專利名稱：含有g(shù)lp-1的融合蛋白、其藥物組合物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，尤其是一種具有延長胰高血糖素樣肽類體內(nèi)半衰期的含有GLP-I的融合蛋白及藥物組合物，以及在制備糖尿病藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
GLP-I (glucagon-likepeptide-1,以下簡稱GLP_1)主要是由小腸L細(xì)胞分泌的一種37個(gè)氨基酸組成的多肽，其活性形式為GLP-I (7-37) OH和GLP-1 (7-36) NH2 (Mojsov S，J Clin Invest. 1987Feb ；79(2) :616-9)。GLP-1有明顯減低人用餐后的血糖，能刺激胰島素的產(chǎn)生，同時(shí)還能起到一定減肥效應(yīng)，并且不會(huì)引起低血糖癥(Drucker D J， Diabetes. 1998Feb ；47(2) :159-69)。近期研究還表明 GLP-1 對胰腺再生作用(Drucker D J,2003Dec ； 144(12) :5145-8)。然而，GLP-1 (7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘，涉及 GLP-I肽的治療用途，來自蜥蜴唾液的人的GLP-I類似物Exendin-4的合成物Exenatide， 2005年在美國作為降糖藥上市，血中的半衰期到2. 5小時(shí)左右，每天需要在早飯及晚飯前注射給藥，每天多次注射給藥在臨床使用中非常不方便，因此，延長GLP-I類似物的體內(nèi)時(shí)間對于方便臨床應(yīng)用具有重要的意義。目前已經(jīng)有不少研究采用GLP-I類似物融合蛋白技術(shù)解決GLP-I類似物在體內(nèi)的存留時(shí)間[CN90101167. 3、CN200710018734. 2、CN200410054397. 9、CN01820232. 2、 CN200380110152. 7、CN200510039265. 3、CN200610127237. I、CN200910009642. 7]，然而，現(xiàn)
有的技術(shù)與臨床理想的目標(biāo)還有很大距離，存在GLP-I半衰期短的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對GLP-I在體內(nèi)的存留時(shí)間較短，導(dǎo)致治療作用較短每天需要多次注射給藥的缺限，提供具有下述通式I結(jié)構(gòu)的含有GLP-I的融合蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有通式I結(jié)構(gòu)的GLP-I融合蛋白作為有效成分以及-種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥用組合物，及其在制備糖尿病治療藥物中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種含有GLP-I的融合蛋白， 具有如下通式I的結(jié)構(gòu)GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-1 -連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-1 -連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I通式I。所述連接肽為GGGGS。所述人源蛋白為HSA。所述含有GLP-I的融合蛋白具有SEQ ID NO :6所不的氣基酸序列或與該序列有 90%以上同源性。所述含有GLP-I的融合蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列對應(yīng)的核苷酸序列SEQ ID NO 5或其互補(bǔ)核苷酸序列。含有上述任一種GLP-I的融合蛋白的藥物組合物。所述的組合物為液體注射劑或凍干注射劑。含有上述任一種GLP-I的融合蛋白的組合物在制備治療糖尿病、肥胖癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的GLP-I融合蛋白具有更長的體內(nèi)存留時(shí)間，可作為有效成分制備糖尿病治療藥物。相當(dāng)寬的劑量范圍內(nèi)是有效的，劑量可由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)、給藥途徑、年齡、體重、對藥物的個(gè)體反應(yīng)，癥狀的嚴(yán)重程度等。 一般來說，本發(fā)明活性成分的有效量lX10-7-20mg/kg/天，可以單劑量給藥或成分劑量給 藥。


圖I顯示了本發(fā)明的融合蛋白免疫印跡結(jié)果(I =GLP-I ；2 :融合蛋白的GLP-I免疫印跡；3 :融合蛋白的HSA免疫印跡)。圖2顯示了本發(fā)明融合蛋白對小鼠耐糖能力的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的通式I的GLP-I或類似物融合蛋白如下述所示 GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽_GLP_1_連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-1通式I其中，連接肽優(yōu)選為含有5個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，序列為GGGGS ；GLP-I 的氨基酸序列為7-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-36 人源蛋白為人
