專利名稱：鯽魚IgM提取純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物免疫球蛋白的提取純化方法，具體地說，是一種鯽魚IgM提 取純化工藝。
背景技術(shù)：
動物的免疫系統(tǒng)是在種系進(jìn)化過程中逐步發(fā)展起來的，其中魚類是最早出現(xiàn)免疫 球蛋白(Ig)的動物，它的免疫系統(tǒng)相對比較原始。盡管魚類的免疫系統(tǒng)比較原始、低級，但 與無脊椎動物相比，其進(jìn)化有了重要突破，已形成包括非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng) 答在內(nèi)的相對完善的免疫系統(tǒng)。同其他脊椎動物一樣，魚類免疫系統(tǒng)包括免疫組織、免疫 細(xì)胞和體液免疫因子三大類。大量的文獻(xiàn)證明魚類能夠進(jìn)行體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中免 疫球蛋白是魚類特異性體液免疫應(yīng)答中最主要的介質(zhì)。與高等脊椎動物相比，魚類體液免 疫研究起步較晚，研究方法也多借助于高等脊椎動物的研究方法。由于魚類免疫球蛋白在 魚類免疫學(xué)研究中具有重要的作用，制備高純度的魚類免疫球蛋白對于研究魚類體液免疫 應(yīng)答規(guī)律、建立以免疫球蛋白為核心的病原快速診斷和魚類血清學(xué)分析方法具有重要的意 義。魚類對抗原刺激的特異性反應(yīng)主要是通過產(chǎn)生IgM來實現(xiàn)的。準(zhǔn)確定量血清IgM 水平，對研究魚類疫病防控，特別是在說明感染后抗體產(chǎn)生以及調(diào)查疫苗免疫后抗體生成 情況是非常必要的。如何將魚類血清IgM又快又方便地純化出來，成為許多魚類免疫學(xué)家 關(guān)心的話題。一些學(xué)者試著采用獸醫(yī)免疫學(xué)上的蛋白純化方法來純化魚類IgM，采用的方法 包括鹽析法、離子交換法、凝膠過濾法等。不同方法純化免疫球蛋白的效率不同，甚至同一 種方法純化不同免疫球蛋白的效果也有差異。一般來說，采用鹽析法得出的產(chǎn)物純度不高， 純化效率和質(zhì)量極低；離子交換層析往往由于被分離的樣品與其它化合物之間等電點等物 理性質(zhì)相近，而不能獲得較純的目的樣品，該方法主要適用于蛋白質(zhì)粗提物的初始純化；凝 膠過濾層析利用了凝膠的多孔性，根據(jù)溶劑分子的大小進(jìn)行分離，因此采用此方法不能分 離分子量近似的蛋白樣品?？梢?，這幾種方法單獨使用或者同種方法重復(fù)使用都存在一定 的缺陷，最好聯(lián)合應(yīng)用。大量研究證實，若是已通過離子交換層析柱純化的蛋白質(zhì)，下一步 理想的純化方法就是凝膠過濾層析，因為這兩種方法可互為補充。但不論采用哪種層析系 統(tǒng)純化鯽魚血清，選擇合適的層析介質(zhì)非常關(guān)鍵，比如采用S^hadex G-200葡聚糖凝膠過 濾純化草魚血清IgM時就發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物純度并不高(李亞南.嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的草魚免 疫球蛋白分析[J].動物學(xué)報，2001，47(2) :132-138·)?？傊?，要想獲得高純度的鯽魚IgM， 需要對多種不同分離技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化組合，對分離條件進(jìn)行優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種提取純化鯽魚IgM的工藝方法，為進(jìn)一步研究魚類體 液免疫應(yīng)答規(guī)律、建立以免疫球蛋白為核心的病原快速診斷和魚類血清學(xué)分析方法奠定基
