專(zhuān)利名稱(chēng)：包含重組hcg的藥物制劑的制作方法
包含重組HCG的藥物制劑本發(fā)明涉及用于治療不育的促性腺激素。具體地，本發(fā)明涉及人絨毛膜促性腺激素(hCG)。所述促性腺激素是一組在男性和女性中調(diào)節(jié)生殖腺功能的異二聚體糖蛋白激素。 它們包括促卵泡激素(FSH)，黃體生成素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG)。人絨毛膜促性腺激素(hCG)由垂體前葉腺自然分泌，并且發(fā)揮功能以支持卵泡發(fā)育和排卵。hCG包含對(duì)于其它糖蛋白激素LH和FSH也是常見(jiàn)的92個(gè)氨基酸的α亞基，以及賦予該激素特異性的hCG獨(dú)有的145個(gè)氨基酸的β亞基。每個(gè)亞基通過(guò)添加復(fù)雜的糖殘基進(jìn)行翻譯后修飾。α亞基包含在氨基酸52和78處的2-Ν-連接的糖基化位點(diǎn)，β亞基包含在氨基酸13和30處的2-Ν-連接的糖基化位點(diǎn)和在氨基酸121、127、132和138處的4個(gè)0-連接的糖基化位點(diǎn)。從懷孕婦女的尿液中提取的hCG[Choragen(Ferring)]已經(jīng)在不育治療中使用了許多年。從尿液中提取的hCG的產(chǎn)生包括大量尿液的收集和處理。重組形式的hCG，即 Ovitrelle(Serono)是可獲得的。這在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)。已知的重組hCG 產(chǎn)物具有與從人尿中產(chǎn)生的hCG不同的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式。具有更緊密地重復(fù)或模擬從人尿中產(chǎn)生的產(chǎn)物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式的hCG產(chǎn)品是合乎需要的。存在與hCG制劑相關(guān)的相當(dāng)大的異質(zhì)性，其涉及在存在的各種同種型的量上的不同。單獨(dú)的hCG同種型顯示相同的氨基酸序列，但是在它們翻譯后修飾的程度上不同；具體的同種型特征為糖分枝結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性以及唾液酸(末端糖)結(jié)合量的不同，這兩者都顯示影響具體的同種型生物活性。天然hCG的糖基化是高度復(fù)雜的。在自然來(lái)源的垂體hCG中的聚糖可以包含廣泛范圍的結(jié)構(gòu)，其可以包括二觸角聚糖、三觸角聚糖和四觸角聚糖的組合。所述聚糖可以具有其它的修飾核心巖藻糖基化、平分型葡糖胺、用乙?；樘前费由斓逆?、部分或完全唾液酸化(sialylation)，具有α 2，3和α 2，6連接的唾液酸化，和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺。此外，在單獨(dú)的糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)的分布之間存在差異。重組hCG(“rhCG”)產(chǎn)品的糖基化反映在宿主細(xì)胞系中存在的糖基轉(zhuǎn)移酶范圍。現(xiàn)存的rhCG產(chǎn)品Ovitrelle源自改造的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)。在CHO來(lái)源的rhCG 中的聚糖修飾范圍比在源自尿液的天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的那些更有限。在CHO來(lái)源的rhCG中發(fā)現(xiàn)的減少的聚糖異質(zhì)性的實(shí)例包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心巖藻糖基化和乙?；樘前费由臁４送?，CHO細(xì)胞僅能夠使用α2，3連接加入唾液酸(Kagawa等，1988， Takeuchi等，1988，Svensson等.，1990)。這不同于天然產(chǎn)生的hCG，其包含具有α 2，3禾口 α 2,6-連接的唾液酸混合物的聚糖。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)與垂體、血清或絕經(jīng)期后尿液FSH比較時(shí)，重組FSH制劑(Organon) 在具有低于4的等電點(diǎn)(pi)的FSH(考慮酸性同種型)的量上不同(U1 Ioa-Aguirre 等.199 。與重組產(chǎn)物Gonal-f Gerono)和Puregon(Organon)比較，在尿制備物中的酸性同種型的量高得多(Andersen等.2004)。這必定反映在rFSH中更低摩爾含量的唾液酸，因?yàn)橛昧蛩猁}修飾的帶負(fù)電荷的聚糖的含量在FSH中很低。與天然FSH比較，更低的唾液酸含量是兩種商購(gòu)FSH產(chǎn)品的特征，并且因此必定反映制備方法中的限制(Bassett和 Driebergen, 2005).已經(jīng)關(guān)于來(lái)自多種來(lái)源的物質(zhì)記載了 FSH的循環(huán)壽命。這些物質(zhì)中的一些已經(jīng)基于總分子電荷進(jìn)行分離，總分子電荷如通過(guò)它們的Pl表征，其中更多的酸等同于更高的負(fù)電荷。對(duì)于總分子電荷的主要貢獻(xiàn)者是每種FSH分子的總唾液酸含量。例如， rFSH(Organon)具有約8m0l/m0l的唾液酸含量，而尿來(lái)源的FSH具有更高的唾液酸含量 (de Leeuw等· 1996)。在大鼠中的相應(yīng)血漿清除率是0. 34和0. 14ml/min (U1 Ioa-Aguirre 等.2003)。在另一個(gè)實(shí)例中，其中將重組FSH樣品分為高和低pi級(jí)分，高pi (更低唾液酸含量)級(jí)分的體內(nèi)功效減少并且其具有更短的血漿半衰期(D'Antonio等.1999)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與FSH類(lèi)似，已知的來(lái)源于CHO的重組hCG產(chǎn)物(例如，Ovitrelle)也具有比尿hCG更低量的具有低于4的等電點(diǎn)(pi)(認(rèn)為是酸性同種型)的hCG，這也反映已知的 rhCG產(chǎn)品比尿hCG更低的唾液酸含量。hCG和rhCG的總唾液酸含量不是直接可比較的，因?yàn)橥僖核嵋话阃ㄟ^(guò)兩種方式連接。垂體/血清/尿hCG都包括α 2，3和α 2，6-連接的唾液酸，其中主要為前者。然而， CHO 細(xì)胞來(lái)源的重組體僅包括 α 2，3(Kagawa 等，1988，Takeuchi 等，1988，Svensson 等·， 1990)。換言之，使用CHO系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白將在其末端唾液酸連接的類(lèi)型方面不同于其天然對(duì)應(yīng)物。除了后者更低的唾液酸總含量以外，這是在天然產(chǎn)物和目前的重組產(chǎn)物之間存在另一種差異，并且在生產(chǎn)藥用的生物制劑中這是一項(xiàng)重要的考慮，因?yàn)樘墙Y(jié)構(gòu)部分可能有助于所述分子的藥理學(xué)性質(zhì)。因此，具有這樣的rhCG產(chǎn)品是理想的，所述rhCG產(chǎn)品更接近地復(fù)制或模擬由人尿生產(chǎn)的產(chǎn)品的生理化學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式。