專利名稱：使用化學控制的氧化還原態(tài)重折疊蛋白質的制作方法
技術領域：
本發(fā)明通常涉及將高濃度的蛋白重折疊，以及更特別地將在一定體積中2. Og/L 及更高的濃度的蛋白重折疊。
背景技術：
重組蛋白可在許多種表達系統(tǒng)中表達，包括非哺乳動物細胞，例如細菌和酵母。與重組蛋白在原核細胞例如細菌中的表達有關的一個難題是所表達的蛋白以通常被稱作包涵體的有限溶解度的細胞內沉淀物沉淀。包涵體作為細菌宿主細胞在高水平表達時不能正確折疊重組蛋白的結果并作為蛋白變得不能溶解的后果而形成。這尤其符合真核來源的大的、復雜的或蛋白序列的原核表達。不正確折疊的重組蛋白的形成在某種程度上限制了細菌性發(fā)酵以高水平的效率生產(chǎn)重組的大的復雜蛋白的商業(yè)應用。自以商業(yè)上可行的水平在非哺乳動物表達系統(tǒng)例如細菌中重組表達蛋白的出現(xiàn)以來，不同的方法已經(jīng)被開發(fā)用于從細菌包涵體獲得正確折疊的蛋白。這些方法通常遵循以下程序表達通常以包涵體沉淀的蛋白、裂解細胞、收集包涵體然后將包涵體溶解在包含變性劑或表面活性劑以及任選還原劑的增溶緩沖液中，所述增溶緩沖液展開蛋白并且將包涵體分解為幾乎沒有結構的單獨的蛋白鏈。隨后，將蛋白鏈用幫助向生物學活性形式復性的重折疊緩沖液稀釋或洗滌。當半胱氨酸殘基在蛋白的一級氨基酸序列中存在時，其常常需要在允許正確形成二硫鍵的環(huán)境(例如氧化還原系統(tǒng))中完成重折疊。復雜分子(例如包含兩個或更多個二硫鍵的分子)的典型重折疊濃度小于2. Og/ L，以及更通常地為 0. 01-0. 5g/L(Rudolph 和 Lilie，(1996)FASEB J. 10 :49-56)。因此，由于以這些通常的產(chǎn)物濃度重折疊蛋白所需要的大體積，故以工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模將大量的復雜蛋白例如抗體、肽體(ρ印tibody)或其他Fc融合蛋白重折疊具有顯著的局限性，并且是面對工業(yè)時的常見問題。限制這些類型的蛋白的重折疊濃度的一個因素是不正確配對的二硫鍵的形成，這可反過來增加那些形式的蛋白聚集的傾向。由于以工業(yè)規(guī)模的蛋白生產(chǎn)運作時涉及大量材料和大的池尺寸，大量時間以及資源可通過將工藝中的一個或多個步驟排除或簡化來節(jié)省。盡管之前已經(jīng)表明在較高濃度下的蛋白重折疊，但是被重折疊的蛋白是分子量上顯著較小的、僅包含一個或兩個二硫鍵的較不復雜的分子中的任一種(參見例如 Creighton, (1974) J. MoI. Biol. 87 :563-577)。此外，這類蛋白的重折疊方法利用基于洗滌
劑的重折疊化學(參見例如Stockel等人(1997)Eur J Biochem 248 =684-691)或利用高壓折疊策略(St John等人，(2001)J. Biol. Chem. 276(50) =46856-63) 更復雜的分子例如抗體、肽體和其他大蛋白通常并不順從洗滌劑重折疊條件并且通常在離液序列高的重折疊溶液中重折疊。這些更復雜的分子通常具有多于兩個的二硫鍵，通常在8和M個二硫鍵之間，并且可以是形成同二聚體或異二聚體的多鏈蛋白。
在本公開內容之前，這些類型的復雜分子都不能在高濃度(即2. Og/L以及更高的濃度)和以對小規(guī)模(并且特別不是在工業(yè)規(guī)模上)來說有任何有意義的效率程度被重折疊。相反，本文公開的方法可以高濃度在小或大(例如工業(yè))的規(guī)模上進行以提供正確重折疊的復雜蛋白。以高濃度和大規(guī)模重折疊蛋白的能力不僅可轉化為重折疊操作自身增加的效率，而且還代表通過排除對另外的設備和人力的需要而節(jié)省的時間和成本。因此，重折疊以高濃度存在的蛋白的方法可轉化為對蛋白生產(chǎn)工藝來說較高的效率和成本節(jié)省。附圖簡述

