專利名稱：四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品加工領(lǐng)域，涉及一種四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷胱甘肽的方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽在生物體內(nèi)有著多種重要的生理功能，特別是對(duì)于維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用。自從谷胱甘肽被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，它不僅作為試劑廣泛用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)的研究測(cè)定中，而且已成為一種重要的生化藥物。谷胱甘肽可以迅速增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，人體內(nèi)谷胱甘肽增加后對(duì)消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和新陳代謝等都有很大幫助。近年來(lái)在我國(guó)科技人員的努力下，基本達(dá)到了工業(yè)化水平。然而谷胱甘肽發(fā)酵過(guò)程中的副產(chǎn)物眾多且化學(xué)性質(zhì)相近，分離困難。目前，從發(fā)酵液中分離純化谷胱甘肽的方法大部分采用裝填有離子交換樹脂的柱子進(jìn)行簡(jiǎn)單的分離，常秀蓮等研究了用七種離子交換樹脂分離谷胱甘肽(常秀蓮，叢麗華；七種離子交換樹脂分離谷胱甘肽的比較所究；食品科技；2008，33 (12))，胡曉梅等提出了用001x7陽(yáng)離子交換樹脂分離純化谷胱甘肽的工藝條件(胡曉梅，黃娟等；離子交換樹脂分離純化谷胱甘肽的研究；發(fā)酵科技通訊；2008，37 (4));楊海鱗等提出一種用超濾和微濾的方法分離純化谷胱甘肽(專利公開號(hào):CN101709077A);溫凱等提出用熱水抽提和超濾等操作從新鮮酵母中分離谷胱甘肽(專利公開號(hào):CN101863959A);王淼等提出一種離心、調(diào)pH值、沸水破壁等操作分離得到谷胱甘肽(專利公開號(hào):CN1850854A);這些方法存在操作復(fù)雜、產(chǎn)品純度低、不能進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn)、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。20世紀(jì)90年代模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)的興起被認(rèn)為是化工技術(shù)中的一次革新，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大，遍及石油、精細(xì)化工、生物發(fā)酵、醫(yī)藥、食品等很多生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其在同系化合物、手性異構(gòu)體藥物、糖類、有機(jī)酸和氨基酸等混合物的分離中顯示出其獨(dú)特性能。研究表明，建造具有同等生產(chǎn)能力的模擬移動(dòng)床色譜裝置的投資為固定床色譜投資的一倍，模擬移動(dòng)床色譜僅為固定床樹脂、洗脫液等的消耗和設(shè)備拆舊的成本的70%左右，而且模擬移動(dòng)床色譜投資僅占全年運(yùn)行費(fèi)用的20%左右。模擬移動(dòng)床色譜在精制純化方面與傳統(tǒng)分批式色譜柱相比有著巨大優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于:提供一種四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷胱甘肽的方法，實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，克服目前傳統(tǒng)的谷胱甘肽制取法制取的成品中谷胱甘肽含量低、雜質(zhì)多、成本昂貴、產(chǎn)生污染較大的缺陷。本發(fā)明方法采用模擬移動(dòng)床色譜法分離純化發(fā)酵液中谷胱甘肽的具體步驟為:
a、用60%的乙醇 對(duì)發(fā)酵液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液；
b、將上清液減壓濃縮得粗提物；
C、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為5-60g/l，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ；d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為1.0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)是由多根相同的陽(yáng)離子交換樹脂柱串聯(lián)，即通過(guò)離子交換過(guò)程中的強(qiáng)弱吸附組分的吸附、精制、解吸、樹脂再生之間不同功能區(qū)之間的按順序切換，根據(jù)谷胱甘肽和雜質(zhì)在分離介質(zhì)上平衡系數(shù)不同的原理進(jìn)行分離純品，通過(guò)組合閥門的切換來(lái)改變進(jìn)料口、提余液出口、流動(dòng)相入口、提取液出口的位置得到目標(biāo)產(chǎn)物；其中，通過(guò)切換時(shí)間的設(shè)置及各功能區(qū)洗脫液的流速的配合使目標(biāo)物得到分離純化。本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由洗脫泵、進(jìn)樣泵、提取泵、色譜柱、電磁閥、信號(hào)采集器、系統(tǒng)控制器和計(jì)算機(jī)連接組成，洗脫液流速為(TlOOOml/min，進(jìn)樣液流速為(Γ50ml/min,提取液流速為(T500ml/min,提余液流速為(T500ml/min,切換時(shí)間為18 24min,模擬移動(dòng)床的溫度為24 32°C，進(jìn)料液、洗脫液溫度為24 32°C，二者溫度保持一致。本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由Γ16根固定床離子交換柱組成，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)由廣4根離子交換柱，其中，一區(qū)位于洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區(qū)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中的雜質(zhì)的解吸；二區(qū)位于提取液出口處與進(jìn)料口之間，在此區(qū)內(nèi)使發(fā)酵液中的雜質(zhì)反復(fù)吸附、解吸而濃縮；三區(qū)位于進(jìn)料口與提余液出口之間，在此區(qū)內(nèi)使谷胱甘肽吸附在固定相上，從相應(yīng)出口得到谷胱甘肽純品；四區(qū)位于提余液出口與洗脫液入口之間，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進(jìn)入一區(qū)，可循環(huán)利用；另一方面將三區(qū)與一區(qū)隔開，防止提余液中的谷胱甘肽進(jìn)入一區(qū)而污染。本發(fā)明是建立在連續(xù)分離的思想上，利用溶液中目標(biāo)產(chǎn)物與共存雜質(zhì)之間在物理、化學(xué)以及生物學(xué) 性質(zhì)的差異，使其在分離操作中具有不同的傳質(zhì)速率和平衡狀態(tài)，通過(guò)模擬移動(dòng)床實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽分離的目的，產(chǎn)品純度好、收率高、產(chǎn)量大。