具有這樣的rhCG產(chǎn)品是理想的，其與已知重組產(chǎn)物比較，具有一種或多種改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，提供這樣的重組hCG( “rhCG”或“rechCG”)，其包括α2，3唾液酸化和α 2，6唾液酸化和，任選地，α2，8唾液酸化。根據(jù)本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)可以具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示]，例如 15mol/mol 至 25mol/mol，例如 17mol/mol 至 24mol/mol，例如 17. 7mol/mol 至 23mol/mol，例如 18mol/mol 至 22mol/mol，例如 19mol/mol 至 21mol/mol，例如 19mol/mol 至 20mol/mol。 根據(jù)本發(fā)明的rhCG (或rhCG制劑)的全部唾液酸化的10 %以上是α2，3_唾液酸化。例如，全部唾液酸化的45% -80%可以是α 2，3-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的50% -70% 可以是α 2，3-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的55%-65%可以是α 2，3_唾液酸化。例如， 全部唾液酸化的65%-85%可以是α2，3-唾液酸化。本發(fā)明的rhCG (或rhCG制劑)的全部唾液酸化的50%以下可以是α 2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的20-55%可以是 α 2,6-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的30-50%可以是α 2,6-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的35-45%可以是α 2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的15_35%可以是α 2，6_唾液酸化。本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)的全部唾液酸化的5%以下可以是α 2,8-唾液酸化，例如全部唾液酸化的0-4%，例如0. 1-4%可以是α2，8-唾液酸化。本發(fā)明的rhCG(或 rhCG制劑)可以不具有α 2，8-唾液酸化。申請(qǐng)人:已經(jīng)開(kāi)發(fā)了人來(lái)源的重組hCG，其具有比CHO來(lái)源的產(chǎn)物OvitrelIe更加酸性的模式，并且其具有更高的唾液酸含量。申請(qǐng)人的研究表明，唾液酸連接的類(lèi)型，α 2， 3-或0 2，6-，可以具有對(duì)1^6的生物清除的巨大影響。與CHO細(xì)胞系相反，人細(xì)胞系可以表達(dá)唾液酸通過(guò)α 2，3和α 2，6連接兩者進(jìn)行連接的重組hCG。通過(guò)改造人細(xì)胞系以表達(dá)rhCG和α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶兩者來(lái)制備具有α 2，3和 α 2，6-連接的唾液酸的混合物的重組hCG(實(shí)施例4、^1和5b)。表達(dá)的產(chǎn)物是高度酸性的并且攜帶α2，3_和α 2，6_連接兩者的唾液酸的混合物；后者由內(nèi)源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供。與在常規(guī)CHO細(xì)胞中表達(dá)的rhCG比較，這具有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)首先，由于這兩種唾液酸轉(zhuǎn)移酶的組合活性，所以所述物質(zhì)是更加高度唾液酸化的；其次，所述物質(zhì)更接近地類(lèi)似于天然hCG。與CHO細(xì)胞來(lái)源的重組產(chǎn)物比較，這可能在生物學(xué)上是更加適合的，所述CHO細(xì)胞來(lái)源的重組產(chǎn)物僅產(chǎn)生α 2，3連接的唾液酸并且具有減少的唾液酸含量。申請(qǐng)人:令人驚奇地發(fā)現(xiàn)與其它重組產(chǎn)物相比，本發(fā)明的rhCG可以更接近地復(fù)制或模擬天然人尿產(chǎn)物的生理化學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式。換言之，本發(fā)明的rhCG可以更接近于“天然”hCG。關(guān)于給藥等，這可能具有明顯的優(yōu)勢(shì)。此外，更“天然”或更“人化”的產(chǎn)品對(duì)于可能需要治療的患者可能是更理想的，盡管在某種意義上，人工意味著盡可能的是 “天然的”。與其它重組產(chǎn)物比較，在糖(例如聚糖)結(jié)構(gòu)上更接近于天然(例如人尿)hCG 的重組hCG產(chǎn)物可能具有其它優(yōu)勢(shì)(例如藥物代謝動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì))。因此，本發(fā)明是hCG的重組形式，其攜帶α2，3和α 2，6唾液酸的混合物并且因此更接近地類(lèi)似于天然hCG。與現(xiàn)存的重組產(chǎn)物比較，預(yù)期這種化合物關(guān)于控制的卵巢刺激、 在IVF技術(shù)中的應(yīng)用、以及排卵誘導(dǎo)的應(yīng)用將導(dǎo)致卵巢的更天然的刺激。根據(jù)本發(fā)明，提供包含α 2，3唾液酸化和α 2,6唾液酸化的重組hCG( “rhCG”或 “rechCG”)(和/或重組hCG制劑)。rhCH或rhCG制劑可以任選地進(jìn)一步包含α 2，8唾液酸化。在本文中，術(shù)語(yǔ)“重組hCG制劑”包括用于例如藥物應(yīng)用的制劑，其包含重組hCG。 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述rhCG可以作為單一同種型或作為同種型的混合物存在。根據(jù)本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)可以具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸的摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示](實(shí)施例8)，例如15m0l/m0l-25m0l/m0l，例如 17mol/mol-24mol/mol，例如 17. 7mol/mol-23mol/mol，例如 18mol/mol-22mol/mol，例如 19mo 1 /mo 1 -2Imo 1 /mo 1，例如19mo 1 /mo 1 -20mo 1 /mo 1。本發(fā)明的rhCG可以在人細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)的全部唾液酸化的10%以上可以是α2，3_唾液酸化。例如，全部唾液酸化的20，30，40，45，50，55，60，70，80或90%以上可以是α 2， 3-唾液酸化。所述rhCG (或rhCG制劑)可以以全部唾液酸化的45%-80%的量，例如全部唾液酸化的50% -70%，例如全部唾液酸化的55% -65%的量包括α 2,3-唾液酸化。所述 rhCG (或rhCG制劑)可以以全部唾液酸化的65-85%的量，例如全部唾液酸化的70-80%， 例如全部唾液酸化的71-79%的量包括α 2，3_唾液酸化。本發(fā)明的rhCG (或rhCG制劑) 的全部唾液酸化的50%以下可以是α 2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的45，40，30， 20，10，5%以下可以是(12，6-唾液酸化。所述^^6(或^^6制劑)可以以全部唾液酸化的 20-55%的量，例如全部唾液酸化的30-50%，例如全部唾液酸化的35-45%的量包括α 2， 6-唾液酸化。所述rhCG(或rhCG制劑)可以以全部唾液酸化的15-35%的量，例如全部唾液酸化的20-30%，例如全部唾液酸化的21- %的量包括α2，6_唾液酸化。本發(fā)明的 rhCG(或rhCG制劑)的全部唾液酸化的5%以下可以是α2，8_唾液酸化。例如，全部唾液