圖1是描述巰基對比率和氧化還原緩沖強度對產(chǎn)物物類(species)分布的影響的一系列曲線圖；圖Ia描述5mM緩沖強度的影響；圖Ib描述7. 5mM緩沖強度的影響；圖Ic描述IOmM緩沖強度的影響；圖Id描述12. 5mM緩沖強度的影響；圖Ie描述15mM緩沖強度的影響；圖If描述20mM緩沖強度的影響。圖2是描述在固定的巰基對比率和巰基對緩沖強度下通氣的程度對物類分布的影響的一系列曲線圖。圖3是以6g/L進行并且使用在IL和2000L進行的所述方法的實施方案最優(yōu)化的化學控制的非需氧重折疊的分析疊加。發(fā)明概述一種將在非哺乳動物表達系統(tǒng)中表達并且在一定體積中以2. Og/L或更高的濃度存在的蛋白重折疊的方法，包括(a)將所述蛋白與重折疊緩沖液接觸以形成重折疊混合物，所述重折疊緩沖液包含氧化還原組分以及下列中的一種或多種(i)變性劑；(ii)聚集抑制劑和(iii)蛋白穩(wěn)定劑，所述氧化還原組分包含具有0.001至100的范圍的最終巰基對比率和2mM或更高的氧化還原緩沖強度；(b)將所述重折疊混合物孵育；以及(c)將所述蛋白從所述重折疊混合物中分離。在不同的實施方案中，所述氧化還原組分具有高于或等于0. 001但是小于或等于 100，例如在 0. 05 至 50、0. 1 至 50、0. 25 至 50、0. 5 至 50、0. 75 至 40、1. 0 至 50 或 1. 5 至 50、 2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、30至50或40至50的范圍內的最終巰基對比率，以及等于或高于2mM例如高于或等于2. 25mM、2. 5mM、2. 75mM、3mM、5mM、7. 5mM、10mM或 15mM的巰基對緩沖強度，其中所述巰基對緩沖強度被有效地界定在IOOmM的最大值。重申的是，就范圍而言，巰基緩沖強度可在2mM和20mM之間，例如2. 25mM和20mM、2. 5mM和20mM、 2. 75mM 和 20mM、3mM 和 20mM、5mM 和 20mM、7. 5mM 和 20mM、10mM 和 20mM、或 15mM 和 2OmM 之間，以形成混合物。在重折疊緩沖液的一個實施方案中，所述重折疊緩沖液包含在Tris緩沖液中的脲、精氨酸-HC1、半胱氨酸和胱胺。在另外的實施方案中，所述組分以實施例3中描述的比例存在于所述重折疊緩沖液中。在重折疊緩沖液的另一個實施方案中，所述重折疊緩沖液包含在Tris緩沖液的脲、精氨酸-HC1、甘油、半胱氨酸和胱胺。在另外的實施方案中，所述組分以實施例4中描述的比例存在于所述重折疊緩沖液中。在某些實施方案中，蛋白最初在一定體積中以非天然的有限溶解度形式例如包涵體存在。備選地，蛋白在所述體積中以可溶形式存在。蛋白可以是重組蛋白或其可以是內源性蛋白。所述蛋白可以是復雜蛋白例如抗體或多聚體蛋白。在另一個實施方案中，蛋白是Fc-蛋白綴合物，例如與Fc結構域融合或連接的蛋白。非哺乳動物表達系統(tǒng)可以是細菌表達系統(tǒng)或酵母表達系統(tǒng)。所述重折疊緩沖液中的所述變性劑可選自脲、胍鹽、二甲基脲、甲基脲和乙基脲。 所述重折疊緩沖液中的所述蛋白穩(wěn)定劑可選自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸鈉、硫酸鉀和滲壓齊U。所述聚集抑制劑可選自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸鈉、硫酸鉀和滲壓劑。所述巰基對可包含至少一種選自以下的組分還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、胱胺和β-巰基乙醇。在不同的實施方案中，純化可包括將所述混合物與親和分離基質例如A蛋白或G 蛋白樹脂接觸。備選地，親和樹脂可以是混合型分離基質或離子交換分離基質。在不同的方面，孵育可在需氧條件或在非需氧條件下進行。