具體實(shí)施例方式 實(shí)例1:選用谷胱甘肽發(fā)酵液，在四區(qū)模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的分離純化，具體步驟為:
a、用60%的乙醇對(duì)發(fā)酵液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液；
b、將上清液減壓濃縮得粗提物；
C、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為5g/l，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ；d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為1.0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。本發(fā)明方法中，模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由4根固定床離子交換柱組成，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)有I根離子交換柱。洗脫液流速100ml/min ;進(jìn)樣液流速為5 ml/min ;提取液流速為80ml/min ;提余液流速為25ml/min ;切換時(shí)間為18mim ;整個(gè)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)的溫度為24°C，進(jìn)料液、洗脫液溫度為24°C。成品HPLC法檢測(cè):PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)，蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱 Hedera 0DS-2 (4.6mmX 250mm，5 μ m)，流動(dòng)相為 V (H2O)=V (CH3CN)=V (TFA)=96.9:3:0.1，流速lml/min，進(jìn)樣量20μ 1，檢測(cè)溫度25°C，使用外標(biāo)法測(cè)定成品谷胱甘肽含量
96.8%ο實(shí)例2:選用谷胱甘肽發(fā)酵液，在四區(qū)模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的分離純化，具體步驟為:
a、用60%的乙醇對(duì)發(fā)酵液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液；
b、將上清液減壓濃縮得粗提物；
C、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為15g/l，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ;d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為1.0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。本發(fā)明方法中模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由8根固定床離子交換柱組成，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)有2根離子交換柱。洗脫液流速200ml/min ;進(jìn)樣液流速為10 ml/min ;提取液流速為lOOml/min ;提余液流速為110ml/min ;切換時(shí)間為18mim ;整個(gè)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)的溫度為24°C，進(jìn)料液、洗脫液溫度為24°C。成品HPLC法檢測(cè):PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)，蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱 Hedera 0DS-2 (4.6mmX 250mm，5 μ m)，流動(dòng)相為 V (H2O)=V (CH3CN)=V (TFA)=96.9:3:0.1，流速lml/min，進(jìn)樣量20μ 1，檢測(cè)溫度25°C，使用外標(biāo)法測(cè)定成品谷胱甘肽含量
96.9%ο實(shí)例3:選用谷胱甘肽發(fā)酵液，在四區(qū)模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的分離純化，具體步驟為:
a、用60%的乙醇對(duì)發(fā)酵液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液；
b、將上清液減壓濃縮得粗提物；
C、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為30g/l，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ;d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為1.0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。本發(fā)明方法中模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由12根固定床離子交換柱組成，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)有3根離子交換柱。洗脫液流速300ml/min ;進(jìn)樣液流速為30 ml/min ;提取液流速為150ml/min ;提余液流速為180ml/min ;切換時(shí)間為22mim ;整個(gè)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)的溫度為28°C，進(jìn)料液、洗脫液溫度為28°C。成品HPLC法檢測(cè):PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)，蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱 Hedera 0DS-2 (4.6mmX 250mm，5 μ m)，流動(dòng)相為 V (H2O)=V (CH3CN)=V (TFA)=96.9:3:0.1，流速lml/min，進(jìn)樣量20μ 1，檢測(cè)溫度25°C，使用外標(biāo)法測(cè)定成品谷胱甘肽含量
97.1%。實(shí)例4:選用谷胱甘肽發(fā)酵液，在四區(qū)模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的分離純化，具體步驟為:
a、用60%的乙醇對(duì)發(fā)酵 液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液；b、將上清液減壓濃縮得粗提物；