6酸化的2. 5%以下可以是α 2，8-唾液酸化。所述rhCG (或rhCG制劑)可以以全部唾液酸化的0到4%，例如全部唾液酸化的0. 1_4%，例如全部唾液酸化的0. 5-3%，例如全部唾液酸化的0. 5-2. 5%的量包括α 2,8-唾液酸化。本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)可以不具有 α 2,8-唾液酸化。唾液酸化，意味著在hCG糖結(jié)構(gòu)上存在著唾液酸殘基的量。α 2，3-唾液酸化意味著在2，3位置處的唾液酸化(如本領(lǐng)域中公知的)和α 2，6唾液酸化意味著在2， 6位置處的唾液酸化(也在本領(lǐng)域中公知的)。因此，“全部唾液酸化的％可以是α 2，3唾液酸化”指在2，3位置處被唾液酸化的hCG中存在的唾液酸殘基總數(shù)的％。術(shù)語(yǔ)“全部唾液酸化的％是α 2，6-唾液酸化”指在2，6位置處被唾液酸化的hCG中存在的唾液酸殘基總數(shù)的％。根據(jù)本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)可以具有6質(zhì)量％以上(例如，6質(zhì)量％-15 質(zhì)量％，例如，7質(zhì)量％-13質(zhì)量％，例如，8質(zhì)量％-12質(zhì)量％，例如，11質(zhì)量％-15質(zhì)量％， 例如，12質(zhì)量％ -14質(zhì)量％ )的唾液酸含量(每個(gè)hCG分子唾液酸化的量)(基于蛋白質(zhì)的質(zhì)量，而不是蛋白質(zhì)加上糖的質(zhì)量)。在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)的重組hCG僅包含α 2，3唾液酸化。本發(fā)明的rhCG可以在人細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)。其可以簡(jiǎn)化生產(chǎn)方法(并使其更有效)，因?yàn)椴僮骱涂刂评缂?xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基以維持唾液酸化與已知方法相比可能是較不關(guān)鍵的。所述方法也可以是更有效的，因?yàn)榕c已知rhCG產(chǎn)品的生產(chǎn)比較，有更少量堿性rhCG 產(chǎn)生；產(chǎn)生更多的酸性rhCG并且分離/去除堿性hCG是較不成問(wèn)題的。rhCG可以在Per. C6細(xì)胞系、Per. C6來(lái)源的細(xì)胞系或修飾的Per. C6細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)。所述細(xì)胞系可以使用α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行修飾。所述rhCG可以包含由[細(xì)胞系]的內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的α 2，6-連接的唾液酸(α 2，6唾液酸化)。備選地，或另外地，所述細(xì)胞系可以使用α 2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾。所述rhCG可以使用α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生。rhCG可以包含由內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的α 2，6-連接的唾液酸(02，6唾液酸化)。所述rhCG可以使用02，3_和/ 或α 2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，在另一方面，提供產(chǎn)生如本文所述的rhCG和/或rhCG制劑的方法 (根據(jù)本發(fā)明的各方面)，所述方法包含在人細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)rhCG的步驟，所述人細(xì)胞系例如Per. C6細(xì)胞系、Per. C6來(lái)源的細(xì)胞系或修飾的Per. C6細(xì)胞系，例如已經(jīng)用α 2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾的細(xì)胞系。所述rhCG結(jié)構(gòu)包含聚糖結(jié)構(gòu)部分?？梢园l(fā)生分支作用，結(jié)果是聚糖可以具有 1，2，3，4或更多個(gè)末端糖殘基或“觸角”，如本領(lǐng)域中眾所周知的。本發(fā)明的rhCG可以具有聚糖，其中唾液酸化存在于單-觸角和/或二觸角和/或三觸角和/或四觸角的結(jié)構(gòu)上。rhCG可以包含單唾液酸化的，二唾液酸化的，三唾液酸化的和四唾液酸化的聚糖結(jié)構(gòu)，例如具有如下的相對(duì)量0. 1-4%單唾液酸化；35-45% 二唾液酸化；0. 5-8%三唾液酸化和0-1 %四唾液酸化(例如，如通過(guò)帶電荷的聚糖的WAX分析所顯示，如在實(shí)施例 8D中所顯示)。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組hCG包括單(1S)、二(2S)、三(3S)和四0S)唾液酸化的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，唾液酸化的結(jié)構(gòu)的相對(duì)量在下述比率內(nèi)(is 2S 3S 4S) 0. 2-1% 35-40% 2. 5-7% 0. 5-1% (例如，如通過(guò)帶電荷的聚糖的WAX分析所顯示， 如在實(shí)施例8D中所顯示)。