發(fā)明詳述相關文獻表明當將不同的蛋白重折疊操作最優(yōu)化時，重折疊緩沖液巰基對比率已經(jīng)被有目的地改變了并且因此巰基緩沖強度不知不覺地在寬范圍的強度內變化(參見例如 Lilie，Schwarz&RudoIph, (1998)Current Opinion in Biotechnology 9(5) :497-501 禾口 Tran-Moseman， Schauer&Clark(1999)Protein Expression&Purification 16(1) 181-189)。在一項研究中，研究了溶菌酶(形成熔球的一種簡單的單鏈蛋白)的巰基對比率和緩沖強度之間的關系。(De Bernardez 等人，(1998)Biotechnol. Prog. 14 :47-54)。De Bernardez的工作在僅考慮單向反應模型的動力學的模型方面描述了巰基濃度。然而，最復雜的蛋白受不易描述的可逆的熱力學平衡支配(參見例如Darby等人，(19%) J. MoI. Biol. 249 :463-477)。在含有許多二硫鍵的大的多鏈蛋白例如抗體、肽體和其他Fc融合蛋白的情況下預期有更復復雜的行為。在本公開內容之前，就與蛋白生產(chǎn)的效率有關的復雜蛋白而言，沒有為巰基緩沖強度、巰基對比率化學和蛋白濃度提供具體關系。因此，以高度濃縮的體積重折疊蛋白的能力在很大程度上是低效或不可完成的目標，導致蛋白生產(chǎn)中的瓶頸，尤其是在工業(yè)規(guī)模上。在本公開內容之前，對于復雜蛋白沒有公開巰基對比率和巰基對緩沖強度的獨立影響的具體控制的研究。如本文所描述的，通過與巰基對比率和蛋白濃度結合控制巰基對緩沖強度，蛋白折疊操作的效率可被最優(yōu)化和提高，并且可在高濃度(例如2g/L或更高) 完成蛋白的重折疊。因此，在一個方面，本公開內容涉及促進在高蛋白濃度(例如高于2.0g/L的濃度) 下的蛋白重折疊的氧化還原巰基對比率化學的鑒定和控制。所述方法可被用于任何類型的蛋白，包括簡單蛋白和復雜蛋白(例如包含2-23個二硫鍵或多于250個氨基酸殘基或具有大于20，000道爾頓的MW的蛋白)，包括含有Fc結構域的蛋白，例如抗體、肽體和其他Fc融合蛋白，并且可在實驗室規(guī)模(通常毫升或升規(guī)模)、中試工廠規(guī)模(通常幾百升)或工業(yè)規(guī)模(通常幾千升)上進行。已知為肽體和其他Fc融合物的復雜分子的實例描述于美國專利第6，660，843號、美國專利第7，138，370號和美國專利第7，511，012號。如本文所描述的，巰基緩沖強度和氧化還原巰基對比率之間的關系已經(jīng)被研究并且優(yōu)化以便提供在各種規(guī)模上以2. 0g/L或更高的濃度將蛋白重折疊的可重現(xiàn)的方法。推導出數(shù)學公式以允許精確計算單獨的氧化還原偶組分的比率和強度，從而獲得緩沖液巰基對比率和緩沖液巰基強度的矩陣。一旦這一關系被建立，那么系統(tǒng)地證明巰基緩沖強度和巰基對比率相互作用以限定在重折疊反應中所產(chǎn)生的產(chǎn)物相關物類的分布是可能的。然而緩沖液巰基對比率僅僅是在總反應中確定總系統(tǒng)巰基對比率的一個組分。由于未折疊的蛋白中的半胱氨酸殘基同樣是反應物，故緩沖液巰基強度需要隨蛋白濃度的增加成比例變化以獲得最佳的系統(tǒng)巰基對比率。因此，除了證明緩沖液巰基強度與巰基對比率相互作用之外，還顯示緩沖液巰基強度還與總反應中的蛋白濃度相關。對緩沖液巰基強度和系統(tǒng)巰基對比率的優(yōu)化可針對特定蛋白例如復雜蛋白定制以將半胱氨酸錯配最小化但仍促進高濃度的重折疊。I.定義如本文所用的，術語“一個”和“一”意指一個或多個，除非以另外的方式特別說明。如本文所用的，術語“非哺乳動物表達系統(tǒng)“意指用于在源自除了哺乳動物以外的生物體的細胞中表達蛋白的系統(tǒng)，所述生物體包括但不限于原核生物，包括細菌例如大腸桿菌(E. coli)，和酵母。通常非哺乳動物表達系統(tǒng)被用來表達目標重組蛋白，而在另外情況下，目標蛋白是通過非哺乳動物細胞表達的內源性蛋白。