專利名稱：融合蛋白的制作方法
融合蛋白
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸分子和能同時(shí)和選擇性地與膠原和CD133蛋白結(jié)合的多肽。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的核酸分子的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。多肽可用于預(yù)防，治療或診斷心血管疾病。因此，本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的多肽，其是優(yōu)選二聚體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
內(nèi)皮祖先細(xì)胞(EPC)居住在骨髓及釋放到血流，在這里它們涉及止血和組織修復(fù)。CD133蛋白，長(zhǎng)效五羥淀粉跨膜糖蛋白，在EPC表面表達(dá)，在這里EPC分化為內(nèi)皮細(xì)胞后表達(dá)下調(diào)。⑶133不在血的任何其他細(xì)胞類型上表達(dá)，這使其成為EPC募集的有吸引力的靶標(biāo)。
從WO 2008/101700知道能將內(nèi)皮祖先細(xì)胞(EPC)吸引到血管損傷位點(diǎn)的雙特異性蛋白。由WO 2008/101700公開的蛋白含有能以高親和性結(jié)合EPC上的⑶133的部分。而且，由WO 2008/101700公開的蛋白含有部分能識(shí)別及結(jié)合血管的內(nèi)皮襯中的損傷。根據(jù)W02008/101700，通過連接能結(jié)合內(nèi)皮前體細(xì)胞的第I蛋白和能結(jié)合膠原的第2蛋白來制備蛋白。第I和第2蛋白通過使用SPDP (N-琥珀酰亞胺基3_(2_吡啶二硫基)_丙酸酯)，其是異雙官能交聯(lián)劑來連接。由于第I蛋白含有與SPDP具有反應(yīng)性的約25個(gè)賴氨酸殘基，及第2蛋白含有約18個(gè)賴氨酸殘基，可能的二聚產(chǎn)物數(shù)是至少450 (18X25)。此外，更高寡聚體的形成不可避免。因此，交聯(lián)的產(chǎn)物含有產(chǎn)物的異源混合物。順便而言，混合物不含有任何第I和第2蛋白的融合蛋白，由于產(chǎn)物未通過編碼第I和第2蛋白的2個(gè)或更多基因的接合來制備。因此，無由WO 2008/101700可利用的產(chǎn)物可被認(rèn)為是融合基因的翻譯產(chǎn)物或作為具有源于各原蛋白的功能性質(zhì)的單多肽。由WO 2008/101700公開的蛋白混合物不合適于用作藥物，由于混合物不可以標(biāo)準(zhǔn)化的及定義的組成和對(duì)于治療性應(yīng)用適合的足夠的純度提供。而且，由于寡聚體不可避免，WO 2008/101700的混合物的產(chǎn)率和功效有問題。另一方面，制備含有在WO 2008/101700的混合物中存在的多肽序列的融合蛋白的嘗試不能結(jié)合能選擇性地和同時(shí)結(jié)合內(nèi)皮前體細(xì)胞和膠原的第2蛋白。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供能同時(shí)和選擇性地與膠原和CD133蛋白結(jié)合的小尺寸多肽，其中可以高產(chǎn)率和高純度制備在藥物組合物中有用的蛋白，用于由EPC分化為血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞直接或由陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子的分泌間接改善治愈過程。本發(fā)明提供編碼特定融合蛋白的核酸分子。融合蛋白可通過EPC歸巢到暴露的膠原用于治療或預(yù)防心血管疾病，或用于診斷目的。根據(jù)第I方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其選自i.包含與SEQ ID NO: I的核苷酸序列或其補(bǔ)體具有至少85%同一性的核苷酸序列的核酸分子；ii.包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列，或其補(bǔ)體的至少1500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的核酸分子；iii.編碼包含與SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子;iv.編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中所述片段包含SEQ ID NO:2的至少500個(gè)連續(xù)的氨基酸；以及V.編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的變體的核酸分子，其中所述核酸分子在6. OXSSC中于45°C溫育、之后是在O. 2XSSC/0. 1%SDS中于65°C洗滌的條件下與包含整個(gè)SEQ ID NO: I的核酸分子，或其補(bǔ)體雜交。SEQ ID NO: I的核酸序列如下 ATGGAAACCCCTGCTCAGCTGCTGTTCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCTGACACCACCGGCGACATCCTGATGACCCAGTCCCCCAAGTCCATGTCCATGTCCCTGGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCAAGGCCTCCGAGAACGTGGACACCTACGTGTCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGAGCAGTCCCCTAAGGTGCTGATCTACGGCGCCTCCAACAGATACACCGGCGTGCCCGACAGATTCACCGGCTCCGGCTCCGCCACCGACTTCTCCCTGACCATCTCCAACGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGATTACCACTGCGGCCAGTCCTACAGATACCCTCTGACCTTCGGCGCTGGCACAAAGCTGGAACTGAAGGGCGGAGGCGGAAGTGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCTCTGAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCCCTGACCTGATGAAGCCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCAACTACTACGTGCACTGGGTGAAACAGTCCCTGGACAAGTCCCTGGAATGGATCGGCTACGTGGACCCTTTCAACGGCGACTTCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTAGCTCCACCGCCTACATGCACCTGTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCCTGgATTGGTACGACACCTCCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGAACCGCTGTGACCGTGTCCTCCCAGTCTGGCCCTCTGCCTAAGCCTTCCCTGCAGGCCCTGCCTTCCTCCCTGGTGCCTCTGGAAAAGCCAGTGACCCTGCGGTGTCAGGGACCTCCTGGCGTGGACCTGTACCGGCTGGAAAAGCTGTCCTCCAGCAGATACCAGGACCAGGCCGTGCTGTTCATCCCTGCCATGAAGCGGTCCCTGGCCGGCAGGTACAGGTGCTCCTACCAGAACGGCTCCCTGTGGTCTCTGCCTTCCGACCAGCTGGAACTGGTCGCCACAGGCGTGTTCGCCAAGCCTTCTCTGTCTGCCCAGCCTGGCCCTGCTGTGTCCTCTGGCGGCGACGTGACCCTGCAGTGCCAGACCAGATACGGCTTCGACCAGTTCGCCCTGTACAAAGAGGGCGACCCAGCCCCTTACAAGAACCCTGAGCGGTGGTACAGGGCCTCCTTCCCTATCATCACCGTGACCGCCGCTCACTCCGGAACCTACCGGTGCTACAGCTTCTCCTCCCGGGACCCTTACCTGTGGTCCGCCCCTAGCGACCCTCTGGAACTGGTGGTCACCGGCACCTCCGTGACCCCTTCCAGGCTGCCTACCGAGCCTCCTAGCTCCGTGGCCGAGTTCTCTGAGGCCACCGCCGAGCTGACCGTGTCTTTCACCAACAAGGTGTTCACCACCGAGACATCCCGGTCCATCACCACCTCCCCCAAAGAGTCCGACTCTCCTGCCGGCCCTGCTCGGCAGTACTACACCAAGGGCAACGGCGGCAGAGTGGAGTGTCCTCCTTGCCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGACAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACAGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG根據(jù)第2方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的第I方面的核酸分子的宿主細(xì)胞。根據(jù)第3方面，本發(fā)明提供能同時(shí)和選擇性地與膠原和CD133蛋白結(jié)合的多肽，其選自(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段，其中所述片段包含SEQ IDNO:2的至少600個(gè)連續(xù)的氨基酸；(b)包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列的多肽的變體，其中所述變體由與包含整個(gè)SEQ ID NO: I的核酸分子或其補(bǔ)體在6. OX SSC中于45°C溫育、之后是在O. 2X SSC/0. 1%SDS中于65°C洗滌的條件下雜交的核酸分子編碼；(C)由以下核酸分子編碼的多肽,所述核酸分子包含與由SEQ IDN0:1的核苷酸序列組成的核酸或其補(bǔ)體具有至少85%同一性的核苷酸序列；以及·
(d)包含與SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽。根據(jù)第3方面的多肽對(duì)于用于預(yù)防或治療心血管疾病是有利的。SEQ ID NO:2的氨基酸序列如下METPAQLLFLLLLWLPDTTCDILMTQSPKSMSMSLGERVTLSCKASENVDTYVSWYQQKPEQSPKVLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFSLTISNVQAEDLADYHCGQSYRYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPDLMKPGASVKISCKASGYSFTNYYVHWVKQSLDKSLEWIGYVDPFNGDFNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGGLDWYDTSYWYFDVWGAGTAVTVSSQSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKE⑶PAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELWTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGNGGRVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK根據(jù)第4方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽的方法，所述方法包括在核酸分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)第3方面的宿主細(xì)胞。根據(jù)第5方面，本發(fā)明提供包含根據(jù)本發(fā)明的第3方面的多肽的藥物組合物。根據(jù)第6方面，本發(fā)明提供根據(jù)第3方面的多肽用于制備預(yù)防或治療心血管疾病的藥物的用途。本發(fā)明展示，可以高效率在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的本發(fā)明的融合蛋白，能以高親和性結(jié)合其靶⑶133和膠原，及甚至在動(dòng)態(tài)條件下能將表達(dá)⑶133的HEK 293細(xì)胞固定到膠原包被的表面，如流室實(shí)驗(yàn)中顯示。與含有與GPVI-Fc化學(xué)連接的W6B3H10mAb的W02008/101700的蛋白混合物可比