3石出。技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，在本發(fā)明中通過飽和硫酸銨分步沉淀結(jié)合 Macro-prep high Q強(qiáng)陰離子交換柱以及S印hacryl S-300葡聚糖凝膠柱層析柱提取純 化了鯽魚IgM，最終獲得了高純度的鯽魚IgM。本發(fā)明的步驟包括1.制備鯽魚血清；2.通過33%到50%飽和硫酸銨分級沉淀法對鯽魚血清進(jìn)行粗提，透析除鹽；3.通過Macro-pr印high Q強(qiáng)陰離子交換柱從鯽魚血清飽和硫酸銨分級沉淀提取 物中進(jìn)一步提取鯽魚IgM ；4.經(jīng)離子交換層析獲得的樣品進(jìn)一步通過S印hacryl S-300葡聚糖凝膠層析柱 進(jìn)行精細(xì)分離純化。步驟2)所述飽和硫酸銨分級沉淀法對鯽魚血清進(jìn)行粗提的方法為33%硫酸銨 飽和度沉淀時，棄沉淀留上清，進(jìn)一步以50%硫酸銨飽和度沉淀時留沉淀棄上清。步驟3) 離子交換層析從鯽魚血清飽和硫酸銨粗提物中進(jìn)一步提取IgM，使用中高壓層析系統(tǒng)，離子 交換劑為Macro-pr印high Q，柱床直徑X柱床高度為2. 5cmX IOcm ；在Macro-pr印high Q離子交換層析過程中，使用的緩沖液為A液30mM Na3PO4,pH 7. 0 ；B液30mM Na3PO4+1. 6M NaCl, pH 7.0 ；梯度洗脫過程中，鯽魚IgM被洗脫下來的緩沖液濃度為體積90 %的A液 +10%的B液。步驟4)凝膠過濾層析進(jìn)一步提取鯽魚IgM，使用中高壓層析系統(tǒng)；凝膠過 濾層析中使用的凝膠介質(zhì)為S印hacryl S-300，柱床直徑X柱床高度為1. 5cmX80cm, Sephacryl S-300 凝膠過濾層析緩沖液為 30mM Na3P04+0. 15M NaCl，pH 7. 4。鯽魚IgM提取純化工藝所獲得的產(chǎn)品，其重鏈和輕鏈分子量分別約為79. 2kDa和 25. 5kDa。


圖1為鯽魚血清50%飽和硫酸銨提取物經(jīng)Macro-pr印high Q強(qiáng)陰離子交換層析 柱分離，出現(xiàn)5個蛋白吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE檢測，目的蛋白IgM在第二峰。圖2為經(jīng)Macro-pr印high Q強(qiáng)陰離子交換層析柱分離純化的第二峰經(jīng) Sephacryl S-300葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)一步分離，出現(xiàn)3個蛋白吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE檢測， 目的蛋白IgM在第二峰。圖3中1-4泳道分別為鯽魚血清、粗提物及經(jīng)Macro-pr印high Q強(qiáng)陰離子交換層 析柱分離的第二峰、經(jīng)S印hacryl S-300葡聚糖凝膠柱層析柱進(jìn)一步分離純化第二峰IgM 的SDS-PAGE圖譜，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量。有益效果本發(fā)明通過對所述樣品分離介質(zhì)的優(yōu)選和工藝的優(yōu)化，從而大幅度提高了對所述 樣品分離純化的效率和質(zhì)量。首先，Macro-pr印high Q強(qiáng)陰離子交換劑與傳統(tǒng)的同類介 質(zhì)相比，對復(fù)雜生物混合物分子具有更高的分辨率、載量并可承受中壓和高流速的特點，親 水基質(zhì)可減少非特異性結(jié)合，巨孔顆?？商岣唠x子位點的結(jié)合以及化學(xué)、機(jī)械和熱穩(wěn)定性； 其次，Sephacryl S-300葡聚糖凝膠的球蛋白分離范圍為1 X IO4-L 5X IO6Da,分辨率較 高，而鯽魚IgM分子量為7 X IO5-S X IO5Da,因此S印hacryl S-300葡聚糖凝膠可有效將目的蛋白鯽魚IgM從雜蛋白中分離出來；第三，由于通過離子交換梯度洗脫獲得的粗提樣品 中含有高濃度鹽緩沖液，在經(jīng)S印hacryl S-300葡聚糖凝膠柱層析分離純化目的蛋白時， 還可以進(jìn)一步除去高鹽。