對于本公開內容的目的，不管目標蛋白是內源的還是重組的，如果蛋白在非哺乳動物細胞中表達，那么這一細胞是“非哺乳動物表達系統(tǒng)”。簡單地說，“非哺乳動物細胞”是源自除了哺乳動物之外的生物體的細胞，其實例包括細菌或酵母。如本文所用的，術語“變性劑”意指當被放置與蛋白接觸時具有除去蛋白的二級和三級結構中的一些或全部的能力的任何化合物。術語變性劑是指影響變性的特別的化學化合物以及包含影響變性的特別的化合物的溶液?？稍谒_的方法中使用的變性劑的實例包括但不限于脲、胍鹽、二甲基脲、甲基脲、乙基脲及其組合。如本文所用的，術語“聚集抑制劑”意指具有破壞并降低或消除兩種或更多種蛋白之間的相互作用的能力的任何化合物。聚集抑制劑的實例可包括但不限于氨基酸，例如精氨酸、脯氨酸和甘氨酸；多元醇和糖，例如甘油、山梨醇、蔗糖和海藻糖；表面活性劑，例如聚山梨酯20、CHAPS、Triton X_100和十二烷基麥芽糖苷；及其組合。如本文所用的，術語“蛋白穩(wěn)定劑”意指具有改變蛋白的反應平衡狀態(tài)使得改進或有利于蛋白的天然狀態(tài)的能力的任何化合物。蛋白穩(wěn)定劑的實例可包括但不限于糖和多元醇，例如甘油或山梨醇；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和α-環(huán)糊精；氨基酸鹽，例如精氨酸、脯氨酸和甘氨酸；滲壓劑和某些HofTmeister鹽，例如Tris、硫酸鈉和硫酸鉀；及其組
口 O如本文所用的，術語“Fe”和“Fe區(qū)”可互換使用并且意指包含人或非人(例如鼠) Ch2和Ch3免疫球蛋白結構域或包含兩個鄰接區(qū)的抗體的片段，所述鄰接區(qū)與人或非人Ch2 和Ch3免疫球蛋白結構域具有至少90%同一性。Fc可以但非必需具有與Fc受體相互作用的能力。參見例如 Hasemann 禾口 Capra, “Immunoglobulins !Structure and Function (免疫球蛋白結構和功能)”，William Ε. Paul 編輯，F(xiàn)undamental Immunology，第二版，209， 210-218 (1989)，其通過引用以其整體并入本文。如本文所用的，術語“蛋白”和“多肽”可互換使用并且意指通過肽鍵連接的至少五個天然或非天然存在的氨基酸的任何鏈。
如本文所用的，術語“分離的”和“純化”可互換使用并且意指可存在于包含目標蛋白的樣品中的異源成分的量減少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 或者更多，所述異源成分為例如生物大分子例如蛋白或DNA。異源蛋白的存在可通過任何適當?shù)姆椒òǜ咝б合鄬游?HPLC)、凝膠電泳和染色和/或ELISA測定法來測定。DNA和其他核酸的存在可通過任何適當?shù)姆椒òz電泳和染色和/或使用聚合酶鏈式反應的測定法來測定。如本文所用的，術語“復雜分子”意指(a)大于20，000MW或包含多于250個氨基酸殘基和(b)在其天然形式中包含兩個或更多個二硫鍵的任何蛋白。復雜分子可以但非必需形成多聚體。復雜分子的實例包括但不限于抗體、肽體和包含F(xiàn)c結構域的其他嵌合分子以及其他大蛋白。已知為肽體和其他Fc融合物的復雜分子的實例描述于美國專利第 6，660，843號、美國專利第7，138，370號和美國專利第7，511，012號。如本文所用的，術語“肽體”是指包含任選地經(jīng)由接頭與Fc結構域連接在一起的一種或多種生物活性肽的多肽。肽體的實例參見美國專利第6，660，843號、美國專利第 7，138，370號和美國專利第7，511，012號如本文所用的，術語“重折疊”意指將二級和三級結構再引入以下蛋白的過程，所述蛋白例如由于表達條件或有意變性和/或還原所致已在體外或體內除去其天然的二級或三級結構中的一些或全部。因此，重折疊的蛋白是已經(jīng)將其天然的二級或三級結構中的一些或全部再引入的蛋白。如本文所用的，術語“緩沖液巰基對比率”由重折疊緩沖液中所使用的還原型和氧化型氧化還原物類的關系來定義，其如方程1所定義方程1緩沖液巰基對比率(TPR)的定義
