專利名稱：與百草枯抗性相關(guān)rna及其對應(yīng)的蛋白、編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與百草枯抗性相關(guān)RNA及其對應(yīng)的蛋白、編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
百草枯(paraquat,I, I ‘-dimethyl-4,4’-bipiridyl ;1,1 二甲基-4,4’-聯(lián)批叮，分子量257.2)是一種非選擇性的速效觸殺型除草劑，它是繼草甘磷之后的第二大除草齊U。百草枯被廣泛應(yīng)用于防除各種一年生雜草；對多年生雜草有強烈的殺傷作用，但其地下莖和根能萌出新枝；對已木質(zhì)化的棕色莖和樹干無影響。同時，百草枯還適用于防除果園、桑園、膠園及林帶的雜草，也可用于防除非耕地、田埂、路邊的雜草，對于玉米、甘蔗、大豆以及苗圃等寬行作物，可采取定向噴施百草枯來防除雜草。百草枯自上世紀(jì)六十年代由原英國卜內(nèi)門化學(xué)工業(yè)有限公司(ICI)研究開發(fā)，迄今其在農(nóng)業(yè)種植中的廣泛應(yīng)用已經(jīng)有50多年的歷史，目前在世界范圍內(nèi)有100多個國家使用百草枯。百草枯在1984年首次被引進(jìn)中國市場，自上世紀(jì)90年代以來，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，我國很多農(nóng)藥企業(yè)先后開始大量生產(chǎn)百草枯原藥，目前百草枯已經(jīng)在我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)得到廣泛應(yīng)用。百草枯為速效觸殺型滅生性季胺鹽類除草劑，植物對其吸收極其迅速，葉片接觸百草枯以后，有效成分對葉綠體層膜破壞力極強，使光合作用和葉綠素合成很快中止，葉片著藥后2-3小時即開始受害變色，百草枯對單子葉和雙子葉植物綠色組織均有很強的破壞作用。在光下生長的植物中，百草枯主要作用于其葉綠體，葉綠體含有綠色植物的光合系統(tǒng)，能吸收光能并制造糖分。百草枯作用于光系統(tǒng)I (photosystem I)的光合膜系統(tǒng),該系統(tǒng)能產(chǎn)生自由電子以推動光合作用。光系統(tǒng)I產(chǎn)生的自由電子與百草枯離子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生自由基結(jié)構(gòu)。氧可以迅速將這些自由基還原，并在這一過程中產(chǎn)生過氧化物。產(chǎn)生的過氧化物具有極高的化學(xué)活性，它能攻擊不飽和膜脂肪酸，迅速打開并分解細(xì)胞膜及組織。百草枯離子與自由基的反應(yīng)過程中會反復(fù)產(chǎn)生更多的過氧化物，直至停止產(chǎn)生自由電子，植物將迅速枯萎死亡。因此，百草枯是光合作用的一種電子傳遞抑制劑。在光系統(tǒng)I中它還能競爭性地抑制NADP的還原，還原后的百草枯迅速再氧化產(chǎn)生一系列的超氧化物陰離子，活性氧自由基的毒害能引起脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)和細(xì)胞膜的損傷。百草枯作為一個應(yīng)用廣泛的除草劑，人們在科學(xué)研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中進(jìn)行了很多抗除草劑植物的篩選并著手對抗除草劑基因進(jìn)行克隆。1987年，人們首次在匈牙利抗莠去津的群體中發(fā)現(xiàn)了百草枯抗性植物小飛蓬(Conyza canadensis)，后來，有研究者在加拿大萵苣中也發(fā)現(xiàn)了只對百草枯有抗性的植株。Jinki Jo等人從人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)中分離克隆了一個抗百草枯的新基因(pqrA, GenBank:AAF86626.1),他們發(fā)現(xiàn)PqrA基因編碼的蛋白對百草枯具有一定抗性。JinkiJo等人將pqrA基因轉(zhuǎn)入煙草后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草與野生型相比具有一定的百草枯抗性。PqrA蛋白是一種膜蛋白，PqrA多肽的親水模式表明它與12個轉(zhuǎn) 膜片段(TMS)家族輸出蛋白具有很高的同源性，是典型的Na+/drug反轉(zhuǎn)運體家族成員，負(fù)責(zé)多種毒物的轉(zhuǎn)運，確保耐性細(xì)胞對有毒化合物的抑制作用。2003年,Nefedova等在藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)PCC 6803野生型菌株和對百草枯抗性突變體Prq20菌株中進(jìn)行了 prqA和mvrA基因的插入失活實驗,首次闡明轉(zhuǎn)運體在光合微生物中參與了對百草枯的抗性。通過細(xì)菌和動物中的研究，目前認(rèn)為百草枯能通過腐胺、氨基酸陽離子轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運。Soar等人 通過研究認(rèn)為百草枯在金蓋花(Arctotheca calendula)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運與百草枯導(dǎo)致傷害緊密相關(guān)，并能誘導(dǎo)百草枯抗性的產(chǎn)生。他們通過在施用百草枯時添加一些多胺，能減少百草枯的毒性；應(yīng)用多胺，腐胺，尸胺和亞精胺檢測，在敏感植物中，百草枯的轉(zhuǎn)運由于多胺的存在競爭性地抑制了百草枯的吸收。多胺、亞精胺和尸胺有效地減少了百草枯在金盞花敏感植株中的轉(zhuǎn)運，抗性植株比敏感植株含有較高的亞精胺水平，因此推測多胺或者多胺轉(zhuǎn)運體參與百草枯的抗性形成。