因此，通過鹽析法_離子交換層析_凝膠過濾層析三種分離方法 的合理有序組織和實施，實現(xiàn)了由目的樣品的粗提、大量捕獲到最后的精提，從而獲得單一 的、高純度的目的樣品。本發(fā)明在各種不同分離方法實施過程中，對分離目的樣品的條件進(jìn)行了大量的摸 索和優(yōu)化，如不同分離階段流動相的鹽濃度、速度等進(jìn)行了優(yōu)化，將目的樣品與其它化合物 完全分離。因此，本發(fā)明首先選擇采用Macro-pi^p high Q強(qiáng)陰離子交換劑可迅速大量捕獲 目的蛋白并去除絕大多數(shù)雜質(zhì)，使所述樣品得到初步純化，從而有效提高了純化的速度和 效率；然后將Macro-pr印high Q強(qiáng)陰離子交換劑分離獲得的樣品再經(jīng)S印hacryl S-300 葡聚糖凝膠進(jìn)一步分離去除其余雜質(zhì)，使所述樣品得到進(jìn)一步精提純化，從而獲得純度較 高的樣品。本發(fā)明通過對所述樣品分離介質(zhì)的優(yōu)選和工藝的優(yōu)化，不僅可以有效提高純化 的效率和產(chǎn)量，而且可以獲得純度較高的目的樣品。
具體實施例方式下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)方法，例如蛋白質(zhì)技術(shù) 手冊(汪家政，范明主編.科學(xué)出版社，2000)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。1.鯽魚IgM提取純化(1)鯽魚血清的制備用75%的酒精棉擦拭鯽魚體表，進(jìn)行消毒，然后尾靜脈采血。加入滅菌的試管中， 置37°C溫箱lh，然后4°C靜置過夜，使血清充分析出。次日，4°C，3000g/min離心20min，用 微量移液器吸取上清液，分裝到1. 5mL的EP管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?2)飽和硫酸銨分級沉淀將5mL鯽魚血清與滅菌PBS緩沖液等量稀釋，冰浴條件下，用磁力攪拌器邊緩慢攪 拌邊逐滴加入5mL pH7. 4的飽和硫酸銨(28 %氨水調(diào)pH)，使最終飽和度為33 %，4°C靜置過 夜；次日，4°C，10，000g/min離心20min后，棄沉淀留上清。上清在冰浴條件下，用磁力攪拌 器邊緩慢攪拌邊逐滴加入5mL pH7. 4的飽和硫酸銨，使最終飽和度為50%，4°C靜置過夜； 次日，4°C條件下10，OOOg/min離心15min后，棄上清，沉淀用5mL滅菌PBS重懸，裝入預(yù)處 理好的透析袋，以30mMNa3P04，pH 7. 0緩沖液4°C透析48h除鹽，24h內(nèi)換液3 4次，直至 用1 % BaCl2檢查透析液呈陰性為止。透析產(chǎn)物用0. 22 μ m的濾膜過濾，分裝于2mL的滅菌 EP管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?3)Macro-prep high Q強(qiáng)陰離子交換層析裝柱及平衡裝柱前先用去離子水沖洗玻璃層析柱(2.5CmX30Cm，Bio-Rad公 司)，浙干后垂直安裝固定于中高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)固定架上；將Macro-pi^p high Q強(qiáng)離子交換劑用30mM Na3PO4, pH 7. 0進(jìn)行平衡、減壓處理后，緩慢引流灌入玻璃 層析柱中，以4mL/min的流速加壓平衡柱床，直至體積不再改變?yōu)橹?，以提高其分辨率?Macro-prep high Q強(qiáng)離子交換柱裝填好后再以平衡緩沖液30mM Na3PO4,pH 7.0進(jìn)行平衡， 直到UV基線平穩(wěn)即可使用，柱床直徑X柱床高度為2. 5cmX 10cm。