權利要求
1.一種將在非哺乳動物表達系統(tǒng)中表達并且在一定體積中以2. Og/L或更高的濃度存在的蛋白重折疊的方法，包括(a)將所述蛋白與重折疊緩沖液接觸以形成重折疊混合物，所述重折疊緩沖液包含氧化還原組分以及下列中的一種或多種⑴變性劑；( )聚集抑制劑；和(iii)蛋白穩(wěn)定劑；所述氧化還原組分包含具有0. 001至100的范圍的最終巰基對比率和2mM或更高的氧化還原緩沖強度；(b)將所述重折疊混合物孵育；以及(c)將所述蛋白自所述重折疊混合物分離。
2.權利要求1的方法，其中所述最終巰基對比率選自0.05至50、0. 1至50、0. 25至50、 0. 5 至 50、0. 75 至 40、1. 0 至 50 或 1. 5 至 50、2 至 50、5 至 50、10 至 50、15 至 50、20 至 50、 30至50或40至50。
3.權利要求1的方法，其中所述巰基對緩沖強度選自大于或等于2.25mM、2. 5mM、 2. 75mM、3mM、5mM、7. 5mM、10mM 或 15mM。
4.權利要求1的方法，其中所述蛋白在所述體積中以非天然的有限溶解度形式存在。
5.權利要求4的方法，其中所述非天然的有限溶解度形式是包涵體。
6.權利要求1的方法，其中所述蛋白在所述體積中以可溶的形式存在。
7.權利要求1的方法，其中所述蛋白是重組的。
8.權利要求1的方法，其中所述蛋白是內源蛋白。
9.權利要求1的方法，其中所述蛋白是抗體。
10.權利要求1的方法，其中所述蛋白是復雜蛋白。
11.權利要求1的方法，其中所述蛋白是多聚體蛋白。
12.權利要求1的方法，其中所述蛋白是Fc-蛋白綴合物。
13.權利要求1的方法，其中所述非哺乳動物表達系統(tǒng)是細菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)中的一種。
14.權利要求1的方法，其中所述變性劑選自脲、胍鹽、二甲基脲、甲基脲和乙基脲。
15.權利要求1的方法，其中所述蛋白穩(wěn)定劑選自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸鈉、硫酸鉀和滲壓劑。
16.權利要求1的方法，其中所述聚集抑制劑選自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸鈉、硫酸鉀和滲壓劑。
17.權利要求1的方法，其中所述巰基對包括至少一種選自以下的組分還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、胱胺和β-巰基乙醇。
18.權利要求1的方法，其中所述孵育在非需氧條件下進行。
19.權利要求1的方法，其中所述分離包括將所述混合物與親和分離基質接觸。
20.權利要求19的方法，其中所述親和分離基質是A蛋白樹脂。
21.權利要求19的方法，其中所述親和樹脂是混合型分離基質。
22.權利要求1的方法，其中所述分離包括將所述混合物與離子交換分離基質接觸。
23.權利要求1的方法，其中所述分離還包括過濾步驟。
24.權利要求23的方法，其中所述過濾步驟包括深層過濾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將在非哺乳動物細胞中表達并以2.0g/L或更高的濃度存在的蛋白重折疊的方法。所述方法包括確定巰基對比率和氧化還原緩沖強度以獲得以下條件，在該條件下實現(xiàn)以2.0g/L或更高的濃度有效折疊并且該條件可在包括商業(yè)規(guī)模在內的體積范圍內使用。
文檔編號C07K1/113GK102482321SQ201080028756
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權日2009年6月22日
發(fā)明者J·E·舒爾茨, R·N·基納三世, R·哈特 申請人:安姆根有限公司