但到目前為止，還沒有在植物中發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)運百草枯的植物蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種與百草枯抗性相關(guān)RNA。本發(fā)明提供的RNA，包括正向RNA和反向RNA ；所述反向RNA是所述正向RNA的反向互補；所述正向RNA為蛋白A的編碼基因中的200-500bp的DNA轉(zhuǎn)錄得到的RNA ；所述蛋白A的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述RNA中，所述蛋白A的編碼基因中的200_500bp的DNA為所述蛋白A的編碼基因中包括5’ UTR區(qū)或3’ UTR區(qū)中任意200-500bp的DNA ；上述蛋白A的編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列I ;所述5’ UTR區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第1-215位核苷酸；所述3’ UTR區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第1704-1953位核苷酸；所述蛋白A的編碼基因的開放閱讀框為序列表中的序列I自5’末端第216-1703位核苷酸。上述正向RNA具體為序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸翻譯出序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。上述RNA由所述正向RNA、linker和所述反向RNA組成；上述RNA具體為如下I) -4)中任--種RNA:I)序列表中的序列3所示的RNA ；2)序列表中的序列3自5’末端第11-637位所示的RNA ；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的RNA序列雜交且具有相同功能的RNA分子；4)與I)或2)限定的RNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的RNA分子。其中，所述正向RNA的核苷酸序列為序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸；所述linker的核苷酸序列為序列表中序列3的自5’末端第274-374位核苷酸；所述反向RNA的核苷酸序列為序列表中序列3的自5’末端第375-637位核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼上述RNA的DNA分子。本發(fā)明提供的DNA分子，包括正向DNA和反向DNA ；所述反向DNA是所述正向DNA的反向互補；所述正向DNA為所述蛋白A的編碼基因中的200_500bp的DNA。上述DNA分子中，所述正向DNA為所述蛋白A的編碼基因的5’ UTR區(qū)或3’ UTR區(qū)中 200-500bp 的 DNA ；上述正向DNA為序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸為序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。上述DNA分子由所述正向DNA、linker和所述反向DNA組成；上述DNA分子具體是如下I) -4)中任--種的DNA分子:I)序列表中序列4所示的DNA分子；2)序列表中的序列4自5’末端第11-637位所示的DNA ；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至 少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述嚴(yán)格條件為:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, v0.1 % SDS 各洗膜一次。其中，其中所述正向RNA的編碼DNA的核苷酸序列為序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸；所述linker的編碼DNA的核苷酸序列為序列表中序列4的自5’末端第274-374位核苷酸；所述反向RNA的編碼DNA的核苷酸序列為序列表中序列4的自5’末端第375-637位核苷酸。含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組載體具體為將上述DNA分子插入pX7的XhoI和SpeI位點中得到的載體。本發(fā)明的第三個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，是將上述的DNA分子導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物對百草枯的抗性高于所述目的植物。在上述方法中，上述的DNA分子通過上述的重組載體導(dǎo)入目的植物中；在上述方法中，所述對百草枯的抗性體現(xiàn)在子葉變綠頻率或植物生長狀況；在上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，在本發(fā)明的實施例中具體的雙子葉植物為擬南芥。蛋白A或其編碼基因在作為RNA干擾靶點在培育對百草枯的抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或蛋白A或其編碼基因在植物對百草枯的抗性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，其中該應(yīng)用為是將所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到植物對百草枯的抗性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述對百草枯的抗性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物的效果通過增加子葉白化死亡率和/或降低植物存活率體現(xiàn)；所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物為擬南芥。