較，本發(fā)明的融合蛋白能在小鼠模型中將自人臍帶血分離的CD133陽(yáng)性祖先細(xì)胞募集到誘導(dǎo)的血管損傷。而且，募集的EPC分化為內(nèi)皮細(xì)胞，由此直接貢獻(xiàn)于內(nèi)皮壁的再生。因此，本發(fā)明的融合蛋白增加再內(nèi)皮化，且在再生血管醫(yī)學(xué)中有有益價(jià)值。本發(fā)明的多肽對(duì)于由分化為血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞直接或由陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子的分泌間接改善治愈過程是有用的。優(yōu)于以往的化學(xué)連接的構(gòu)建體，新融合蛋白對(duì)膠原具有更高親和性(見圖9)。這表示用作對(duì)于局部結(jié)合血管損傷有更高功效的藥物的優(yōu)勢(shì)。在融合蛋白的各種可能性中，僅scFv-lh顯示對(duì)⑶133可比較的高親和性，然而其他來源的構(gòu)建體未顯示(見圖5)。除了本發(fā)明的多肽對(duì)于血管再生過程的應(yīng)用之外，也可采用以在由化學(xué)治療或放射治療消除骨髓之后改善移植的干細(xì)胞歸巢到骨髓。本發(fā)明提供能同時(shí)和選擇性地與膠原和⑶133蛋白結(jié)合的小尺寸的根據(jù)SEQ IDNO: 2的多肽。本發(fā)明的蛋白可以高產(chǎn)率和高純度制備，這使得其在藥物組合物中高度有用。本發(fā)明的多肽是融合蛋白，S卩，融合基因的翻譯產(chǎn)物。融合蛋白含有單鏈抗-CD133抗體結(jié)構(gòu)域，接頭，F(xiàn)e部分，及GPVI部分。本發(fā)明的蛋白可為二聚體形式。本發(fā)明的多肽基于單鏈抗體(scFv)，其僅由單克隆抗體的輕和重鏈的可變序列組成，其由連接的接頭肽組合在一個(gè)多肽鏈上。此單鏈抗體以意外地高親和性保留對(duì)于親本mAb的抗原的特異性。根據(jù)本發(fā)明使用的親本mAb可由小鼠雜交瘤細(xì)胞克隆W6B3H10，可商購(gòu)的克隆 W6B3C1 (Miltenyi, Bergisch Gladbach)的亞克隆產(chǎn)生?！ひ?yàn)楸景l(fā)明的多肽的抗體部分源于小鼠單克隆抗體，含有此部分的融合蛋白是小鼠-人嵌合蛋白。由于有技術(shù)可利用，以在基于重組抗體的藥學(xué)中取代小鼠來源的序列，其成為了開發(fā)人源化的或完全人的治療性分子的本領(lǐng)域狀態(tài)。此尤其當(dāng)重復(fù)施用時(shí)，減少或防止針對(duì)治療性蛋白的免疫應(yīng)答。因此，可使本發(fā)明的多肽的單鏈部分由稱之為CDR移植的方法經(jīng)歷人源化過程。在此，將包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的小鼠來源的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人框架殘基?？蓪⒃从谖锓N小鼠的融合蛋白的抗體部分通過小鼠CDR的CDR移植到人共有受體框架序列來成功地人源化。人源化的融合蛋白保留對(duì)其靶蛋白CD133和膠原I的結(jié)合性質(zhì)，及以相比融合蛋白類似親和性與小鼠單鏈序列結(jié)合。第2融合偶體能識(shí)別及結(jié)合血管內(nèi)皮襯中的損傷。在內(nèi)皮細(xì)胞層由手術(shù)干預(yù)諸如支架移植損傷之后或動(dòng)脈粥樣硬化性噬斑破裂之后，膠原，內(nèi)皮下基質(zhì)的成分，暴露于血流。此導(dǎo)致血小板的快速附接和活化，其進(jìn)而可導(dǎo)致血栓形成和血管的最終阻塞。人源化的融合蛋白能抑制血小板與損傷的血管壁的結(jié)合，如由降低的血栓形成區(qū)顯示(見圖22)。相比具有小鼠抗體序列的前體分子，預(yù)期施用之后人源化的融合蛋白改善患者的免疫系統(tǒng)的耐受性。血小板經(jīng)在血小板表面上表達(dá)的糖蛋白VI(GPVI)，膜糖蛋白受體粘附于膠原。人血小板糖蛋白VI的可溶性部分，其對(duì)應(yīng)于蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，顯示對(duì)膠原的高結(jié)合親和力。GPVI以高親和性作為同源二聚體結(jié)合膠原。為了一方面輔助二聚化和另一方面輔助融合蛋白由親和層析的純化，將人IgG的Fe部分附接于可溶性GPVI部分。Fe-片段經(jīng)鉸鏈區(qū)的余下的部分中的共價(jià)二硫鍵形成二聚體，其促進(jìn)很可能由二硫鍵形成支持的GPVI的二聚化。而且，F(xiàn)e-標(biāo)簽增加血流中融合蛋白的半衰期。

圖I顯示W(wǎng)6B3H10輕和重可變區(qū)cDNA的組裝的序列。特別是，圖IA顯示κ輕鏈的序列。加下劃線的序列屬于輕鏈序列的恒定區(qū)。圖IB顯示Y重鏈的序列。圖2顯示A中描繪的構(gòu)建體scFv-lh和B中顯示的scFv_hl的核苷酸序列。A中的加下劃線的序列源于重鏈的恒定區(qū)，B中的加下劃線的序列源于輕鏈的恒定區(qū)。Gly-Ser接頭序列以斜體字書寫。圖3顯示使用Strep-Tactin基質(zhì)自CHO細(xì)胞上清液純化單鏈抗體scFv_lh的蛋白印跡，用Str印MAb-典型-HRP抗體檢測(cè)。顯示流通(FT)，頭2個(gè)洗滌級(jí)分(Wl，W2)，洗出液級(jí)分I 5 (El E5)和洗脫后基質(zhì)(M)。在泳道E2 E5中在約27kDa的預(yù)期的尺寸顯示特異性條帶。泳道M顯示非特異性信號(hào)。圖4顯示自細(xì)菌的scFv-hl的純化的考馬斯凝膠。B，細(xì)菌裂解物，E2/3，組合的洗出液2和3，E4，E5，洗出液級(jí)分4和5。圖5顯示單鏈抗體與固定的AC133/293細(xì)胞上的⑶133的結(jié)合。A，濃度依賴性結(jié)合性質(zhì)B，2nmol/L W6B3H10mAb與固定的AC133/293細(xì)胞上的⑶133的結(jié)合由單鏈抗體scFv-lh的競(jìng)爭(zhēng)。圖6顯示融合蛋白scFv-lh-GPVI-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO: I)和氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。圖IA顯示對(duì)于在CHO細(xì)胞中有效表達(dá)密碼子-優(yōu)化的核苷酸序列，其中編 碼單鏈部分的序列加下劃線。圖IB顯示自核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。顯示的20個(gè)氨基酸前導(dǎo)序列肽在成熟蛋白中缺乏。單鏈部分的序列加下劃線。GPVI和FcIgG2由以粗體顯示的GGR-接頭連接。圖7顯示在非-還原和還原性條件下在4 20%聚丙烯酰胺凝膠上分離的融合蛋白，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。圖8顯示融合蛋白與固定的AC133/293細(xì)胞上的⑶133結(jié)合的表征。圖8A顯示用于比較融合蛋白和親本mAb W6B3H10的結(jié)合的滴定ELISA。圖8B顯示用2nM W6B3H10mAb和融合蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)物的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。圖9顯示由ELISA測(cè)量融合蛋白相比GPVI-FcIgGl與O. Iyg牛膠原I的結(jié)合。圖9A展示濃度依賴性結(jié)合。圖9B展示融合蛋白與I μ g/ml固定的膠原I結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，由增加量的可溶性膠原I競(jìng)爭(zhēng)。圖10展示表達(dá)⑶133的細(xì)胞及HEK 293對(duì)照細(xì)胞與膠原在2000/s剪力下融合蛋白介導(dǎo)的結(jié)合。圖11展示在體內(nèi)連接誘導(dǎo)的損傷之后，qEPC與小鼠頸動(dòng)脈的融合蛋白介導(dǎo)的結(jié)合，由活體熒光顯微鏡檢測(cè)量。圖12顯示融合蛋白對(duì)左心室功能(A)及對(duì)梗塞尺寸(B)的效應(yīng)。N=5/6，*p〈0. 05，**ρ〈0·005 (t 檢驗(yàn))。圖13顯示由含有人源化的序列的噬菌體克隆相比帶有小鼠單鏈序列的噬菌體mlh的FACS分析的親和性測(cè)量。圖13A顯示噬菌體克隆26相比噬菌體mlh的親和性。圖13B顯示噬菌體克隆27和噬菌體克隆29相比噬菌體mlh的親和性。使用Graphpad Prism4. O軟件進(jìn)行分析。當(dāng)輸入平均FI (熒光指標(biāo))，Geo-平均FI或中位FI時(shí)測(cè)量pM中的相對(duì)親和性。圖14顯示以供體序列作為陰性對(duì)照，而受體序列作為陽(yáng)性對(duì)照評(píng)定人源化的抗體序列的人性。A，供體VL ；B,受體VL ；C,克隆26VL ；D,供體VH ；E,受體VH ；F,克隆26VH。圖15顯示使用NCBI的BlastP程序比較蛋白序列。圖15A顯示親本小鼠單鏈抗體(SEQ ID NO:22 ;小鼠)和人受體序列(SEQ IDN0:23 ;受試者)的序列比對(duì)。圖15B顯示人源化的單鏈抗體克隆26 (SEQ ID NO:24 ;人源化的)和人受體序列(SEQ ID N0:23;受試者)的序列比對(duì)。框住及指示輕(CDR-L1 (SEQ ID NO:25)，CDR-L2 (SEQ ID NO:26)和 CDR-L3(SEQ ID NO:27))和重鏈(CDR-Hl (SEQ ID NO:28)，CDR-H2 (SEQ ID NO:29)和 CDR-H3 (SEQIDNO: 30))的互補(bǔ)決定區(qū)。圖16顯示人源化的融合蛋白(SEQ ID NO: 15 ;上行)與含有小鼠來源的單鏈部分的融合蛋白(SEQ ID NO:2 ;下行)使用NCBI的Blastx程序的蛋白序列比對(duì)。序列顯不蛋白水平上95%的同一性。圖17顯示具有源于鑒定的噬菌體克隆26的單鏈部分的人源化的融合蛋白hscFv-lh-GPVI-Fc 的核苷酸(SEQ ID NO: 14)和氨基酸序列(SEQ ID N0:15)。圖 17A 顯示對(duì)于在CHO細(xì)胞中有效表達(dá)密碼子-優(yōu)化的核苷酸序列(SEQ ID NO: 14)，其中編碼人源化的單鏈部分的序列加下劃線。圖17B顯示自核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID N0:15)。顯示的20個(gè)氨基酸前導(dǎo)序列肽在成熟蛋白中缺失。人源化的單鏈部分的序列加下劃線。圖18顯示分別在還原及非-還原性條件下，在4 20%聚丙烯酰胺凝膠上與 scFv-lh-GPVI-Fc (m)—起分離的人源化的融合蛋白hscFv-lh-GPVI-Fc (h)。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。圖19顯示融合蛋白與固定的AC133/293細(xì)胞上的⑶133抗原的結(jié)合的表征。圖19A顯示用于比較人源化的和非-人源化的融合蛋白的結(jié)合的細(xì)胞ELISA。圖19B顯示2nMW6B3H10mAb與固定的AC133/293細(xì)胞的結(jié)合由人源化的和非-人源化的融合蛋白的競(jìng)爭(zhēng)。包括Fe-蛋白作為陰性對(duì)照。圖20顯示由ELISA測(cè)量的人源化的和非-人源化的融合蛋白與O. Iyg固定的牛膠原I的劑量-依賴性結(jié)合。將Fe-蛋白用作陰性對(duì)照。圖21顯示源于噬菌體克隆27的人源化的單鏈抗體的核苷酸序列(SEQ ID NO: 16 ；在圖21A中)和氨基酸序列(SEQ ID N0:17 ;在圖21B中)。圖21C顯示編碼包含克隆27的人源化的序列的融合蛋白的序列(SEQ ID NO: 18 ;查詢)和小鼠(SEQ ID N0:2;受試者)單鏈抗體序列的DNA序列比對(duì)，其中序列同一性是96%。圖22顯示源于噬菌體克隆29的人源化的單鏈抗體的核苷酸序列(SEQ ID NO: 19 ；在圖22A中)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 20 ;在圖22B中)。圖22C顯示編碼包含克隆29的人源化的序列的融合蛋白的序列(SEQ ID N0:21 ;查詢)和小鼠(SEQ ID N0:2;受試者)單鏈抗體序列的DNA序列比對(duì)，其中序列同一性是96%。圖23顯示在結(jié)扎左頸總動(dòng)脈之后血小板聚集物的尺寸分析。結(jié)果作為自5個(gè)體/組的平均值土 SEM給出。發(fā)明詳述當(dāng)多肽可以其在CD133蛋白和膠原蛋白之間形成橋的狀態(tài)存在時(shí)，尤其是在本實(shí)施例中描述的條件下，多肽能同時(shí)與膠原和⑶133蛋白結(jié)合。分別與SEQ ID NO: I或SEQID NO: 2具有約85%同一性，優(yōu)選90%，95%或98%同一性的氨基酸或核苷酸序列在本文被定義為足夠同一。因此，術(shù)語〃足夠同一 〃指稱第I氨基酸或核苷酸序列與第2氨基酸或核苷酸序列(SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2)含有足夠的或最小數(shù)的同一或相當(dāng)?shù)?例如，具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基)氨基酸殘基或核苷酸，使得第I和第2氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。如本文所用，“融合蛋白”是發(fā)揮融合蛋白活性的多肽。如本文所用，"融合蛋白活性"，"融合蛋白的生物學(xué)活性"或"融合蛋白的功能活性〃指稱同時(shí)和選擇性與膠原和CD133蛋白結(jié)合。核酸分子本發(fā)明針對(duì)核酸分子，其與SEQ ID NO: I顯示的核苷酸序列，或其補(bǔ)體具有足夠的同一性，即具有至少85% (90%，95%或98%)同一性。本發(fā)明針對(duì)核酸分子，其包括SEQ ID NO: I顯示的核苷酸序列，或其補(bǔ)體的至少1500 (1600，1800，2000，2200)個(gè)核苷酸的片段。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子具有SEQ ID NO: I顯示的核苷酸序列。也在本發(fā)明之內(nèi)的是編碼具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子。本發(fā)明也包括編碼多肽的核酸分子，其中所述核酸與由SEQ IDN0:2組成的核酸分子在嚴(yán)格條件下雜交(例如，在6*氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)于約60°C雜交，之后是在O. 2*SSC，0. 1%SDS于65°C—次或更多洗滌)，且其中所述核酸編碼至少500個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少700個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，在翻譯后修飾之前及以還原型具有大致65 85kD的分子量的多 肽。本發(fā)明的一方面屬于編碼融合蛋白或其有生物學(xué)活性的部分的分離的核酸分子，以及對(duì)于用作鑒定編碼融合蛋白的核酸(例如，融合蛋白mRNA)的雜交探針足夠的核酸分子和對(duì)于用作用于融合蛋白核酸分子的擴(kuò)增或突變的PCR引物足夠的片段。如本文所用，術(shù)語〃核酸分子〃旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈DNA。"分離的"核酸分子是從核酸的天然的來源中存在的其他核酸分子分離的核酸分子。優(yōu)選地，〃分離的〃核酸無(優(yōu)選蛋白編碼序列)天然地側(cè)接核酸所來源的生物的基因組DNA中的核酸的序列。而且，〃分離的〃核酸分子，諸如cDNA分子，可為基本上無其他細(xì)胞物質(zhì)，或當(dāng)由重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)是培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上無化學(xué)前體或其他化學(xué)品。本發(fā)明的核酸分子，例如，具有SEQ ID NO: I的核苷酸序列，或此核苷酸序列的任何補(bǔ)體的核酸分子，可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息分離(Sambix)Oket al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual.2nd,ed. , Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N. Y.，1989)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含是SEQ ID N0:1顯示的核苷酸序列的補(bǔ)體，或其部分的核酸分子。與給定核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與給定核苷酸序列足夠互補(bǔ)的核酸分子，其可與核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定的雙聯(lián)體。而且，本發(fā)明的核酸分子可僅包含編碼融合蛋白的部分核酸序列，例如，可用作探針或引物的片段或編碼融合蛋白的有生物學(xué)活性的部分的片段。編碼融合蛋白的〃有生物學(xué)活性的部分〃的核酸片段可通過分離編碼具有融合蛋白生物學(xué)活性的多肽的SEQ ID NO: I的部分，表達(dá)融合蛋白的編碼的部分(例如，由體外重組表達(dá))及評(píng)定融合蛋白的編碼的部分的活性來制備。本發(fā)明還包括由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性不同于SEQ ID NO: I的核苷酸序列，由此編碼與由SEQ ID NO: I顯示的核苷酸序列編碼的相同的融合蛋白的核酸分子。因此，在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子是至少1500 (1600,1800,2000，2200)個(gè)核苷酸長(zhǎng)度及在嚴(yán)格條件下與包含SEQID NO: I的核苷酸序列，優(yōu)選編碼序列的核酸分子雜交。如本文所用，術(shù)語〃在嚴(yán)格條件下雜交〃旨在描述雜交及洗滌條件，在該條件下，彼此具有至少85%(95%，98%)同一性的核苷酸序列一般保持彼此雜交。該嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和可見于Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&S ons, N.Y. (1989),6. 3. 1-6. 3.6。嚴(yán)格雜交條件的一例是在6*氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約4°C雜交，之后是在O. 2*SSC，0. 1%SDS中于50 65°C (例如，50°C或60°C或65°C)—次或更多洗滌。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。變化可由突變導(dǎo)入SEQ ID NO: I的核苷酸序列，由此不改變?nèi)诤系鞍椎墓δ苣芰Χ鴮?dǎo)致編碼的蛋白的氨基酸序列的變化。例如，可進(jìn)行導(dǎo)致在"非-必要的"氨基酸殘基的氨基酸取代的核苷酸取代。"非-必要的"氨基酸殘基是可不改變生物學(xué)活性而自SEQID NO: 2的序列改變的殘基，然而"必要的"氨基酸殘基對(duì)于融合蛋白的生物學(xué)活性是需要的。因此，本發(fā)明的另一方面屬于編碼含有對(duì)于活性不是必要的氨基酸殘基中的變化 的融合蛋白的核酸分子。該融合蛋白在氨基酸序列上與SEQ ID N0:2不同，且仍保留生物學(xué)活性。在一實(shí)施方式中，核酸分子包括編碼包括與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少約85%，95%或98%同一性的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。編碼具有不同于SEQ ID NO: I的序列的序列的融合蛋白的分離的核酸分子可通過將一個(gè)或更多核苷酸取代，添加或缺失導(dǎo)入融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO: I)，使得一個(gè)或更多氨基酸取代，添加或缺失導(dǎo)入編碼的蛋白來創(chuàng)建。突變可由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變來導(dǎo)入。優(yōu)選地，在一個(gè)或更多預(yù)測(cè)的非-必要的氨基酸殘基制造保守性氨基酸取代。由此，例如，1%，2%，3%，5%或10%的氨基酸可被保守性取代取代。"保守性氨基酸取代"是氨基酸殘基用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的取代。已在本領(lǐng)域定義具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性的側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β -分支的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。由此，融合蛋白中的預(yù)測(cè)的非必要氨基酸殘基優(yōu)選用來自相同的側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基取代?；蛘撸蛔兛裳刂炕虿糠秩诤系鞍拙幋a序列，諸如由飽和誘變隨機(jī)導(dǎo)入，且可就融合蛋白生物學(xué)活性篩選得到的突變體，以鑒定保留活性的突變體。通過誘變，編碼的蛋白可重組表達(dá)，且可測(cè)定蛋白活性。可檢定突變?nèi)诤系鞍椎耐瑫r(shí)和選擇性地與CD133和膠原結(jié)合的能力。本發(fā)明也涉及包含編碼本發(fā)明的人源化的免疫球蛋白(例如，單鏈抗體)的核酸序列的分離的核酸分子，以及涉及包含編碼人源化的免疫球蛋白輕鏈(例如，編碼SEQ IDNO: 12，13，14或15的氨基酸序列的序列和/或編碼SEQ ID NO: 111，116的氨基酸序列的序列或其部分)或重鏈(例如，編碼SEQ ID NO: 17，18，19或20的氨基酸序列的序列和/或編碼SEQ ID NO: 110，114的氨基酸序列的序列或其部分)的序列的分離的核酸分子。而且，本發(fā)明涉及包含編碼包含源于對(duì)⑶133具有結(jié)合特異性的非人抗體(例如，單鏈抗體)的免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的人源化的免疫球蛋白的核酸序列(例如，編碼包含SEQ ID NO: 25，26，27，28，29和/或30的氨基酸序列或其部分的序列)及源于人來源的免疫球蛋白的框架區(qū)(例如，編碼SEQ ID NO:23的氨基酸序列的序列或其部分)的分離的核酸分子。本發(fā)明還涉及編碼含有人源化的對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白或該免疫球蛋白的鏈的部分的融合蛋白的核酸分子。提供例如，包含編碼人源化的免疫球蛋白輕鏈的基因，包含編碼源于對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的非人抗體的輕鏈的CDR (例如，編碼包含SEQ ID NO: 25，26和/或27的氨基酸序列或其部分的序列)，及源于人來源的輕鏈框架區(qū)的核苷酸序列的表達(dá)載體。包含編碼人源化的免疫球蛋白重鏈的基因，包含編碼源于對(duì)于⑶133具有結(jié)合特異性的非人抗體的重鏈的⑶R (例如，編碼包含SEQ ID NO:28, 29和/或30的氨基酸序列或其部分的序列)，及源于人來源的重鏈的框架區(qū)的核苷酸序列的表達(dá)載體是該構(gòu)建體的另一例。在一實(shí)施方式中，表達(dá)載體可包括編碼人源化的免疫球蛋白的核酸，其包括編碼包含源于對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的非人抗體的輕鏈的CDR的輕鏈可變區(qū)和來自人來源的輕鏈的框架區(qū)的第I核酸序列，及編碼包含源于對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的非人抗體的重鏈的CDR的重鏈可變區(qū)和來自人來源的重鏈的框架區(qū)的第2核 酸序列(例如，編碼包含SEQ ID NO: 17，20或24的氨基酸序列的序列)。在一實(shí)施方式中，表 達(dá)載體可包括編碼輕鏈的核酸，其包括編碼，例如，自SEQ ID NO: I的輕鏈可變區(qū)(nt 61 381)的第I核酸序列，及編碼，例如自SEQ ID NO: I的重鏈可變區(qū)(nt 427 798)的第2核酸序列或其部分。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體可包括編碼本文所述的輕鏈的核酸及編碼本文所述的重鏈的核酸。分離的融合蛋白和抗-融合蛋白抗體本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少85%，優(yōu)選95%或98%同一性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的一方面屬于分離的融合蛋白，及其有生物學(xué)活性的部分，以及對(duì)于用作免疫原以產(chǎn)生抗-融合蛋白抗體適合的多肽片段。在一實(shí)施方式中，融合蛋白由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。作為重組表達(dá)的替代，融合蛋白或多肽可使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成?！ǚ蛛x的〃或〃純化的〃蛋白或其有生物學(xué)活性的部分是基本上無細(xì)胞物質(zhì)或來自融合蛋白所來源的細(xì)胞或組織來源的其他混雜蛋白，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上無化學(xué)前體或其他化學(xué)品。術(shù)語"基本上無細(xì)胞物質(zhì)"包括融合蛋白的制備物，其中蛋白從其所分離的或重組產(chǎn)生的細(xì)胞的細(xì)胞組分分離。由此，基本上無細(xì)胞物質(zhì)的融合蛋白包括具有少于約30%，20%，10%或5% (由干重)的非-融合蛋白(也在本文稱之為〃混雜蛋白〃)的融合蛋白的制備物。當(dāng)融合蛋白或其有生物學(xué)活性的部分重組產(chǎn)生時(shí)，其也優(yōu)選基本上無培養(yǎng)基，S卩，培養(yǎng)基占蛋白制備物的少于約20%，10%或5%的體積。當(dāng)融合蛋白由化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，其是優(yōu)選基本上無化學(xué)前體或其他化學(xué)品，即，其從涉及蛋白合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)品分離。因此該融合蛋白的制備物具有少于約30%，20%，10%，5% (由干重)的化學(xué)前體或非-融合蛋白化學(xué)品。融合蛋白的有生物學(xué)活性的部分包括包含足夠同一于或源于融合蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID N0:2顯示的氨基酸序列)的氨基酸序列的肽，其相比全長(zhǎng)融合蛋白包括更少氨基酸，且呈現(xiàn)至少融合蛋白活性。一般而言，有生物學(xué)活性的部分包含具有至少融合蛋白活性的結(jié)構(gòu)域或基序。融合蛋白的有生物學(xué)活性的部分可為多肽，其為，例如，至少500，550，600，650或700個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。優(yōu)選的有生物學(xué)活性的多肽包括一個(gè)或更多融合蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是源于選擇性地結(jié)合CD133的單鏈抗體的結(jié)構(gòu)域，接頭，F(xiàn)e部分和GPVI部分。有用的融合蛋白是包括與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少約85%，優(yōu)選95%或99%同一性的氨基酸序列及保留SEQ ID NO:2的融合蛋白的功能活性的蛋白。因?yàn)槿诤系鞍椎目贵w部分源于小鼠單克隆抗體，融合蛋白是小鼠-人嵌合蛋白，其小鼠序列除了那些涉及抗原識(shí)別的之外，可針對(duì)人序列通過抗體人源化取代。一般而言，部分人抗體和完全人抗體相比其他抗體在人身體之內(nèi)具有更長(zhǎng)半衰期。因此，更低劑量和欠頻繁的施用常常是可能的。修飾諸如脂質(zhì)化可用于穩(wěn)定化抗體及增強(qiáng)攝取和組織穿透(例如，進(jìn)入腦)。用于抗體脂質(zhì)化的方法被Cruikshank等人((1997) J. Acquired ImmuneDeficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)描述。2個(gè)序列之間的百分率同源性的確定可使用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的，2個(gè)序列的比較利用的數(shù)學(xué)算法的非限制性例是Karlin和Altschul的算法(1990) Proc. Nat’ I Acad. Sci. USA 87:2264-2268，在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Nat’I Acad. Sci· USA90:5873-5877 中修飾。