專利名稱：細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于精細(xì)化工領(lǐng)域中的一種細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針。
背景技術(shù)：
鋅是參與細(xì)胞生理活動(dòng)的重要成分。盡管傳統(tǒng)的鋅離子生物無(wú)機(jī)化學(xué)的研究集中于蛋白質(zhì)中鋅的結(jié)構(gòu)功能與催化功能上，但鋅離子的神經(jīng)生物學(xué)研究越來(lái)越受到關(guān)注。通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物組織，包括前列腺、分泌胰島的胰腺和海馬體微神經(jīng)元等的化學(xué)研究，人們發(fā)現(xiàn)前列腺癌、糖尿病和神經(jīng)組織老化等疾病會(huì)導(dǎo)致鋅的分布混亂。生物體中鋅離子大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，細(xì)胞中鋅離子含量從亞納摩爾到300 μΜ不等。鋅離子能調(diào)節(jié)離子通道的功能，鋅離子不但在乙溴醋胺的衰亡中起著至關(guān)重要的作用，而乙溴醋胺與神經(jīng)組織老化疾病有直接關(guān)系，而且對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)也是極其重要的。由于鋅離子有著眾多的生理作用， 因此鋅離子的神經(jīng)生物學(xué)研究仍然是一個(gè)感興趣的課題。與其他檢測(cè)方法相比，熒光檢測(cè)具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)迅速、檢測(cè)快捷方便并可以進(jìn)行實(shí)時(shí)區(qū)域離子檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)， 且雙光子熒光探針使用800-1100 nm的激光作為激發(fā)光源，雙光子激發(fā)熒光顯微鏡遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的單光子熒光顯微鏡，它不但能克服單光子熒光顯微鏡產(chǎn)生的光致毒、光漂白、組織自發(fā)熒光干擾，而且能進(jìn)行單光子熒光顯微鏡所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的定點(diǎn)激發(fā)與深度成像，從而顯著提高檢測(cè)的靈敏度與成像的清晰度。這些優(yōu)點(diǎn)運(yùn)用到鋅的生理功能的探索方面必將為我們揭示鋅的生理作用機(jī)制，但這必須配套開(kāi)發(fā)用于生物中鋅離子成像的雙光子熒光探針。 基于PET原理的雙光子熒光鋅離子探針絡(luò)合鋅離子后，雙光子熒光強(qiáng)度升高，因此可以通過(guò)監(jiān)測(cè)雙光子熒光強(qiáng)度的變化來(lái)確定鋅離子含量的高低，此外，可以借助雙光子熒光顯微鏡對(duì)活細(xì)胞或生物組織進(jìn)行鋅離子生物成像，并對(duì)鋅離子的生理作用與生物過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)三維跟蹤研究。已報(bào)道的對(duì)鋅離子有選擇性的熒光探針主要分兩大類一是單光子熒光鋅離子探針；二是雙光子熒光鋅離子探針。單光子熒光鋅離子探針是如喹啉與熒光素衍生物[(1) Hendrickson, K. M. ； Geue, J. P. ； Wyness, 0. ； Lincoln, S. F. ； Ward, A. D. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125 (13)，3889 - 3895; (2) omatsu, K. ； Kikuchi, K. ； Kojima, H. ； Urano Y. ； Nagano, Τ. J. Am. Chem. Soc. 2005，127·. 10197-10204]，因激發(fā)波長(zhǎng)在 350-560 nm,易產(chǎn)生光致毒與熒光漂白等不利影響，給細(xì)胞檢測(cè)造成干擾較大。雙光子熒光鋅離子探針是近年來(lái)發(fā)展的一類探針，這類探針具有近紅外激發(fā)、暗場(chǎng)成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發(fā)、高橫向分辨率與縱向分辨率、降低生物組織吸光系數(shù)及降低組織自發(fā)熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)。已報(bào)道了四個(gè)雙光子鋅離子探針[(3) Belfield, K. D.; Bondar, M. V. ； Frazer, A. ； Morales, A. R. ； Kachkovsky, 0. D. ； Mikhailov, I. A. ； Masunov, Α. E. ； Przhonska, 0. V. J. Phys. Chem. B 2010，114，9313 -9321. (4) Kim, H. M.