、價(jià)格低廉，因此如何充分開 發(fā)利用花生柏中的蛋白質(zhì)資源，提高其附加值，是植物蛋白資源綜合利用的重要環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種原料來源豐富廉價(jià)，且抗氧化活性很強(qiáng)的抗氧化肽及 其制備方法，該抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Gly-Ser，具體技術(shù)方案如下。ー種抗氧化肽的制備方法，包括如下步驟
(I)成曲酶的制備將10 30g麩皮，5 20g花生柏，0. 01 0. Ig氯化鈣和15 50g 去離子水混合均勻；在高壓蒸汽滅菌鍋中100 121°C下殺菌15 30min，冷卻至38°C，接 種米曲霉，在培養(yǎng)箱28 32°C培養(yǎng)48 72h ;加入200mL去離子水，在30 50°C水浴中 攪拌1 311，在0 4で下5000 10，000 X ^ 離心20 30min，取上清液，冷凍干燥得成 曲酶。CN 102660615 A書
明
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(2)花生柏酶解物的制備將花生柏與水按質(zhì)量比1 :4 1 :8混合，加入以花生柏 蛋白質(zhì)量計(jì)0. 4 1%的成曲酶，在50 55°C酶解4 24h ;85 95°C下滅酶15 30min， 離心，取上清液，得到花生柏酶解液；
(3)抗氧化肽的分離純化將花生柏酶解液通過截留分子量為3000Da的超濾膜，濾去 大分子，取透過液，冷凍干燥成粉末；再用凝膠過濾色譜柱G-15進(jìn)行分離純化，用去離子水 以0. 6 2 ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測波長為214nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活 性，收集活性最高的組分，然后冷凍干燥成粉末；
(4)最后用反相高效液相色譜法進(jìn)一步純化，色譜柱為XBridge pre C18柱(5 y m， 10 X 150mm; Waters, USA)，流動(dòng)相為A相和B相，洗脫程序?yàn)?_4min內(nèi)采用的流動(dòng)相中 A與B體積比為5:95-10:90, 4_8min內(nèi)采用的流動(dòng)相中A與B體積比為10:90-30:70, 8-12min內(nèi)采用的流動(dòng)相中A與B體積比為30:70-50:50，12_30min內(nèi)采用的流動(dòng)相中A與 B體積比為50:50，流速為2ml/min，檢測波長為214nm。測定各組分的抗氧化活性，收集活 性最高的組分，冷凍干燥，得到目標(biāo)肽。所述A相為甲醇，B相為質(zhì)量濃度0. 1%的三氟乙酸水溶液。用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定肽的氨基酸序列為Tyr-Gly-Ser，分子量為325. 3Da。在本發(fā)明中，米用ORAC (Oxygen radical absorbance capacity,氧自由基吸收 能力)法來測定抗氧化肽的活性。該方法現(xiàn)已經(jīng)成為美國農(nóng)業(yè)部、美國衛(wèi)生院、FDA評價(jià)食 品抗氧化能力的重要標(biāo)準(zhǔn)。歐洲、日本等國家的食品、功能食品行業(yè)也普遍采用0RAC作為 抗氧化能力的重要評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，是目前評價(jià)體外抗氧化能力最權(quán)威性的方法?；?RAC反應(yīng) 在75 mmol -L _1磷酸鹽緩沖液(pH =7.4)環(huán)境中進(jìn)行，F(xiàn)L (熒光素鈉鹽)、AAPH (自由基產(chǎn) 生劑)、標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)Trolox (維生素E水溶性類似物)以及待測樣品均用該緩沖液溶解 和稀釋。具體測定操作為在96孔板各微孔中分別加入待測樣品20 yl，F(xiàn)L (終濃度為70 nmol *L ―1 ) 120iU，在37°C下預(yù)置15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH (終 濃度為12 mmol-L 1 )60 yl啟動(dòng)反應(yīng)，并將微孔板置于熒光分析儀中在37°C下以激發(fā)波 長485 nm,發(fā)射波長528 nm進(jìn)行連續(xù)測定，每1 min測定一次各孔突光強(qiáng)度，測定120min, 熒光強(qiáng)度分別記為fo，f\，f2* * f120O將記錄的各微孔不同時(shí)間點(diǎn)的絕對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)
126 ￡
fn與初始熒光強(qiáng)度fo相比，折算成相對熒光強(qiáng)度，并根據(jù)公式
權(quán)利要求
1.ー種抗氧化肽的制備方法，其特征在于該方法步驟如下 (1)成曲酶的制備將10 30g麩皮，5 20g花生柏，O.01 O. Ig氯化鈣和15 50g去離子水混合均勻；在高壓蒸汽滅菌鍋中100 121°C下殺菌15 30min，冷卻至38°C，接種米曲霉，在培養(yǎng)箱28 32°C培養(yǎng)48 72h ;加入200mL去離子水，在30_50°C水浴中攪拌l_3h，在0-4°C下5000 10，000 X g·離心20 30min，取上清液，冷凍干燥得成曲酶； (2)花生柏酶解物的制備將花生柏與水按質(zhì)量比I:4 I :8混合，加入占花生柏蛋白質(zhì)量O. 4% 1%的成曲酶，在50 55°C酶解4 24h ；85 95°C下滅酶15 30min，離心，取上清液，得到花生柏酶解液； (3)抗氧化肽的分離純化將花生柏酶解液通過截留分子量為3000Da的超濾膜，濾去大分子，取透過液，冷凍干燥成粉末；再用Sephadex G_15凝膠柱進(jìn)行分離純化，用去離子水以O(shè). 6 2 ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測波長為214nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分，然后冷凍干燥得粉末A ； (4)將粉末A溶于水后用反相高效液相色譜進(jìn)ー步純化，色譜柱為XBridgepreC18柱，流動(dòng)相為A相和B相，洗脫程序?yàn)?-4min內(nèi)采用的流動(dòng)相中A與B體積比為5:95-10:90, 4-8min內(nèi)采用的流動(dòng)相中A與B體積比為10:90-30:70，8_12min內(nèi)采用的流動(dòng)相中A與B體積比為30:70-50:50,12_30min內(nèi)采用的流動(dòng)相中A與B體積比為50:50,流速為2ml/min，檢測波長為214nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述A相為甲醇，B相為質(zhì)量濃度O.1%的三氟こ酸水溶液。
3.由權(quán)利要求I所述制備方法制得的抗氧化肽，其特征在于，具有Tyr-Gly-Ser的氨基 序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗氧化肽及其制備方法。本發(fā)明利用花生粕及自制的成曲酶，通過酶法水解，得到花生粕酶解液，再利用超濾膜、凝膠過濾色譜及反相高效液相色譜對其進(jìn)行分離純化得到一種新的抗氧化肽產(chǎn)品，并測定其氨基酸序列。該產(chǎn)品的氨基酸序列為Tyr-Gly-Ser，分子量為325.3Da，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，氧自由基吸收能力是還原型谷胱甘肽的4倍，而且該肽具有分子量小、可被人體直接吸收的特點(diǎn)，因此可以廣泛應(yīng)用于食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域。
文檔編號C07K1/34GK102660615SQ201210114368
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者任嬌艷, 崔春, 蘇國萬, 趙謀明, 鄭淋 申請人:華南理工大學(xué)