血清白蛋白。本發(fā)明的通式I的GLP-I融合蛋白是通過下述方法制備的I、構(gòu)建編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA本發(fā)明中的融合蛋白可以從各種來源獲得野生型白蛋白和免疫球蛋白，例如這些蛋白可以從由表達(dá)野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的組織或細(xì)胞的cDNA文庫獲得。本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法對相關(guān)的融合蛋白的mRNA進(jìn)行篩選，通過公開的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列設(shè)計(jì)引物。本發(fā)明的融合蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)優(yōu)選來源于天然人序列，以減少融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性危險(xiǎn)。本發(fā)明中將根據(jù)人血清白蛋白的公開序列設(shè)計(jì)PCR引物，從人血RNA中釣取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通過標(biāo)準(zhǔn)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。2、構(gòu)建本發(fā)明中GLP-I的DNA本發(fā)明參考專利CN1363654A中GLP-1中雙鏈DNA全長的合成方法，進(jìn)行GLP-I雙鏈DNA全長的合成。本發(fā)明中GLP-I經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的DNA測序進(jìn)行序列驗(yàn)證。
3、構(gòu)建本發(fā)明中GLP-I融合蛋白載體利用本領(lǐng)域常規(guī)的PCR突變技術(shù)制備連接有連接短肽的GLP-I用以與蛋白表達(dá)質(zhì)粒的連接。連接技術(shù)是本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明利用PCR將含有連接肽的GLP-I與蛋白表達(dá)質(zhì)粒通過T4連接酶進(jìn)行連接，得到本發(fā)明中所有融合蛋白的表達(dá)載體。一旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的表達(dá)載體，它可以用來傳染大腸桿菌，生產(chǎn)融合蛋白。重組DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。4、用于重組表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的一般方法用本發(fā)明中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，用于表達(dá)融合蛋白。參考本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白表達(dá)技術(shù)優(yōu)化本發(fā)明中各種融合蛋白的表達(dá)，用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的原貝1J、技術(shù)(例如培養(yǎng)基、溫度、pH等)可以 參見MammalianCell Biotechnology A PracticalApproach,M. Butler。本發(fā)明中的GLP-1融合蛋白的表達(dá)采用本領(lǐng)域常規(guī)的Iac 啟動(dòng)子大腸桿菌融合蛋白表達(dá)技術(shù)，使用IPTG啟動(dòng)GLP-I融合蛋白的產(chǎn)生。5、本發(fā)明融合蛋白的純化一旦本發(fā)明的融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白分離和純化技術(shù)對本發(fā)明中的融合蛋白進(jìn)行純化。例如根據(jù)融合蛋白表達(dá)載體內(nèi)的標(biāo)簽進(jìn)行融合蛋白的粗提純。本發(fā)明中，純化后的融合蛋白可以通過超濾方法將其濃縮至藥用濃度，融合蛋白經(jīng)過紫外線的處理用以增加其藥用的安全性。6、本發(fā)明的融合蛋白的表征本發(fā)明中，可以用許多方法表征本發(fā)明的融合蛋白。這些方法中的一些包括與蛋白染色偶聯(lián)的SDS-PAGE或免疫印跡技術(shù)。本發(fā)明中的融合蛋白通過免疫印跡的鑒定，例如使用GLP-I的抗體。7、本發(fā)明的組合物本發(fā)明的GLP-I融合蛋白，可以與一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料共同制成藥物組合物，這些輔料包括水溶性填充劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑等等。 該藥物組合物可以通過肌肉、靜脈內(nèi)、皮下注射途經(jīng)進(jìn)行給藥，優(yōu)選的劑型為凍干或溶液注射劑。本發(fā)明所述的水溶性填充劑輔料包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一種或幾種的組合。PH調(diào)節(jié)劑是枸櫞酸、磷酸、鹽酸等非揮發(fā)性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉、或鉀或銨、碳酸鈉或鉀或銨鹽、碳酸氫鈉或鉀或銨鹽等生理可接受的有機(jī)或無機(jī)酸和堿及鹽；穩(wěn)定劑是EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、 碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。