； Seo, M. S. ； An, Μ. J. ； Hong, J. H. ； Ti an, Y. S. ； Choi, J. H. ； Kwon, 0. ； Lee, K. J. ； Cho, B. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2008，47·. 5167 - 5170. (5) Sumalekshmy,S. ； Henary, Μ. M. ； Siegel, N. ； Lawson, P. V. ； Wu, Y. ； Schmidt, K. ； Bredas, J. -L. ； Perry, J. W. ； Fahrni, C. J. J. Am. Chem. Soc. 2007，129·. 11888 - 11889. (6) Bhaskar, Α. ； Ramakrishna, G. ； Twieg, R. J. ； Goodson, Τ. J. Phys. Chem. C 2007，111·. 14607 - 14611]，但這些探針的雙光子吸收截面(5 )均較小，最大的才193 GM0 為了提高檢測(cè)的靈敏度與成像的清晰度，有必要開(kāi)發(fā)更大雙光子吸收截面的雙光子鋅離子探針。為了克服現(xiàn)有的鋅離子單、雙光子熒光探針結(jié)構(gòu)和性能上的不足，本發(fā)明提供一種適用于活細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)、性能優(yōu)良的基于二苯代乙烯雙光子熒光染料的細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方法是一種細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針，采用二苯代乙烯雙光子熒光分子探針，該二苯代乙烯熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式I
權(quán)利要求
1. 一種細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針，其特征是采用二苯代乙烯雙光子熒光分子探針，該二苯代乙烯熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式I
2.合成如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針的方法， 其特征是是將2，5- 二氰基-4-甲基-4’ -[見(jiàn)二(2-氯乙基)]氨基二苯乙烯(II )，與氨甲基吡啶(III)反應(yīng)，經(jīng)過(guò)柱分離得到探針純品，
3.應(yīng)用如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針的方法， 其特征是將溶解于水中的細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針加入到被測(cè)的含鋅離子的細(xì)胞的培養(yǎng)液中，使探針濃度在廣10 mM，被測(cè)細(xì)胞與探針在10 40 °C，和含 1 10 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.1-10.0小時(shí)，探針透過(guò)細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)鋅離子絡(luò)合發(fā)生熒光變化，用不含探針和銀離子的水溶液或培養(yǎng)液充分洗滌后；細(xì)胞在雙光子熒光顯微鏡下得到鋅離子分布的熒光圖像，由此得到鋅離子的存在、細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域分布和濃度 fn息ο
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)用二苯代乙烯雙光子熒光探針，采用二苯代乙烯雙光子熒光分子探針。探針?lè)肿訂喂庾优c雙光子激發(fā)分別在390～420nm與790～820nm范圍內(nèi)，并且化學(xué)-光穩(wěn)定性好；探針?lè)肿咏j(luò)合鋅離子前熒光量子產(chǎn)率較高，可以對(duì)鋅離子進(jìn)行單、雙光子熒光檢測(cè)；探針?lè)肿訉?duì)鋅離子有很好的選擇性；在生理pH范圍內(nèi)，探針?lè)肿訉?duì)pH變化不敏感；在pH5～8的范圍內(nèi)，pH變化對(duì)絡(luò)合物的熒光發(fā)射基本上沒(méi)有影響；探針?lè)肿优c鋅離子之間的解離常數(shù)在亞微摩爾級(jí)范圍內(nèi)，可以檢測(cè)亞微摩爾濃度的細(xì)胞鋅離子；探針?lè)肿蛹?xì)胞滲透性好，適于細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度變化的檢測(cè)；可共聚焦激光顯微鏡得到各類活細(xì)胞或組織內(nèi)鋅離子的分布熒光圖像或假彩比例熒光圖像。
文檔編號(hào)C07D401/04GK102154005SQ20111004871
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者任安祥, 馮承浩, 李海渤, 黃池寶 申請(qǐng)人:韶關(guān)學(xué)院