本發(fā)明的第四個目的是提供一種蛋白A。本發(fā)明提供的蛋白A，是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物對百草枯的抗性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白A中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由495個氨基酸殘基組成。編碼上述蛋白A的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述基因具體是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與⑴限定的DNA序列雜交且編碼與植物對百草枯的抗性相關(guān)蛋白的DNA分子；(3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物對百草枯的抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由1953個核苷酸組成。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個能夠轉(zhuǎn)運百草枯的轉(zhuǎn)運體蛋白PARl (Paraquat Resistantl)，當(dāng)在植物中缺失PARl基因時，突變體植物表現(xiàn)出對高濃度百草枯的抗性，同時在植物中過量表達(dá)PARl基因時，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對百草枯的敏感性，因此，本發(fā)明提供了一段RNA，將其導(dǎo)入野生型擬南芥，可以得到對百草枯高抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥，本發(fā)明的研究為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中培育抗百草枯的作物新品種提供了一個理想的靶點基因，具有很廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為pari突變體的遺傳篩選圖2為pari突變體對百草枯抗性分析圖3為PARl基因的圖位克隆圖4為PARl基因的驗證圖5為PARl基因的過量表達(dá)分析圖6為土中生長的植物對百草枯的敏感性分析圖7為RNA干擾轉(zhuǎn)基因植物的表型分析
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、PARl基因的獲得及其功能鑒定一、PARl基因的發(fā)現(xiàn)1、pari突變體的遺傳篩選百草枯是一種非選擇性除草劑，百草枯能夠作用于葉綠體的光合系統(tǒng)I，并且能夠?qū)е鲁踝杂苫膹V生。為了便于大規(guī)模的遺傳篩選，采用了種子在含百草枯的培養(yǎng)基上光下萌發(fā)的方法。通過實驗發(fā)現(xiàn)，百草枯對野生型擬南芥種子的萌發(fā)呈現(xiàn)出劑量依賴的抑制效應(yīng)。在低濃度下，例如在0.5 μ M百草枯培養(yǎng)基上，野生型擬南芥種子仍能萌發(fā)并且子葉變綠，但其生長明顯滯后；隨著百草枯濃度的升高，種子甚至不能萌發(fā)(在大于2μΜ的條件下)，即使萌發(fā)但子葉關(guān)閉或白化，另外根的生長也受到很大影響。百草枯能以劑量依賴的方式很強地抑制種子的生長和發(fā)育，百草枯這種特性為篩選百草枯抗性突變體提供了便利。對Col-O生態(tài)型的擬南芥甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate, EMS)誘變的M2群體進(jìn)行篩選。為了減少假陽性同時又不漏篩抗性稍弱的突變體，用了 2.5μ M百草枯作為篩選濃度。從1，5000個Col-O生態(tài)型的M2株系中，第一輪篩選獲得了 14個候選突變體，第二輪確證了2個突變體pari和par4。這些突變體對百草枯的抗性強度存在差異。但它們在正常生長條件下與野生型相比在形態(tài)上沒有顯而易見地變化。將其中抗性最強的一個突變體命名為pari突變體(圖1，其中，上排左邊植物為pari突變體，下排為其相應(yīng)親本，在2μ M百草枯培養(yǎng)基上生長10天的情況，Col-O為野生型擬南芥)。2、pari突變體對百草枯抗性分析pari突變體在正常生長條件下與野生型擬南芥相比沒有明顯的差異(圖2，A為在MS培養(yǎng)基上生長7天的幼苗(左Col-Ο，右pari)，但在百草枯培養(yǎng)基上表現(xiàn)出了極強的萌發(fā)抗性(圖2，B為在含3μ M百草枯的MS培養(yǎng)基上生長7天的幼苗(左Col-Ο，右pari))和生長優(yōu)勢(圖2，C為在含1.5μ M百草枯的MS培養(yǎng)基上生長21天的植株(左Col_0，右pari))，當(dāng)轉(zhuǎn)移MS培養(yǎng)基上生長的pari和對照Col-O到含有百草枯的培養(yǎng)基上，對照Col-O新葉和靠近培養(yǎng)基的老葉黃化死亡，但pari仍具有旺盛的生長勢(圖2，D為在MS培養(yǎng)基上生長10天的幼苗轉(zhuǎn)移到含3 μ M百草枯的MS培養(yǎng)基上再生長2周的情況(仍為綠色的是Parl，已黃化的是Col-Ο))，另外百草枯嚴(yán)重抑制了對照Col-O主根的伸長和側(cè)根的生成，但對pari的抑制是削弱的，仍有大量側(cè)根生成。以上結(jié)果表明無論在種子萌發(fā)還是在種苗生長時期，pari均具有較強的百草枯抗性，并且pari突變沒有影響到植物的正常生長發(fā)育。3、PAR1基因的圖位克隆pari突變體與擬南芥Ler生態(tài)型進(jìn)行雜交得到Fl代種子，自交之后用F2群體進(jìn)行定位分析。