優(yōu)選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。滲透壓調(diào)節(jié)劑，是氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。所述注射制劑的制備方法包括以下步驟(I)凍干劑取GLP-I融合蛋白和水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入O. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物， 封口即得。(2)溶液注射液取GLP-I融合蛋白和水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入O. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌10-20 分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，封口即得。下列結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明實(shí)施例I人血清白蛋白編碼DNA的構(gòu)建本發(fā)明中將根據(jù)人血清白蛋白的公開序列設(shè)計(jì)PCR引物，從人血RNA中釣取人血清白蛋白的mRNA。在進(jìn)行人血清白蛋白mRNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)PCR弓丨物使人血清白蛋白的編碼DNA末端含有適合與載體連接的酶切位點(diǎn)(KpnI-HSA-NotI)。通過標(biāo)準(zhǔn)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。引物I 5GGT ACC AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC CTT3
引物2 5GCG GCC GC TAA GCC TAA GGC AGC TTG ACT TGC AGC AA3將PCR產(chǎn)物進(jìn)行KpnI/Notl雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行純化以去除內(nèi)切酶。實(shí)施例2 “GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-” 編碼 DNA 的構(gòu)建本專利采用全基因合成方法制備編碼“ GLP-1-GGGGS-GLP-1 _GGGGS_GLP_ I-GGGG S-”的DNA,基因序列為SEQ ID NO I及其反向互補(bǔ)序列。將SEQ ID NOl與其反向互補(bǔ)序列等摩爾混合，95°C水浴5分鐘后緩慢冷卻至室溫，形成雙鏈DNA。利用PCR技術(shù)對此雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增并使其3末端具有與HSA 5末端連接的位點(diǎn)(KpnI)及5末端與表達(dá)載體(pET15b)連接的位點(diǎn)(NdeI)。將產(chǎn)物進(jìn)行(KpnI/ NdeI)雙酶切，并進(jìn)行純化。實(shí)施例 3“-GGGGS-GLP-l-GGGGS-GLP-l-GGGGS-GLP-l”編碼 DNA 的構(gòu)建本專利采用全基因合成方法制備編碼“ -GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GL P-1”的DNA,基因序列為SEQ ID NO 3及其反向互補(bǔ)序列。將SEQ ID NO 3與其反向互補(bǔ)序列等摩爾混合，95°C水浴5分鐘后緩慢冷卻至室溫，形成雙鏈DNA。利用PCR技術(shù)對此雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增并使其5末端具有與HSA 3末端連接的位點(diǎn)(NotI)及3末端具有與表達(dá)載體(pET15b)連接的位點(diǎn)(BamHI)將產(chǎn)物進(jìn)行 (Notl/BamHI)雙酶切，并純化。SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列SEQ ID NO :2.SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列SEQ ID NO :4.實(shí)施例4 構(gòu)建編碼 “ GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-I-GGGGS-GLP-I” 的 DNA將實(shí)施例2中的酶切過的GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-與酶切過的 HSA通過KpnI酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接。然后將此連接產(chǎn)物與酶切后的-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GL P-1-GGGGS-GLP-1通過NotI酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接。PCR擴(kuò)增，酶切及連接技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)熟知的知識(shí)及技術(shù)。