根據(jù)本發(fā)明，在另一方面，提供在人細(xì)胞系中產(chǎn)生的(例如表達(dá)的)rhCG。所述 rhCG可以包括α 2，3-和α 2，6_唾液酸化?？梢栽赑er. C6細(xì)胞系、Per. C6來(lái)源的細(xì)胞系或修飾的Per.C6細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)rhCG?？梢允褂忙?2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾所述細(xì)胞系。rhCG可以包含由[細(xì)胞系]的內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的α2，6_連接的唾液酸 (α2，6唾液酸化)。備選地或另外地，可以使用α 2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)可以具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示]，例如15mol/mol至25mol/mol，例如17mol/mol至24mol/mol，例如 17. 7mol/mol 至 23mol/mol，例如 18mol/mol 至 22mol/mol，例如 19mol/mol 至 21mol/mol， 例如19mol/mol至20mol/mol。rhCG(或rhCG制劑)的全部唾液酸化的10%以上可以是 α 2,3-唾液酸化，例如全部唾液酸化的45% -80%可以是α 2,3-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的50% -70%可以是α 2，3_唾液酸化，例如，全部唾液酸化的55_65%可以是α 2， 3-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的65-85%可以是α2，3-唾液酸化。本發(fā)明的rhCG(或 rhCG制劑)的全部唾液酸化的50%以下可以是α2，6-唾液酸化。例如全部唾液酸化的 20-55%可以是α 2，6-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的30-50%可以是α 2，6_唾液酸化， 例如，全部唾液酸化的35-45%可以是α2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的15_35%可以是α2，6-唾液酸化。本發(fā)明的rhCG(或rhCG制劑)的全部唾液酸化的5%以下可以是 α 2，8-唾液酸化，例如全部唾液酸化的0-4%，例如0. 5-4%可以是α 2，8_唾液酸化。本發(fā)明的rhCG (或rhCG制劑)可以不具有α 2，8-唾液酸化。根據(jù)本發(fā)明，在另一方面，提供包含含有α 2，3-唾液酸化和α 2，6_唾液酸化的 rhCG(例如，如上提及)的藥物組合物。所述藥物組合物還可以包含F(xiàn)SH和/或LH?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式獲得FSH。在本文中使用的FSH包含人來(lái)源的和重組FSH?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法從任何適當(dāng)來(lái)源(例如，尿)純化人來(lái)源的FSH。 所述FSH可以是重組FSH-例如，在人細(xì)胞系中表達(dá)的FSH。表達(dá)和純化重組FSH的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。LH可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法獲得。LH，如本文所用，包含人來(lái)源的和重組 LH?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法從任何適當(dāng)?shù)膩?lái)源(例如，尿)純化人來(lái)源的LH。表達(dá)和純化重組LH的方法是本領(lǐng)域中已知的。所述藥物組合物可以用于治療不育，例如，用于在例如輔助生殖技術(shù)(ART)，排卵誘導(dǎo)或?qū)m內(nèi)人工受精(IUI)中。所述藥物組合物可以例如用于這樣的醫(yī)學(xué)適應(yīng)證，在所述適應(yīng)證中使用已知hCG制劑。本發(fā)明還提供本文所述的rhCG和/或rhCG制劑(根據(jù)本發(fā)明的各方面)用于制備治療不育的藥物的應(yīng)用?？梢詫⒈景l(fā)明的藥物組合物配制為用于任何藥物施用途徑的眾所周知的組合物，所述藥物施用途徑例如口服、直腸、腸胃外、透皮(例如，貼片技術(shù))、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、intrasusternal、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(粉末、藥膏或滴劑)或作為含服劑或鼻噴霧劑。典型的組合物包含藥用載體，如水溶液、無(wú)毒性賦形劑， 包括鹽和防腐劑，緩沖劑等，如在雷明頓藥物科學(xué)第15版(Remington，s Pharmaceutical Sciences fifteenth edition,Matt 出版公司，1975)，在 1405-1412 和 1461-87 頁(yè)中，以及在國(guó)家藥典(national formulary)XIV第 14版(美國(guó)藥物協(xié)會(huì)(American Pharmaceutical Association)，1975)中所述。適合的水性和非水性藥物載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，羧甲基纖維素及其適合的混合物，植物油(如橄欖油)， 和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。本發(fā)明的組合物還可以包含添加劑如，但不限于防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散齊U?？梢园辜?xì)菌劑和抗真菌劑以防止微生物的生長(zhǎng)，并且包括，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。此外，包含等張劑如糖、氯化鈉等可能是合乎需要的。在一些情形中，為了實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)的作用，需要延緩自皮下或肌內(nèi)注射的hCG (和其它活性成分，如果存在的話(huà))的吸收。這可以通過(guò)使用具有較差水溶性的結(jié)晶或無(wú)定形物質(zhì)的液體混懸液來(lái)實(shí)現(xiàn)。hCG吸收的速率于是取決于其溶出速率，其又可以取決于晶體大小和結(jié)晶形式。備選地，腸胃外施用的hCG組合形式的延緩吸收通過(guò)將所述hCG組合溶解或懸浮在油賦形劑中實(shí)現(xiàn)?？勺⑸溟L(zhǎng)效制劑形式可以通過(guò)在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成hCG(和其它藥劑，如果存在的話(huà))的微膠囊基質(zhì)來(lái)進(jìn)行制備。取決于hCG與聚合物的比率以及所用的特定聚合物的性質(zhì)，可以控制hCG釋放的速率。其它可生物降解的聚合物的實(shí)例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚(原酸酯)，聚(酐)等?？勺⑸涞拈L(zhǎng)效制劑也通過(guò)將hCG包埋在脂質(zhì)體或微乳中進(jìn)行制備，所述脂質(zhì)體或微乳可與機(jī)體組織相容?？勺⑸渲苿┛梢岳缤ㄟ^(guò)經(jīng)過(guò)留住細(xì)菌(bacterial-retaining)的濾器進(jìn)行過(guò)濾，或通過(guò)摻入無(wú)菌固體組合物形式的滅菌劑來(lái)進(jìn)行滅菌，所述無(wú)菌固體組合物可以溶解或分散在無(wú)菌水或其它無(wú)菌可注射介質(zhì)中，之后立即使用。可以將可注射制劑提供在任何適合的容器中，所述容器例如小瓶、預(yù)先填充的注射器、注射藥筒等。