將該算法并入 Altschul，等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序，分值=100，字長(zhǎng)=12進(jìn)行而獲得與本發(fā)明的核酸分子類似或同源的核苷酸序列。為了為比較目的獲得空位的比對(duì)，可如描述于 Altschul 等人(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 用空位 BLAST。當(dāng)利用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可使用相應(yīng)程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見http: // www.ncbi.nlm.nih.gov。2個(gè)序列之間的百分率同一性可使用類似于上述那些的技術(shù)，允許或不允許間隔測(cè)定。在計(jì)算百分率同一性中，一般計(jì)數(shù)完全匹配。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白產(chǎn)生由標(biāo)準(zhǔn)物重組DNA技術(shù)。例如，DNA片段編碼不同多肽序列，例如通過采用連接用鈍端或交錯(cuò)端，限制酶消化框內(nèi)連接在一起根據(jù)常規(guī)技術(shù)，以提供用于適當(dāng)?shù)哪┒?，適當(dāng)補(bǔ)平粘著端，堿性磷酸酶處理，以避免不期望的接合，及酶促連接。在另一實(shí)施方式中，融合基因可由常規(guī)技術(shù)包括自動(dòng)化的DNA合成儀合成。可使用用于多克隆和單克隆抗體制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將分離的融合蛋白，或其部分或片段，用作免疫原，以產(chǎn)生結(jié)合融合蛋白的抗體?？墒褂萌L(zhǎng)融合蛋白或，替代性地，本發(fā)明提供用作免疫原的融合蛋白的抗原性肽片段。融合蛋白的抗原性肽包含SEQ ID N0:2顯示的氨基酸序列的至少8 (優(yōu)選10，15，20或30)個(gè)氨基酸殘基，及包括融合蛋白表位，使得針對(duì)肽產(chǎn)生的抗體與融合蛋白形成特定免疫復(fù)合物。本發(fā)明也提供含有人源化的對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白的可變區(qū)的多肽。特別是，本發(fā)明也涉及含有人源化的對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白片段的本發(fā)明的融合蛋白的多肽，其中免疫球蛋白包含非人來源(例如，嚙齒動(dòng)物)和至少部分人來源的免疫球蛋白(例如，人框架區(qū)，Y類型的人恒定區(qū))的抗原結(jié)合區(qū)。 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽可還包括全部或部分人來源的恒定區(qū)，例如，全部或部分人重鏈恒定區(qū)和/或人輕鏈恒定區(qū)。而且，本發(fā)明的多肽可包含包括具有一個(gè)或更多突變，例如，減少與Fe受體結(jié)合和/或固定補(bǔ)體的能力的一個(gè)或更多突變的全部或部分人恒定區(qū)的人源化的免疫球蛋白。融合蛋白免疫原可用于通過用所述免疫原免疫適合的受試者，例如，兔，山羊，小鼠或其他哺乳動(dòng)物來制備抗體。適合的受試者用免疫原性融合蛋白制備物的免疫誘導(dǎo)多克隆抗-融合蛋白抗體應(yīng)答。因此，本發(fā)明的另一方面屬于抗-融合蛋白抗體。多克隆抗-融合蛋白抗體可通過用融合蛋白免疫原免疫適合的受試者來制備。針對(duì)融合蛋白的抗體分子可從哺乳動(dòng)物(例如，自血)分離，并由良好知道的技術(shù)，諸如蛋白A層析進(jìn)一步純化，以獲得IgG級(jí)分。在免疫之后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間時(shí)，可從受試者得到抗體-產(chǎn)生細(xì)胞及用于由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如雜交瘤技術(shù)描述的由Kohler和Milstein (1975)Nature 256:495-497,人 B 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor 等人(1983) Immunol Today 4:72),或ElBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等人(1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, Inc. , pp. 77-96)制備單克隆抗體。
重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面屬于載體，優(yōu)選表達(dá)載體，其含有編碼融合蛋白(或其部分)的核酸。如本文所用，術(shù)語〃載體〃指稱能運(yùn)輸已與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是〃質(zhì)?！?，其指稱可連接另外的DNA段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載體，其中可將另外的DNA段連接到病毒基因組。載體可能在導(dǎo)入它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)和附加型哺乳動(dòng)物載體的細(xì)菌載體)。將其他載體(例如，非-附加型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞基因組，及由此隨著宿主基因組復(fù)制。而且，特定載體能指導(dǎo)它們可操作地連接的基因的表達(dá)。一般而言，重組DNA技術(shù)中實(shí)用的表達(dá)載體優(yōu)選是質(zhì)粒(載體)形式。但是，本發(fā)明也包括該其他形式的表達(dá)載體，諸如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含適合于核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式的本發(fā)明的核酸。因此，重組表達(dá)載體包括一個(gè)或更多調(diào)控序列，基于待對(duì)于表達(dá)使用的宿主細(xì)胞選擇的，其可操作地連接到待表達(dá)的核酸序列。在重組表達(dá)載體之內(nèi)，〃可操作地連接的〃旨在表示目標(biāo)核苷酸序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式連接到調(diào)控序列(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，在宿主細(xì)胞中)。術(shù)語"調(diào)控序列"旨在包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如，多聚腺苷酸化信號(hào))。該調(diào)控序列，例如，描述于 Goeddel ;Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。調(diào)控序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成性表達(dá)的那些，和僅在特定宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的表達(dá)的那些(例如，組織-特異性調(diào)控序列)。可將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，由此產(chǎn)生由本發(fā)明的核酸編碼的融合蛋白或肽。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核生物或真核生物細(xì)胞，例如，細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸埃希氏菌(E. coli),昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)，酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)(Goeddel, Gene Expression Technology :Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。或者，重組表達(dá)載體可,例如使用 T7 啟動(dòng)子調(diào)控序列和T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄及翻譯。
在原核生物中蛋白的表達(dá)可在大腸埃希氏菌(E. coli)中，用含有指導(dǎo)蛋白表達(dá)的組成性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體進(jìn)行。融合載體向其編碼的蛋白添加許多氨基酸，通常添加到重組蛋白的氨基末端。該融合載體一般用于3個(gè)目的(I)增加重組蛋白的表達(dá)；
(2)增加重組蛋白的溶解度；及(3)通過作為親和純化中的配體而輔助重組蛋白的純化。常常，在融合表達(dá)載體中，蛋白水解切割位點(diǎn)被導(dǎo)入融合部分和重組蛋白連接處，以致使在融合蛋白純化后重組蛋白自融合部分的分離。該酶，及它們的同源識(shí)別序列，包括因子Xa,凝血酶和腸激酶。典型融合表達(dá)載體包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith andJohnson(1988)Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass)和 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, N. J.)，其分別將谷胱甘肽S_轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖E結(jié)合蛋白，或蛋白A融合到靶重組融合蛋白。適合的誘導(dǎo)性非-融合大腸埃希氏菌(E. coli)表達(dá)載體的例包括pTrc(Amann 等人(1988) Gene 69:301-315)和 pET lid (Studier 等人，Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego, Calif.(1990)60-89)。自pTrc載體的靶基因表達(dá)依賴于自雜交體trp-lac融合啟動(dòng)子的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。自PET Ild載體的靶基因表達(dá)依賴于自T7gnl0-lac融合啟動(dòng)子由共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。此病毒聚合酶由自帶有在lacUV5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gnl基因的居住性λ原噬菌體的宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)供給。最大化在大腸埃希氏菌(E. coli)中重組蛋白表達(dá)的一個(gè)策略是在具有損傷的蛋白水解地切割重組蛋白的能力的細(xì)菌中表達(dá)蛋白(Gottesman, Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology185, Academic Press,San Diego, Calif.(1990) 119-128)。另一策略是改變待插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列,從而用于各氨基酸的個(gè)體密碼子是在大腸埃希氏菌(E. coli)中優(yōu)先利用的那些(Wada et al. (1992)NucleicAcids Res. 20:2111-2118)。本發(fā)明的核酸序列的該改變可由標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于在酵母釀酒酵母(S. cerevisiae)中表達(dá)的載體的例包括 pYepSecl (Baldari et al. (1987)EMBOJ. 6:229-234),pMFa(Kurjan and Herskowitz, (1982)Cell 30:933-943),pJRY88(Schultzet al. (1987)Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.),pGBT9 (Clontech, Palo Alto, Calif. )，pGADIO (Clontech, Palo Alto, Calif. )，pYADE4和 pYGAE2 和 pYPGE2 (Brunelli and Pall (1993) Yeast 9:1299-1308),pYPGE15 (Brunelliand Pall(1993)Yeast 9:1309-1318)，pACTll (Dr. S. E.Elledge1Baylor College ofMedicine),及 picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif. X或者，本發(fā)明的融合蛋白可在昆蟲細(xì)胞中使用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)。在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)蛋白可利用的桿狀病毒載體包括PAc系列(Smith et al. (1983)Mol. CellBiol. 3:2156-2165)和 pVL 系列(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的例包括 PCDM8 (Seed(1987)Nature 329:840)，pCI (Promega)和pMT2PC (Kaufman et al. (1987)EMBO J. 6:187-195)。