把F2群體播種于含有百草枯的培養(yǎng)基上挑選抗性植株首先用BSA的方法進(jìn)行初步定位，結(jié)果把PARl位點初步定位于第I號染色體的上臂兩個SSLP分子標(biāo)記CIW12和CIffl之間，距離CIW12 16.67cM, CIffl 17.9cM，這與CIW12和CIffl之間的遺傳距離33cM相似(圖3A)。為了精細(xì)定位，又設(shè)計了新的InDel和CAP標(biāo)記，通過對2365個F2群體的抗性植株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在InDel標(biāo)記T8E3處有19重組事件，在CAP標(biāo)記T12021處有11個重組事件，兩個標(biāo)記之間的物理距離大約為215Kb，預(yù)測有52個開放閱讀框。經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)，基因Atlg31830的第1081位核苷酸由鳥苷酸(G)突變成了腺苷酸(A)，結(jié)果導(dǎo)致其編碼蛋白的第361位氨基酸由苷氨酸(G)突變成了精氨酸(R)(圖3，B)。通過上述研究，認(rèn)為Atlg31830是pari突變體的相關(guān)候選基因，命名為PARl。通過氨基酸的序列比對，發(fā)現(xiàn)PARl蛋白中的第361位的苷氨酸在其同源蛋白中都具有很高的保守性(圖3，B)。4、PARl基因的驗證為了驗證侯選基因的真實性，從美國擬南芥生物資源中心(The ArabidopsisBiological Resource Center, ABRC)買來 Atlg31830 基因的兩個 T-DNA 插入突變體Salkll9707和Salkl29045。為了研究方便，分別將之前的pari突變體命名為parl_l，將Salkl 19707 和 Salkl29045 分別命名為 parl-2 和 parl-3，在 parl-2 和 parl-3 突變體中，由于T-DNA插入到了該基因的內(nèi)部，造成了目的基因不能正常轉(zhuǎn)錄，是目的基因的功能缺失突變體。分別提取parl-l、parl_2和par 1-3的RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,通過RT-PCR,分別以引物 Fl (5 ‘-ACCATACACTTCCAAAGGCTTTGT-3，)和 B2 (5 ‘-CCATCATCATCATCGTAAAGATTA-3，(parl-Ι突變體中，因為是點突變，所以轉(zhuǎn)錄本是存在的，有擴(kuò)增產(chǎn)物。而由于T-DNA插入造成的parl-2和parl-3突變體，轉(zhuǎn)錄本是被破壞的，所以沒有擴(kuò)增產(chǎn)物)檢測了 Atlg31830分別在parl-1, parl-2和parl-3中的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atlg31830在兩個T-DNA插入突變體中的轉(zhuǎn)錄本均被破壞(圖4,A)。分別將parl-1, parl-2和parl-3播種在含有I μ M百草枯的MS培養(yǎng)基上,結(jié)果發(fā)現(xiàn)parl-2和parl_3與parl-Ι —樣具有明顯的抗百草枯的表型(體現(xiàn)在沒有白化子葉，且根長沒有變短，圖4，B)。又分別將parl-Ι和parl-2，parl-1和parl-3做了雜交，結(jié)果Fl代植物在含有I μ M百草枯的培養(yǎng)基上表現(xiàn)出與parl-1一樣的抗性(圖4，C和D)，因此可以肯定Atlg31830就是PARl基因。二、PARl基因的獲得及其功能鑒定1、PAR1基因的克隆野生型擬南芥(Arabidopsis`thaliana, Columbia, Col-Ο)生態(tài)型，購自美國擬南芥生物資源中心(The Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC),產(chǎn)品編號為CS28166。提取野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia, Col-Ο)生態(tài)型的基因組DNA作為模板，利用分別引入XhoI和SmaI酶切位點的引物F3(5 ‘-AACTCGAGctggatgacgttATGCAGAAGCGG-3，)和 B3(5 ‘-tgcccgggACGTATTAGAGTTTCTTCGTATTC-3’)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，于 58 °C 退火，擴(kuò)增得到的1522bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸，該PCR的基因命名為PAR1，該基因編碼的蛋白命名為PAR1，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述蛋白的編碼基因的5’ UTR區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第1-215位核苷酸；所述蛋白的編碼基因的3’ UTR區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第1704-1953位核苷酸；所述蛋白的編碼基因的開放閱讀框為序列表中的序列I自5’末端第216-1703位核苷酸。2、PARl基因的功能研究I)構(gòu)建PARl基因過量表達(dá)的重組表達(dá)載體將上述I得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過XhoI和SmaI酶切得到酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切得到的pBluescript SK載體片段(可購自默克公司，產(chǎn)品目錄號為ST212205)連接，得到連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入載體pBluescript SK的XhoI和SmaI酶切位點間得到的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為SK-PARl。