加樣及洗脫將2mL處理完畢的樣品用進(jìn)樣針推注到進(jìn)樣環(huán)中，選擇自動洗脫， 進(jìn)行程序編寫。自動洗脫程序如下首先，以2mL/min流速將樣品引入柱床，再以2mL/min 的流速，30mM Na3PO4, pH 7. 0的洗脫緩沖液80mL洗脫未結(jié)合蛋白；其次，以4mL/min流 速，90% 30mMNa3P04, pH 7. 0 禾口 10 % 30mMNa3P04+l. 6M NaCl, pH 7. 0 的洗脫緩沖液 80mL 洗脫目的蛋白IgM，并進(jìn)行收集；最后，以4mL/min流速，84% 30mMNa3P04, pH 7. 0和16% 30mMNa3P04+l. 6M NaCl，pH 7. 0的洗脫緩沖液80mL洗脫非目的蛋白。再生及平衡以4mL/min 流速，100% 30mM Na3PO4+1. 6M NaCl，pH 7. 0 洗脫緩沖液 80mL洗脫結(jié)合較緊的非目的蛋白；最后，以4mL/min流速，100% 30mM Na3PO4, pH 7. 0洗脫 緩沖液80mL洗脫再次平衡柱床。(4) Sephacryl S-300葡聚糖凝膠過濾層析裝柱及平衡裝柱前先用去離子水沖洗玻璃層析柱(1. 5cmX 100cm, Bio-Rad)，浙 干后垂直安裝固定于中高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)固定架上；將S印hacryl S-300葡 聚糖凝膠用30mM Na3PO4, pH 7. 0進(jìn)行平衡、減壓處理后，緩慢引流灌入玻璃層析柱中，以 2mL/min的流速加壓平衡柱床，直至柱床體積不再改變?yōu)橹梗蕴岣咂浞直媛?。S印hacryl S-300葡聚糖凝膠層析柱裝填好后，再以30mMNa3P04+0. 15MNaCl,pH 7. 4平衡緩沖液進(jìn)行平 衡，直到UV基線平穩(wěn)即可使用，柱床直徑X柱床高度為1.5CmX80Cm。加樣及洗脫將ImL處理完畢的樣品用進(jìn)樣針推注到進(jìn)樣環(huán)中，選擇自動洗脫，進(jìn) 行程序編寫。自動洗脫程序如下首先，以0. 5mL/min流速將樣品引入柱床，再以0. 5mL/min 的流速30mM Na3PO4, pH 7. 0洗脫緩沖液200mL進(jìn)行洗脫并收集；最后，以0. 5mL/min流速 30mM Na3PO4, pH 7. 0平衡緩沖液200mL進(jìn)行再次平衡柱床。樣品濃縮及保存將洗脫下來的目的蛋白裝到超濾濃縮管(截留量> lOOKDa， Millipore公司)中，4°C離心5min，3500g/min。濃縮后的樣品分裝到1. 5mL EP管中，ImL/ 管，-20°C保存。經(jīng)過多步分離純化，從5mL鯽魚血清(蛋白濃度60mg/mL)中純化得到4. 4mg IgM, 得率為1. 4%，經(jīng)SDS-PAGE檢測、蛋白掃描儀分析，純度達(dá)96 %以上。2.鯽魚IgM的檢測SDS-PAffi分析配制12%的分離膠(16mL ddH20, 2. OmL 30%丙烯酰胺溶液，1. 3mL 1.5M Tris 緩沖液 pH 8. 8,0. 05mL 10% SDS,0. 05mL 10%過硫酸銨，0. 002mL 四甲基乙二 胺)和5%的濃縮膠(1. 4mL ddH20,0. 33mL 30%丙烯酰胺溶液，0. 25mL IM Tris緩沖液pH 6. 8,0. 02mL 10% SDS, 0. 02mL 10%過硫酸銨，0. 002mL四甲基乙二胺)。樣品添加上樣緩沖 液沸水煮lOmin。濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V。電泳2. 5h。考馬斯亮蘭染色2h，脫色 液脫色。結(jié)果觀察僅在約79. 2kDa、25. 5kDa處有兩條明顯的條帶出現(xiàn)，即鯽魚IgM的重鏈 及輕鏈。綜上所述，本發(fā)明鯽魚IgM的提取純化工藝，可獲得高純度的鯽魚IgM，對于研究 魚類體液免疫應(yīng)答規(guī)律、建立以免疫球蛋白為核心的病原快速診斷和魚類血清學(xué)分析方法 具有重要的意義。本發(fā)明有以下創(chuàng)新點1.通過鹽析法-離子交換層析-凝膠過濾層析三 種分離方法合理有序的組織和實施，實現(xiàn)了目的樣品由粗提、大量捕獲到最后精提；2.本 發(fā)明使用的Macro-pi^p high Q強(qiáng)陰離子交換劑對復(fù)雜生物混合物分子具有更高的分辨率、更大的載量，并可承受中壓和高流速的特點；3.凝膠過濾層析中使用的凝膠介質(zhì)為 Sephacryl S-300，分辨率較高，其對蛋白分離范圍1 X IO4-L 5 X IO6Da,可有效分離鯽魚 IgM0本發(fā)明通過對所述樣品分離介質(zhì)的優(yōu)選和工藝的優(yōu)化，不僅可以有效提高純化的效率 和和產(chǎn)量，而且可以獲得純度較高的目的樣品。