可注射制劑可以作為這樣的產(chǎn)品供應(yīng)，所述產(chǎn)品具有包含hCG的藥物組合物(任選地具有FSH，LH等)。如果存在超過(guò)一種活性成分(即hCG，和例如FSH或LH)，這些可以適合于單獨(dú)或在一起施用。如果單獨(dú)施用，施用可以是先后的。所述產(chǎn)品可以在任何適合的包裝中供應(yīng)。例如，產(chǎn)品可以包含許多含有hCG，F(xiàn)SH，或FSH和hCG的組合的預(yù)先填充的注射器，在泡眼包裝或其它裝置里包裝注射器以保持無(wú)菌。產(chǎn)品可以任選地包含使用所述 hCG和FSH制劑的說(shuō)明書(shū)。根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)實(shí)踐調(diào)整藥物組合物各種成分的pH和提取物濃度。見(jiàn) GOODMAN 禾口 GILMAN，s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES (治療劑的藥理學(xué)基礎(chǔ))，第7版。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為用于腸胃外施用的組合物供應(yīng)。制備腸胃外制劑的一般方法是本領(lǐng)域中已知的并且在REMINGTON ;THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(雷明頓藥物科學(xué)和實(shí)踐)，同上文，第780-820頁(yè)中描述。腸胃外組合物可以以液體制劑或作為固體供應(yīng)，所述固體與無(wú)菌可注射介質(zhì)混合，之后立即施用。 在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，腸胃外組合物以易于施用和均一劑量的單位劑型供應(yīng)。發(fā)明詳述現(xiàn)在參照下面的實(shí)施例和附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明，在附圖中

圖1顯示phCG α/β表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜；圖2顯示α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST3GAL4)表達(dá)載體；圖3顯示α 2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6GAL1)表達(dá)載體；圖4顯示與現(xiàn)有技術(shù)的制劑(泳道1，2)相比較，通過(guò)用考馬斯藍(lán)染色的IEF在人細(xì)胞系來(lái)源的重組hCG制劑(泳道3，4)中檢測(cè)rhCG同種型；
圖5顯示α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的Per. C6hCG樣品的代謝清除率(MCRs)；和圖6顯示α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的Per. C6rhCG樣品的長(zhǎng)效MCRs。序列選擇人艦根據(jù)Fiddes和Goodman (1979)使用hCG α多肽的基因編碼區(qū)。該序列登記為 ΑΗ007338，并且在構(gòu)建時(shí)，不存在該蛋白序列的其它變體。該序列在本文中稱(chēng)為SEQ ID 1。根據(jù)Fiddes和Goodman (1980)使用hCGi3多肽的基因編碼區(qū)。所述序列登記為 NP_000728，并且與CG0 3、CG0 5和CG0 7的蛋白序列相一致。該序列在本文登記為SEQ ID 2。睡液酸轉(zhuǎn)移酶α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶-根據(jù)Kitagawa和Paulson(1994)使用β-半乳糖苷 0-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶4(0 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，513641^4)的基因的編碼區(qū)。該序列登記為 L23767，并且在本文稱(chēng)為SEQ ID 3。α 2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶-根據(jù)Grundmarm等(1990)使用β -半乳糖酰胺 (galactosamide) α-2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶1 ( α 2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶，ST6GAL1)的基因編碼區(qū)。 該序列登記為ΝΜ_003032并且在本文稱(chēng)為SEQ ID 4。
實(shí)施例實(shí)施例IhCG表達(dá)載體的構(gòu)建分別使用引物組合CGa-fw與CGa_rev和CGb_fw與CGb_rec，通過(guò)PCR擴(kuò)增hCG α 多肽(ΑΗ007338, SEQ ID 1)禾口 hCG3 多肽(NP_000728，SEQ ID 2)的編碼序列。CGa-fw 5， -CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3，CGa-rev 5’ -GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3，CGb-fw 5’ -CCAGGCGCGCCACCATGGAGATGTTCCAGGGGCTGC-3’CGb-rev 5’ -CCGGGTTAACTTATTGTGGGAGGATCGGGG-3’將得到的擴(kuò)增hCG β DNA用限制性酶AscI和HpaI消化，并將其插入在攜帶新霉素選擇標(biāo)記的CMV驅(qū)動(dòng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的AscI和HpaI位點(diǎn)中。類(lèi)似地，將hCG α DNA用 BamHI和NheI消化，并將其插入到在已經(jīng)包含hCGi3多肽DNA的表達(dá)載體上的位點(diǎn)BamHI 禾口 NheI中。將載體DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)的DH5 α菌株。挑取菌落用于擴(kuò)增，并且從包含含有hCGa和β兩者的載體的數(shù)目中選擇20個(gè)用于測(cè)序。選擇用于測(cè)序的所有菌落包含正確的按照SEQ ID 1和SEQ ID 2的序列。選擇質(zhì)粒phCGA+B用于轉(zhuǎn)染(圖1)。實(shí)施例2ST3表達(dá)載體的構(gòu)建使用引物組合2，3STfw和2，3STrev，通過(guò)PCR擴(kuò)增β -半乳糖苷α_2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶4(ST3，L23767，SEQ ID 3)的編碼序列。