將SK-PARl載體用的XhoI和SpeI酶切位點進(jìn)行酶切，回收酶切片段作為連接片段，同時以XhoI和SpeI雙酶切植物誘導(dǎo)表達(dá)載體pBA002 (記載在A GFP-mouse talinfusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actincytoskeleton in growing pollen tubes, Benedikt Kost, Pius Spielhofer, Nam-HaiChua, The Plant Journal，16 (3)，393-401，1998，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，得到載體骨架，用T4DNA連接酶連接片段和載體骨架，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到克隆，在含有50毫克/升壯觀酶素的LB平板上37度培養(yǎng)16小時，最后篩選得到具有抗壯觀酶素抗性的克隆，提取該克隆的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列I插入PBA002的XhoI和SpeI酶切位點間得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pBA-PARl。2)、轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥的獲得將上述獲得的pBA-PARl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101(購自Biovector C0.，LTD，產(chǎn)品貨號:Biovector-375)，然后用花侵染轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-O (購自美國擬南芥生物資源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC,產(chǎn)品編號為 CS28166,以下簡稱野生型擬南芥)的花序，通過除草劑Basta (50mg/L)篩選出30株Tl代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥，經(jīng)過自交，得到600株T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥。3)、轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥的鑒定分別將編號為#3和#6的T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥的種子播種后在MS培養(yǎng)基(1/2MS，1%蔗糖，0.8%瓊脂)(其中，MS鹽、瓊脂和蔗糖購自北京西美杰科技有限公司，產(chǎn)品貨號M531、A7848和S391，)上22度24小時光照培養(yǎng)10天，提取全苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得。0嫩，用引物卩1(5 ‘-ACCATACACTTCCAAAGGCTTTGT-3’)和 B2 (5 ‘-CCATCATCATCATCGTAAAGATTA-3’)進(jìn)行RT-PCR，檢測了 PARl基因在T2代轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平，以野生型擬南芥和 parl-2 突變體(The Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC, Salkl 19707)為對照，以 Actin7 為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為 ACTIN7F:5 ‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3’ 和ACTIN7B:5‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3’。結(jié)果如圖 5A 所示，為 RT-PCR 技術(shù)檢測 PARl基因的表達(dá)水平，從圖中看出，與野生型擬南芥相比，編號為#3 (0E#3)和#6(0E#6)的T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥中PARl基因的表達(dá)水平均具有不同程度地升高，而parl-2突變體沒有表達(dá)，說明編號為#3和#6的T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥為陽性的過表達(dá)擬南芥。4)、轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥在培養(yǎng)基中對百草枯的敏感性分析分別將野生型擬南芥、編號為#3和#6的T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥種子播種在含有0.5μ M百草枯的1/2MS培養(yǎng)基(1/2MS配方同上)上生長(22度，24小時光照)一周。每個株系50株，實驗重復(fù)三次，用子葉白化死亡率(子葉白化率是最直觀也最明顯的表型，可以代表植物對百草枯的敏感性)來定量體現(xiàn)對百草枯的敏感性。結(jié)果如圖5Β所示，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，編號為#3和#6的Τ2代轉(zhuǎn)PARl擬南芥對百草枯的敏感性增強，表現(xiàn)為植物的子葉白化死亡。