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用時(shí)，表達(dá)載體的控制功能常常由病毒調(diào)控元件提供。例如，通常使用的啟動(dòng)子源于多瘤病毒，腺病毒2，巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對(duì)于用于原核生物和真核生物細(xì)胞的其他適合的表達(dá)系統(tǒng)，見Sambrook等人的第16和17章(見上)。在另一實(shí)施方式中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能指導(dǎo)在特定細(xì)胞類型中核酸的優(yōu)先表達(dá)。本領(lǐng)域知道組織-特異性調(diào)控元件。適合的組織-特異性啟動(dòng)子的非限制性例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝-特異性；Pinkert et al. (1987)Genes Dev. 1:268-277),淋巴樣-特異性啟動(dòng)子(Calame 和 Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)，尤其是 T 細(xì)胞受體(Winoto 和 Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733)和免疫球蛋白(Banerji 等人(1983)Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell33:741-748)啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一方面屬于已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體或本發(fā)明的分離的核酸分子的宿主細(xì)胞。術(shù)語不僅指稱特定受試者細(xì)胞，但指稱該細(xì)胞的后代或潛在后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響，特定修飾可在后代發(fā)生，該后代可不，實(shí)際上，與親本細(xì)胞相同，但是仍包括在本文所用的術(shù)語的范圍之內(nèi)。宿主細(xì)胞可為任何原核生物或真核生物細(xì)胞。例如，融合蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸埃希氏菌(E. coli)，昆蟲細(xì)胞，酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或·COS細(xì)胞)中表達(dá)。本發(fā)明的載體DNA或分離的核酸分子可經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核生物或真核生物細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語〃轉(zhuǎn)化〃和〃轉(zhuǎn)染〃旨在指稱將外源核酸(例如，DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的各種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。對(duì)于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞適合的方法可見于Sambrook，等人和其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。為了鑒定及選擇這些整合體，通常將編碼可選擇的標(biāo)記物(例如，對(duì)抗生素的抗性)的基因隨著目標(biāo)基因?qū)胨拗骷?xì)胞。優(yōu)選的可選擇的標(biāo)記物包括賦予對(duì)藥物，諸如G418，潮霉素和甲氨喋呤的抗性的那些?？蓪⒕幋a可選擇的標(biāo)記物的核酸在與編碼融合蛋白的相同的載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞或可在分離的載體上導(dǎo)入。用導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可由藥物選擇鑒定。本發(fā)明的宿主細(xì)胞，諸如培養(yǎng)中的原核生物或真核生物宿主細(xì)胞，可用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生融合蛋白的方法。在一實(shí)施方式中，所述方法包括在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(已向其中導(dǎo)入編碼融合蛋白的重組表達(dá)載體或分離的核酸分子)，使得產(chǎn)生融合蛋白。在另一實(shí)施方式中，方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離融合蛋白。藥學(xué)組合物可將核酸分子和多肽(也在本文稱之為〃本發(fā)明的活性化合物〃)合入適合于施用的藥物組合物。該組合物一般包含核酸分子，融合蛋白，或抗體和藥學(xué)可接受的載體。如本文所用語言"藥學(xué)可接受的載體"包括溶劑，分散介質(zhì)，包被，抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，等滲劑和吸收延遲劑，其是與藥學(xué)施用相容?？蓪⒘硗獾幕钚曰衔锖先虢M合物。本發(fā)明的藥物組合物配制為與其旨在的施用途徑相容?？蓛?yōu)選的施用途徑包括腸胃外，例如，靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用。用于腸胃外施用的溶液或懸浮液無菌稀釋劑諸如注射用水，鹽溶液，不揮發(fā)油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑諸如芐基醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩沖劑諸如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽和張度調(diào)節(jié)劑諸如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或堿，諸如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整。腸胃外制備物可包封進(jìn)玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多劑量瓶。適合于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液或分散劑和無菌可注射溶液或分散劑的臨時(shí)制備用無菌粉。對(duì)靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括生理學(xué)鹽水，克列莫佛EUBASF ;Parsippany, N. J.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在全部情況中，組合物必需是無菌和應(yīng)是流體至容易可注射性存在的程度。其必需制備和存儲(chǔ)條件下是穩(wěn)定的，和必需被保存免于微生物諸如細(xì)菌和真菌的混雜作用。載體可為含有，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，及液體聚乙二醇)，及其混合物的溶劑或分散介質(zhì)。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可，例如，通過使用包被諸如卵磷脂，在分散劑的情況下通過維持需要的粒徑，及通過使用表面活性劑來維持。防止微生物的作用可由各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，抗壞血酸，硫柳汞，等達(dá) 至IJ。在許多情況中，在組合物中包括等滲劑，例如，糖，多元醇諸如甘露糖醇，山梨糖醇，氯化鈉會(huì)是可優(yōu)選的。無菌可注射溶液可通過根據(jù)需要將活性化合物(例如，融合蛋白或抗-融合蛋白抗體)以需要的量在適當(dāng)?shù)娜軇┲信c以上列舉的成分之一種或組合合并，之后是過濾的滅菌來制備。一般而言,分散劑通過將活性化合物合并到含有基本分散介質(zhì)和自以上列舉的那些的需要的其他成分的無菌媒質(zhì)來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉的情況中，優(yōu)選的制備方法是自其之前無菌過濾的溶液真空干燥及冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分加任何其他所需成分的粉。配制劑量單元形式的口腔或腸胃外組合物對(duì)于容易施用和劑量均一性尤其有利。本文所用的劑量單元形式指稱作為待處理受試者的單元?jiǎng)┬瓦m合的物理學(xué)獨(dú)立單元。各單元含有計(jì)算為產(chǎn)生與需要的藥學(xué)載體關(guān)聯(lián)的期望的治療效果的預(yù)定量的活性化合物。可將本發(fā)明的核酸分子插入載體及用作基因治療載體?？蓪⒒蛑委熭d體由，例如，靜脈內(nèi)注射，局部施用(US-A 5，328，470)或由立體定向注射(見，例如，Chen etal. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:3054-3057)遞送到受試者?；蛑委熭d體的藥學(xué)制備物可在可接受的稀釋劑中包含基因治療載體，或可包含嵌入基因遞送媒質(zhì)的慢釋放基質(zhì)。或者，其中可自重組體細(xì)胞完整產(chǎn)生的完全基因遞送載體，例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥學(xué)制備物可包括產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的一種或更多細(xì)胞。藥物組合物可與用于施用的使用說明一起包括在容器，包裝或分注器中。發(fā)明的用途和方法本文所述的核酸分子，蛋白，蛋白同源物，及抗體可用于一種或更多以下方法Ca)治療方法(例如，治療性和預(yù)防性)。(b)篩選測(cè)定；(c)預(yù)測(cè)性醫(yī)學(xué)(例如，診斷測(cè)定，預(yù)后測(cè)定)。融合蛋白與其他細(xì)胞蛋白相互作用，尤其是干細(xì)胞，且可由此由EPC分化為血管壁內(nèi)皮細(xì)胞直接或由陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子的分泌間接用于改善治愈過程。本發(fā)明的分離的核酸分子可用于表達(dá)融合蛋白(例如，在基因治療應(yīng)用中，在宿主細(xì)胞中，經(jīng)重組表達(dá)載體)。此外，融合蛋白可用于篩選調(diào)節(jié)融合蛋白活性或表達(dá)的藥物或化合物以及用于治療病癥。此外，本發(fā)明的抗-融合蛋白抗體可用于調(diào)節(jié)融合蛋白活性。治療方法
本發(fā)明提供治療處于(或靈敏于)心血管病癥的風(fēng)險(xiǎn)或具有與暴露的內(nèi)皮下膠原關(guān)聯(lián)的心血管病癥的受試者的預(yù)防性和治療性方法。預(yù)防性方法一方面，本發(fā)明提供受試者中預(yù)防與暴露的內(nèi)皮下膠原關(guān)聯(lián)的疾病或病情的方法。處于由暴露的內(nèi)皮下膠原導(dǎo)致的或貢獻(xiàn)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者可由，例如，用鑒定處于心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的常規(guī)方法，諸如高LDL膽留醇水平，動(dòng)脈高血壓，糖尿病，吸煙及由對(duì)于不穩(wěn)定的動(dòng)脈噬斑，諸如對(duì)比NMR成像中的噬斑增強(qiáng)的以往的及新生物標(biāo)記，肌鈣蛋白T和I或RGD肽來鑒定。特別是，本發(fā)明的多肽對(duì)于治療心血管疾病是有用的。特定心血管病癥相關(guān)于使膠原暴露于血小板的內(nèi)皮損傷。本發(fā)明的多肽可用于治療該病癥。這些病癥包括動(dòng)脈粥樣硬化的全部并發(fā)癥，諸如急性冠狀綜合征(諸如心肌梗塞)和急性或慢性腦血管病癥，諸如 瞬時(shí)缺血性發(fā)作(TIA)或中風(fēng)，由經(jīng)皮導(dǎo)管干預(yù)(PCI)和心臟手術(shù)的心臟和冠狀干預(yù)。而且，由造血干細(xì)胞與融合蛋白的預(yù)溫育及骨髓膠原經(jīng)融合蛋白的糖蛋白VI組分的結(jié)合，可改善由移植之后干細(xì)胞的骨髓再生。治療性方法本發(fā)明的多肽可用于預(yù)防或治療心血管疾病的治療性方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽以二聚體形式使用。尤其是，本發(fā)明的多肽可用于祖先細(xì)胞歸巢而改善血管修復(fù)。多肽施用的劑量方案依賴于待治療的受試者的齡，重量，性別和病情。劑量可優(yōu)選是0.01 2g的范圍的本發(fā)明的多肽每患者/天。多肽可優(yōu)選腸胃外施用。施用可為I 5次/天。在一實(shí)施方式中，方法涉及施用與其他劑，或劑的組合組合的本發(fā)明的多肽。其他劑的例是GPVI-Fc，溶血栓劑諸如重組組織纖溶酶原活化物，抗-血小板劑，諸如ADP受體阻斷劑(氯吡格雷，替格雷洛，坎格雷洛和其他)，凝血酶拮抗劑(達(dá)比加群或其他)，或因子X拮抗劑(諸如利伐沙班)，或肝素。
實(shí)施例