所得核苷酸序列SEQ ID NO 5.實(shí)施例5構(gòu)建本發(fā)明中GLP-I融合蛋白表達(dá)載體及融合蛋白的純化將表達(dá)質(zhì)粒pET15b進(jìn)行雙酶切(Ndel/BamHI)，然后與實(shí)施例4中的產(chǎn)物通過Ndel/BamHI酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接。_旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的表達(dá)載體，它可以用來傳染大腸桿菌，生產(chǎn)融合蛋白。重組DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。將構(gòu)建完畢的 pET 15b [GLP-1 -GGGGS-GLP-1 -GGGGS-GLP-1 -GGGGS-HSA-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GL P-l-GGGGS-GLP-1](命名為pET15b6GLPlHSA)以熱擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，熱擊轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)。將轉(zhuǎn)化后的融合蛋白表達(dá)載體在含有氨芐青霉素抗生素的LB培養(yǎng)平皿上培養(yǎng)篩選具有氨芐青霉素抗性的細(xì)胞。將得到的具有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行質(zhì)粒提取及純化，質(zhì)粒進(jìn)行序列鑒定完全正確。將過夜的菌液I :100比例以LB新鮮培養(yǎng)基稀釋，37 °C培養(yǎng)菌液直至0D600達(dá)到O. 6，使用IPTG啟動(dòng)融合蛋白的表達(dá)，并將體系溫度降至25 C。融合蛋白表達(dá)16h后，將囷液尚心，收集后，超聲波破碎菌體，操作程序?yàn)閐Ocycles，15秒/cycle。將破碎后的菌液高速離心，上清液被注入鎳柱。用鎳柱去捕獲含6XHIS標(biāo)簽的融合蛋白，并利用咪唑的濃度梯度對融合蛋白進(jìn)行洗脫。將洗脫的蛋白收集，利用具有IOkDa半透膜的離心管對收集的蛋白進(jìn)行透析及濃縮。凝血酶處理純化后的融合蛋白用來切除N末端的6XHIS標(biāo)簽，凝血酶的酶切技術(shù)參考 Invitrogen公司的實(shí)驗(yàn)手冊。利用Gel Filtration S-200蛋白純化柱進(jìn)行反應(yīng)混合物的分離，同時(shí)對目標(biāo)融合蛋白進(jìn)行精純。上述純化后的融合蛋白經(jīng)IOK過濾膜過濾濃縮后，紫外線滅菌處理，所得氨基酸序列SEQID NO 6。實(shí)施例6GLP-1融合蛋白的免疫印跡鑒定 用含I % SDS和2mg溴酚藍(lán)的PBS稀釋純化后的融合蛋白。煮沸變性后，取20 μ I 樣品置SDS-PAGA膠上，電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉溫室封閉2小時(shí)，加入鼠抗人GLP-I的單抗(SantaCruz，USA)室溫下孵育I小時(shí)，然后用HRP標(biāo)記的兔抗鼠的多抗進(jìn)行二抗結(jié)合，用ECL試劑盒發(fā)光顯色(Amersham Pharmacia Biotech, USA)。結(jié)果如圖I所示本發(fā)明的融合蛋白得到了較好的表達(dá)。實(shí)施例7取實(shí)施例6的融合蛋白IOmg,穩(wěn)定劑精氨酸O. 2g,聚乙二醇60000. 05g置于容器中,加注射用水80ml，攪拌使溶解，再加入甘露醇8g、山梨醇2g,攪拌使溶解，以O(shè). lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 0-8. O，補(bǔ)加水至100ml。加入O. 3g活性碳，在10-25°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支Iml進(jìn)行分裝。預(yù)凍2小時(shí)后，冷凍下減壓干燥18小時(shí)，至樣品溫度到15-20°C后，再干燥5小時(shí)，制得白色疏松塊狀物，封口即得白色凍干粉針，規(guī)格IOOug/支。實(shí)施例8取實(shí)施例6的融合蛋白25mg，加穩(wěn)定劑磷酸氫二鉀O. 05g，氯化鈉O. 9g，置于容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g攪拌使溶解，用O. lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 5-8. 5，補(bǔ)加水至100ml，加入0. 25g活性碳，在10_20°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支2ml進(jìn)行分裝，預(yù)凍2小時(shí)后，冷凍下減壓干燥15 小時(shí)，至樣品溫度到15-20°C后，再干燥5小時(shí)，制得白色疏松塊狀物，封口即得白色凍干粉針，規(guī)格500ug/支。實(shí)施例9取實(shí)施例6的融合蛋白50mg,加入穩(wěn)定劑三輕甲基氨基甲燒0. 2g,焦亞硫酸鈉 0. lg、氯化鈉0. 9g至容器中，加注射用水80ml中攪拌溶解，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH為6_8，補(bǔ)加水至100ml，加入O. 2g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，采用微孔濾膜過濾除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，規(guī)格IOOOug/支。