在0.5μ M百草 枯的培養(yǎng)基上生長一周后，野生型擬南芥的子葉白化死亡率為4% ；編號為#3和#6的T2代轉(zhuǎn)PARl擬南芥的子葉白化死亡率分別為90%和86.5%。5)、轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥在土中對百草枯的敏感性分析通過前面的系列研究，可以確定PARl是一個與植物抗百草枯密切相關(guān)的蛋白，為了以后通過生物技術(shù)來利用PARl作為靶點基因產(chǎn)生抗除草劑的植物新品種，首先在模式植物擬南芥中進(jìn)行了實驗。分別將野生型擬南芥(Col-0)、pari突變體parl_l (該突變體是在上述一中篩選得到的)，parl-2、parl-3和編號為#3、#6的T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥種子播種在含有蛭石的營養(yǎng)缽中，待植物生長到6周左右時，對植物噴施10毫升的2μΜ(低濃度)百草枯和20 μ M(高濃度)百草枯(相當(dāng)于5mg/L，溶劑為水，百草枯購自美國Sigma公司，貨號為36541)，在噴施后7天分別觀察結(jié)果。以噴施等量的水為對照。每個株系10株。以植物的存活率來代表植物對百草枯的反應(yīng)。結(jié)果如圖6所示,對照中野生型(Col-O)、parl突變體(parl-l,parl_2和parl_3)和編號為#3、#6的T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥生長無顯著差異。在低濃度(2μΜ)百草枯條件下，編號為#3、#6的Τ2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥基本萎蔫死亡，野生型植物少部分死亡，而突變體植物大多生長良好。

在高濃度(20 μ Μ)百草枯條件下，野生型和編號為#3、#6的Τ2代轉(zhuǎn)pBA_PARl擬南芥全部死亡，而僅有突變體parl-Ι和parl-2還有存活。以植物的存活率來代表植物對百草枯的反應(yīng)。統(tǒng)計在噴施20μ M百草枯4天后的存活率，結(jié)果如下:野生型(Col-ο)在百草枯處理4天后的存活率為30% ；pari突變體(parl_l, parl_2和parl_3)在百草枯處理4天后的存活率都是100%。編號為#3、#6的T2代轉(zhuǎn)PARl擬南芥在百草枯處理4天后的存活率分別為10%和 15%。實施例2、抑制PARl基因表達(dá)的RNA及其表達(dá)載體的獲得高效的RNAi需要形成一個含有內(nèi)含子的自我互補“發(fā)夾”RNA分子。RNAi載體的構(gòu)建應(yīng)該包含一個轉(zhuǎn)錄單位組成的一個靶基因的由內(nèi)含子隔開的兩個反向的拷貝，內(nèi)含子為發(fā)卡提供了必需的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體需要兩個步驟完成，具體如下:其中，pX7是一個有雌二醇誘導(dǎo)的植物表達(dá)載體，記載在Applicationsof Chemical-1nducible Expression Systems in Functional Genomics andBiotechnology,Nam-Hai ChuaiMethods in Molecular Biology，323 (III)，329-342，2006，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)。以野生型擬南芥為模板，用引物PARlRNAiFlaaggatccgtcgacTCAACAGCAGACTCGGGAATA(包含 BamHI 和 SalI 酶切位點)和PARlRNAiBl aactgcagaagcttTTCAAATCGACAATGGCAAC(包含 PstI 和 HindIII 酶切位點)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物即為PARl基因的DNA片段。將上述得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)Sail、HindIII酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的 pSK-1nt 載體(Applications of Chemical-1nducible Expression Systemsin Functional Genomics and Biotechnology, Nam-Hai Chua, Methods in MolecularBiology，323 (III)，329-342，2006，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)連接，得到中間載體；再將上述得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH1、PstI酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的中間載體連接，得到pSK-1nt-PARl。將上述的pSK-1nt-PARl用XhoI和SpeI酶切，得到的649bp的酶切片段與經(jīng)過同樣酶切得到的PX7連接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，該質(zhì)粒為將序列4插入pX7的XhoI和SpeI位點間得到的載體。其中序列3自5’末端第11-273位核苷酸為正向的RNA，序列3自5’末端第375-637位核苷酸為反向的RNA;序列表中序列3的自5’末端第274-374位核苷酸為linker(RNA)；序列4自5’末端第11-273位核苷酸為正向的RNA的編碼基因，序列4自5’末端第375-637位核苷酸為反向的RNA的編碼基因；序列表中序列4的自5’末端第274-374位核苷酸為Iinker(DNA)；其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸翻譯出序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸為序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。