2,3STfw 5， -CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3，2,3STrev 5， -TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3，將得到的擴(kuò)增的ST3 DNA用限制性酶BamHI和AflII進(jìn)行消化，并將其插入在攜帶潮霉素抗性標(biāo)記的CMV驅(qū)動(dòng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體上的BamHI和AflII位點(diǎn)中。將所述載體如前述擴(kuò)增，并且測(cè)序?？寺ST3#l(圖2)包含正確的根據(jù)SEQ ID 3的序列，并選擇其用于轉(zhuǎn)染。實(shí)施例3ST6表達(dá)載體的構(gòu)建使用引物組合2，6STfw和2，6STrev，通過(guò)PCR擴(kuò)增β -半乳糖酰胺α _2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(ST6，NM_003032，SEQ ID 4)的編碼序列。2,6STfw 5， -CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3，2,6STrev 5， -TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3，將得到的擴(kuò)增的ST6DNA用限制性酶BamHI和AflII進(jìn)行消化，并將其插入攜帶潮霉素抗性標(biāo)記的CMV驅(qū)動(dòng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體上的BamHI和AflII位點(diǎn)中。將所述載體如前述擴(kuò)增并且測(cè)序?？寺ST6#ll(圖3)包含正確的根據(jù)SEQ ID 4的序列，并選擇其用于轉(zhuǎn)染。實(shí)施例4phCG A+B在PER. C6細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)染分離和克隆的篩選。通過(guò)在單一質(zhì)粒中表達(dá)hCG的兩個(gè)多肽鏈產(chǎn)生生產(chǎn)hCG的Per. C6克隆(見(jiàn)實(shí)施例1)。為了獲得穩(wěn)定的克隆，與phCGA+B構(gòu)建體一起使用基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑。在補(bǔ)充了 10% FCS并包含G418的Per. C6選擇培養(yǎng)基中選擇穩(wěn)定的克隆。在轉(zhuǎn)染后三周，長(zhǎng)出 G418抗性克隆。選擇共389個(gè)克隆用于分離。在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離的克隆直到70-80% 匯合。使用hCG選擇性ELISA測(cè)定上清液的hCG蛋白含量，并且使用cAMP積累測(cè)定法(CAMP accumulation assay)，在克隆的細(xì)胞系中測(cè)定關(guān)于hCG受體的藥理學(xué)活性。表達(dá)功能蛋白的克隆(118)進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增到M孔、6孔和T80燒瓶中。在產(chǎn)生足量的物質(zhì)的T80燒瓶中開(kāi)始關(guān)于確定來(lái)自47個(gè)克隆的物質(zhì)的生產(chǎn)率和質(zhì)量的研究。在如前述的補(bǔ)充培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞7天，并且收集上清液。使用hCG選擇性 ELISA測(cè)定生產(chǎn)率。確定所述物質(zhì)的等電情況(使用實(shí)施例6所述的方法)。將來(lái)自IEF 的信息用來(lái)選擇用于代謝清除率分析的克隆。關(guān)于唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造，選擇具有足夠生產(chǎn)率和質(zhì)量的克隆。實(shí)施例fe唾液酸化水平在過(guò)量表達(dá)α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞中增加。pST3在表達(dá)hCG的PER. C6細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)；轉(zhuǎn)染分離和克隆篩選。通過(guò)從在已經(jīng)表達(dá)hCG的兩個(gè)多肽鏈的Per. C6細(xì)胞(見(jiàn)實(shí)施例4)中的各個(gè)質(zhì)粒 (見(jiàn)實(shí)施例2、表達(dá)α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶來(lái)產(chǎn)生生產(chǎn)高度唾液酸化hCG的Per. C6克隆。針對(duì)它們的性質(zhì)，所述性質(zhì)包括生產(chǎn)率，良好生長(zhǎng)情況，功能蛋白的產(chǎn)生，和產(chǎn)生的包含一些唾液酸化的hCG，選擇在實(shí)施例4中提及的由PER.C6 細(xì)胞產(chǎn)生的克隆。如前在實(shí)施例4中所述產(chǎn)生穩(wěn)定的克隆。分離來(lái)自α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶程序的克隆，將其擴(kuò)增并測(cè)定。用于α 2，3_研究的最終克隆數(shù)是5個(gè)。α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶克隆適合無(wú)血清培養(yǎng)基和懸浮條件。如前，使用hCG選擇性ELISA，在hCG受體細(xì)胞系中的功能反應(yīng)，IEF (實(shí)施例6)，測(cè)定克隆。它們還進(jìn)行代謝清除率(實(shí)施例9)和USP hCG生物測(cè)定(實(shí)施例10)評(píng)估。將結(jié)果與商購(gòu)重組hCG(0vitrelle，Serono)和親代hCG Per. C6細(xì)胞系進(jìn)行比較。將代表性樣品顯示在實(shí)施例和附圖中。總之，與僅表達(dá)hCG的細(xì)胞比較，在Per.C6細(xì)胞中hCG與α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶一起的表達(dá)導(dǎo)致增加水平的唾液酸化的hCG。實(shí)施例恥在表達(dá)hCG的PER. C6細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)pST3―― —種不同的方法上述產(chǎn)生的α β異型二聚體(實(shí)施例4)具有導(dǎo)致非常基本的IEF模式的低水平唾液酸化。如上所示(實(shí)施例如)，與僅表達(dá)hCG的細(xì)胞比較，在Per.C6細(xì)胞中hCG與α 2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶一起的表達(dá)導(dǎo)致增加水平的唾液酸化的hCG。雙重轉(zhuǎn)染hCGa和β亞基基因與a 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因到混懸的細(xì)胞培養(yǎng)形式的Per. C6細(xì)胞中。通過(guò)在無(wú)血清條件下共轉(zhuǎn)染hCG載體(雙α / β，實(shí)施例1)和編碼α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶的載體(實(shí)施例幻而產(chǎn)生細(xì)胞系。