材料除了以下方法部分中提及的試劑盒和材料之外，使用以下物質(zhì)。寡核苷酸購(gòu)自Eurofins MWG Operon (Ebersberg,德國(guó))。Herculase 聚合酶(Stratagene, La Jolla,California)用于PCR擴(kuò)增。細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基和PBS來自Biochrom (Berlin，德國(guó))。化學(xué)品來自Roth (Karlsruhe,德國(guó))和Sigma-Aldrich (Seelze,德國(guó))。牛膠原I購(gòu)自BDBiosciences (San Jose, California)。雜交瘤細(xì)胞系W6B3H10的輕和重鏈的可變序列的擴(kuò)增和鑒定從4X IO6 和 I. 4X IO7 細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞系 W6B3H10，使用 OligotexDirect mRNA試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國(guó))，根據(jù)生產(chǎn)商的流程分離mRNA。取18 μ I分離的mRNA使用 Superscript III 試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, California)根據(jù)生產(chǎn)商的流程用于cDNA合成。為了擴(kuò)增編碼W6B3H10抗體的重和輕鏈的可變區(qū)的序列，測(cè)試不同引物組合用于K輕鏈可變序列擴(kuò)增的Bi7/Bi5，Bi8/Bi5，用于Y重鏈可變序列的Bi3/Bi4，Bi3d/Bi4(引物描述于Diibel S et al, 1994)。得到的條帶自瓊脂糖凝膠切下,使用GFX Gel條帶純化試劑盒(GE Healthcare, Piscataway, New Jersey)純化,及用用于輕鏈測(cè)序的Bi5seq(5’ GGGAAGATGGATCCAGTTG 3’；SEQ ID NO:7)，Bi5fwd (5’ CCATGTCCATGTCACTTG 3’；SEQ IDN0:8)，及 Bi5rev (5，GGTTTCTGTTGATACCAG 3，；SEQ ID N0:9)測(cè)序。重鏈序列用測(cè)序引物Bi4seq (5’CAGGGGCCAGTGGATAGA 3’；SEQ ID NO:10),Bi4fwd (5’CTGACCTGATGAAGCCTG 3’；SEQ ID N0:ll)，&Bi4rev (5，TTCACCCAGTGCACGTAG 3’ ；SEQ ID NO: 12)獲得。單鏈抗體及融合蛋白的表達(dá)和純化編碼單鏈抗體的DNA構(gòu)建體由基因合成產(chǎn)生，并克隆(Geneart, Regensburg,德國(guó))進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 pcDNA5_FRT (Invitrogen, Carlsbad, California)。使用Attractene (QIAGEN, Hilden,德國(guó))或陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,Carlsbad, California)根據(jù)生產(chǎn)商的流程進(jìn)行CHO細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。因?yàn)橛脴?gòu)建體scFv-hl無表達(dá)可檢測(cè)，且CHO細(xì)胞中scFv-lh的表達(dá)非常差，將兩種構(gòu)建體的DNA經(jīng)NcoI/XhoI亞克隆進(jìn)細(xì)菌表達(dá)載體pET22b (+) (Merck, Darmstadt,德國(guó))。序列由測(cè)序控制,及使用這些DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)株BL21 (DE3)的大腸埃希氏菌(E. coli) (Merck, Darmstadt,德國(guó))。使用O. 2mM IPTG誘導(dǎo)單鏈抗體的表達(dá)。蛋白的分離經(jīng)Strep-Tactin親和純化(IBA·BioTagnology, Gottingen，德國(guó))根據(jù)生產(chǎn)商的流程進(jìn)行。編碼pcDNA5-FRT 中的 scFv-lh-GPVI_FcIgG2 的 DNA 構(gòu)建體定購(gòu)自 Geneart(Regensburg,德國(guó))。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體 2000(Invitrogen,Carlsbad California)根據(jù)隨附的流程產(chǎn)生穩(wěn)定地表達(dá)的CHO細(xì)胞系。為產(chǎn)生更大尺度的融合蛋白，將CHO細(xì)胞在T500三重瓶(NUNC，Rochester，紐約)上培養(yǎng)。為了分離融合蛋白，收集細(xì)胞上清液，并使用ImlHi Trap 蛋白 G HP 柱(GE Healthcare, Piscataway, New Jersey)純化。將分離的蛋白針對(duì)PBS 透析 ο/η。由細(xì)胞ELISA測(cè)試單鏈抗體與在HEK293細(xì)胞上表達(dá)的⑶133抗原的結(jié)合將聚-L-賴氨酸96-孔板(BD Biosciences, San Jose, California)用 CD133 表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)C133/293如下包被。將O. 2ml的培養(yǎng)基中的I X IO5細(xì)胞加入各孔及ο/η于37°C，5%C02溫育，以允許細(xì)胞附接于板表面。次日將孔用O. 2ml PBS洗滌一次及用O. Iml 2%多聚甲醛(在PBS中，pH7. 4)于室溫固定10 20min。將孔用PBS-T (PBS+0. 1%吐溫-20)洗滌及用lXRotiBlock*3%PBS-T中的乳于室溫阻斷I小時(shí)。用PBS-T洗滌之后，將相應(yīng)抗體的系列稀釋加入孔及于室溫伴隨振搖溫育至少I小時(shí)。用PBS-T洗滌之后，添加O. Iml的 Str印MAb-典型-HRP (在 PBS-T 中 1:10000，Iba BioTagnology，G8ttillgen,德國(guó))或辣根過氧化物酶連接的抗-小鼠IgG (在PBS-T中1:10000, Dianova, Hamburg,德國(guó))及于室溫伴隨振搖溫育I小時(shí)。用PBS-T洗滌之后，添加O. Iml的1-Step Ultra TMB-ELISA底物(Thermo Scientif ic, Braunschweig,德國(guó)),及溫育直到顯影充足的藍(lán)染色。為了停止反應(yīng)，將O. ImIIM H2SO4W入各孔，和用無限F200平板讀數(shù)儀(TECAN，Mannedorf,Switzerland)在450nm和595nm處的吸光度作為參照測(cè)量。為了測(cè)試結(jié)合特異性,用300ng/ml(2nM)W6B3H10親本mAb及增加量的競(jìng)爭(zhēng)物蛋白進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。使用抗-小鼠IgG-HRP抗體(在PBS-T中的1:10000, Dianova, Hamburg,德國(guó))檢測(cè)信號(hào)。用固定的膠原I的結(jié)合ELISA將Immulon 2HB 96-孔板(NUNC，Rochester，紐約)用在 15mMNa2C03，35mM NaHCO3,pH9. 6中的O. Iml I μ g/ml牛膠原I o/n于4°C包被。將孔用PBS-T洗滌，用PBS-T中的O. Iml I X RotiBlock (Roth, Karlsruhe,德國(guó))阻斷I小時(shí)，并在添加O. Iml的融合蛋白的3倍稀釋之前再次洗滌。于室溫伴隨振搖溫育I小時(shí)之后，將孔用PBS-T洗滌?？讓⒂迷赑BS-T 中 1:10000 的 O. Iml 抗-人 IgG-HRP (Dianova, Hamburg,德國(guó))于室溫伴隨振搖溫育 I 小時(shí)。將板用 PBS-T 洗滌及用 O. Iml I-步驟 Ultra TMB-ELISA (PIERCE, Rockford,Illinois)溫育。在足夠顯影藍(lán)染色之后，通過添加0. Iml IM H2SO4停止反應(yīng)。在450nm和595nm處作為參照波長(zhǎng)使用無限F200平板讀數(shù)儀(TECAh Mannedorf, Switzerland)測(cè)量吸光度。用 Sigma Plot 11 使用 Four Parameter Logistic 計(jì)算 EC5tl 值。在剪力下表達(dá)⑶133的細(xì)胞粘接于膠原將玻璃載玻片用10 μ g/ml膠原I根據(jù)Langer et al (2005)包被及插入流室(Oligene, Berlin,德國(guó))。將載玻片的膠原包被的表面用10yg/ml的融合蛋白預(yù)處理30min。為了顯示結(jié)合的⑶133依賴性，也將載玻片與W6B3H10mAb溫育。添加AC133/293細(xì)胞，及在2000s-1的剪力下溫育。將實(shí)驗(yàn)磁帶錄像及離線評(píng)價(jià)。小鼠中的頸動(dòng)脈結(jié)扎和由活體顯微鏡檢的EPC粘接的評(píng)定從人臍帶血分離⑶133+細(xì)胞,如描述于(Bueltmann A et al,2003)。為了評(píng)價(jià)融合蛋白對(duì)EPC體內(nèi)募集的效應(yīng)，我們使用活體熒光顯微鏡檢如描述于(Massberg et al,2002)。在實(shí)驗(yàn)之前,將EPC用5_ 二乙酸羧基突光素琥拍酰亞胺基酯(DCF)染色及與融合蛋白(20μ g/ml/100nM)或 GPVI-Fe (15 μ g/ml/100nM)溫育 30min。將野生型C57BL/6J小鼠(Charles River Laboratories)通過咪達(dá)唑侖(5mg/kg體重；Ratiopharm),美托咪定(0. 5mg/kg 體重；Pfizer)和芬太尼(0. 05mg/kg 體重，CuraMed/Pharam GmbH)溶液的腹膜內(nèi)注射來麻醉。將聚乙烯導(dǎo)管(Portex)移植進(jìn)右頸靜脈，并將熒光EPC (5X104/250 μ I)靜脈內(nèi)注射。游離解剖頸總動(dòng)脈，及劇烈結(jié)扎5min，以誘導(dǎo)血管損傷。在血管損傷之前及之后，熒光EPC與損傷的血管壁的相互作用由頸總動(dòng)脈的原位體內(nèi)視頻顯微鏡檢，使用Zeiss Axiotech顯微鏡(20X水浸沒物鏡，W 20x/0. 5 ；Carl ZeissMicroimaging, Inc.),用落射用IOO-W HBO萊燈可視化。通過計(jì)數(shù)在15s之內(nèi)未動(dòng)或自內(nèi)皮表面分開的細(xì)胞來評(píng)定附著的EPC數(shù)。它們的數(shù)以細(xì)胞/mm2內(nèi)皮表面給出。NOD/Scid小鼠中的心肌梗塞模型將NOD/Scid小鼠如上述麻醉。將管插入人工呼吸用氣管。胸開口之后，將左降低冠狀動(dòng)脈用絲結(jié)扎45min。在由結(jié)扎開口輔助的再灌注之后，將胸部和氣管縫合。立即然后和48小時(shí)后，將用融合蛋白(20 μ g/ml)或等摩爾量的Fe-對(duì)照蛋白預(yù)處理30min的分離的人CD34+祖先細(xì)胞通過尾靜脈靜脈內(nèi)應(yīng)用。另一對(duì)照組在手術(shù)之后未獲得任何祖先細(xì)胞。干預(yù)之后7d和28d通過超聲波心動(dòng)圖記術(shù)測(cè)定分區(qū)變化(FAC)，以評(píng)定左心室功能。隨后處死小鼠，及由伊文斯藍(lán)和TTC染色分析梗塞區(qū)尺寸。由⑶R移植的小鼠單鏈抗體的人源化使源于小鼠序列的融合蛋白的單鏈部分由CDR移植經(jīng)歷人源化。作為原材料，使用帶有用于單鏈抗體的序列的細(xì)菌表達(dá)載體pET22b-SCFv-lh以及表達(dá)CD 133的HEK 293細(xì)胞系A(chǔ)C 133/293與HEK 293對(duì)照細(xì)胞一起。以下詳細(xì)列出人源化過程中使用的方法。包裝噬菌體顯示庫(kù)的流程I.制備輔助噬菌體通過用不同稀釋的輔助噬菌體于37°C感染對(duì)數(shù)期TGl細(xì)菌細(xì)胞30min及平鋪在2TY板上的頂部瓊脂來制備輔助噬菌體。將小噬斑在3mL液體2TY培養(yǎng)基中與TGl的30 μ L過夜培養(yǎng)物一起溫育，并于37°C生長(zhǎng)2h。將此培養(yǎng)物稀釋于IL 2TY培養(yǎng)基，并生長(zhǎng)lh。在加入卡那霉素至50μ g/mL之后，將培養(yǎng)物于37°C生長(zhǎng)16h。將細(xì)胞由離心(lOmin，以5000g)移出，和通過添加O. 25vol的噬菌體沉淀劑來自上清液沉淀噬菌體。在冰上溫育30min之后，通過以5000g離心IOmin,之后是將沉淀重懸浮于5mL PBS和通過O. 22- μ m濾器滅菌來收集噬菌體粒子。通過測(cè)定2TY板上噬斑-形成單元(pfu)數(shù)來用含有100 μ LTGl (飽和的培養(yǎng)物)和噬菌體稀釋的頂部-瓊脂層滴定輔助噬菌體。將噬菌體濃儲(chǔ)物溶液稀釋到I X 1013pfu/mL及以小等份于-20°C存儲(chǔ)。2.制備原庫(kù)噬菌體通過用庫(kù)甘油濃儲(chǔ)物接種500ml 2TY-G和于37°C以250rpm振搖溫育至在600nm處O. 8 O. 9的光密度來制備庫(kù)噬菌體。將VCSM13輔助噬菌體加入培養(yǎng)物至5X109pfu/ml的終濃度，并將培養(yǎng)物于37°C伴隨振搖溫育30min,然后伴隨200rpm輕輕振搖溫育30min,以允許噬菌體感染。通過以2，200g離心15min，并將沉淀重懸浮于相同的體積的2TY-AK來 回收細(xì)胞。將此培養(yǎng)物于30°C伴隨快速振搖(300rpm)溫育過夜。將細(xì)胞通過以7000g于4°C離心15min來沉淀，并將含有噬菌體的上清液回收到預(yù)冷卻的IL瓶。將O. 3vol的噬菌體沉淀劑加入上清液，混合及在冰上溫育lh，以允許噬菌體沉淀。將噬菌體通過以7000g在相同的瓶中于4°C離心15min兩次來沉淀。移出盡可能多的上清液，并將沉淀重懸浮于SmLPBS0將噬菌體在更小管中以12，OOOg再離心lOmin，并將噬菌體不攪亂可呈現(xiàn)的細(xì)菌沉淀地經(jīng)上清液回收。最終，通過用噬菌體濃儲(chǔ)物的稀釋物感染TGl細(xì)胞，平鋪到2TY-AG，溫育和呈現(xiàn)的氨芐西林抗性集落數(shù)的枚舉來滴定噬菌體濃儲(chǔ)物。然后將噬菌體以等份于4°C存儲(chǔ)。淘選噬菌體顯示庫(kù)的流程微量滴定淘選板的孔用源于⑶133表達(dá)AC133/293細(xì)胞的⑶133-合并的膜制備物通過于37°C溫育2小時(shí)直接包被，并用阻斷緩沖劑(PBS含有2%乳)于4°C過夜阻斷。將阻斷的孔用O. P/oPBST (含O. I O. 3%吐溫20 (V/V)的PBS)洗滌6次，并將等同體積的噬菌體庫(kù)和4%PBSM的總體積O. 