實施例3、抑制PARl基因的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植物獲得對百草枯的抗性1、轉(zhuǎn)pX7 -PARl擬南芥的獲得將上述由實施例2獲得的PX7-PAR1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，然后用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-O的花序，通過潮霉素(50mg/L)篩選出20株Tl代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥，經(jīng)過自交，得到400株T2代轉(zhuǎn)pBA-PARl擬南芥。2、轉(zhuǎn)pX7-PARl擬南芥的鑒定分別將編號為#1、#2和#3的T2代轉(zhuǎn)pX7_PARl擬南芥的種子播種后在MS培養(yǎng)基(1/2MS，1%蔗糖，0.8%瓊脂)(其中，MS鹽、瓊脂和蔗糖購自北京西美杰科技有限公司，產(chǎn)品貨號M531、A7848和S391，)上22度24小時光照培養(yǎng)7天，然后用20 μ M的雌激素(17-β-Estradiol, Sigma，產(chǎn)品貨號E8875)誘導(dǎo)24小時，提取全苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，然后用引物PARlqFl:TCTGTGCTGTTGTAGCACTCTCGT 和 PARlqBI:ATTCCCGAGTCTGCTGTTGAAGGT 進(jìn)行熒光實時定量 RT-PCR (qRT-PCR)，檢測了 PARl基因在T2代轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平，以野生型擬南芥為對照，以Actin7為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為 ACTIN7F:5 ‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3’ 和 ACTIN7B:5 ‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3’。每個株系約10株，實驗重復(fù)三次結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果如圖7A所示，為qRT-PCR技術(shù)檢測PARl基因的表達(dá)水平，從圖中看出，野生型擬南芥(Col-O)的PARl基因的相對表達(dá)量為13.77 ± 1.21 ；編號為#1、#2和#3的T2代轉(zhuǎn)pX7_PARl擬南芥的PARl基因的相對表達(dá)量分別為
5.63土 L 82，10.75±0.58 和 2.09土 L 03 ；
從上述可以看出，與野生型擬南芥(Col-O)相比，編號為#1、#2和#3的T2代轉(zhuǎn)PX7-PAR1擬南芥中PARl基因的表達(dá)水平均具有不同程度地降低，其中，編號為#1,#2和#3轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的PARl基因的轉(zhuǎn)錄水平分別降低到了野生植物體內(nèi)的41 %，78%和15%，說明轉(zhuǎn)PX7-PAR1擬南芥中的PARl的表達(dá)抑制，且編號為#1、#2和#3的T2代轉(zhuǎn)pX7_PARl擬南芥為干擾了 PARl表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因植物。3、轉(zhuǎn)pX7-PARl擬南芥的對百草枯抗性分析分別將野生型擬南芥Col-Ο、編號為#1、#2、#3和#4的T2代轉(zhuǎn)pX7_PARl擬南芥種子播種在含有20 μ M的雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，產(chǎn)品貨號Ε8875)和Ι.ΟμΜ百草枯的1/2MS培養(yǎng)基(1/2MS配方同上)上生長(22度,24小時光照)一周。每個株系約30株，實驗重復(fù)三次，用子葉變綠表示植物對百草枯的抗性(在1.0 μ M百草枯的培養(yǎng)基上，野生型植物的子葉萌發(fā)以后不能變綠，植物的生長明顯被抑制；而對百草枯有抗性的植物的子葉則能正常變綠，植物可以很好地生長。子葉變綠是最直觀也最明顯的表型，可以代表植物對百草枯的抗性)來定量體現(xiàn)對百草枯的抗性。觀察結(jié)果如圖7Β所示，發(fā)現(xiàn)與野生型(Col-Ο)相比，編號為#1至#4的Τ2代轉(zhuǎn)PX7-PAR1擬南芥對百草枯的抗性增強，表現(xiàn)為植物的子葉能正常變綠，植物可以正常生長。在1.0 μ M百草枯的培養(yǎng)基上生長一周后，野生型擬南芥的子葉變綠頻率(葉變綠頻率=子葉變綠的植物數(shù)目/植物總數(shù))為5 %;編號為#1、#2、#3和#4的Τ2代轉(zhuǎn)pX7-PARl擬南芥的子葉變綠頻率分別為78%，65%，95%和85%。通過上述實驗，通過生 物技術(shù)在植物體內(nèi)抑制PARl基因的表達(dá)，可以使植物獲得很好的百草枯抗性，而通過生物技術(shù)提高PARl基因在植物體內(nèi)的表達(dá)，則可以增強植物對百草枯的敏感性。
權(quán)利要求