針對(duì)它們的性質(zhì)，所述性質(zhì)包括生產(chǎn)率，良好生長(zhǎng)情況，功能蛋白的產(chǎn)生，和產(chǎn)生的包含一些唾液酸化的hCG，選擇由 PER.C6 細(xì)胞產(chǎn)生的克隆。分離、擴(kuò)增和測(cè)定克隆。如前，使用hCG選擇性ELISA，在hCG受體細(xì)胞系中的功能反應(yīng)，IEF (實(shí)施例6)，測(cè)定克隆。它們還進(jìn)行代謝清除率(實(shí)施例9)和USP hCG生物測(cè)定(實(shí)施例10)評(píng)估。將結(jié)果與商購(gòu)重組hCG(0vitrelle，Serono)和親代hCG Per. C6細(xì)胞系進(jìn)行比較。將代表性樣品顯示在實(shí)施例和附圖中(見(jiàn)實(shí)施例6，9，10，附圖4和5)。與不與a 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的hCG和Ovitrelle相比，由所述克隆產(chǎn)生的重組hCG(即，根據(jù)本發(fā)明的重組hCG) 具有顯著提高的唾液酸化(即，平均更多的具有大量唾液酸的hCG同種型)(見(jiàn)實(shí)施例6和 8，附圖4)。實(shí)施例6通過(guò)等電聚焦分析Per. C6產(chǎn)生的hCG同種型的等電點(diǎn)pi。電泳定義為帶電荷的分子通過(guò)電場(chǎng)經(jīng)過(guò)溶劑的轉(zhuǎn)運(yùn)。生物分子經(jīng)過(guò)電場(chǎng)的移動(dòng)性將取決于場(chǎng)強(qiáng)、分子上的凈電荷、分子的大小和形狀、離子強(qiáng)度和分子遷移經(jīng)過(guò)的介質(zhì)的性質(zhì)。等電聚焦(IEF)是基于它們的pi分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。Pl是這樣的pH，在所述PH蛋白質(zhì)不帶凈電荷并在電場(chǎng)中不會(huì)遷移。hCG同種型的唾液酸含量精細(xì)地改變每種同種型的Pl點(diǎn)，其可以使用這種技術(shù)研究以顯現(xiàn)來(lái)自每種克隆的Per. C6hCG同種型。使用等電聚焦分析在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的Per. C6產(chǎn)生的hCG同種型的等電點(diǎn)。 如在實(shí)施例4、fe和恥中所述產(chǎn)生來(lái)自Per. C6hCG克隆的細(xì)胞培養(yǎng)基。在兩性電解質(zhì)溶液pH 3. 0-7. 0中，在pH 3. 0-7. 0梯度的天然條件下，在包含5% 聚丙烯酰胺的Novex IEF凝膠上分離Per.C6hCG樣品。蛋白使用本領(lǐng)域公知方法用考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)。圖4顯示，根據(jù)本發(fā)明的組合物(泳道3，10 μ g，和泳道4，15 μ g)和現(xiàn)有技術(shù)CHO 來(lái)源的組合物 Ovitrelle (泳道 1，Ovitrelle, 10 μ g,和泳道 2，Ovitrelle, 15 μ g)，通過(guò)考馬斯藍(lán)染色的IEF檢測(cè)rhCG同種型。條帶代表包含不同數(shù)量唾液酸分子的hCG的同種型。使用這種方法，鑒定產(chǎn)生具有更多數(shù)量唾液酸分子的hCG同種型的克隆。圖4顯示， 用a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的人細(xì)胞系來(lái)源的重組hCG(根據(jù)本發(fā)明的組合物)具有比 Ovitrelle更加酸性的模式。實(shí)施例7Per. C6hCG的唾液酸連接的分析使用基于凝集素的聚糖區(qū)分方法分析復(fù)合糖。使用這種方法，可以表征與硝基纖維素結(jié)合的糖蛋白和復(fù)合糖。凝集素選擇性識(shí)別特定結(jié)構(gòu)部分，例如a2，3連接的唾液酸。 使用的凝集素與類(lèi)固醇半抗原洋地黃毒苷綴合，這使得能夠進(jìn)行結(jié)合的凝集素的免疫學(xué)檢測(cè)。使用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE技術(shù)分離來(lái)自親代克隆(沒(méi)有另外的唾液酸轉(zhuǎn)移酶)和α 2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的克隆的純化的Per. (HiCG。將商購(gòu)重組hCG (Ovitrelle，Serono)用作標(biāo)準(zhǔn)物。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用DIG聚糖區(qū)分試劑盒(目錄號(hào)11 210 238001，羅氏)分析唾液酸。與黑接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)的陽(yáng)性反應(yīng)指示末端連接 (2-6)唾液酸。與朝鮮槐(Maackia amurensis)凝集素II (MAA)的陽(yáng)性反應(yīng)指示末端連接(α 2-3)的唾液酸。簡(jiǎn)言之，親代克隆包含低水平的α 2，3-和α 2，6_唾液酸兩者。用α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的克隆包含高水平的α 2，3-唾液酸連接和低水平的α2，6_唾液酸連接。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照Ovitrelle僅包括α 2，3_唾液酸連接。這與關(guān)于在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中產(chǎn)生的重組蛋白已知的情況是一致的(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988，Svensson等·，1990)。結(jié)論為，用α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造Per. C6hCG細(xì)胞成功地增加與樣品中重組 hCG綴合的唾液酸分子的數(shù)量。實(shí)施例8A和8B總唾液酸量化唾液酸是被認(rèn)為是單糖的蛋白結(jié)合的糖并且與其它單糖如半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺和巖藻糖組合存在。使用基于Manton等的方法(J. Biochem. Biophys. Methods.(生物化學(xué)生物物理學(xué)方法雜志)30 (1995)，37-48)的方法，測(cè)量根據(jù)本發(fā)明純化的rhCG上的總唾液酸。實(shí)施例8A測(cè)量用α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾的Per. C6重組hCG (例如，實(shí)施例，實(shí)施例恥) 的總唾液酸含量，并且發(fā)現(xiàn)其大于15m0l/m0l[以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示]，例如大于18mol/mol，例如大于19. lmol/mol。