5mL的混合物加入對(duì)照孔[預(yù)阻斷的]。在第I輪的篩選期間，噬菌體粒子數(shù)應(yīng)是至少IOOX高于庫(kù)尺寸(例如，對(duì)于IOltl克隆的庫(kù)，1012cfu)。第I輪之后多樣性下降至106，由此無隨后輪的篩選的該需求。將板于室溫溫育30min，以阻斷結(jié)合的位點(diǎn)。將輸入的噬菌體混合物加入淘選孔[用靶蛋白包被的]，于室溫溫育60min及用PBSMT(含有2%乳的PBS)洗滌10 20次。通過用200 μ L酸性洗脫緩沖劑于室溫溫育5min來洗脫噬菌體。將含有噬菌體的上清液轉(zhuǎn)移到新管及用Tris-HCl緩沖劑中和。將大腸埃希氏菌(Escherichia coli) TGl的新鮮指數(shù)地生長(zhǎng)的培養(yǎng)物用洗脫的噬菌體感染，和將它們的一半擴(kuò)增用于進(jìn)一步輪的選擇。將余下的洗出液存儲(chǔ)于4°C。質(zhì)量控制噬菌體FACS的流程將AC133/293 細(xì)胞收集到 Iml 含有 5microM EDTA 的 PBS 中(10 μ I 的 O. 5Μ 濃儲(chǔ)物)，立即混合，以防止凝集及保持在冰上。將細(xì)胞用FACS緩沖劑(補(bǔ)充了 1%BSA或5%FBS及含有O. 05%NaN3的PBS)洗滌2 3X，并將自最終洗滌的細(xì)胞沉淀懸浮于50 μ I FACS緩沖劑。將10 μ I的噬菌體溶液加入50 μ I的細(xì)胞懸浮液，輕輕混合及在冰上溫育30分鐘。將細(xì)胞用FACS緩沖劑洗滌2 3Χ，及懸浮于50 μ I FACS緩沖劑。將10 μ I的抗體[兔抗-M13pAb-FITC]溶液加入50 μ I的細(xì)胞懸浮液，輕輕混合及在冰上溫育30分鐘。將細(xì)胞用FACS緩沖劑洗滌2 3Χ及懸浮于200 300 μ I FACS緩沖劑用于分析。由噬菌體FACS方法和GraphpadPrism 4. O軟件的親和性測(cè)量流程將顯示目標(biāo)scFv的噬菌體在測(cè)定之前標(biāo)準(zhǔn)化到相同的滴度，稀釋到不同滴度及如上述測(cè)定。使用卩遼菌體FACS的輸出用于逐步計(jì)算目標(biāo)scFv的親和性,如Graphpad Prism
4.O軟件的用戶手冊(cè)中例示。人源化的融合蛋白的表達(dá)和純化接收人源化的單鏈抗體克隆26的序列信息之后，將人源化的融合蛋白的序列虛擬組裝及合成及克隆(Geneart, Regensburg,德國(guó))進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA5_FRT(Invitrogen, Carlsbad, California)。根據(jù)早先描述的流程開發(fā)穩(wěn)定的細(xì)胞系，其中融合蛋白表達(dá)及分泌為CHO細(xì)胞的上清液，及使用Iml HiTrap蛋白G HP柱(GE Healthcare, Piscataway, New Jersey)純化。分離的蛋白針對(duì) PBS 透析 ο/η。由細(xì)胞ELISA的人源化的融合蛋白與HEK293細(xì)胞上表達(dá)的⑶133抗原的結(jié)合的測(cè)試上述方法除了聚-L-賴氨酸96-孔板用僅6 7X 104AC133/293細(xì)胞/孔包被之外。左頸總動(dòng)脈結(jié)扎之后測(cè)定血小板聚集的活體顯微鏡檢對(duì)于活體顯微鏡檢實(shí)驗(yàn),使用雄性C57B1/6J小鼠。通過以120Xg離心IOmin自Iml供體小鼠的朽1檬酸鹽血制備富含血小板的血衆(zhòng),其已用Tyrodes緩沖劑pH6. 5調(diào)至2ml。分離含有血小板的上清液,并將血小板通過添加20 μ I 5-羧基-二乙酸熒光素乙酰氧基甲基酯(Invitrogen)和于室溫避光溫育5min來突光標(biāo)記。將體積用TyrodespH6. 5填充達(dá)4ml，并將血小板通過以900Xg離心12min來沉積。將血小板分別重懸浮于250 μ I的Tyrodes ρΗ6· 5和Tyrodes ρΗ7. 4,等份計(jì)數(shù),并將血小板數(shù)調(diào)整到2. 8 X 10lcl/ml。將實(shí)驗(yàn)小鼠(24±2g)通過美托咪定(O. 5mg/kg體重，Pfizer),咪達(dá)唑侖(5mg/kg體重，Roche)和芬太尼(0. 05mg/kg體重,Janssen-Cilag)溶液的腹膜內(nèi)注射麻醉。手術(shù)期間體溫用恒溫毪系統(tǒng)(Harvard Apparatus)維持恒定于38. 5°C。將聚乙烯導(dǎo)管(Portex)移植進(jìn)左尾靜脈，及在左頸總動(dòng)脈解剖之后，將250 μ I (7Χ IO9)標(biāo)記的血小板靜脈內(nèi)注射進(jìn)尾靜脈。隨后靜脈內(nèi)應(yīng)用lmg/kg體重的人源化的融合蛋白或等摩爾量的FcIgG2對(duì)照蛋白。將左總動(dòng)脈用絲(7-0Prolene，Ethicon)劇烈結(jié)扎5min，以誘導(dǎo)血管損傷。使用有落射用100W HBO汞燈和 s/w-CCD 照相機(jī) BC71 (HornImaging)的突光顯微鏡(Axioskop 2FS mot, Carl Zeiss)在結(jié)扎之后以不同時(shí)間間隔監(jiān)控結(jié)扎區(qū)。通過用Photoshop CS5軟件分析3個(gè)固定的-像的平均值來測(cè)定血小板聚集物，其中以像素測(cè)量由血小板聚集物產(chǎn)生的更高光強(qiáng)度的區(qū)的尺寸，然后使用定義的網(wǎng)格轉(zhuǎn)化為ym2。結(jié)果和討論編碼單克隆抗體W6B3H10的可變序列的鑒定和構(gòu)建體設(shè)計(jì)PCR之后擴(kuò)增，其用各引物組合產(chǎn)生產(chǎn)物，自凝膠切下條帶，純化及測(cè)序。組裝源于用3種不同引物測(cè)序的序列各(圖I)及使用NCBI (http: // www. ncbi. nlm. nih. rov/iRblast/)的IGBlast與IgG數(shù)據(jù)庫(kù)比較。為了建立用于2種可能的取向“輕-重”或“重-輕”的單鏈抗體(scFv)的序列，自數(shù)據(jù)庫(kù)V-Base (見http: Il vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk)隨機(jī)選擇各前導(dǎo)序列，以輔助抗體分泌進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。重和輕鏈的序列由編碼GlyGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerGly Gly GlyGly Ser的Gly-Ser接頭(SEQ ID N0:13)連接。為了允許通過親和純化分離單鏈抗體，在C-末端添加編碼Str印Tag II的序列。建立的命名為scFv-lh和scFv-hl的構(gòu)建體序列顯示于圖2。單鏈抗體的表達(dá)和結(jié)合⑶133的測(cè)試CHO細(xì)胞用單鏈構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后，可用scFv-lh檢測(cè)弱表達(dá)(見圖3)。大規(guī)模轉(zhuǎn)染之后，可分離足夠的蛋白用于對(duì)于細(xì)胞ELISA中結(jié)合CD133測(cè)試。于此并行，蛋白也在大腸埃希氏菌(E. coli)中表達(dá)，用于足夠的濃儲(chǔ)物產(chǎn)生。產(chǎn)生ScFv-hl，其可不在CHO細(xì)胞中表達(dá)，并自大腸埃希氏菌(E. coli)單獨(dú)純化。(見圖4)。
為了測(cè)試是否單鏈抗體識(shí)別它們的抗原CD133，將單鏈抗體的3倍稀釋系列在固定的AC133/293細(xì)胞上溫育，使⑶133抗原在它們的表面表達(dá)。然而在低nM范圍有清楚的scFv-lh以高親和性的結(jié)合，意外地，未檢測(cè)到scFv-hl對(duì)⑶133的親和性(見圖5A)。此發(fā)現(xiàn)不是由于不同表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)樽源竽c埃希氏菌(E. coli)純化的scFv-lh與自哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)分離的scFv-lh顯示相同的結(jié)合特征。為了測(cè)試scFv-lh與⑶133相互作用的特異性，使2nM的W6B3H10mAb與固定的AC133/293細(xì)胞上的⑶133的結(jié)合與增加量的單鏈抗體競(jìng)爭(zhēng)。此明顯展示，scFv-lh可以
3.InM的IC50值有效阻斷單克隆抗體與抗原⑶133的結(jié)合(圖5B)，此意外地高親和性可為由于分子的更小得多的尺寸，這使得對(duì)于scFv-lh的固定的CD133相比對(duì)于更大mAb的更可接近。融合蛋白的設(shè)計(jì),表達(dá)和表征作為用于融合蛋白的成分鑒定scFv-lh之后,選擇GPVI_FcIgG2作為雙功能蛋白的第2部分。而GPVI應(yīng)介導(dǎo)與膠原結(jié)合，將IgG2的Fe部分選擇為一方面輔助親和純化及另一方面避免與更通常使用的FcIgGl關(guān)聯(lián)的不期望的效應(yīng)子功能。因此，以單鏈抗體組分scFv-lh之后是可溶性糖蛋白VI和FcIgG2的方式設(shè)計(jì)融合蛋白，其由用于更柔性的3個(gè)氨基酸GGR-接頭分離(圖6)。在T500三重瓶上在穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的粘接培養(yǎng)物中表達(dá)融合蛋白。使用蛋白G親和層析純化上清液。融合蛋白的典型產(chǎn)率在2 2. 7mg/l范圍內(nèi)。蛋白的鑒定和純度由使用連接到辣根過氧化物酶的抗-人IgG抗體的蛋白印跡(數(shù)據(jù)不顯示的)及由考馬斯亮藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠控制(圖7)。在還原性條件下融合蛋白的分離產(chǎn)生約90kD的條帶尺寸。在非-還原性條件下的分子質(zhì)量是大致180kD，其明顯顯示蛋白作為二聚體存在。79. IkD的單體蛋白的理論分子質(zhì)量顯示，其必需翻譯后修飾，最很可能由糖基化。對(duì)于血小板糖蛋白VI,僅在氨基酸92描述一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(Kunicki et al,2005)。單鏈抗體部分無用于N-聯(lián)糖基化的共有序列，然而IgG2的Fe-部分也帶有一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。因?yàn)檫@2個(gè)糖基化位點(diǎn)不足以解釋觀察到的尺寸差異，融合蛋白可含有另外的O-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。融合蛋白與⑶133和膠原的結(jié)合特征
由ELISA用固定的AC133/293細(xì)胞比較融合蛋白及W6B3H10mAb與⑶133的結(jié)合(圖8A)。觀察到的對(duì)于融合蛋白是O. 21nM及對(duì)于W6B3H10mAb是O. 12nM的EC50值在相同的數(shù)量級(jí)。由此融合蛋白與抗原CD133的結(jié)合性質(zhì)相比單鏈抗體改善了，其可僅部分由融合蛋白的二聚化解釋，其導(dǎo)致類似于見于全尺寸抗體的情況的2個(gè)同一抗原結(jié)合位點(diǎn)。單鏈多肽隨后的GPVI_FcIgG2多肽可對(duì)單鏈抗體部分的3維結(jié)構(gòu)具有一些穩(wěn)定化效應(yīng)，這似乎是有益于抗原結(jié)合。為了確認(rèn)結(jié)合的特異性，用2nM W6B3H10mAb及增加量的融合蛋白進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。mAb與固定的AC133/293細(xì)胞的結(jié)合的有效抑制確認(rèn)結(jié)合由CD 133介導(dǎo)(見圖8B)。也顯示融合蛋白與其第2結(jié)合偶體膠原I的結(jié)合。在用固定的膠原I的ELISA中，將融合蛋白的結(jié)合與GPVI-FcIgGl的結(jié)合比較。對(duì)于二者，可觀察到劑量依賴性結(jié)合，但意外地，結(jié)合親和力不同(圖9A)。融合蛋白與膠原的結(jié)合特異性由與可溶性膠原I的競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 確認(rèn)(圖 9B)。在動(dòng)態(tài)條件下融合蛋白的雙特異性結(jié)合在之前實(shí)驗(yàn)中，獨(dú)立地展示融合蛋白與各其結(jié)合偶體的結(jié)合。為了通過同時(shí)結(jié)合兩種靶蛋白確認(rèn)分子的雙官能性，將玻璃載玻片用10 μ g/ml膠原I包被，插入到流室，與10 μ g/ml的融合蛋白預(yù)溫育及與表達(dá)⑶133的AC133/293細(xì)胞在2000/s的剪力下溫育，模擬人血流中存在的條件。此實(shí)驗(yàn)展示，融合蛋白非常有效介導(dǎo)CD133表達(dá)細(xì)胞與膠原的結(jié)合，甚至在剪力下。結(jié)合可由添加親本W(wǎng)6B3H10mAb逆轉(zhuǎn)，這顯示AC133/293細(xì)胞固定到膠原表面是CD133-依賴性的(圖10)。EPC與損傷的血管的體內(nèi)結(jié)合為了測(cè)試是否表達(dá)⑶133的EPC可被有效募集及附接到損傷的血管壁，將EPC從人臍帶血分離，熒光標(biāo)記及與融合或?qū)φ盏鞍譍PVI-Fc預(yù)溫育，然后靜脈內(nèi)應(yīng)用到麻醉的小鼠的頸靜脈。在頸動(dòng)脈血管壁損傷之后，以增加的時(shí)間間隔對(duì)附接的EPC數(shù)計(jì)數(shù)。這明顯顯示，融合蛋白相比對(duì)照蛋白顯著增加附接的EPC數(shù)，在損傷之后5min細(xì)胞達(dá)最高數(shù)，但在60min之后仍有顯著細(xì)胞數(shù)(圖11)。EPC與對(duì)照蛋白的預(yù)溫育也導(dǎo)致顯著的量的附著的EPC的觀察可被建立的EPC粘附于由血小板介導(dǎo)的血管損傷位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)所解釋(Abou-Saleh et al,2009)。