C、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為50g/l，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ；d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為1.0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。本發(fā)明方法中模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由16根固定床離子交換柱組成，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)有4根離子交換柱。洗脫液流速500ml/min ;進(jìn)樣液流速為40 ml/min ;提取液流速為200ml/min ;提余液流速為340ml/min ;切換時(shí)間為24mim ;整個(gè)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)的溫度為32°C，進(jìn)料液、洗脫液溫度為32°C。成品HPLC法檢測(cè):PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)，蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱 Hedera 0DS-2 (4.6mmX 250mm，5 μ m)，流動(dòng)相為 V (H2O)=V (CH3CN)=V (TFA)=96.9:3:0.1，流速lml/min，進(jìn)樣量20μ 1，檢測(cè) 溫度25°C，使用外標(biāo)法測(cè)定成品谷胱甘肽含量
97.5%。實(shí)例5:選用谷胱甘肽發(fā)酵液，在四區(qū)模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的分離純化，具體步驟為:
a、用60%的乙醇對(duì)發(fā)酵液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液；
b、將上清液減壓濃縮得粗提物；
C、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為60g/l，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ;d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為1.0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。本發(fā)明方法中模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由12根固定床離子交換柱組成，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)由3根離子交換柱。洗脫液流速600ml/min;進(jìn)樣液流速為50 ml/min ;提取液流速為300ml/min ;提余液流速為350ml/min ;切換時(shí)間為22min ;整個(gè)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)的溫度為28°C，進(jìn)料液、洗脫液溫度為28°C。成品HPLC法檢測(cè):PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)，蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱 Hedera 0DS-2 (4.6mmX 250mm，5 μ m)，流動(dòng)相為 V (H2O)=V (CH3CN)=V (TFA)=96.9:3:0.1，流速lml/min，進(jìn)樣量20μ 1，檢測(cè)溫度25°C，使用外標(biāo)法測(cè)定成品谷胱甘肽含量
97.2%。
權(quán)利要求
1.一種四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中的谷胱甘肽的方法，具體步驟為 a、用60%的乙醇對(duì)發(fā)酵液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液； b、將上清液減壓濃縮得粗提物； C、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為5飛Og/Ι，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2. 5 ； d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為I. 0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷胱甘肽的方法中的模擬移動(dòng)床，其特征在于該模擬移動(dòng)床由洗脫泵、進(jìn)樣泵、提取泵、色譜柱、電磁閥、信號(hào)采集器、系統(tǒng)控制器和計(jì)算機(jī)連接組成，洗脫液流速為(TlOOOml/min，進(jìn)樣液流速為(Γ50 ml/min，提取液流速為(T500ml/min，提余液流速為(T500ml/min，切換時(shí)間為18 24min，模擬移動(dòng)床的溫度為24 32°C，進(jìn)料液、洗脫液溫度為24 32°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷胱甘肽的方法中的模擬移動(dòng)床，其特征在于該模擬移動(dòng)床由Γ16根固定床離子交換柱組成，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)由f 4根離子交換柱，其中，一區(qū)位于洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區(qū)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中的雜質(zhì)的解吸；二區(qū)位于提取液出口處與進(jìn)料口之間，在此區(qū)內(nèi)使發(fā)酵液中的雜質(zhì)反復(fù)吸附、解吸而濃縮；三區(qū)位于進(jìn)料口與提余液出口之間，在此區(qū)內(nèi)使谷胱甘肽吸附在固定相上，從相應(yīng)出口得到谷胱甘肽純品；四區(qū)位于提余液出口與洗脫液入口之間，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進(jìn)入一區(qū)，可循環(huán)利用；另一方面將三區(qū)與一區(qū)隔開，防止提余液中的谷胱甘肽進(jìn)入一區(qū)而污染。
全文摘要
本發(fā)明公開了四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷胱甘肽的方法，具體步驟為a、用60%的乙醇對(duì)發(fā)酵液浸提3h，7000r/min離心20min，取上清液；b、將上清液減壓濃縮得粗提物；c、用去離子水將得到的粗提物配成濃度為5~60g/l，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.5；d、采用裝填有陽(yáng)離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床分離純化谷胱甘肽發(fā)酵液粗提物的進(jìn)樣液，由濃度為1.0%的NaCl溶液作為洗脫液，控制模擬移動(dòng)床各功能區(qū)的流動(dòng)相流速和柱切換時(shí)間，將谷胱甘肽和雜質(zhì)分離，從提余液出口處收集得到谷胱甘肽純品，從提取液出口處得到雜質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K1/18GK103254276SQ201210037280
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者金新亮, 李勝迎, 李枝玲, 張大兵, 羅軍俠, 張寧 申請(qǐng)人:江蘇漢邦科技有限公司