這可以與Ovitrelle相比較，Ovitrelle 的總唾液酸含量為17. 6mol/moL·實(shí)施例8B測(cè)量用α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶080019-19修飾的Per. C6重組hCG (通過(guò)上述實(shí)施例 5a的方法制備)的總唾液酸含量，并且發(fā)現(xiàn)其為20mOl/mOl [以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示]。同樣地，這可以有利地與Ovitrelle相比較，Ovitrelle的總唾液酸含量為17. 6mol/moL·檢測(cè)該實(shí)例(080019-19)來(lái)定量α2，3禾口 α2，6唾液酸的相對(duì)量(實(shí)施例 8C)。實(shí)施例8C α 2，3和α 2，6唾液酸的相對(duì)量的量化使用已知技術(shù)-具有正常相(NP)的HPLC，測(cè)量α 2，3和α 2，6唾液酸在純化的 rhCG[實(shí)例(080019-19)，和由實(shí)施例5的方法制備的另兩個(gè)實(shí)例]上的相對(duì)百分比量。為了定量在0-連接聚糖中的α 2，3和2，6-唾液酸，進(jìn)行下述分析。將0_連接的聚糖用Orela聚糖釋放試劑盒從hCG樣品上分解，并在NP-HPLC上分離。將提取、合并的聚糖(如上提取)的樣品用不同的唾液酸酶消化以確定連接。使用α2，3，6，8唾液酸酶和 α 2，3唾液酸酶進(jìn)行聚糖的酶降解。然后，將酶消化的聚糖在NP柱上重新分離，使用準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)，在NP-HPLC上鑒定0-聚糖。計(jì)算相對(duì)百分?jǐn)?shù)，并且顯示在下表中(SA=唾液酸)。
權(quán)利要求
1.重組hCG(rhCG)，其包含α2，3_和α 2，6_唾液酸化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組hCG，其具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量，所述唾液酸含量以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的重組hCG，其具有15m0l/m0l至25m0l/m0l的唾液酸含量。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組hCG，其中全部唾液酸化的10%以上是α2，3_唾液酸化和/或其中全部唾液酸化的50%以下是α 2,6-唾液酸化。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組hCG，其中全部唾液酸化的45%-80%是α2， 3-唾液酸化。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組hCG，其中全部唾液酸化的20%-55%是α2， 6-唾液酸化。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組hCG，其還包含α2，8-唾液酸化。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組hCG，其中所述唾液酸含量是按質(zhì)量計(jì)算6%以上。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組hCG，其在人細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組hCG，其在Per.C6細(xì)胞系，Per. C6衍生的細(xì)胞系或修飾的Per. C6細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的重組hCG，其中所述細(xì)胞系已經(jīng)使用α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行修飾。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的重組hCG，其包含由內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的 α 2，6-連接的唾液酸(02，6唾液酸化)。
13.在人細(xì)胞系中表達(dá)的重組hCG。
14.一種重組hCG制劑，其包含α 2，3-和α 2，6_唾液酸化。
15.一種包含rhCG的藥物組合物，所述rhCG包含α 2，3_唾液酸化和α 2，6_唾液酸化。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的重組hCG或根據(jù)權(quán)利要求14的制劑或根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其包含15m0l/m0l以上的唾液酸含量，所述唾液酸含量以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示，任選地其中全部唾液酸化的10%以上是α 2，3-唾液酸化和/或任選地其中全部唾液酸化的50%以下是α 2，6-唾液酸化。
17.一種藥物組合物，其任選地用于治療不育，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-13或16中任一項(xiàng)的rhCG和/或根據(jù)權(quán)利要求14或16的制劑，任選地還包含F(xiàn)SH和/或LH。
18.一種治療不育的方法，其包括向受試者施用包含根據(jù)權(quán)利要求1-13或16中任一項(xiàng)的rhCG的組合物，和/或根據(jù)權(quán)利要求14或16中任一項(xiàng)的制劑，和/或根據(jù)權(quán)利要求15 或17中任一項(xiàng)的藥物組合物的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-13或16中任一項(xiàng)的rhCG和/或根據(jù)權(quán)利要求14或16中任一項(xiàng)的rhCG制劑在制備用于治療不育的藥物中的應(yīng)用。
20.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-13或16中任一項(xiàng)的rhCG和/或根據(jù)權(quán)利要求14或16 中任一項(xiàng)的rhCG制劑的方法，所述方法包括在人細(xì)胞系中生產(chǎn)或表達(dá)所述rhCG的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-13或16中任一項(xiàng)的重組hCG，其包含單(IS)、二(2S)、三(3S)和四GS)唾液酸化的結(jié)構(gòu)。
22.根據(jù)權(quán)利要求22的重組hCG，其中唾液酸化的結(jié)構(gòu)的相對(duì)量在下述比率內(nèi) (1S 2S 3S 4S) 0. 2-1 35—40 2.5—7 0.5—1。
全文摘要
包含重組hCG(rhCG)的制劑。
文檔編號(hào)C07K14/59GK102549011SQ201080044470
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月5日
發(fā)明者丹尼爾·普拉克辛, 伊恩·科廷厄姆, 理查德·博伊德·懷特 申請(qǐng)人:輝凌公司