與融合蛋白的預(yù)溫育可在具有對(duì)于冠狀動(dòng)脈疾病的危險(xiǎn)因素的患者中尤其有益，其中循環(huán)EPC數(shù)是低且其可由同種異體EPC移植或由離體擴(kuò)展的自體EPC移植物治療。融合蛋白對(duì)NOD/Scid小鼠中心肌梗塞模型中左心室功能和梗塞區(qū)的影響在NOD/Scid小鼠中由左降低冠狀動(dòng)脈的結(jié)扎誘導(dǎo)梗塞。由超聲波心動(dòng)圖記術(shù)及由處死之后心臟的染色來分析用20 μ g/ml的融合蛋白預(yù)處理的CD34+祖先細(xì)胞的應(yīng)用對(duì)左心室功能和梗塞區(qū)尺寸的效應(yīng)。然而在手術(shù)之后7d無可觀察到對(duì)左心室功能的效應(yīng)，在第28天，相比未用祖先細(xì)胞處理的動(dòng)物和用與Fe對(duì)照溫育的祖先細(xì)胞處理的動(dòng)物，顯著差異顯而易見(見圖12A)。融合蛋白處理也導(dǎo)致梗塞區(qū)尺寸的顯著減小，如顯示于圖12B。成為觀察的正面效應(yīng)的基礎(chǔ)的機(jī)理迄今未鑒定。許多動(dòng)物研究顯示，移入用于心肌修復(fù)的僅小部分的干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞或血管細(xì)胞，但其推定，觀察的心臟改善可由營(yíng)養(yǎng)支持或由祖先細(xì)胞分泌的旁分泌因子導(dǎo)致，且其可對(duì)相鄰細(xì)胞具有有益效應(yīng)或活化居住性心臟干細(xì)胞(Greco&Laughln, 2010)。表達(dá)人源化的sc-抗體的曬菌體的表征由⑶R移植的抗體人源化過程，由此⑶R序列轉(zhuǎn)移到人亞組共有(H-SubI-κ和H-SubI-VH)受體框架序列，導(dǎo)致具有對(duì)膜結(jié)合的⑶133的顯著親和性的3個(gè)噬菌體克隆(26，27，29)的鑒定。噬菌體稀釋系列的FACS測(cè)量顯示，對(duì)于克隆26是32. 19pM的KD (平均熒光指標(biāo))，且對(duì)于克隆27和29分別是50. 78pM和102. 9pM的KD (圖13A，13B)。與此相比，帶有原小鼠單鏈抗體的噬菌體在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中顯示25. 63和26. 93pM的KD。使用在線工具(http: Il www.bioinf.org.uk/ab/shab/)評(píng)定克隆26的VL和VH序列相比小鼠供體和人受體序列的那些的人性顯示向人受體序列的值的Z-分值移位(見圖14)，其確認(rèn)人源化的序列的更人樣特征。此也可展示，通過比較小鼠或人源化的單鏈抗體的蛋白序列與人受體序列(見圖15)。人源化的抗體顯示76%的序列同一性，差異主要由于不同互補(bǔ)決定區(qū)，然而小鼠單鏈抗體相比人受體序列是僅在氨基酸序列的59%同一性。在兩個(gè)比對(duì)中，忽略連接的接頭肽序列。具有親本分子的氨基酸序列的人源化的融合蛋白與小鼠來源的單鏈部分的核苷酸序列的比對(duì)導(dǎo)致95%的序列同一I"生(見圖16)。·人源化的融合蛋白的產(chǎn)生和其表達(dá)和表征選擇與膜結(jié)合的⑶133顯示最高親和性的人源化的單鏈抗體(克隆26)的序列，其相比小鼠單鏈序列在相同的數(shù)量級(jí)，以建立人源化的融合蛋白hscFv-lh-GPVI-Fc (見圖16)。由穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系產(chǎn)生一批蛋白，并自細(xì)胞上清液由蛋白G親和層析純化。由用抗-人IgG抗體的蛋白印跡確認(rèn)蛋白的鑒定，所述抗體與融合蛋白的Fe片段結(jié)合。在用考馬斯亮藍(lán)染料染色的聚丙烯酰胺凝膠中控制純度。在還原及非-還原性條件下，人源化的融合蛋白與具有小鼠單鏈部分的融合蛋白呈現(xiàn)相同的遷移行為(見圖18)。因此，其最可能是，人源化過程未關(guān)于翻譯后修飾如糖基化模式或分子的二聚化改變?nèi)诤系鞍住?b>人源化的融合蛋白與CD133抗原和膠原的結(jié)合的測(cè)試將通過用固定的細(xì)胞的細(xì)胞ELISA的人源化的融合蛋白與穩(wěn)定的細(xì)胞系A(chǔ)C133/293上的跨膜蛋白⑶133的結(jié)合與親本融合蛋白的結(jié)合比較(圖19)。用Sigma Plot
11.O計(jì)算的兩種分子的EC50在相同的O. 25 O. 3nM的范圍。用2nM W6B3H10mAb和融合蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)物的競(jìng)爭(zhēng)ELISA確認(rèn)了結(jié)合特異性，及顯示對(duì)于人源化的和小鼠融合蛋白分別2. 7和3. InM的IC50值。融合蛋白的人源化應(yīng)不改變其GPVI部分與膠原I的結(jié)合性質(zhì)。為了證明此推定，由ELISA用固定的牛膠原I測(cè)量結(jié)合?？捎脤?duì)于人源化的和親本融合蛋白分別4. 7和6. 3nM的EC50值顯示兩種蛋白的劑量-依賴性結(jié)合(見圖20)。在小鼠模型中頸總動(dòng)脈損傷之后人源化的融合蛋白對(duì)血小板聚集的體內(nèi)效應(yīng)為了測(cè)試是否人源化的融合蛋白在頸總動(dòng)脈損傷之后對(duì)血小板聚集具有任何影響，靜脈內(nèi)施用供體小鼠的熒光標(biāo)記的血小板，之后是輸注lmg/kg的人源化的融合蛋白或等摩爾量的Fe-對(duì)照蛋白和立即血管結(jié)扎。直到結(jié)扎之后60min形成的血小板聚集物尺寸的確定顯示用人源化的融合蛋白處理的組和對(duì)照組之間高度顯著差異(P〈0. 005, Student氏t檢驗(yàn))見圖23)，確認(rèn)人源化的融合蛋白與血小板結(jié)合的GPVI就體內(nèi)膠原結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的能力，其進(jìn)而導(dǎo)致降低的血小板活化及聚集形成。參考文獻(xiàn)Abou-Saleh H, Yacoub D, Theoret JF, Gillis MA, Neagoe PE, LabartheB,Theroux P，Sirois MG, Tabrizian M，Thorin E，Merhi Y，Endothelial progenitorcells bind and inhibit platelet function and thrombus formation, Circulation120(2009)，2230-2239Bueltmann A, Gawaz Mj Miinch G，Ungerer M，Massberg S，Immunoadhesincomprising a glycoprotein VI domain, W003104282(2003)Diibel Sj Breitling F，F(xiàn)uchs Pj Zewe Mj Gotter Sj Welschof Mj MoldenhauerG，Little MJ，Isolation of IgG antibody Fv-DNA from various mouse and rathybridoma cell lines using the polymerase chain reaction with a simple set ofprimers. Immunol Methods 175 (1994)，89-95.Greco N&Laughln MJj Umbilical cord blood stem cells for myocardialrepair and regeneration. Methods Mol Biol.660 (2010)，29-52.
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權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其選自 1.包含與SEQID NO: I的核苷酸序列或其補(bǔ)體具有至少85%同一'丨生的核苷酸序列的核酸分子； .包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列，或其補(bǔ)體的至少1500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的核酸分子； iii.編碼包含與SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子； vi.編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中所述片段包含SEQ ID NO:2的至少500個(gè)連續(xù)的氨基酸；以及 V.編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的變體的核酸分子,其中所述核酸分子在6. OXSSC中于45°C溫育、之后是在O. 2XSSC/0. 1%SDS中于65°C洗滌的條件下與包含整個(gè)SEQ ID NO: I的核酸分子，或其補(bǔ)體雜交。
2.權(quán)利要求I的核酸分子，其選自 Ca)包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列的核酸； (b)編碼包含SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；以及 (c)編碼由權(quán)利要求I定義的含有人源化的對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白或?qū)τ贑D133具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白的部分的多肽的核酸分子。
3.權(quán)利要求I或2的核酸分子，其還包含載體核酸序列。
4.宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求I 3之任一項(xiàng)的核酸分子。
5.能同時(shí)和選擇性地與膠原和CD133蛋白結(jié)合的多肽，其選自 (a)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:2的至少600個(gè)連續(xù)的氨基酸； (b)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽的變體，其中所述變體由與包含整個(gè)SEQID NO: I的核酸分子或其補(bǔ)體在6. OXSSC中于45°C溫育、之后是在O. 2XSSC/0. 1%SDS中于65°C洗滌的條件下雜交的核酸分子編碼； (c)由以下核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子包含與由SEQIDNO:l的核苷酸序列組成的核酸或其補(bǔ)體具有至少85%同一性的核苷酸序列；以及 (d)包含與SEQID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽。
6.權(quán)利要求5的多肽，其包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
7.由權(quán)利要求5或6定義的多肽，其包含對(duì)于CD133具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)。
8.由權(quán)利要求7定義的多肽，其包含SEQID NO: 25，26，27，28，29和/或30的氨基酸序列或其部分作為互補(bǔ)決定區(qū)。
9.由權(quán)利要求7或8定義的多肽，其包含源于人來源的免疫球蛋白的免疫球蛋白框架區(qū)。
10.權(quán)利要求5 9之任一項(xiàng)的多肽，其是二聚體。
11.產(chǎn)生包含SEQID NO: 2的氨基酸序列的多肽的方法，所述方法包括在核酸分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞。
12.藥物組合物，其包含權(quán)利要求5 9之任一項(xiàng)的多肽。
13.權(quán)利要求5 9之任一項(xiàng)的多肽，其用于心血管疾病的預(yù)防或治療或診斷。
14.權(quán)利要求5 9之任一項(xiàng)的多肽用于制備預(yù)防或治療心血管疾病的藥物的用途。
15.權(quán)利要求5 9之任一項(xiàng)的多肽用于制備不穩(wěn)定噬斑的診斷標(biāo)記物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其選自i．包含與SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其補(bǔ)體具有至少85%同一性的核苷酸序列的核酸分子；ii．包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其補(bǔ)體的至少1500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的核酸分子；iii．編碼包含與SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子；vi．編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中所述片段包含SEQ ID NO:2的至少500個(gè)連續(xù)的氨基酸；以及v．核酸分子編碼多肽含有人源化的免疫球蛋白或?qū)τ贑D133具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白的部分；編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的變體的核酸分子，其中所述核酸分子在6.0×SSC中于45℃溫育、之后是在0.2×SSC/0.1%SDS中于65℃洗滌的條件下與包含整個(gè)SEQ ID NO:1的核酸分子，或其補(bǔ)體雜交。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102906116SQ201180022857
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者M·加瓦齊, T·舍恩貝格爾, H·德根, G·明希, H-P·霍爾特霍夫, A·比爾特曼, H-J·比林, C·萊德 申請(qǐng)人:高級(jí)科爾有限公司