權(quán)利要求
一種鯽魚IgM提取純化的工藝，包括1)制備鯽魚血清；2)通過質(zhì)量比33%到50%飽和硫酸銨分級沉淀法對鯽魚血清進(jìn)行粗提；3)通過強(qiáng)陰離子交換柱Macro prep high Q Cartridge從鯽魚血清飽和硫酸銨分離沉淀的提取物中進(jìn)一步提取鯽魚IgM；4)經(jīng)離子交換層析獲得的樣品進(jìn)一步通過葡聚糖凝膠層析柱SephacrylTM S 300進(jìn)行精細(xì)分離純化，所制得的鯽魚IgM重鏈和輕鏈分子量分別約為79.2kDa和25.5kDa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯽魚IgM提取純化工藝，其特征在于步驟2)所述飽和硫 酸銨分級沉淀法對鯽魚血清進(jìn)行粗提方法為33%硫酸銨飽和度沉淀時棄沉淀留上清，50% 硫酸銨飽和度沉淀時留沉淀棄上清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鯽魚IgM提取純化工藝，其特征在于，步驟3)離子交換 層析從鯽魚血清飽和硫酸銨粗提物中進(jìn)一步提取IgM使用的中高壓層析系統(tǒng)，離子交換劑 % Macro-prep high Q,X tt^i^iS^J 2. 5cmX IOcm ；^ Macro-prep high Q 離 子交換層析過程中，使用的緩沖液為A液30mM Na3PO4, pH 7. 0 ；B液30mM Na3PO4 + 1. 6M NaCl，pH 7. 0 ；梯度洗脫過程中，鯽魚IgM被洗脫下來的緩沖液濃度為體積90%的A液+10% 的B液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鯽魚IgM提取純化工藝，其特征在于，步驟4)凝膠 過濾層析進(jìn)一步提取鯽魚IgM使用的中高壓層析系統(tǒng)，凝膠過濾層析中使用的凝膠介質(zhì) 為 S印hacryl S-300，柱床直徑 X 柱床高度為 1. 5cmX80cm，Sephacryl S-300 High Resolution 凝膠過濾層析緩沖液為 30mM Na3PO4+ 0. 15M NaCl, pH 7. 4。
5.權(quán)利要求1-4之一所述的鯽魚IgM提取純化的工藝所獲得的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及鯽魚IgM提取純化工藝，一種將鯽魚IgM從鯽魚血清中與其它化合物相分離，從而獲得高純度鯽魚IgM的方法。包括制備鯽魚血清；通過33%到50%飽和硫酸銨分級沉淀法對鯽魚血清進(jìn)行粗提；通過Macro-prephighQ強(qiáng)陰離子交換柱從鯽魚血清飽和硫酸銨分離沉淀提取物中進(jìn)一步提取鯽魚IgM；經(jīng)離子交換層析獲得的樣品進(jìn)一步通過SephacrylTMS-300葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)行精細(xì)分離純化。從5mL鯽魚血清(蛋白濃度60mg/mL)中純化得到4.4mgIgM，得率為1.4%，經(jīng)SDS-PAGE檢測、蛋白掃描儀分析，純度達(dá)96%以上。
文檔編號C07K1/16GK101955530SQ20101052939
公開日2011年1月26日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者劉永杰, 焦大為, 陸承平 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)