1.一種RNA，包括正向RNA和反向RNA ； 所述反向RNA是所述正向RNA的反向互補； 所述正向RNA為蛋白A的編碼基因中的200-500bp的DNA轉(zhuǎn)錄得到的RNA ； 所述蛋白A的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA，其特征在于: 所述蛋白A的編碼基因中的200-500bp的DNA為所述蛋白A的編碼基因中包括5’UTR區(qū)或3’ UTR區(qū)的部分或者全部片段的200-500bp的DNA ； 所述蛋白A的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I ; 所述5’ UTR區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第1-215位核苷酸；所述3’ UTR區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第1704-1953位核苷酸； 所述正向RNA具體為序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的RNA，其特征在于: 所述RNA由所述正向RNA、linker和所述反向RNA組成； 所述RNA具體為如下I)-4)中任--種RNA: 1)序列表中的序列3所示的RNA； 2)序列表中的序列3自5’末端第11 -637位所示的RNA； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的RNA序列雜交且具有相同功能的RNA分子； 4)與I)或2)限定的RNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的RNA分子。
4.一種編碼權(quán)利要求1-3中任一所述RNA的DNA分子，包括正向DNA和反向DNA ； 所述反向DNA是所述正向DNA的反向互補； 所述正向DNA為所述蛋白A的編碼基因中的200-500bp的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于:所述蛋白A的編碼基因中的200-500bp的DNA為中包括5’ UTR區(qū)或3’ UTR區(qū)中任意200_500bp的DNA ； 所述正向DNA具體為序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的DNA分子，其特征在于: 所述DNA分子由所述正向DNA、linker和所述反向DNA組成； 所述DNA分子具體是如下I)-4)中任--種的DNA分子: 1)序列表中序列4所示的DNA分子； 2)序列表中的序列4自5’末端第11-637位所示的DNA； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
7.含有權(quán)利要求4-6中任一所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；所述重組載體具體為將權(quán)利要求4-6中任一所述DNA分子插入pX7中得到的載體。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求4-6中任一所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物對百草枯的抗性高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:權(quán)利要求4-6中任一所述DNA分子通過權(quán)利要求7所述的重組載體導(dǎo)入目的植物中； 所述對百草枯的抗性體現(xiàn)在子葉變綠頻率； 所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物為擬南芥。
10.蛋白A或其編碼基因在作為RNA干擾靶點在培育對百草枯的抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用； 或蛋白A或其編碼基因在植物對百草枯的抗性中的應(yīng)用； 或一種蛋白A，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物對百草枯的抗性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)； 或編碼上述蛋白A的基因，是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I 所不的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物對百草枯的抗性相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物對百草枯的抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與百草枯抗性相關(guān)RNA及其對應(yīng)的蛋白、編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的提供的RNA，包括正向RNA和與其反向互補的反向RNA；所述正向RNA的核苷酸序列為序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸；所述反向RNA的核苷酸序列為序列表中序列3的自5’末端第375-637位核苷酸。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個能夠轉(zhuǎn)運百草枯的轉(zhuǎn)運體蛋白PAR1(Paraquat Resistant1)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中培育抗百草枯的作物新品種提供了一個理想的靶點基因，具有很廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K14/415GK103173439SQ20111043622
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者左建儒, 牟金葉, 安豐英, 付福友 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所