實(shí)施例10取實(shí)施例6的融合蛋白5mg，穩(wěn)定劑谷氨酸O. Olg、氯化鉀O. 09g至容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖Ig攪拌溶解。加氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH為7. 0-8. 5， 補(bǔ)加水至100ml，加入O. 05g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，采用微孔濾膜過濾除菌，以每支Iml灌封、即得融合蛋白注射液，規(guī)格50ug/支。實(shí)施例11融合蛋白的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)給大鼠注射GLP-I及其融合蛋白(折合含GLP-I為O. 5mg/kg)，分別于注射前及注射后O. 5、1、3、6、9、12、24、36和48小時(shí)后于眼叢靜脈取血約O. 2ml，制備血清備用。GLP-I濃度測定方法采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測小鼠血清中融合蛋白的濃度，操作如下4°C離心分離血漿。用羊抗鼠的GLP-I濃度測定試劑盒(R&D System Co.，Ltd)對鼠血漿中的GLP-I融合蛋白的濃度進(jìn)行測定。將I : I稀釋后的鼠血漿樣品加入96孔板，加入同體積的GLP-I抗體后，37°C孵育I小時(shí)。使用洗液清洗96孔板3次， 加入HRP后孵育30分鐘。同樣的方法對96孔板進(jìn)行清洗，然后加入501底物A 及底物B， 37°C孵育10分鐘。用硫酸中止反應(yīng)后測定450-570nm值，并與標(biāo)準(zhǔn)濃度的GLP-I進(jìn)行比對及根據(jù)ELISA結(jié)果計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。融合蛋白的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果見表1，結(jié)果顯示本發(fā)明的融合蛋白在體內(nèi)的半衰期較單獨(dú)的GLP-I明顯延長，具有長效特性。表I融合蛋白在大鼠體內(nèi)的末相半衰期
樣品來源半衰期(小時(shí))
GLP-IO
GLP-I融合蛋白 8 3實(shí)施例12融合蛋白的降血糖實(shí)驗(yàn)給小鼠分別注射GLP-I及融合蛋白(折合含GLP-I為100g/kg)，分別于給藥后 O. 5、1、3、6、9、12、24、36和48小時(shí)注射葡萄糖并于尾端測定血糖含量，結(jié)果顯示GLP-I在 O. 5小時(shí)后基本喪失其降血糖功能，但是融合蛋白藥物卻在給藥24小時(shí)后依然存在降血糖功能，圖2。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種含有GLP-I的融合蛋白，其特征在于，具有如下通式I的結(jié)構(gòu) GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I通式I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含有GLP-I的融合蛋白，其特征在于，所述連接肽為GGGGS。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的含有GLP-I的融合蛋白，其特征在于，所述人源蛋白為HSA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有GLP-I的融合蛋白，其特征在于，所述含有GLP-I的融合蛋白具有SEQ ID NO 6所不的氣基酸序列或與該序列有90%以上同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有GLP-I的融合蛋白，其特征在于，所述含有GLP-I的融合蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列對應(yīng)的核苷酸序列SEQ ID NO:5或其互補(bǔ)核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求1-5任ー種GLP-I的融合蛋白的藥物組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在干，所述的組合物為液體注射劑或凍干注射劑。
8.含有權(quán)利要求1-5任ー種GLP-I的融合蛋白的組合物在制備治療糖尿病、肥胖癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有GLP-1的融合蛋白、其藥物組合物及用途，具有如下通式GLP-1-連接肽-GLP-1-連接肽-GLP-1-連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-1-連接肽-GLP-1-連接肽-GLP-1。所述連接肽為GGGGS。所述人源蛋白為HSA。GLP-1融合蛋白能夠有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因?yàn)榘胨テ诙潭鵁o法在臨床上使用的現(xiàn)狀。在2型糖尿病治療藥物領(lǐng)域較有前景。
文檔編號C07K19/00GK102690352SQ20111006715
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者李瑛 申請人:天津拓飛生物科技有限公司